【発明の詳細な説明】
増強された安定性の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼ
発明の背景
大麦の品質は、穀粒が醸造を目的とした麦芽の調製、家畜飼料の処方において
使用されるか又は人間の食糧の一成分として使用されるかに応じて、一定の範囲
の物理的及び化学的属性を包括する。現在、大麦の品質の仕様は、発芽した大麦
（麦芽）が主原料である麦芽製造及び醸造業界の目的に合わせて主として調整さ
れている。品質の仕様には、粒度、休眠、麦芽エキス、穀粒タンパク質含有量、
麦芽中のでんぷん分解のための酵素の発達及び（１→３，１→４）−β−グルカ
ン含有量などが含まれる。麦芽エキスは、広く用いられている品質指標である。
これは、熱湯で抽出されうる麦芽処理された穀粒の百分率の見積りである。エキ
ス百分率が大きくなればなるほど後の醸造中の酵母による発酵成長のための材料
のレベルが高くなることから、大麦育種家及び栽培者は、高い麦芽エキス値をも
つ穀粒を生産しようと競い合っている。麦芽エキス値は、発芽していない大麦の
組成及び麦芽製造中の胚乳の一時変異の速度及び程度の両方によって影響される
。胚盤から又はアリューロンから、でんぷん質胚乳の細胞の中のその基質に至る
までのでんぷん分解酵素及びタンパク質分解酵素の自由な拡散に対する潜在的バ
リヤとしての細胞壁の中心的役割を考えると、壁の組成そして壁成分を加水分解
する酵素を急速に産生する穀粒の能力が麦芽エキス値の重要な決定因子であると
いうのは驚くにあたらないことである。
大麦の胚乳細胞壁の主たる成分は、壁の約70重量％を占める（１→３，１→４
）−β−グルカンである(Fincher，1975)。発芽中の
穀粒において、（１→３，１→４）−β−グルカナーゼは、胚乳可動化中に細胞
壁の（１→３，１→４）−β−グルカンを脱重合させるように機能する。
発芽していない大麦穀粒の中の合計（１→３，１→４）−β−グルカンは、麦
芽エキスと強い相関関係を有していない（Henry 1986; Stuart et al，1988）。
しかしながら、麦芽処理された大麦の中の残留（１→３，１→４）−β−グルカ
ンは、マイナス方向で麦芽エキスと強い相関関係をもち（Bourne et al，1982;
Henry 1986; Stuart et al，1988）、この残留多糖類は大麦中の初期（１→３，
１→４）−β−グルカンレベルそしてさらに重要なことに麦芽製造中に高レベル
の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼを急速に産生する穀粒の能力の組合せ
を反映している。（Stuart et al，1988）。大麦の栽培品種の（１→３，１→４
）−β−グルカナーゼ潜在能は同じく、遺伝子型及び環境の両方に依存している
が、穀粒成熟中の環境条件が、酵素の発達において特に重要であると思われる（
Stuart et al，1988）。育種プログラムにおいて生成された多数の大麦系統の中
の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼレベルの定量のために役立つ可能性の
ある酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)において、大麦（１→３，１→４）−β−
グルカナーゼに特異的なモノクローナル抗体が使用されてきた（H φj et al，1
990）。さらに、（１→３，１→４）−β−グルカン含有量が変化した突然変異
体大麦(Aastrup 1983; Molina-Cans et al，1989)又は（１→３，１→４）−β
−グルカナーゼ潜在能が、麦芽製造の品質に対するこれらの成分の効果について
さらに研究する上で有用となり、育種プログラムにおいて貴重なものであり得る
。
高温で酵素活性を保持する（１→３，１→４）−β−グルカナーゼ〔Ｅ，Ｃ，
３，２，１，73〕の能力（熱安定性）は、麦芽製造及
び醸造産業における大麦の利用中きわめて重要なものである。「麦芽エキス」指
数によって測定されるような麦芽の品質は、発芽中に高レベルの酵素を急速に合
成する穀粒の能力によって大きく左右される（Stuart et al，1988）。醸造プロ
セスでは高レベルの（１→３，１→４）−β−グルカナーゼが同様に望ましく、
このプロセスにおいては、麦芽エキス内の残留（１→３，１→４）−β−グルカ
ンは、高粘度の水溶液を形成するその傾向のため麦汁及びビールのろ過に不利な
影響を与える可能性がある。これらの残留物は同様に、完成品ビールにおける低
温又は高いエタノール濃度での或る種の煙霧又は沈殿物の形成にも貢献しうる（
Woodward and Fincher，1983）。商業的な麦芽製造及び醸造の間に用いられる高
温はこれらの酵素の急速かつ大規模な不活性を導く。商業的キルン乾燥プロセス
の高温（最高85°）は酵素活性の60％以上を破壊し、残留する酵素の多くが、麦
芽抽出のために用いられる熱湯によって不活化される(Brunswick et al，1987)
，Loi et al，1987)。従って、熱安定性の（１→３，１→４）−β−グルカナー
ゼ酵素を発現する大麦の市販の株を開発すること、又は醸造プロセスにおいて使
用するべき添加剤として外因的に（１→３，１→４）−β−グルカナーゼ酵素を
産生することがきわめて望ましい。
大麦（１→３，１→４）−β−グルカンは同様に、家畜飼料産業においても問
題を提起する。穀物粒から調製される家きん用処方においては、（１→３，１→
４）−β−グルカンは、ニワトリの腸の中味の粘度を著しく上昇させる。こうし
て、消化が損なわれ、成長速度が遅くなり、卵及び屠体の衛生的とり扱いを困難
にする粘性ある糞という結果がもたらされる。（Fincher and Stone，1986）。
この応用分野では、酵素が１つのpH範囲特に前腸のpH領域内で安定していること
が必要とされる。同様に、家畜飼料製造において広く
使用されている蒸気ペレット化プロセスに耐えるべく酵素が充分に熱安定性をも
つことも有利である。
従って、熱安定性及び／又はpH安定性を増強させるべく修正されたアミノ酸配
列の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼは、修正された酵素を発現する大麦
を用いることによってか又は処理中の大麦に対し修正された酵素を付加すること
によって、さまざまな産業的用途をもつことになると考えられている。
低レベルの構成性発現が発酵中の活性酵素の分泌及び残留（１→３，１→４）
−β−グルカンの脱重合を導くことになることを期待して、醸造用酵母内に（１
→３，１→４）−β−グルカナーゼを挿入することに著しく関心が寄せられてき
た（Hinchliffe，1988）。マウスα−アミラーゼシグナルペプチドと融合された
大麦（１→３，１→４）−β−グルカナーゼcDNA(Fincher et al，1986)が、酵
母アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子プロモータの指揮下で酵母から発現され
分泌される(Jackson et al，1986)。イソ酵素ＥIIのための遺伝子はまだ分離さ
れていないが、プローブとしての用途のためにほぼ全長のcDNAが利用可能である
ということは、かかる分離が従来の方法を用いて容易に実施可能であるというこ
とを意味している。
我々は、ここで（１→３，１→４）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧII及び（１
→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧII（Ｅ，Ｃ，３，２，１，39）の３次元構
造を決定し、増強された熱安定性及びpH安定性を提供するための修正ならびにか
かる安定化を達成するための適切な点突然変異のための候補であるような酵素の
構造の領域を同定した。我々は、わずか50％の配列相同性しか共有しないこれら
２つの酵素の３次元構造がその構造的枠組の中で著しく類似していること、そし
てその活性部位も、基質の特異性における差異にもか
かわらず驚くほど類似していることを発見した。
発明の要約
第１の態様に従うと、本発明は、増強された熱安定性及び／又はpH安定性をも
つ（１→３，１→４）−β−グルカナーゼを提供する。
第２の態様においては、本発明は、増強された熱安定性及び／又はpH安定性を
もつ（１→３，１→４）−β−グルカナーゼをコードする分離したDNA 配列、及
びこの配列を含むプラスミド、発現ベクター及びトランスジェニック植物を提供
する。好ましくは、発現宿主はE．coli 又はSaccharomyces cereviseaeであり、
好ましくは、トランスジェニック植物は大麦である。改良型酵素をコードする植
物からの大麦穀粒が本発明の範囲内にあるということは明確に理解されることだ
ろう。
第３の態様においては、本発明は、麦芽製造、醸造及び家畜飼料処理から成る
グループの中から選択された方法において、
ａ）出発材料として本発明の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼを発現す
る大麦を使用すること又は、
ｂ）処理すべき穀粒に対し、本発明の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼ
を付加する段階、
を含んで成る方法を提供している。
第４の態様では、本発明は、本発明に基づく改良型（１→３，１→４）−β−
グルカナーゼ及びそれと合わせて喫飲料又は家畜飼料の処理において使用するた
めに受容可能な担体を含む、麦芽製造、醸造又は家畜飼料処理において使用する
ための組成物を提供している。
発明の詳細な説明
本発明についてここで、以下の制限的な意味のない例及び図面のみを参照して
詳細に説明する。なお図面中、
図１はＥII及びＧIIグルカナーゼ酵素のポリペプチドバックボーンのアルファ
炭素トレースの立体図を示す。太いラインはＥII酵素を表わし、さらに軽いライ
ンはＧII酵素を表わす。活性部位の溝は北から南へ走り、（ＥII配列番号を用い
て）残基232 及び 288にある２つの推定上の活性部位残基グルタミン酸がそうで
あるように、Ｃ−及びＮ−末端が表わされている。
図２は、与えられた配列がアミノ酸に対する３文字コードを用いている状態で
、３次元構造に基づくＥII（下部ライン）及びＧII（上部ライン）グルカナーゼ
酵素の配列比較を示す。各ラインの出発点にある残基番号は、２つの酵素の配列
番号である。両方の酵素の二次構造要素はＧII配列より上、かつＥII配列より下
に与えられている。(三次構造の記述において使用される表記法については本文
を参照のこと)。
αはアルファらせんを表わす；βはベータシートを表わす；Ａ及びＢは、標準
的なα／βバレルのものに対する付加的なアルファらせん及びベータシートを表
わす。
図３は、（１→３，１→４）−β−グルカナーゼＥII酵素の概略図である。矢
印の頭を伴う要素は、ベータシート構造を表わし、巻き上ったテープコイルを伴
う要素はアルファらせんを表わす。小さい方のベータシートのいくつかは描かれ
ていない。他の場所で、連鎖はロープとして表わされている。黒色ドットは、熱
安定性突然変異体が提示されたアミノ酸の場所を表わす（本文参照）。
図４は（１→３）−β−グルカナーゼＧII酵素の概略図である。矢印の頭を伴
う要素はベータシート構造を表わし、巻き上ったテー
プコイルを伴う要素は、アルファらせんを表わす。より小さいベータシートのい
くつかは描かれていない。他の場所で、連鎖はロープとして表わされている。黒
色ドットは、酵素の特異的活性を付与する活性部位の溝のまわりのアミノ酸の場
所を表わす。ＧII酵素の特異性をＥII酵素の特異性に変更するためこれらのアミ
ノ酸を修正することが提案される。
図５は、pH3.5 における（１→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧIIの安定性
と（１→３，１→４）−β−グルカナーゼイソ酵素ＥIIの安定性の間の比較を示
す。
図６は、50°での（１→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧIIの安定性と（１
→３，１→４）−β−グルカナーゼイソ酵素ＥIIの安定性を比較する。
図７は、上昇する温度での（１→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧIIの安定
性と（１→３，１→４）−β−グルカナーゼイソ酵素ＥIIの安定性を比較してい
る。
（１→３，１→４）−β−グルカナーゼは、以下の通りグルコシル残基がＣ（
０）３位置で置換されている場合にのみ（１→３，１→４）−β−グルカン中の
（１→４）−β−グルコシルリレケージの加水分解に、触媒として作用する：
グルコシル残基は、それぞれ３及び４によるＧ，（１→３）−及び（１→４）
−β−リンケージによって表わされ、多糖類連鎖の還元末端(red)が示されてい
る。かくして、酵素は、その基質の中に、隣接する（１→３）−及び（１→４）
−β−リンケージされたグリコシル残基に対する絶対的必要性をもつ。（１→３
）−β−グルカナーゼ〔Ｅ，Ｃ，３，２，１，39〕は、（１→３，１→４）−β
−グルカン内に発見される単一の（１→３）−β−リンケージを加水分解できな
いが、以下のような、（１→３）−β−グルカン内の（１→３）−β−グルコシ
ルリンケージの加水分解を触媒とすることができる：
矢印はグルコシル残基（Ｇ）の間の（１→３）−β−リンケージの加水分解を
示す。
さらに、（１→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧIIは、（１→３，１→４）
−β−グルカナーゼＥII酵素に比べてさらに熱安定性、pH安定性及びプロテアー
ゼ耐性があることが知られている。かくして、これらの酵素の３次元構造を使用
して、我々は以下の方法により（１→３，１→４）−β−グルカナーゼのさらに
安定した形を作り上げることができる：
（ａ）（１→３）−β−グルカナーゼの熱安定性を生成する構造的要素を（１
→３，１→４）−β−グルカナーゼへとトランスファする。
（ｂ）タンパク質構造及び安定性の一般的原理を使用して（１→３，１→４）
−β−グルカナーゼを修正する（Matthews，1987）。
（ｃ）（１→３）−β−グルカナーゼを（１→３，１→４）−β−グルカナー
ゼへと形質転換することにより、熱安定性又はpH安定性のある（１→３，１→４
）−β−グルカナーゼ酵素を工学処理する。これは、（１→３，１→４）−β−
グルカナーゼ酵素の触媒部位の要素を（１→３）−β−グルカナーゼ酵素へとト
ランスファすることによって行なわれる。
（ｄ）Ｃ及びＮ末端を横切ってジスルフィド結合を形成することのできるシス
テイン対を作り上げることにより、熱可塑性（１→３
，１→４）−β−グルカナーゼ及び（１→３）−β−グルカナーゼを工学処理す
る。
これらの方法のうち２つ以上のものの組合せを使用することもできる。
これらの方法の各々について、タンパク質構造がわかっているということが重
要な前提条件である。これを知っていることにより、我々は、基質の特異性を支
配する２つの酵素の間の差異を熱安定性及びpH安定性についての差異から分離す
ることができる。このことにより又、我々は、二次構造要素の安定性を増強する
ことになるのは配列に対するどんな種類の変更であるかを予想することができる
。グルカナーゼ遺伝子の無作為突然変異誘発は、タンパク質の構造を破断するこ
とによってその安定性を不変的に減少させることになるか、又は酵素の不活性化
をひき起こす可能性がある。これは、現行の方法ではアミノ酸配列情報のみから
タンパク質のひだ形成及び触媒活性を予想することができないからである。
例１ グルカナーゼ酵素の３次元構造の決定
我々は、BlundeII及びJohnson(1979)によって記述されたＸ線結晶構造解析技
術により、高解像度（２，２Ａ）で（１→３，１→４）−β−グルカナーゼイソ
酵素ＥII（以下ＥIIと呼ぶ）及び（１→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧII（
以下ＧIIと呼ぶ）の３次元構造を決定した。
補遺３では、各酵素の単結晶から得たＸ線回析の結晶構造回析による洗錬から
決定される通りの、２つの酵素の３次元座標及び平均熱振動パラメータ（等方性
Ｂ値）を記した。
ＥII及びＧIIグルカナーゼ構造は、基本的に同一のα／βバレルひだを有する
（図１）。主として配列の挿入及び欠失が存在する位
置においてループの中にわずかな混乱が見られる。配列の比較は、図２に記され
ている。バレル軸に対して垂直な分子の上部表面の全長に沿って走る活性部位の
溝は、溝の中央領域においてほぼ同一であり、溝の端部に向かって詳細に異なっ
ている。２つの活性部位グルタミン酸塩のカルボキシレート基（Chen et al，19
93）は、７Ａほど離れて同一の要領で位置づけられている。同様にこれらの残基
のまわりには、既知の全ての植物（１→３）−β−グルカナーゼの中に完全に保
存されている残基の環が存在する（Xu et al，1992及びGenbank データベースか
らの配列）。新しいタイプのα／βバレルである構造の詳細が、以下に示されて
いる。
図２では、２つの酵素の配列アラインメントに沿って二次構造の要素が同定さ
れた。ここで、ベーターバレルストランドをβ1と、ベータストランドを連結す
る大（最長）らせんをαiと呼ぶ。なおｉは１から８までである。小βシート及
びαらせんは、ストランドβiの後でかつβi+1の前に現われる場合にはそれぞれ
Ｂi及びＡiと呼び、複数が出現する場合には、更に下付き文字ａ又はｂで表わさ
れる。
上述の説明からグルカナーゼ三次構造を見ると、バレル軸（東西に走る楕円形
バレルの長軸）から下に、活性部位溝は、図３及び図４に示されている通り分子
の上部表面上に北から南へと走っている。
Ｎ末端は、β1としてバレルの東側に入る分子の下から出発し、上部表面上に
現われ、α1として底面に向かって戻り（分子の外側を横断する）β2と遭遇し、
ここでこのモチーフはストランドβ2〜β4について反復され、従来のα／βバレ
ルの上半分を構築する（第３のα／βループについて２つのらせんが存在するこ
とに留意されたい）。
バレルの下半分は、他のα／βバレル構造では以前に観察されたことのないよ
り精巧な二次構造要素を有する。らせんα6のまわりに構築されたサブドメイン
と呼ぶことのできるものが存在する。このらせんは、溝の軸に対して垂直にかつ
溝の南端部で走行し、３つの２本鎖アンチパラレルβシート「フィンガー」（上
部表面のＢ5、下部表面上のＢ7、及び溝の南端部にあるＢ6）及び３つの小さい
らせん（溝の西側にあるＡ5及び束側にあるＡ6a及びＡ6a）によって支持されて
いる。溝の下半分を構成する残基のためのプラットフォームを形成するこのサブ
ドメインは、ＥII及びＧII酵素の間で詳細に異なっている（特異性の差異から生
じるものと考えられる）。例えばらせんＡ5はＧIIには欠如している。
約30の残基から成るＣ−末端ストランドはストランドβ8の後で出発し、残基P
he 275 とAla 276 の間のシスペプチド結合が関与する異常な回転を有する（シ
スプロリンはこのタイプの回転に対応できなかった）。この回転により 276から
286までの残基のループは、触媒酸基として作用するべく適当な配向で、小さな
らせん回転α8内にある 288にグルタミン酸塩を位置づけることができる。この
ときＣ末端ストランドは、らせんα1とα7の間の分子の下面まで下降し、Ｎ末端
から 4.2Ａの範囲内にまで至る。
例２ 基質との接触部位の同定
基質結合溝内のどのアミノ酸が基質と接触したかを観察するため、１→３リン
ケージされたオリゴ糖で結晶を浸漬させた後、グルカナーゼＧIIの構造を決定し
た。単量体又は二糖類のグルコースユニットがタンパク質に結合する３つの部位
が発見された。これらの部位の座標は、補遺２に列挙されている。これは、溝内
の基質の配向として、ＧIIに対する提案されている変更のいくつかが基質の結合
にとって重要であることを立証している。
例３ 酵素の熱安定性を増大させるために提案される大麦の（１→３，１→４ ）−β−グルカナーゼの修正
以下のアミノ酸変更は、ＥII及びＧII酵素の３次元構造に基づいて（１→３，
１→４）−β−グルカナーゼＥIIの熱安定性を増強させるために提案されるもの
である。提案された変更のいくつかには、そのタンパク質を安定化させる一因で
ありうるＧIIアミノ酸を置換することが関与する。これらの置換は、提案されて
いる変更が酵素の特異性を変えない（活性部位溝を不変のままに残す）こととい
う原則に基づくものであり、ここで変更がタンパク質の３次元構造における有害
な変化をもたらすことはない。可能な場合には、アミノ酸連鎖を剛化し、ひだ形
成されていないタンパク質のエントロピーを減少させるために、らせん内でグリ
シンをプロリン又はアラニンで置換させた（Matthews et al，1987）。負に帯電
した残基を、らせんのＮ末端に付着させてそれらを安定化させた（Nicholson et
al，1988，Eijsink et al，1992）。ひだ形成されたタンパク質の結合エネルギ
ーを増大させるためイオン対を導入し、タンパク質のその他の部分との水素結合
を増大させることにより、糖化(glycation)を防ぎ安定性を改善するためリシン
をアルギニンに変更した（Mrabet et al，1992）。ＥＩ及びＥIIは、（１→３，
１→４）−β−グルカナーゼのイソ酵素を表わし、ＧＩ〜ＧVIは（１→３）−β
−グルカナーゼのイソ酵素を表わす（Xu et al，1992）。これらの置換の場所は
図３に示されている。突然変異は以下の表記法を用いて記述される：すなわち、
例えば、突然変異Ala 14 Serは、アミノ酸配列中の位置14におけるセリンに対す
るアラニン残基の突然変異を表わす（図31）。アミノ酸については従来の３文字
コードが使用されている。
上述の提案されている修正のうち、以下のイオン対を同時に置換しなければな
らない。
Ala 15 Arg 及び Asn 36 Asp
Thr 17 Asp 及び Met 298 Lys
Ala 95 Asp 及び Ser 128 Arg
Pro 153 Asp 及び Gln 156 Arg
Lys 227 Arg 及び Gly 268 Arg
Gly 152 Thr 及び His 221 Ala
イオン対の同時置換についてのこの必要条件を受けて、提案されている修正の
うち２つ以上のものの組合せを使用することができるということも明らかに理解
できるだろう。
Ｎ及びＣα原子のまわりの主連鎖ねじり角度が０°以上である付
加的な突然変異クラスが提案される。この場合、Gly 残基による置換は、特にα
−らせんのＣ末端においてエネルギー的により有利である(Aurora et al.，1994
)。これらの突然変異は、以下のとおりである：
例４ 触媒活性を（１→３，１→４）−β−グルカナーゼのものに変え、酵素 の熱安定性及びpH安定性を増大させるために提案される、大麦の（１→３）−β −グルカナーゼの修正
前述の通り、ＧII及びＥIIの両方の酵素の最も顕著な特長は、分子の片面を横
切る深い溝である。これは、基質の結合部位であると思われる。ＧII及びＥIIの
両方の酵素からの構造的情報を用いると、どのアミノ酸残基が基質の特異性を制
御する確率が高いかを決定することが可能である。その上、これら２つの酵素は
構造的に非常に類似していることから、特異性を変更するために１つの酵素から
のループをもう１つの酵素のより熱及びpH安定な枠組上に移植することが可能で
ある。
我々は、ＥII酵素からの対応するアミノ酸により裂溝の側面及び底面を形成す
るＧIIループを置換えることを提案する。これらの変更は以下の通りである：
残基 8 Ile→Ser,
残基 34 Phe→Ala,
残基 208 Ala→Thr,
残基 209 Met→Thr,
残基 213 Val→Phe,
残基 128-137 Ile-Arg-Phe-Asp-Glu-Val-Ala-Asn-Ser-Phe→Val-Ser-Gln-Ala
-Ile-Leu-Gly-Val-Phe-Ser(配列番号１)
残基 171-179 Phe-Ala-Tyr-Arg-Asp-Asn-Pro-Gly-Ser→Leu-Ala-Trp-Ala-Tyr
-Asn-Pro-Ser-Ala(配列番号２)及び
残基 283-291 Thr-Gly-Asp-Ala-Thr-Glu-Arg-Ser-Phe→Asp-Ser-Gly-Val-Glu
-Gln-Asn-Trp(配列番号３)
これらの変更のいくつか又は全てが必要である。当業者であれば、置換の有効
性を容易に試験することができるだろう。
ここでも又、これらの提案された修正のうち２つ以上のものの組合せを使用す
ることもできる。
Doan及びFincher(1992)は、ＥＩ酵素と比べて、ＥIIが、残基190 にある炭水
化物のためより熱安定性が高い、ということを示した。我々は、熱安定性を増強
させるため、修正されたＧII酵素内に炭水化物付着部位を導入することを提案す
る。必要とされる突然変異は 189−191 Gln −Pro −Gly →Asn −Ala −Ser で
ある。図４は、提案された突然変異の場所を示すＧII酵素構造の概略図である。
例５ 突然変異体グルカナーゼの構築
提案された突然変異体グルカナーゼの構築は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を
ベースとするメガプライマ方法（Sarkar & Sommers，1990）を用いて行なうこと
ができ、我々のうちの一人(Doan and Fincher 1992)によりこの方法ですでにイ
ソ酵素ＥＩ及びＥIIの単点突然変異体が産生された。簡単に言うと、各々の部位
の突然変異体又は隣接する突然変異の短かい一続きについて、突然変異にとって
必要とされる相補的配列及び野性型cDNAへとアニールするのに充分なフランキン
グ領域を含む１つのオリゴヌクレオチドが合成される。このオリゴヌクレオチド
は、DNA ポリメラーゼを用いてcDNA鋳型に対し拡張される。cDNAの突然変異体切
片を増幅させるため PCRを用い、次にこれを、もとのcDNAを含むプラスミドの中
へ挿入し戻す。多数の突然変異については、最終的構成体を産生するべくこのプ
ロセスをくり返す。
我々は現在、突然変異誘発のための出発点を形成するＥII及びＧII酵素のため
のcDNAをもっている(Doan and Fincher，1992; H φj et al，1989)。これらの
酵素の改良された安定性又は変化した特異性を立証することを目的として、又酵
素を大量に産生するため、次にタンパク質をE．coli(Wynn et al，1992)又は昆
虫細胞（例えばSf９細胞）の中で、バキュロウィルス系（Doan & Fincher，1992
）を用いて発現させることができる。当業者であれば、その他のさまざまな適切
な発現系に気づくことだろう。例えば、酵母は適切な宿主となるし、このような
工学処理された酵母は直接醸造プロセスの中で使用することができる。（１→３
，１→４）−β−グルカナーゼイソ酵素ＥＩ及びイソ酵素ＥＩ及びＥIIのための
ほぼ全長のcDNAをコードする遺伝子（Slakeski et al，1990）が利用可能である
ことによって、遺伝子技術を通して発芽した穀粒内での（１→３，１→４）−β
−グルカナーゼの発達を加速するか又は増強する機会が提供される。例えば遺伝
子上へとより効果的なプロモータをスプライシングすること、発現レベルを増強
するべく既存のプロモータを変性させること、翻訳エンハンサを使用すること、
又は遺伝子のコピー数を増加させることといったいくつかの手段によって、増大
した酵素活性を達成することができる。
突然変異酵素が大麦内に取り込まれ空間的及び時間的に適切な形
で発現されるためには、さらに２つの段階が必要とされる。これらは、適切な発
現制御を伴った大麦グルカナーゼ遺伝子の構築、ならびに生存可能な大麦植物内
への遺伝子の挿入という２段階である。プロモータ領域及びコーティング領域及
びシグナルペプチドを含む、ＥII遺伝子の配列が決定されてきた（Wolf，1991）
。従って、突然変異体グルカナーゼの適正な発現のため、我々は、この遺伝子の
一部分を、上述の方法を用いて突然変異体cDNAの対応する部分によって置換する
ことにする。大麦の形質転換、すなわち稔性あるトランスジェニック大麦植物を
再生することが近い将来可能となるものと期待されている。外来性の又は処理済
みのDNAを大麦ゲノムの中に安定した形で組み込むことができ(Lazzeri et al，1
991)、単一の原形質体から稔性植物を再生することが可能である(Jahne et al，
1991a，b)。大麦に関係ある穀物の中でも、現在、イネを日常的に形質転換する
ことができ、小麦及びトウモロコシの両方の形質転換も報告されてきている。生
物分解技術を用いて大麦などの単子葉植物の形質転換を行なうための方法が広く
用いられており、トランスジェニック大麦の完全植物が成長させられた。
例６
ｉ）pH3.5 でのＧII及びＥIIの安定性
37℃でウシ血清アルブミンの存在下で、pH3.5 で100mM の酢酸ナトリウム緩衝
液の中で、（１→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧII(9.2μｇ／ml)及び（１
→３，１→４）−β−グルカナーゼイソ酵素ＥII（0.23mg／ml）をインキュベー
トさせた。残留酵素活性（Ａc）を測定し、ｔ＝０（Ａo）での初期活性と比較し
た。結果は図５に示されている。ＧIIは、ＥIIに比べpH3.5 で経時的に著しく大
きくなる安定性を示している（注：pH4.3 で、酵素はその安定性においてわずか
に異なっているにすぎず、最小限の活性損失しか示
していない；データ図示せず）。
ii）50℃でのＧII及びＥIIの安定性
50℃でウシ血清アルブミン（１mg／ml）の存在下でpH5.0 で50mMの酢酸ナトリ
ウム緩衝液中で、（１→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧII（16μｇ／ml）及
び（１→３，１→４）−β−グルカナーゼイソ酵素ＥII（19μｇ／ml）をインキ
ュベートした。残留酵素活性（Ａt）を測定し、ｔ＝０での初期活性（Ａo）に比
較した。結果は図６に示されている。ＧIIは、ＥIIに比べ50℃ではるかに安定し
ている。
iii）上昇する温度でのＧII及びＥIIの安定性
15分間、指示された温度でpH5.0 で50mMの酢酸ナトリウム緩衝液の中で、（１
→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧII（16μｇ／ml）及び（１→３，１→４）
−β−グルカナーゼイソ酵素ＥII（19μｇ／ml）をインキュベートした。残留酵
素活性（Ａt）を測定し、ｔ＝０での初期活性（Ａo）と比較した。結果は図７に
示されている。ＥIIは最高40℃まで安定しているにすぎず、一方ＧIIは最高50℃
まで安定している。
例７ 部位特異的突然変異誘発
例３の中で列挙された、考えられる突然変異のうち、以下の変性が、安定性を
改善する確率が最も高いと考えられた。変性は、以下のものに基づいている：
１．イオン対の作成： Gly 53 Asp
Gly 53 Glu
Thr 17 Asp; Met 298 Lys
Ala 95 Asp; Ser 128 Arg
２．潜在的糖化（glycation） Lys 122 Arg
部位の除去 Lys 23 Arg
Lys 74 Arg
３．ひだ形成されていない状態 Gly 44 Arg
でのエントロピーの減少 Gly 223 Ala
Ala 79 Pro
４．疎水性効果 Phe 85 Tyr
部位特異的突然変異誘発は、鋳型として２本鎖プラスミドDNA を用いU.S.E．M
utagenesisキット(Pharmacia)を使用して唯一の制限酵素部位の削除手順によっ
て行なわれた。突然変異を生成するため、適当な突然変異誘発プライマを設計し
、標準的DNA 合成装置で合成した。全てのオリゴヌクレオチドプライマを、使用
前にその５′末端でリン酸化し、基本的にメーカーが規定したとおりに突然変異
誘発手順を行なった。Sequenase version 2.0 配列決定キット（U.S．Biochemic
al Co,）を用いてジオキシヌクレオチド配列決定により、突然変異体を確認した
。
以下の突然変異体を産生し、配列分析により確認した：
Lys 74 Arg
Gly 44 Arg
Phe 85 Arg
Gly 53 Glu
Lys 122 Arg
Lys 23 Arg
Ala 70 Pro
さらに我々は以下の突然変異体も作った。
Gly 223 Ala
Gly 53 Asp
例８ E．coli 内での突然変異体酵素の発現
発現プラスミドpMAL-c2 内の突然変異体cDNAインサートを、E．ｃ
oli DH5α 細胞内で形質転換させ、 0.2％のグルコース及び 100μｇ／mlのアン
ピシリンを含むLBの中で37℃で一晩成長させた。細胞懸濁液のアリュートを同じ
培地中へ継代培養させ37℃でいきおいよく振とうさせながら 600nmで 0.5の光学
密度まで成長させ、１mMのイソフェニル−β−チオガラクトシドで３時間誘発さ
せ、リゾチーム処理及び凍結／解凍により溶菌させた。遠心分離により細胞砕片
を除去した後、未精製の抽出物内でか又は精製の後で酵素活性を測定した。
以下のＥII突然変異体がE．coli の中で発現され、発現されたタンパク質は、
適正なサイズのものであることが確認された。
Lys 122 Arg
Phe 86 Tyr
Gly 44 Arg
例９ 組換え型融合タンパク質の精製
野性型酵素の精製のため、１リットルの培養からの粗抽出物を、15mMのトリス
−HCl 緩衝液pH8.0 で10倍に希釈し、pH8.0 の25mMのトリス−HCl 緩衝液で平衡
化されたDEAE−Sepharose Fast Flow（Pharmacia）カラム（３×11.5cm）に 2.5
ml／分の流速で付加した。
カラムを徹底的に洗浄した後、結合したタンパク質を、 1.2リットルの平衡化緩
衝液で線形0 −250mM のNaCl勾配で溶出させた。有意な酵素活性を含む分画をプ
ールし、脱塩し25mMのNaAc、pH5.0 に調整した。徹底的な洗浄の後、１リットル
の平衡化緩衝液の中で線形0 −200mM のNaCl勾配で、結合したタンパク質を溶出
させた。純粋タンパク質を含む分画をプールして 5.0mgの活性融合タンパク質を
得た。
突然変異体酵素を、浅い塩勾配溶出を用いて、単一のイオン交換クロマトグラ
フィ段階により全て精製した。４〜５リットルの培養
からの粗抽出物を、15mMのトリス−HCl（pH8.0）で10倍に希釈し、12.5mMのトリ
ス−HCl（pH8.5）で平衡化されたDEAE−セファロースカラム（５×21cm）に 2.5
〜3.0 ml／分の流速で付加した。徹底的に洗浄した後、結合タンパク質を 2.0ml
／分の流速で 1.9リットルの線形０〜80mM NaCl 勾配で溶出させた。純粋な融合
タンパク質を含む分画を、 SDS−PAGEにより位置決定し、プールし、濃縮させ、
遠心分離による清澄化した先立ち限外ろ過により 2.5mMの酢酸ナトリウム(pH5.0
)まで調整した。
例10 発現された酵素の活性
基質としてpH5.0 の50mMの酢酸ナトリウム中の５mg／mlの大麦（１→３，１→
４）−β−グルカンを用いて、40℃で（１→３，１→４）−β−グルカナーゼ活
性を粘度計を用いて測定した。活性の単位は、一分あたりの逆比粘度における 1
.0の増加をひき起こす（Δ１／ηsp）酵素の量として定義づけされる。比活性は
１mgのタンパク質あたりの活性として表わされる。
以下の突然変異体酵素の活性を測定し、これを発現された野性型酵素の活性と
比較した：
Lys 122 Arg 活性は野性型と同じ。
Phe 85 Tyr 活性は野性型の約70％。
Gly 44 Arg 活性は非常に低い。
例11 熱安定性検定
pH5.5 の50mMの酢酸ナトリウム緩衝液で野性型又は突然変異体融合タンパク質
のアリコートを希釈し、15分間40℃〜50℃の範囲の温度でこれをインキュベート
させた。０℃でインキュベートさせた試料を、対照として用いた。残留酵素活性
を、例10で記した通り、 550μｌの（１→３，１→４）−β−グルカン基質を用
いて粘度計で測定した。
本書に列挙した参考文献は、以下の頁で識別されている。
当業者にとっては、本発明が明確さ及び理解を目的として詳細に記述されてき
たものの、本書に記述されている実施形態及び方法に対し、本明細書に開示され
た発明がある概念の範囲から逸脱することなく、さまざまな修正及び変更を加え
ることができるということは明白であろう。
追加１．
大麦からのＥII及びＧIIグルカナーゼ酵素の原子座標の表
大麦の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼＥII酵素における306 個のアミ
ノ酸の非水素原子の原子座標及び等方温度因子が下記に列挙される。2896個の原
子座標が表に存在し、それは結晶格子に見出される結合された水分子を包含する
。これに続いて、結晶格子に見出される２つの独立した（１→３）−β−グルカ
ナーゼＧII酵素分子の原子座標が存在する。最初の分子残基は１〜306 までの数
字を付与され、そして２番目の分子残基は401 〜606 である。4564個の原子座標
が表に存在する。また、結晶格子に見出される結合された水分子も包含される。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９５年５月１５日
【補正内容】
低レベルの構成性発現が発酵中の活性酵素の分泌及び残留（１→３，１→４）
−β−グルカンの脱重合を導くことになることを期待して、醸造用酵母内に（１
→３，１→４）−β−グルカナーゼを挿入することに著しく関心が寄せられてき
た（Hinchliffe，1988）。マウスα−アミラーゼシグナルペプチドと融合された
大麦（１→３，１→４）−β−グルカナーゼcDNA(Fincher et al，1986)が、酵
母アルコールデヒドロゲナーゼＩ遺伝子プロモータの指揮下で酵母から発現され
分泌される(Jackson et al，1986)。イソ酵素ＥIIのための遺伝子はまだ分離さ
れていないが、プローブとしての用途のためにほぼ全長のcDNAが利用可能である
ということは、かかる分離が従来の方法を用いて容易に実施可能であるというこ
とを意味している。
我々は、ここで（１→３，１→４）一β−グルカナーゼイソ酵素ＥII及び（１
→３）−β−グルカナーゼイソ酵素ＧII（Ｅ，Ｃ，３，２，１，39）の３次元構
造を決定し、増強された熱安定性及びpH安定性を提供するための修正ならびにか
かる安定化を達成するための適切な点突然変異のための候補であるような酵素の
構造の領域を同定した。我々は、わずか50％の配列相同性しか共有しないこれら
２つの酵素の３次元構造がその構造的枠組の中で著しく類似していること、そし
てその活性部位も、基質の特異性における差異にもかかわらず驚くほど類似して
いることを発見した。
発明の要約
第１の態様に従うと、本発明は、増強された熱安定性及び／又はpH安定性をも
つ（１→３，１→４）−β−グルカナーゼを提供する。
第２の態様においては、本発明は、増強された熱安定性及び／又
はpH安定性をもつ（１→３，１→４）−β−グルカナーゼをコードする分離した
DNA 配列、及びこの配列を含むプラスミド、発現ベクター及びトランスジェニッ
ク植物を提供する。
８．次の置換：
Gly 53 Asp
Gly 53 Glu
Thr 17 Asp; Met 298 Lys
Ala 95 Asp; Ser 128 Arg
Lys 122 Arg
Lys 23 Arg
Lys 74 Arg
Gly 44 Arg
Gly 223 Ala
Ala 89 Pro
Phe 85 Tyr
の１又は複数を含んで成る請求の範囲第６項記載の（１→３，１→４）−β−グ
ルカナーゼ。
９．変異 189−191 Gln −Pro −Gly →Asn −Ala −Ser をさらに含んで成る
請求の範囲第６〜８のいずれか１項記載の（１→３，１→４）−β−グルカナー
ゼ。
10．置換Lys 122 →Arg 及び／又は置換Phe 85→Tyr を含んで成る請求の範囲
第６項記載の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼ。
11．請求の範囲第１〜10のいずれか１項記載の（１→３，１→４）−β−グル
カナーゼをコードする配列を有するDNA 分子。
12．請求の範囲第11項記載のDNA 分子を含んで成るプラスミド。
【手続補正書】特許法第１８４条の８
【提出日】１９９５年９月２１日
【補正内容】
請求の範囲
１．増強された熱安定性及び／又はpH安定性の植物（１→３，１→４）−β−
グルカナーゼ酵素であって、異なった基質特異性の非相同タンパク質配列の移行
により変性されている酵素。
２．植物（１→３，１→４）−β−グルカナーゼであって、前記酵素のアミノ
酸配列が：
（ａ）植物（１→３）−β−グルカナーゼの構造要素を含むように変性され、
ここで前記構造要素が改良された熱安定性を付与し；
（ｂ）ヘリックスを安定化するために、折たたまれたタンパク質の結合エネル
ギーを高めるために、水素結合を高めるために、そして／又はグリケーションを
妨げるために活性部位以外の部位で変性され；又は
（ｃ）Ｃ及びＮ末端を通してジスルフィド結合を形成できるシステイン対を創
造することによって変性されていることを特徴とする植物（１→３，１→４）−
β−グルカナーゼ。
３．複数の変性（ａ）〜（ｃ）が存在する請求の範囲第２項記載の（１→３，
１→４）−β−グルカナーゼ。
４．前記酵素（１→３）−β−グルカナーゼの構造骨格及び（１→３，１→４
）−β−グルカナーゼの触媒部位の要素を含んで成る請求の範囲第１項記載の（
１→３，１→４）−β−グルカナーゼ。
５．請求の範囲第２項記載の変性（ｂ）及び／又は変性（ｃ）をさらに含んで
成る請求の範囲第４項記載の（１→３，１→４）−β−グルカナーゼ。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｎ 9/24
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(71)出願人 エルエー トローブ ユニバーシティ
オーストラリア国，ビクトリア 3083，バ
ンドゥーラ，プレンティー ロード（番地
なし)
(72)発明者 バージース，ジョゼフ ヌーズマリー
オーストラリア国，ビクトリア 3067，ブ
ランズウィック，ニコルソン ストリート
179
(72)発明者 ギャレット，トーマス ピーター ジョン
オーストラリア国，ビクトリア 3056，ブ
ランズウィック，グレイ ストリート ２
(72)発明者 フィンチャー，ジョフリー ブルース
オーストラリア国，サウス オーストラリ
ア 5068，リーブルック，ロチェスター
ストリート ５
(72)発明者 ホイ，ピーター ボーディアー
オーストラリア国，ビクトリア 3084，ヘ
イデルバーグ，アンドリュース ストリー
ト １
(72)発明者 チェン，リン
オーストラリア国，ビクトリア 3083，キ
ングスバリー，キャッシュ ストリート
８