KR101189613B1

KR101189613B1 - 테아닌의 제조법

Info

Publication number: KR101189613B1
Application number: KR1020077001224A
Authority: KR
Inventors: 유키타카 오카다; 마코토 오제키; 노부유키 아오이
Original assignee: 타이요 카가꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2004-06-28
Filing date: 2005-06-22
Publication date: 2012-10-10
Also published as: US8211674B2; JPWO2006001296A1; CA2570828A1; AU2005257281B2; CA2570828C; EP1764416A1; CN1977047A; AU2005257281A1; TW200605873A; JP4874105B2; KR20070026823A; CN1977047B; WO2006001296A1; US20070224667A1; EP1764416A4; TWI359014B

Abstract

본 발명은, 테아닌의 효율적인 신규제조법을 제공하여, 부산물이 적고 간단하고 또한 공업적으로 유리한 테아닌 생산을 가능하게 하는 것을 목적으로 한다. 글루타민과 에틸아민 유도체의 혼합물에, 바실루스(Bacillus)속, 곰팡이(특히, 아스퍼질러스(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)속, 리조푸스(Ｒｉｚｏｐｕｓ)속, 무코르(Ｍｕｃｏｒ)속) 또는 효모(특히, 한세눌라(Ｈａｎｓｅｎｕｌｌａ)속, 사카로마이세스(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)속, 칸디다(Ｃａｎｄｉｄａ)속) 유래 중 일종 또는 이종(두가지 종류)이상의 미생물 유래의 글루타미나아제를 사용함으로써 상기 과제가 해결된다.

Description

테아닌의 제조법{METHOD OF PRODUCING THEANINE}

본 발명은, 테아닌(theanine)의 신규한 제조법에 관한 것이다.

테아닌은 녹차 맛의 주요성분으로서 알려져 있고, 차를 비롯한 식품의 향기성분으로서 중요한 물질이다. 테아닌을 포함하는 γ-글루타밀 유도체(γ-glutamyl derivative)는, 동물 및 식물체에 있어서 생리활성물질(生理活性物質)로서 작용한다고 지적되고 있다. 예를 들면 Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ., 19(7) 1301-1307(1971)에는, 테아닌이나 L-글루타민(L-glutamine)이 카페인에 의해 유발되는 경련에 길항(拮抗)한다고 보고되어 있다. 이것으로부터 이들의 화합물이 중추 신경계에 작용한다고 생각되어 생리활성물질로서의 유용성이 기대되고 있다.

종래부터 테아닌의 제조방법으로서는, 옥로(玉露; 차의 종류 중의 하나)의 생산용 차밭에서 얻어지는 테아닌을 함유하는 차잎 건조물에서 추출하는 방법이 일반적이다. 그러나 이 방법을 사용했을 경우에 다음의 두개의 단점이 있다. 즉 (1)테아닌은 차잎 건조물당 불과 1.5% 전후 정도밖에 축적되지 않는다는 것 및 (2)일반의 엽차용 차밭에서는 광합성이 활발하기 때문에 합성된 테아닌이 신속하게 분해되어 축적량이 적다는 것이다. 따라서 차잎 건조물로부터의 추출법으로는 공업적으로 충분한 양의 테아닌을 생산하는 것이 어렵고 실용적이지 않다는 것이 지적되고 있다.

이러한 것으부터 공업적 생산방법의 개발이 기대되고 있어, 그 하나로서 테아닌을 화학적으로 유기합성하는 방법이 보고되어 있다(상기 : Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ., 19(7) 1301-1307(1971)). 그러나 이 유기합성 반응은 수율이 낮고 합성물의 분리 정제 등에 있어서 번잡한 조작을 필요로 한다고 하는 문제점이 지적되고 있다.

또한 다른 공업적 생산방법으로서, 슈도모나스속(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ屬) 유래의 글루타미나아제(glutaminase)의 γ-글루타밀기 전이반응(γ-glutamyl基轉移反應)을 이용하여 L-글루타민과 에틸아민으로부터 테아닌을 합성하는 효소법이 보고되어 있다(일본국 공개특허공보 특개평11-225789). 게다가 이 효소를 담체(擔體)에 고정화한 효소법이 개발되어 있다(일본국 공개특허공보 특개평5-328986). 그러나 슈도모나스(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)속 유래의 글루타미나아제를 사용한 경우에는, 테아닌을 합성하는 반응과 함께 가수분해반응에 의해 L-글루타민산(L-glutamic acid)이 부반응물로서 합성되어 버린다. 이 때문에 부산물로서의 Ｌ-글루타민산이 테아닌 정제를 번잡하게 한다고 하는 문제점이 있다.

[특허문헌1] 일본국 공개특허공보 특개평11-225789호 공보

[특허문헌2] 일본국 공개특허공보 특개평5-328986호 공보

[비특허문헌1]Ｃｈｅｍ．Ｐａｒｍ．Ｂｕｌｌ., 19(7) 1301-1307(1971)

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

본 발명은 상기 문제를 고려하여 이루어진 것으로서, 그 목적은 테아닌의 효율적인 제조법을 제공하는 것에 있다.

[발명의 구성]

발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 바실루스(Bacillus)속, 곰팡이 또는 효모 중 일종(一種) 또는 이종(二種; 두 가지 종류) 이상의 미생물 유래의 글루타미나아제를 사용하여, 테아닌을 고수율로 합성할 수 있고 또한 부산물이 극히 소량인 것을 찾아내어 기본적으로는 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉 본 발명의 요지는 글루타민과 에틸아민 유도체의 혼합물에, 바실루스(Bacillus)속, 곰팡이 또는 효모 중 일종 또는 이종(두가지 종류)이상의 미생물 유래의 글루타미나아제를 작용시키는 것을 특징으로 하는 테아닌의 제조법에 관한 것이다.

도1은　 바실루스(Bacillus)속 유래의 글루타미나아제 및 슈도모나스(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)속 유래의 글루타미나아제를 사용하여 L-글루타민과 에 틸아민으로부터 테아닌을 효소 합성했을 때의 합성 테아닌량, 글루타민산량을 나타낸 표이다.

도2는 곰팡이 유래의 글루타미나아제 및 슈도모나스(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)속 유래의 글루타미나아제를 사용하여 L-글루타민과 에틸아민으로부터 테아닌을 효소 합성했을 때의 합성 테아닌량, 글루타민산량을 나타낸 표이다.

도3은 효모 유래의 글루타미나아제 및 슈도모나스(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)속 유래의 글루타미나아제를 사용하여 L-글루타민과 에틸아민으로부터 테아닌을 효소 합성했을 때의 합성 테아닌량, 글루타민산량을 나타낸 표이다.

도4는 테아닌 표품 및 단리물질의 ＩＲ스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

다음에 본 발명의 실시예에 대해서 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 하기의 실시예에 의해 한정되는 것이 아니라 그 요지를 변경하지 않고 다양하게 개변해서 실시할 수 있다. 또한 본 발명의 기술적 범위는 균등한 범위에까지 미치는 것이다.

본 발명에 사용되는 테아닌은, 차의 잎에 포함되어 있는 글루타민산 유도체로서 차의 맛의 주성분이며 맛을 발전시키는 것을 용도로 하는 식품첨가물로서 사용되고 있다. 구체적으로는, γ-글루타밀에틸아미 드(glutamilethylamide), L-글루타민산-γ-에틸 아미드 등으로 부르는 화합물이다.

본 발명에 사용되는 에틸아민 유도체는, 에틸아민(ethylamine), 에틸아민 염산염(ethylamine hydrochloride), 에틸아민 염화금산염(ethylamine chloroaurate), 에틸아민 지방산염(ethylamine fatty acid salt), 에틸아민 피크레이트(ethylamine picrate), 에틸아민의 Ｎ-벤젠술포닐(benzenesulfonyl) 화합물, 에틸아민의 Ｎ-p-톨루엔술포닐(toluenesulfonyl) 화합물 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지는 않는다. 또한 특히 이들 중에 에틸아민, 에틸아민 염산염을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서의 글루타미나아제는, L-글루타민을 가수분해 해서 L-글루타민산을 생성하는 글루타미나아제 활성을 구비하고, 된장/간장 등의 발효식품의 맛의 향상·발현에 사용되고 있는 것이다. 글루타미나아제는, 알칼리 조건하에 있어서 γ-글루타밀 전이 활성이 가수분해 활성보다 높아지는 것이 알려져 있어, 테아닌을 비롯한 알킬아미드(alkylamide)의 합성에도 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 글루타미나아제 활성은, L-글루타민을 기질(基質)로 하여 효소를 작용시켜 생성되는 Ｌ-글루타민산을 정량함으로써 측정된다. 생성된 Ｌ-글루타민산 양은, 시판되는 키트(kit) 예를 들면 F 키트 L-글루타민산(Roche Diagnostics사)을 사용해 측정할 수 있다. 본 효소의 단위로서는 1분간 당 1μｍol의 글루타민산을 생성하는 효소량을 「ｍＵ」으로 정의했다. 또한 이 정의를 사용하여 용액 중의 단백질 1mg당의 효소량을 글루타미나아제 비활성 「ｍＵ/ｍｇ」로 정의했다.

본 발명에 있어서의 바실루스(Bacillus)속은, 세포형태학적으로 그람양성의 호기성균(gram positive aerobic bacteria), 간균(bacillus), 아포형성능(sporulatability), 운동성을 구비하는 등의 여러 가지 성질을 구비하는 미생물이다.

본 발명에 있어서의 바실루스(Bacillus)속 유래의 글루타미나아제의 기원은 특별하게 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 바실루스 서브틸리스(Bacillus　subtilis),　 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus　amyloliquefaciens),　 바실루스 코아귤란스(Bacillus　coagulans),　 바실루스 렌투스(Bacillus　lentus),　 바실루스 리첸니포르미스(Bacillus　licheniformis),　 바실루스 폴리믹사(Bacillus　polymixa),　 바실루스 스테아로서모필루스(Bacillus　stearothermophilus),　 바실루스 서모프로테오라이티쿠스(Bacillus　thermoproteolyticus) 유래의 효소이다. 글루타미나아제 비활성이 특히 높은 균이 바람직하다고 하는 관점에서 보면, 가장 바람직하게는 바실루스 서브틸리스(Bacillus　subtilis),　 바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus　amyloliquefaciens) 유래의 글루타미나아제이다.

또한 바실루스(Bacillus)속 유래의 글루타미나아제는, 바이오테크놀로지(biotechnology)를 응용하여 유전자 재조합(gene recombination) 등의 개변균(modified bacteria)에 의해 제조한 것도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 곰팡이(mold)는, 진균류 중에서 균사(菌絲)가 서로 얽힌 부정형의 집합체를 이르는 총칭이며, 조균류(藻菌類; Phycomycetes), 자낭균류(子囊菌類; Ascomycetes)의 대부분 및 담자균류(擔子菌類; Basidiomycetes)의 일부에서 찾아 볼 수 있다.

본 발명에 있어서의 곰팡이 유래의 글루타미나아제의 기원은 특별하게 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus　oryzae), 　아스퍼질러스 나이거(Aspergillus　niger),　 페니실리움 노타툼(Penicillium　notatum), 　리조푸스 스톨로니퍼(Rizopus　stolonifer), 　무코르 스포노수스(Mucor　sponosus) 유래의 효소이다. 글루타미나아제 비활성이 특히 높은 균이 바람직하다고 하는 관점에서 가장 바람직하게는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus　oryzae),　아스퍼질러스 나이거(Aspergillus　niger) 유래의 글루타미나아제이다.

또한 곰팡이 유래의 글루타미나아제는, 바이오테크놀로지를 응용하여 유전자 재조합 등의 개변균에 의해 제조한 것도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 효모는 자낭균류에 속하는 균류이다. 엽록소를 포함하지 않고 출아(出芽)에 의해 번식되지만 분열에 의한 것도 있다. 주류, 간장, 빵 등의 제조에 이용된다.

본 발명에 있어서의 효모 유래의 글루타미나아제의 기원은 특별하게 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces　cerevisiae),　 사카로마이세스 룩시(Saccharomyces　rouxii), 　 칸디다 유틸리스(Candida　utilis),　 칸디다 안타륵티카(Candida　antarctica), 　한세눌라 아노말라(Hansenulla　anomala),　 쉬조사카로마이세스 옥토스포루스(Schizosaccaromyces　octosporus) 유래의 효소이다. 글루타미나아제 비활성이 특히 높은 균이 바람직하다고 하는 관점에서 보면, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces　cerevisiae),　 사카로마이세스 룩시(Saccharomyces　rouxii),　 칸디다 유틸리스(Candida　utilis),　 칸디다 안타륵티카(Candida　antarctica) 유래의 글루타미나아제이다.

또한 효모 유래의 글루타미나아제는, 바이오테크놀로지를 응용하여 유전자 재조합 등의 개변균에 의해 제조한 것도 사용할 수 있다.

상기 바실루스(Bacillus)속, 곰팡이, 효모 등의 미생물 유래의 글루타미나아제로서는, (1)미생물 그 자체 또는 (2)미생물로부터 추출되는 정제하지 않은 효소(crude enzyme)를 사용할 수도 있다. 그러나 테아닌 전환율의 관점에서 보면, 미생물로부터 글루타미나아제를 정제해서 사용하는 것이 바람직하다. 글루타미나아제의 정제 방법은 공지의 어떠한 효소정제법을 사용해도 좋다. 예를 들면 칼럼 크로마토그래피(column chromatography), 용매를 사용한 분배, 투석, 한외여과(限外濾過; ultrafiltration), 전기영동(electrophoresis), 중성염(中性鹽)에 의한 분별염석(分別鹽析), 알콜, 아세톤을 사용하는 분별침전법(fractional precipitation), ＨＰＬＣ(high performance liquid chromatography) 등을 예시할 수 있다. 이 중 용매 분배 및 각종 크로마토그래피, ＨＰＬＣ을 조합시켜 글루타미나아제를 정제하 는 것이 바람직하다. 또한 ＣＭ-셀룰로오스 칼럼 크로마토그래피(cellulose column chromatography), 세파덱스(sephadex) G150 칼럼 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 칼럼 크로마토그래피, 부틸-토요펄(butyl-Toyopearl) 칼럼 크로마토그래피를 조합시켜도 좋다.

이렇게 해서, 본 발명에 관한 테아닌의 제조법에 있어서는, 바실루스(Bacillus)속, 페니실리움(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ)속, 리조푸스(Ｒｉｚｏｐｕｓ)속, 무코르(Ｍｕｃｏｒ)속, 아스퍼질러스(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)속, 한세눌라(Ｈａｎｓｅｎｕｌｌａ)속, 쉬조사카로마이세스(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ)속, 칸디다(Ｃａｎｄｉｄａ)속 중에서 일종(一種) 또는 이종(二種) 이상의 미생물 유래의 글루타미나아제를 글루타민과 에틸아민 유도체에 작용시키는 것이 바람직하다. 이 경우에 (1)이들 미생물의 배양 상청액(上淸液; supernatant)의 글루타미나아제 비활성이 10ｍＵ/ｍｇ 이상이 되는 조건에서 배양한 것인 경우가 바람직하고, 또 (2)글루타미나아제에 대해서는, 본 발명에 있어서의 주산물인 테아닌과 부산물인 글루타민산의 비(테아닌/글루타민산)가 5보다 큰 것을 사용하는 것이 부산물을 경감시키는 점에서 바람직하다.

본 발명에 있어서의 테아닌 효소 합성시의 액성은 특별하게 한정되는 것은 아니지만, ｐＨ는 약 9~12가 바람직하고 약 10~11이 더 바람직하다. 또한 반응 온도는 특별하게 한정되는 것은 아니지만 약 0도~45도가 바람직하고 약 4도~30도가 더 바람직하다. 기질로서 사용하는 Ｌ-글루타 민, 에틸아민 유도체 농도는 특별하게 한정되는 것은 아니지만, L-글루타민 약 0.1mol 이상, 에틸아민 유도체 약 1mol 이상이 바람직하다. 본 발명에 있어서의 Ｌ-글루타민은, 순수한 Ｌ-글루타민을 포함하는 것 이외에 L-글루타민 나트륨염 등 적당한 무기염 혹은 유기염을 포함한다.

본 발명의 방법에 의해 합성된 테아닌을 반응액으로부터 단리정제(單離精製)하는 것에는 공지의 어떤 아미노산 정제법을 사용해도 좋아서, 예를 들면 칼럼 크로마토그래피, 용매를 사용한 분배, 투석, 결정화(crystallization), 한외여과, 전기영동, 중성염에 의한 분별염석, 알콜, 아세톤을 사용한 분별침전법, ＨＰＬＣ 등을 예시 할 수 있다. 이 중에서 용매분배 및 각종 크로마토그래피, ＨＰＬＣ을 조합시키는 것이 바람직하다. 또한 ＣＭ-셀룰로오스 칼럼 크로마토그래피, 세파덱스 G150 칼럼 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피, 부틸-토요펄 칼럼 크로마토그래피를 조합시켜도 좋다.

본 발명에 있어서의 담체(擔體)로는 글루타미나아제를 고정화 하는 것으로서, 예를 들면 셀리트(Celite), 규조토, 고령석(kaolinite), 실리카겔(silica gel), 몰레큘러시브(molecular sieves), 다공질 글라스(porous glass), 활성탄, 탄산칼슘, 세라믹스 등의 무기 담체(inorganic carrier), 세라믹스 파우더(ceramic powder), 폴리비닐 알콜, 폴리프로필렌, 키토산(chitosan), 이온교환수지, 소수흡착수지, 킬레이트수지(chelate resin), 합성흡착수지 등의 유기고분자 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

이하, 실시예 및 시험예를 통해 본 발명을 더 상세하게 설명한다. 이들은 본 발명의 실시예의 일부로서, 본 발명은 당해 실시예 및 시험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예1　

바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 글루코오스 0.3%, 폴리펩톤 3.0%, 효모 엑기스 1.0%, 염화나트륨 0.5%을 포함하는 ｐＨ7.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에, 염용액에 의한 용리(溶離; elution)에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(Amersham Bioscience(주))을 사용하여 농축 및 탈염(脫鹽)을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 67ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예2　

바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus　amyloliquefaciens)를 글루코오스 0.3%, 폴리펩톤 3.0%, 효모 엑기스 1.0%, 염화나트륨 0.5%을 포함하는 ｐＨ 7.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 53ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예3　

바실루스 코아귤란스(Bacillus　coagulans)를 글루코오스 0.3%, 폴리펩톤 3.0%, 효모 엑기스 1.0%, 염화나트륨 0.5%을 포함하는 ｐＨ7.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 43ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예4　

바실루스 리첸니포르미스(Bacillus　licheniformis)를 글루코오스 0.3%, 폴리펩톤 3.0%, 효모 엑기스 1.0%, 염화나트륨 0.5%을 포함하는 ｐＨ7.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 40ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예5　

바실루스 세레우스(Bacillus　cereus)를 글루코오스 0.3%, 폴리펩톤 3.0%, 효모 엑기스 1.0%, 염화나트륨 0.5%을 포함하는 ｐＨ7.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 5ｍＵ/ｍｇ이었다.

비교예1　 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas　nitroreducens) 유래의 정제 글루타미나아제의 조제　

슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas　nitroreducens)를, 글루탐산나트륨(sodium glutamate) 0.6%, 효모 엑기스 0.1%, 글루코오스 1.0%, ＫＨ₂ＰＯ₄0.05%, K₂ＨＰＯ₄0.05%, ＭｇＳＯ₄·7H₂O　0.07%, ＥＤＴＡ-Ｆｅ　0.01%을 포함하는 배양액(ｐＨ7)을 사용하여, 30L 발효조(jar fermenter)-(30L, 통기 1ｖｖｍ=25L/분, 회전수 2,000ｒｐｍ)에서 약 20시간 배양했다. 얻어진 배양액 175L의 균체를 세정 후에, 30ｍＭ 인산칼륨완충액(ｐＨ7.0) 7.5L에 현탁(懸濁)하고 5~20도에서 초음파 파쇄하여 균체 파쇄물(crushed bacterial cells)을 얻었다.

7% 암모니아수로 ｐＨ를 7로 조정하면서 균체 파쇄물을 황산 암모늄으로 분류(fractionate)를 하고, 45~90% 포화 프랙션(saturation fraction)을 얻었다. 이것을 0.01M 인산칼륨완충액에 녹이고 같은 완충액에 대하여 투석했다. ＤＥＡＥ-셀룰로오스 칼럼(15×60cm)에 흡착시키고 글루타미나아제를 0.1M의 식염(食鹽)을 포함하는 완충액으로 용출(溶出; elute)하여, 글루타미 나아제 액을 얻었다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 15ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예6 정제 글루타미나아제에 의한 테아닌의 효소 합성

정제 글루타미나아제(0.1ｍＬ)를 사용하여 기질용액 10ｍＬ(0.5M　L-글루타민 및 여러 가지 농도의 에틸아민)을 ｐＨ10.0, 온도 30도의 조건에서 테아닌의 효소 합성을 했다.

실시예7　ＨＰＬＣ에 의한 테아닌량 및 글루타민산량의 정량

테아닌의 효소 합성을 한 효소반응액 중의 테아닌량 및 글루타민산량은, 반응액을 적당하게 희석한 후에 ＨＰＬＣ에 걸어 정량 했다. 얻어진 테아닌량(ｍｏｌ/L) 및 글루타민산량(ｍｏｌ/L)을 이용하여 기질의 글루타민량(ｍｏｌ/L)으로부터의 mol 전환율(％)을 계산했다.

ＨＰＬＣ의 정량조건은 밑의 표와 같다.

[표1]

분석 칼럼 : Develosil ODS HG-5/노무라 가가쿠 가부시키가이샤

검출기 : Waters2487 듀얼λ UV/VIS검출기/Waters

테아닌 표품 : L-테아닌/구리타고교 가부시키가이샤

내부표준물질: 니코틴아미드/나카라이 테스크

이동상(移動相):순수한 물:메탄올:트리플루오로아세트산=980 : 20 : 1

시험예1　바실루스(Bacillus)속 유래의 글루타미나아제 및 슈도모나스(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)속 유래의 글루타미나아제에 의한 테아닌 효소 합성

실시예1~실시예5 및 비교예1에서 얻은 각 미생물 유래의 글루타미나아제를 사용하여 실시예6의 조건으로 테아닌 효소 합성 시험을 하였다. 시험 후의 테아닌량 및 글루타민산량은 실시예7의 조건으로 측정했다. 시험의 결과를 도1에 나타냈다.

실시예1~실시예5 및 비교예1의 어느 하나의 글루타미나아제를 사용한 경우에도, L-글루타민으로부터 테아닌으로의 mol 전환율은 50% 이상이었다. 특히, 실시예1~실시예4의 글루타미나아제의 mol 전환율은 각각 78%, 76%, 72% 및 70% 라고 하는 높은 값이었다. 한편 L-글루타민으로부터 L-글루타민산으로의 mol 전환율(부산물의 생산)은 실시예1~실시예4의 글루타미나아제에서는 6% 이하의 낮은 값이었지만, 실시예5 및 비교예1의 글루타미나아제에서는 15% 이상의 높은 값을 나타냈다. 글루타미나아제를 사용해서 테아닌을 합성하는 경우에는, 테아닌으로의 mol 전환율이 높은 것에 더하여 부산물인 Ｌ-글루타민산으로의 mol 전환율이 낮은 것이 바람직하다. 그렇게 하면 테아닌의 정제공정을 간단하게 할 수 있다. 본 시험예에 있어서 이러한 조건을 만족시키기 위해서는, 바실루스(Bacillus)속 유래의 글루타미나아제로서 그 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성이 10ｍＵ/ｍｇ 이상의 것을 사용하는 것이 바람직하다.

실시예8 　

아스퍼질러스 오리재(Aspergilus　oryzae)를 맥아추출물(Malt　extract) 2.0%, 글루코오스 2.0%, 펩톤 0.1%, 효모엑기스(Yeast extract) 0.1%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 42ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예9　

아스퍼질러스 나이거(Aspergilus　niger)를 맥아추출물 2.0%, 글루코오스 2.0%, 펩톤 0.1%, 효모엑기스 0.1%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 39ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예10　

리조푸스 스톨로니퍼(Rizopus　stolonifer)를 맥아추출물 2.0%, 글루코오스 2.0%, 펩톤 0.1%, 효모엑기스 0.1%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 15ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예11　

무코르 스포노수스(Mucor　sponosus)를 맥아추출물 2.0%, 글루코오스 2.0%, 펩톤 0.1%, 효모엑기스 0.1%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 5ｍＵ/ｍｇ이었다.

시험예2 곰팡이 유래의 글루타미나아제 및 슈도모나스(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)속 유래의 글루타미나아제에 의한 테아닌 효소 합성

실시예8~실시예11 및 비교예1에서 얻은 각 미생물 유래의 글루타미나아제를 사용하여 실시예6의 조건으로 테아닌 효소 합성 시험을 하였다. 시험 후의 테아닌량 및 글루타민산량은 실시예7의 조건으로 측정했다. 시험의 결과를 도2에 나타냈다.

실시예8~실시예11 및 비교예1의 어느 하나의 글루타미나아제를 사용한 경우에도, L-글루타민으로부터 테아닌으로의 mol 전환율은 50% 이상이었다. 특히, 실시예8 및 실시예9의 글루타미나아제의 mol 전환율은 각각 72% 및 73% 라고 하는 높은 값이었다. 한편 L-글루타민으로부터 L-글루타민산으로의 mol 전환율(부산물의 생산)은, 실시예8 및 실시예9의 글루타미나아제에서는 5% 이하의 낮은 값이었지만, 비교예1의 글루타미나아제에서는 10% 라고 하는 높은 값이었다. 글루타미나아제를 사용해서 테아닌을 합성하는 경우에는, 테아닌으로의 mol 전환율이 높은 것에 더하여 부산물인 Ｌ-글루 타민산으로의 mol 전환율이 낮은 것이 바람직하다. 그렇게 하면 테아닌의 정제공정을 간단하게 할 수 있다. 본 시험예에 있어서 이러한 조건을 만족시키기 위해서는, 곰팡이 유래(특히, 아스퍼질러스(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)속, 리조푸스(Ｒｉｚｏｐｕｓ)속, 무코르(Ｍｕｃｏｒ)속)의 글루타미나아제로서, (1)그 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성이 10ｍＵ/ｍｇ 이상의 것 또는 (2)L-글루타민으로부터의 mol 전환율에 있어서, 본 실시예에 있어서의 주산물인 테아닌과 부산물인 글루타민산의 비(테아닌/글루타민산의 비 = X)가 X> 5인 것을 사용하는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다.

실시예12　

사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces　cerevisiae)를 맥아추출물 0.3%, 효모엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글루코오스 1.0%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 45ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예13　

사카로마이세스 룩시(Saccharomyces　rouxii)를 맥아추출물 0.3%, 효모엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글루코오스 1.0%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 40ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예14　

칸디다 유틸리스(Candida　utilis)를 맥아추출물 0.3%, 효모엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글루코오스 1.0%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도 를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 30ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예15　

칸디다 안타륵티카(Candida　antarctica)를 맥아추출물 0.3%, 효모엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글루코오스 1.0%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 25ｍＵ/ｍｇ이었다.

실시예16　

한세눌라 아노말라(Hansenulla　anomala)를 맥아추출물 0.3%, 효모엑기스 0.3%, 펩톤 0.5%, 글루코오스 1.0%을 포함하는 ｐＨ5.0의 배지에서 30도의 온도에서 배양했다. 얻어진 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 얻었다. 이 배양 상청액에 차가운 에탄올을 첨가하여 얻어진 침전을 원심분리하여 회수했다. 얻어진 침전물을 인산완충용액(ｐＨ7.0)에 용해하고 투석을 했다. 투석액은 DEAE-세파로스 패스트 플로우(ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ)를 사용해서 흡착한 후에 염용액에 의한 용리에 의해 단백질의 순도를 높였다. 얻어진 글루타미나아제 용액을 ＵＦ막(ＵＦＰ-5-C-3MA)(아머샴바이오사이언스(주))을 사용하여 농축 및 탈염을 하여 정제 글루타미나아제를 얻었다. 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성은 15ｍＵ/ｍｇ이었다.

시험예3 효모 유래의 글루타미나아제 및 슈도모나스(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ)속 유래의 글루타미나아제에 의한 테아닌 효소 합성

실시예12~실시예16 및 비교예1에서 얻은 각 속 유래의 글루타미나아제를 사용하여 실시예6의 조건으로 테아닌 효소 합성 시험을 하였다. 시험 후의 테아닌량 및 글루타민산량은 실시예7의 조건으로 측정하였다. 시험의 결과를 도3에 나타냈다.

실시예12~실시예16 및 비교예1의 어느 하나의 글루타미나아제를 사용한 경우에도, L-글루타민으로부터 테아닌으로의 mol 전환율은 50% 이상이었다. 특히, 실시예12~실시예15의 글루타미나아제의 mol 전환율은 각각 70% 이상이라고 하는 높은 값이었다. 한편 L-글루타민으로부터 L-글루타민산으로의 mol 전환율(부산물의 생산)은, 실시예12~실시예15의 글루타미나아제에서는 어느 것이나 낮은 값이었지만, 비교예1의 글루타미나아제에서는 10%라고 하는 높은 값이었다. 글루타미나아제를 사용해서 테아닌을 합성하는 경우에는, 테아닌으로의 mol 전환율이 높은 것에 더하여 부산물인 Ｌ-글루타민산으로의 mol 전환율이 낮은 것이 바람직하다. 그렇게 하면 테아닌의 정제공 정을 간단하게 할 수 있다. 본 시험예에 있어서 이러한 조건을 만족시키기 위해서는, 효모(특히, 사카로마이세스(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)속, 칸디다(Ｃａｎｄｉｄａ)속) 유래의 글루타미나아제로서, 그 배양 상청액의 글루타미나아제 비활성이 10ｍＵ/ｍｇ 이상의 것을 사용하는 것이 바람직하다.

실시예17 키토펄(CHITOPEARL)4010을 사용한 고정화 글루타미나아제의 조제

키토산(chitosan) 비즈(beads)인 시판품(市販品)의 키토펄4010(후지방적(주))을 50ｍＭ 인산나트륨완충액(ｐＨ7.4)에 24시간 침지(浸漬)시켰다. 이 평형화(equilibration) 후 키토펄4010의 10ｍＬ을 실시예3에서 조제한 글루타미나아제(15mg/ｍＬ) 25ｍＬ에 침지시키고 약 2시간 진탕(振蕩; shake)하였다. 그 후에 부착액을 제거한 키토펄4010을 2.5% 글루타알데히드(glutaraldehyde) 용액에 넣고 또 2시간 진탕하였다. 글루타알데히드 처리 후, 30배의 50ｍＭ 인산나트륨완충액(ｐＨ7.4)을 사용해서 흡광도(280ｎｍ)가 0.01 이하가 될 때까지 세정하여 칼럼에 충전(充塡)했다.

실시예18 고정화 글루타미나아제에 의한 효소반응

실시예17에서 조정한 고정화 글루타미나아제를 사용하여, 기질용액(4% 글루타민, 25% 에틸아민　ｐＨ10.0)을 30도, ＳＶ=0.2의 유속으로 통과하게 하였을 경우에, 70%의 수율로 테아닌을 얻을 수 있었다.

실시예19 음이온교환수지를 사용한 고정화 글루타미나아제의 조제

실시예3에서 얻어진 정제 글루타미나아제(15mg/ｍＬ) 25ｍＬ에 대하여, 음이온교환수지인 다이아이온ＨＰＡ25(미쓰비시화학(주))를 10ｍＬ 첨가 후에 약 2시간 진탕하였다. 그 후에 부착액을 제거한 ＨＰＡ25를 2.5% 글루타알데히드 용액에 넣고 또 2시간 진탕하였다. 글루타알데히드 처리 후에 30배의 50ｍＭ 인산나트륨완충액(ｐＨ7.4)을 사용해서 흡광도(280ｎｍ)가 0.01 이하가 될 때까지 세정하여 칼럼에 충전했다.

실시예20 고정화 글루타미나아제에 의한 효소반응

실시예19에서 조정한 고정화 글루타미나아제를 사용하여, 기질용액(4% 글루타민, 25% 에틸아민　ｐＨ10.0)을 30도, ＳＶ=0.2의 유속으로 통과하게 하였을 경우에, 75%의 수율로 테아닌을 얻을 수 있었다.

실시예21 테아닌의 정제

테아닌의 반응액으로부터의 단리정제(單離精製; isolation and refinement)는, 반응액에서 에틸아민을 감압 농축함으로써 제거한 후에 ＲＯ막에 의한 탈염을 하고, 그 후 Ｄｏｗｅｘ50 × 8, Ｄｏｗｅｘ1 × 2 칼럼 크로마토그래피에 걸고 이것을 에탄올 처리 함으로써 이루어졌다.

이 단리물질을 아미노산 아날라이저(amino acid analyzer), 페이퍼 크로마토그래피(paper chromatography)에 걸었을 때, 테아닌 표준물질과 같은 거동을 나타내었다. 또한 단리물질을 염산 혹은 글루타미나아제로 가수분해 처리를 하였을 때에 1:1의 비율로 L-글루타민산과 에틸아민이 생겼다. 이와 같이 단리물질이 글루타미나아제에 의해 가수분해 된 것으로부터, 에틸아민이 L-글루타민산의 γ위(位)에 결합한 것을 알 수 있다. 또한 가수분 해에 의하여 발생한 Ｌ-글루타민산이 Ｌ형인 것은, L-글루타민산 데히드로게나아제(Dehydrogenase)(ＧｌｕＤＨ)에 의해 확인되었다. 도4에는, 테아닌 표품(標品) 및 단리물질의 ＩＲ스펙트럼을 나타냈다. 양쪽 물질은 모두 동등한 스펙트럼을 나타냈다. 이것으로부터 단리물질이 테아닌인 것이 확인되었다.

본 발명에 의하면, 테아닌의 효율적인 신규 제조법을 제공하여 간단하고 또한 공업적으로 유리한 생산을 가능하게 할 수 있다. 즉 바실루스(Bacillus)속, 곰팡이 또는 효모 중 일종 또는 이종 이상의 미생물 유래의 글루타미나아제를 사용함으로써, 종래보다 높은 테아닌으로의 전환율을 보이고 공업적인 생산이 가능하게 된다.

Claims

테아닌(theanine)을 제조하는 방법으로서,

바실루스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 리조푸스 스톨로니퍼(Rizopus stolonifer), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 룩시(Saccharomyces rouxii), 칸디다 유틸리스(Candida utilis) 및 칸디다 안타륵티카(Candida antarctica)로 이루어지는 군으로부터 선택된 일종(一種) 또는 이종(二種) 이상의 미생물 유래의 글루타미나아제(glutaminase)를 사용하고,

상기 글루타미나아제를 글루타민(glutamine)과 에틸아민(ethylamine) 유도체에 작용시키는 테아닌을 제조하는 제조방법에 있어서, (i)상기 미생물의 배양 상청액(supernatant)의 글루타미나아제 비활성이 10mU/mg 이상, (ii)상기 글루타미나아제는, 주산물(主産物)인 테아닌과 부산물(副産物)인 글루타민산(glutamic acid)의 몰 비(mol 比)(테아닌/글루타민산)가 5보다 크고, (iii)테아닌 효소 합성시의 pH가 9~12이고, 또한

L-글루타민으로부터 테아닌으로의 몰(mol) 전환율이 70% 이상, 및

L-글루타민으로부터 글루타민산으로의 몰 전환율이 6% 이하인

것을 특징으로 하는 테아닌의 제조법.
제1항에 있어서,

상기 글루타미나아제가 담체(擔體; carrier)에 고정화 되는 것을 특징으로 하는 테아닌의 제조법.
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