CN105695435A - 一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用。首次分离获得一种来源于深海海洋嗜热细菌(Geobacillus sp.4j)的耐高温α-淀粉酶，其具有酶活性高且热稳定性高的特点。

Description

一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及本一种Geobacillussp.4j的高温淀粉酶基因amyA，本发明还公开了含有该基因的表达载体和宿主细胞及其表达方法。

背景技术

淀粉是一种碳水化合物，主要以α-D-葡萄糖为单位聚合而成，链平均长度为500-1000个葡萄糖残基。淀粉中能溶于热水的一部分叫直链淀粉(Amylase)，不能溶解的叫支链淀粉(Amylopectin)。

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的通称，广泛存在于动植物和微生物中。由于淀粉酶在工农业上的重要价值，因此很早就有人对淀粉酶进行研究。淀粉酶按照水解淀粉方式的不同大致可分为四大类：(1)α-淀粉酶(EC3.2.1.1)，它以糖原或淀粉为底物，从分子内部切开α-1,4糖苷键而使底物水解成糊精和少量的葡萄糖和麦芽糖。(2)β-淀粉酶(EC3.2.1.2)：从底物的非还原末端依次间隔的切开α-1,4糖苷键，因此作用于直链淀粉时所得的产物为麦芽糖，而作用于支链时只能得到50％-65％麦芽糖，残留下40％左右的极限糊精。(3)葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3)：习惯上简称糖化酶，从底物非还原性末端依次水解α-1,4糖苷键和分支点α-1,6糖苷键，生成葡萄糖。(4)异淀粉酶(EC3.2.1.9)：只水解糖原或支链淀粉分支点α-1,6糖苷键，切下整个侧枝。

从催化专一性上看，把α-淀粉酶归为糖苷水解酶类(glycosylhydrases)的第13家族，属于α-葡萄糖苷水解酶(α-Glycosylhydrases，EC3.2.1)，α-淀粉酶(α-amylase)又称为液化淀粉酶，其系统名称为α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(α-1,4-glucan-glucanhydrolaseEC3.2.1.1)，常用名α-淀粉酶，又名α-1,4糊精酶，是一种内切酶，能水解淀粉分子中的α-1,4糖苷键，将其任意切成长短不一的短链糊精和少量的低相对分子质量糖类，直链淀粉和支链淀粉均以无规则的形式进行分解，从而使淀粉糊的粘度迅速下降，即“液化”起作用，故α-淀粉酶又称为液化酶。

α-淀粉酶存在于包括人、动物、植物、真菌和细菌等各种生物中。微生物中能产生α-淀粉酶的属有：Bacillus，Thermomonospor，Acinetobacter，Pseudomonas，Streptomyces，Aspergillus，Penicillus等。目前在工业上大量使用的α-淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)。其中地衣芽孢杆菌生产的淀粉酶因具有热稳定性而被优先使用。耐高温的淀粉酶由于具有相当高的热稳定性，因此自从1973年开始投入生产以来，被广泛应用于制糖、酿造、有机酸等以淀粉为原料的深加工工业，是目前工业上用途最为广泛的酶之一。

高温菌是一种极端菌，它们能够适应非常恶劣的自然条件与它们自身带有能够耐受极端条件的蛋白是非常相关的。

鉴于目前耐高温的淀粉酶的需求量大，开发具有耐高温，活性稳定的高温淀粉酶或生淀粉酶成了当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种耐高温淀粉酶、其编码基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种耐高温的淀粉酶，所述淀粉酶选自：

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的多肽(包含信号肽和成熟多肽)；

(b)氨基酸序列如SEQIDNO:2中第35-549位所示的多肽(不包含信号肽，仅为成熟多肽)；

(c)将SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)多肽的功能的由(a)或(b)衍生的多肽。

在一个优选例中，所述的耐高温的淀粉酶来源于深海海洋嗜热细菌(Geobacillussp.4j)。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的淀粉酶。

在一个优选例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，所述的载体包含所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的载体是pMD19-T表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种细胞，其包含所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的细胞是大肠杆菌Top10。

在本发明的另一方面，提供一种生产所述的α-淀粉酶的方法，包括：培养所述的细胞，从培养物中分离出表达产物。

在一个优选例中，利用信号肽将α-淀粉酶分泌到胞外，采用硫酸铵盐析沉淀、镍柱纯化的方法分离出表达产物。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物中含有所述的α-淀粉酶；以及食品学上可接受的载体。

在一个优选例中，所述的组合物的pH值为4.5～7(较佳地为5～6)；或

所述的组合物的保存温度为55～80℃(较佳地为60～70℃)；或

所述的组合物中还包括选自下组的金属离子：K⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺以及Na⁺。

在本发明的另一方面，提供所述的α-淀粉酶的用途，用于水解糖原或淀粉。

在本发明的另一方面，提供一种水解糖原或淀粉的方法，所述方法包括：用所述的α-淀粉酶处理糖原或淀粉。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、OD540对还原糖含量线性关系的标准曲线(葡萄糖为标准)。

图2、Gs4j-amyA的酶学特性。

(a)pH值对于Gs4j-Amy的影响；

(b)温度对于Gs4j-Amy的影响；

(c)24小时室温储存后重组Gs4j-Amy对于pH稳定性的影响；

(d)重组Gs4j-Amy的温度稳定性。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次分离获得一种来源于深海海洋嗜热细菌(Geobacillussp.4j)的α-淀粉酶(高温淀粉酶)，其具有酶活性高且热稳定性高(耐热性好)的特点。在此基础上完成本发明。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的α-淀粉酶”是指α-淀粉酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化α-淀粉酶。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。α-淀粉酶的纯度能用氨基酸序列分析。

如本文所用，所述的amyA、gs4j-amy与gs4j-amyA可互换使用；amyA、Gs4j-amy与Gs4j-amyA可互换使用。

本发明的α-淀粉酶可以是重组蛋白(多肽)、天然蛋白、合成蛋白。本发明的α-淀粉酶可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的α-淀粉酶可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的α-淀粉酶还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括α-淀粉酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然α-淀粉酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的α-淀粉酶片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“α-淀粉酶”指具有α-淀粉酶活性的SEQIDNO:2序列的蛋白。该术语还包括具有与α-淀粉酶相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括α-淀粉酶的活性片段和活性衍生物。

该α-淀粉酶的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与α-淀粉酶的DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含α-淀粉酶或其片段的融合蛋白。

发明还提供α-淀粉酶的类似物。这些类似物与天然α-淀粉酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的α-淀粉酶并不限于上述例举的代表性的蛋白。

在本发明中，“α-淀粉酶保守性变异体(多肽)”指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg

Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白的编码区序列可以与SEQIDNO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的多肽，但与SEQIDNO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNO:2的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列(如信号肽)；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少80％，较佳地至少90％，更佳地至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，0℃；或(2)杂交时加有变性剂，50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQIDNO:2中的成熟蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的α-淀粉酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或α-淀粉酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的α-淀粉酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码α-淀粉酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，α-淀粉酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：大肠杆菌质粒。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含α-淀粉酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。所述宿主细胞优选各种有利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌Top10构建表达α-淀粉酶的重组细胞。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

作为实施方式之一，通过包含本发明α-淀粉酶编码序列的大肠杆菌(例如大肠杆菌Top10)发酵来生产α-淀粉酶，并通过His标签镍柱纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。

作为本发明的优选方式，在制备时，以简并PCR技术从深海Geobacillussp.4j基因组中克隆高温淀粉酶基因amyA并构建完成大肠杆菌重组表达菌BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy。用本发明制备的大肠杆菌重组表达菌株BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy表达水平高，能稳定分泌(利用大肠杆菌的信号肽OmpA)到胞外上清中，更利于纯化。且多次传代后表达里那个未有降低，所以通过本发明可以以较低的成本大量生产重组高温淀粉酶。

本发明的α-淀粉酶的用途包括(但不限于)：用于水解糖原或淀粉。本发明的α-淀粉酶具有优异的水解糖原或淀粉的效果，且具有良好的热稳定性以及pH稳定性，应用前景良好。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的α-淀粉酶以及食品学上或工业上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：缓冲液、水等。其可被制成溶液或粉剂等。所述的“有效量”是指可发挥α-淀粉酶的功能或活性的且可被接受的量。在使用时，本领域能够根据所述α-淀粉酶的酶活性方便地确定所述的有效量。

本发明利用基因工程手段制备了能够表达α-淀粉酶的重组菌株，并获得了优质的α-淀粉酶。本发明通过酶学性质鉴定进行了酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性等理化性质的分析，证明本发明的α-淀粉酶具有很好的pH稳定性，良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力，酶活性很高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施列1、高温淀粉酶基因amyA部分序列的克隆

使用简并引物以深海海洋嗜热细菌(Geobacillussp.4j)(由国家海洋局第三海洋研究所提供)的基因组为模板进行聚合酶链反应(PCR)克隆高温淀粉酶基因amyA，具体操作为：

在培养基中过夜培养Geobacillussp.4j，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。使用兼并引物进行梯度PCR反应：

p1：5’-ATGATGCARTAYTTYGA-3’(SEQIDNO:3)，

p2：5’-ACRTACCAYTTNCCCCA-3’(SEQIDNO:4)，

PCR条件为：95℃预变性5min，随后95℃30s、45℃-65℃30s、72℃1min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在550bp左右有一明亮的特异性条带。将该条带切下，经琼脂糖凝胶电泳回收后连接pMD19-T载体后采用标准的氯化钙法转入大肠杆菌Top10菌株中，涂布于含有硫酸卡那霉素抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养，使用通用引物M13进行PCR验证，正确后将阳性转化子送去测序。

通过生物信息学分析该质粒所含的片段确为高温淀粉酶基因的部分序列。将该阳性转化子命名为pMD19-T-amyA/Top10，将其含有的质粒命名为pMD19-T-amyAp。

实施列2、高温淀粉酶基因amyA全长的克隆

参照基因走读的试剂盒GenomeWalkingKit(Takara)说明书的引物设计原则，以简并PCR获得的同源性较高的淀粉酶基因序列为依据，分别设计出上下游的SP1、SP2、SP3共6条特异性引物，首轮以Geobacillussp.4j基因组DNA为模板，AP1(备选AP2、AP3、AP4)和SP1为引物。第二轮以稀释到合适倍数(通常为1000倍或10000倍)的第一轮PCR反应液为模板，AP1(备选AP2、AP3、AP4)和SP2为引物。第三轮以稀释到合适倍数(通常为1000倍或10000倍)的第二轮PCR反应液为模板，AP1(AP2、AP3、AP4)和SP2为引物。经过3轮PCR反应，根据序列拼接后的结果重新进行下一轮基因走读，经凝胶电泳后获得高温淀粉酶基因amyA的部分序列的上游片段约1800bp，下游片段约2000bp。将2个片段分别连接pMD19-T载体后采用标准的氯化钙法转入大肠杆菌top10菌株中，涂布于含有硫酸卡那霉素抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养，使用通用引物M13进行PCR验证，正确后将阳性转化子送去测序。

将测序结果与已获得的淀粉酶基因的部分序列进行比对拼接，再通过生物信息学方法确定高温淀粉酶基因amyA(后续也称为gs4j-amyA)的开放阅读框，得到高温淀粉酶基因amyA的序列(SEQIDNO:1)，序列全长1650bp，编码一个含有549个氨基酸的蛋白质(SEQIDNO:2)。

实施列3、高温淀粉酶基因amyA表达载体的构建

根据得到的高温淀粉酶基因amyA全序列设计如下引物：

上游引物Am-OA-F：5’-AGCGAGCTCATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGCCGCACCGTTTAACG-3’(SEQIDNO:5)，

下游引物Am-OA-R：5’-CCCGCTCGAGTAGGCCATGCCACCAAC-3’(SEQIDNO:6)。

其中，上游引物中包含了大肠杆菌外膜蛋白信号肽ompA的编码序列。

用PCR扩增得到高温淀粉酶基因amyA全序列。该PCR条件为95℃预变性5min，随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行32个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示1700bp左右处有一特异性条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，用ScaI和XhoI酶切，琼脂糖凝胶电泳回收1700bp左右的DNA片段。

将大肠表达载体pET-28a同样用ScaI和XhoI酶切，琼脂糖凝胶电泳回收5300bp的DNA片段，将其与上述所得1700bp的的DNA片段连接后，按照标准的氯化钙法转化入大肠杆菌Top10中，筛选具有硫酸卡那霉素抗性的转化子。LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养后使用通用引物M13进行PCR验证，PCR验证程序为95℃预变性5min，随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示在2000bp左右有正确条带的为阳性转化子，将对应的正确的菌株送测序，测序显示序列正确，质粒构建正确。将该阳性转化子命名为pET28a-amyAp/Top10，含有的质粒命名为pET28a-amyAp。

实施例4、高效表达高温淀粉酶的大肠杆菌工程菌株BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy的构建

将表达载体pET28a-ompA-gs4j-amy按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中，筛选具有硫酸卡那霉素抗性的转化子。LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养后使用通用引物M13进行PCR验证，PCR验证程序为95℃预变性5min，随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳显示在2000bp左右有正确条带的为阳性转化子，将阳性转化子命名为BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy。

实施例5、利用大肠杆菌重组株BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy生产重组α-淀粉酶

挑取BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy重组菌株单克隆于10mlLB培养基中(卡纳霉素50μg/ml)，37℃培养直到菌液浓度OD₆₀₀达到1.0左右，取1ml菌液以2％的接种量接种于50mlLB培养基中(卡纳霉素50μg/ml)，37℃培养2h左右直到菌液浓度OD₆₀₀达到0.6左右，向培养液中加入IPTG诱导菌体表达，IPTG的终浓度为1mmol/L，37℃培养48h。

实施例6、amyA蛋白纯化和酶活测定

前述成功构建了菌株BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy，该菌株高效表达Gs4j-amyA。Gs4j-amyA在大肠杆菌外膜蛋白信号肽ompA的作用下分泌到胞外，纯化时选择硫酸铵盐析的方法获得粗酶沉淀，然后通过镍柱金属螯合层析进行纯化。

蛋白纯化平衡缓冲液：10mmol/L磷酸二氢钠，10mmol/L磷酸氢二钠，0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH7.4。蛋白纯化洗脱缓冲液：10mmol/L磷酸二氢钠，10mmol/L磷酸氢二钠，0.5mol/LNaCl，500mmol/L咪唑，pH7.4。所有的蛋白纯化缓冲液均需要0.45μm滤膜过滤后使用。透析缓冲液为去除咪唑的蛋白纯化平衡缓冲液。

1、硫酸铵盐析法获取Gs4j-amyA粗酶液

BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy能很好实现两种淀粉酶的分泌表达，按照前述方法培养，IPTG诱导48h产生的发酵上清液，加入适量硫酸铵使得上清酶液达到一定饱和度，过夜并间断搅拌，使得蛋白沉淀下来。然后于5000r/min，4℃离心10min，将上清和沉淀分离，沉淀用1ml磷酸盐缓冲液溶解，制成共10ml粗酶液，粗酶液经过截留分子量为30KDa透析袋在透析缓冲液中透析36h，每12h更换一次缓冲液，除去大部分硫酸铵盐分，透析过程中有部分蛋白沉淀，体积增大到15ml，通过离心除去蛋白沉淀，然后用0.45μm滤膜过滤后用做后续纯化的粗酶液。为了确定盐析过程较合适的硫酸铵饱和度，各取1ml上清粗酶液，缓慢加入硫酸铵分别使相应的饱和度为20％-90％(饱和度100％对应的硫酸铵含量为707g/L)，5000r/min，4℃离心15min将盐析上清和盐析沉淀尽量分离，然后盐析沉淀用1ml的PBS重悬，测定盐析上清和盐析沉淀的蛋白含量和酶活。

2、Gs4j-amyA粗酶液的镍柱纯化

配制平衡缓冲液、洗脱缓冲液，0.45μm滤膜过滤后超声30min方可使用。采用镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，洗脱时用含50～500mmol/L咪唑的洗脱液分阶段洗脱，各洗脱2个柱体积。收集的部分测定酶活并测定蛋白的浓度，再取有蛋白的部分通过蛋白电泳检测纯度。

3、酶活和蛋白测定

淀粉酶活力以水解产生一定还原糖所需的酶量来表征，还原糖的测定采用DNS法。绘制标准曲线：取7支试管，标记为0、1、2、3、4、5、6，按表2.1在冰水浴中配制成总体积800μL的溶液。

各管摇匀，从冰水浴中转移到沸水浴中，等到沸腾后精确计时反应5min，放入冰水浴中冷却后加去离子水6ml，混匀再用分光光度计测定540nm处的吸光值，空白为0号管。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，OD₅₄₀为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线(图1)，算出计算公式。反应体系中还原糖含量(mg)＝稀释倍数×(A₅₄₀+0.0054)÷1.1787。

由于测定的粗酶液中(发酵上清液或菌体破壁液)含有还原糖，且1％(w/v)的可溶性淀粉底物中也有部分还原糖。因此酶活力测定时要去除这两方面的影响。1％(w/v)的淀粉底物的配制：将1％(w/v)的可溶性淀粉糊化后溶解到pH7.50含有0.05mol/L磷酸氢二钠的柠檬酸液中，搅拌均匀，120℃灭菌20min后4℃保存。

表2、还原糖的标准曲线测定步骤

总反应产生的还原糖：取若干试管标记，吸取1％(w/v)的淀粉底物280μl(pH7.50)，放入60℃恒温水浴预热10min。然后将粗酶液(新鲜菌液8000g离心3min后的发酵上清液)20μl加入试管中，立即混匀，精确反应10min。反应后，将反应试管立即转移到冰水浴中，立即加入200μl去离子水和300μl的DNS试剂，混合均匀。然后转移至100℃恒温水浴精确计时反应5min后，立即放入冰水混合物中冷却，然后加入离子水6ml，混匀再用分光光度计测定540nm处的吸光度值A。底物的还原糖：与总反应同步进行，操作一致，不加粗酶液，以去离子水20μl代替，显色反应完成后，用分光光度计测定540nm处的吸光度值B。粗酶液中的还原糖：与总反应同步进行，操作一致，只是不加底物，底物以去离子水280μl代替，显色反应完成后，用分光光度计测定540nm处的吸光度值C。

以标准曲线为参照，算出以上吸光值A、B、C对应的还原糖含量A₁、B₁、C₁，则酶反应产生的还原糖为(A₁-B₁-C₁)，以此算出相应的酶活。酶活的定义：上述条件下(60℃，pH7.50，1％的淀粉底物)，每分钟时间内1ml酶液水解产生1μmol还原糖的酶量定为1个酶活单位。

蛋白的测定采用Bradford蛋白质定量试剂盒(天根)。

结果测得，BL21/pET28a-ompA-gs4j-amy发酵后最终胞外蛋白酶活数据最高达到130U/ml，是Geobacillussp.4j菌株所产酶活的20倍。

培养液上清经过硫酸铵盐析沉淀、重悬透析后比活分别达到1043U/mg和2.29U/mg，镍柱纯化后比活分别提高到8579U/mg和53.6U/mg。

实施例7、酶学特性分析

1、Gs4j-amyA酶的最适pH和pH稳定性

反应体系的pH会影响或改变酶的空间构象，影响活性部位基团的解离，因此对于酶反应，通常有最适于酶维持构象和发挥活性的pH值，即最适反应pH。通常商品化α-淀粉酶的最适pH值为6～7。

分别采用0.05mol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(4-7.5)、磷酸盐缓冲液(6-8.5)、甘氨酸盐缓冲液(9.5-12)来配制1％糊化的可溶性淀粉底物，然后测定Gs4j-amyA60℃反应时的酶活。最适pH值测定时，由于酶与底物的比例为1:28，所以底物的pH值基本等于反应体系的pH值。Gs4j-amyA分别采用不同的pH梯度范围的柠檬酸盐(pH4-7.5)、磷酸盐(pH6-8.5)、甘氨酸盐(pH9.5-12)来进行稀释后放置，室温下放置24h，然后测定剩余的酶活。

结果发现，60℃时Gs4j-amyA的最适pH为5.5(图2a)，其中pH在4.5～7之间，其活性维持在50％以上。该酶在5～12的广泛pH范围内较稳定(图2c)，室温下放置24h后活性维持在70％以上。相比于其他商品α-淀粉酶，该酶表现出较好的耐酸性，由于淀粉浆液自然pH为4.5～5.0，传统淀粉水解工业通常需要将自然pH调节到6.8-7，此过程增加了工艺成本，因此传统淀粉工业的理想水解酶的pH应不大于4.5。因此，Gs4j-amyA在耐酸方面具有优势。

2、Gs4j-amyA酶的最适温度和热稳定性

分别采用pH值为6和6.5的0.05mol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液来配制1％糊化的可溶性淀粉底物，然后分别测定两种酶30-100℃和30-80℃温度范围内的酶活。酶热稳定实验在PCR仪上进行，分别取一定体积的两种酶液到PCR管中，分别在60℃、70℃、80℃、90℃温度下保温一定的时间，然后测定酶液的残余酶活，每次取样前补足蒸发的水分，取样后调整PCR体系的大小。

Gs4j-amyA在55～80℃之间其酶活力维持50％以上(图2b)，以1％糊化可溶淀粉为底物的最适温度为65℃。热稳定实验(图2d)可以看出酶在60℃、70℃、80℃下保温4h后，其残余酶活分别为原酶活的95％、94％、80％，表明其具有相对较高的热稳定性。

因此，Gs4j-amyA具有广泛的温度适应性。

3、金属离子对酶活的影响

一些酶类的辅酶或激酶如Mg²⁺、Ca²⁺等常作为必备离子加入到培养基中因此需要了解金属离子对Gs4j-amyA的酶活的影响。

金属离子母液加入到pH值为6和6.5的0.05mol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液配制的1％(w/v)糊化的可溶性淀粉底物，使反应体系中金属离子的终浓度分别为0.005mmol/L和0.01mmol/L。测定60℃时的酶活，不加金属离子的酶活设为对照。

结果发现，Mn⁺²、Cu²⁺、Ag⁺、Fe²⁺对Gs4j-amyA有严重的抑制作用，K⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺以及Na⁺对其活性有促进作用(表3)，其中Fe³⁺的作用最明显，2mmol/L的Fe³⁺对酶活有70％的提升。Ca²⁺在10mmol/L的浓度时使得酶活提高20％作用，可见该酶发挥活性不依赖于Ca²⁺。

表3、金属离子对Gs4j-amyA的影响

4、酶的底物特异性

分别用pH值为5.5和6.5的0.05mol/L磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液配制1％(w/v)的不同底物，测定酶作用于各个底物的酶活，以1％(w/v)可溶的糊化淀粉为对照。不同的底物包括可溶性生淀粉、直链淀粉、支链淀粉、普鲁兰、蔗糖。同时比较了不同来源的1％(w/v)的生淀粉在55℃、65℃、70℃、80℃、90℃温度下的酶活力大小，以65℃时1％(w/v)可溶的糊化淀粉底物测定的酶活为对照，包括玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉、红薯淀粉、马铃薯淀粉、豌豆淀粉、直连淀粉、支链淀粉和可溶性生淀粉。

pH6、温度60℃时Gs4j-amyA作用不同底物的相对酶活见表4。可以看出以糊化的可溶性淀粉为对照，Gs4j-amyA对于普鲁兰糖和蔗糖无活性，对于可溶性生淀粉的相对酶活为22％。对于直链淀粉和支链淀粉的相对酶活分别为45.5％和67.9％，其对于支链淀粉的相对酶活高于直链淀粉。Gs4j-amyA对不同生淀粉底物均具有较高的催化活性，作用于直链淀粉和马铃薯淀粉的最适温度为70℃，作用于玉米淀粉、小麦淀粉、木薯淀粉、红薯淀粉、豌豆淀粉、支链淀粉和可溶性生淀粉的最适温度为80℃(在80℃下，4h生淀粉水解率达到50％)，其中55～90℃温度范围内，Gs4j-amyA对支链淀粉的相对酶活均高于70％。一方面可能是因为支链淀粉更易糊化，另一方面支链状态有助于酶于底物的结合或识别，α-淀粉酶作用于淀粉时是从淀粉内部无差别地切断α-1,4-葡糖苷键，因此更多的支链可能或有利于酶发挥作用。

表4、不同底物的相对酶活

Gs4j-amyA的最适pH为5.5，其中pH在4.5-7之间，其活性维持在50％以上。该酶在5-12的广泛pH范围内较稳定，室温下放置24h后活性维持在70％以上。Gs4j-amyA具有广泛的温度适应性，在55～80℃之间其酶活力维持50％以上，以1％糊化可溶淀粉为底物的最适温度为65℃。Gs4j-amyA在60℃、70℃、80℃、90℃时的失活速率常数分别为0.01459h^-1、003168h^-1、0.1632h^-1、2.591h^-1，对应的t_1/2分别为47.5h、21.8h、4.25h、0.26h，可见该酶在80℃以下的耐热性能是极佳的。K⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Na⁺对Gs4j-amyA活性有促进作用，Ca²⁺对该酶的影响并不明显，因此该酶不是Ca²⁺依赖性的。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种耐高温的淀粉酶，其特征在于，所述淀粉酶选自：

(a)氨基酸序列如SEQIDNO:2所示的多肽；

(b)氨基酸序列如SEQIDNO:2中第35-549位所示的多肽；

(c)将SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)或(b)多肽的功能的由(a)或(b)衍生的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的淀粉酶。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体包含权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种细胞，其特征在于，其包含权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种生产权利要求1所述的α-淀粉酶的方法，其特征在于，包括：培养权利要求4所述的细胞，从培养物中分离出表达产物。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的α-淀粉酶；以及食品学上可接受的载体。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的pH值为4.5～7；或

所述的组合物的保存温度为55～80℃。

8.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物中还包括选自下组的金属离子：K⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺或Na⁺。

9.权利要求1所述的α-淀粉酶的用途，其特征在于，用于水解糖原或淀粉。

10.一种水解糖原或淀粉的方法，其特征在于，所述方法包括：用权利要求1所述的α-淀粉酶处理糖原或淀粉。