JPH05284983A - Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミドの製造方法 - Google Patents
Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミドの製造方法Info
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- JPH05284983A JPH05284983A JP4089199A JP8919992A JPH05284983A JP H05284983 A JPH05284983 A JP H05284983A JP 4089199 A JP4089199 A JP 4089199A JP 8919992 A JP8919992 A JP 8919992A JP H05284983 A JPH05284983 A JP H05284983A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】本発明は、γ−グルタミルトランスペプチダー
ゼ（ＧＧＴ）活性を有する酵素の存在下に、Ｌ−γ−グ
ルタミル基を有する化合物と低級アルキルアミンもしく
はその塩とを反応させて、テアニンを始めとするＬ−γ
−グルタミル低級アルキルアミドを得る方法を提供す
る。 【効果】本発明の酵素的合成法によれば、短時間で簡単
にしかも高収率で目的とするテアニン乃至その関連物質
を製造できる。
ゼ（ＧＧＴ）活性を有する酵素の存在下に、Ｌ−γ−グ
ルタミル基を有する化合物と低級アルキルアミンもしく
はその塩とを反応させて、テアニンを始めとするＬ−γ
−グルタミル低級アルキルアミドを得る方法を提供す
る。 【効果】本発明の酵素的合成法によれば、短時間で簡単
にしかも高収率で目的とするテアニン乃至その関連物質
を製造できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＬ−γ−グルタミル低級
アルキルアミドの製造方法、より詳しくはγ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ（以下ＧＧＴと略す）活性を有
する酵素を用いて酵素的に上記化合物を合成する新しい
方法に関する。
アルキルアミドの製造方法、より詳しくはγ−グルタミ
ルトランスペプチダーゼ（以下ＧＧＴと略す）活性を有
する酵素を用いて酵素的に上記化合物を合成する新しい
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミ
ド、特にＬ−γ−グルタミルエチルアミドは、茶の旨味
成分としてよく知られている。該テアニンは１９４９年
に酒戸により発見され（農化、２３巻、２６２、１９４
９）、その後、該テアニンを構成成分とするペプチドが
抗菌活性を有することも明らかにされ（Chem.Pharm.Bul
l., 28,3549(1980) ）、該テアニン及びその関連物質と
しての他の一連の低級アルキルアミド類が、食品分野、
医薬品分野等において、興味深い物質として着目されて
いる。
ド、特にＬ−γ−グルタミルエチルアミドは、茶の旨味
成分としてよく知られている。該テアニンは１９４９年
に酒戸により発見され（農化、２３巻、２６２、１９４
９）、その後、該テアニンを構成成分とするペプチドが
抗菌活性を有することも明らかにされ（Chem.Pharm.Bul
l., 28,3549(1980) ）、該テアニン及びその関連物質と
しての他の一連の低級アルキルアミド類が、食品分野、
医薬品分野等において、興味深い物質として着目されて
いる。
【０００３】上記テアニン及びその関連物質の製造法と
しては、古くから化学的合成法、例えばＬ−ピロリドン
酸金属塩を無水アルキルアミンに溶解後、加温してアミ
ド塩とした後、金属を除く方法（特公昭３７−１１６６
１号）やグルタミン酸−γ−エステルを二硫化水素の存
在下にアルキルアミンと反応させてアミドとする方法
（特公昭３９−２３３９２号）等が知られており、最
近、茶の培養細胞を利用する方法（特開平３−１８７３
８８号、Plant Cell Reports, vol.9,65(1990)や、酵母
のエネルギー供給系とグルタミン合成酵素を共存させて
酵素合成する方法（特公昭６３−２８５９６号）等が種
々開発されつつある。
しては、古くから化学的合成法、例えばＬ−ピロリドン
酸金属塩を無水アルキルアミンに溶解後、加温してアミ
ド塩とした後、金属を除く方法（特公昭３７−１１６６
１号）やグルタミン酸−γ−エステルを二硫化水素の存
在下にアルキルアミンと反応させてアミドとする方法
（特公昭３９−２３３９２号）等が知られており、最
近、茶の培養細胞を利用する方法（特開平３−１８７３
８８号、Plant Cell Reports, vol.9,65(1990)や、酵母
のエネルギー供給系とグルタミン合成酵素を共存させて
酵素合成する方法（特公昭６３−２８５９６号）等が種
々開発されつつある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記化
学合成法は合成過程で多くの不純物が生じやすく、反応
時間が長い欠点があり、また培養細胞を利用する方法
は、カルスの調製や培養に長時間が必要である弊害があ
る。微生物起源の酵素を利用する酵素的合成法は、上記
化学合成法に比して優れた利点を有すると考えられる
が、前記提案されたグルタミン合成酵素を利用する方法
は、合成反応にエネルギーの供給（ＡＴＰ）が必要で、
その操作が繁雑となる不利が認められ、尚、実用的な方
法とはいえないものであった。
学合成法は合成過程で多くの不純物が生じやすく、反応
時間が長い欠点があり、また培養細胞を利用する方法
は、カルスの調製や培養に長時間が必要である弊害があ
る。微生物起源の酵素を利用する酵素的合成法は、上記
化学合成法に比して優れた利点を有すると考えられる
が、前記提案されたグルタミン合成酵素を利用する方法
は、合成反応にエネルギーの供給（ＡＴＰ）が必要で、
その操作が繁雑となる不利が認められ、尚、実用的な方
法とはいえないものであった。
【０００５】従って、本発明の目的は従来知られている
テアニン乃至その関連物質の製造法に見られる欠点を全
て解消して、短時間で簡単にしかも高収率で目的とする
物質を製造できる新しい酵素的合成法を確立する点にあ
る。
テアニン乃至その関連物質の製造法に見られる欠点を全
て解消して、短時間で簡単にしかも高収率で目的とする
物質を製造できる新しい酵素的合成法を確立する点にあ
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
より鋭意研究を重ねた結果、本発明者らが先に開発し特
許出願した耐塩性グルタミナーゼ（特開平２−２６１３
７９号公報）がＧＧＴ活性を有することに着目し、該Ｇ
ＧＴ活性を有する酵素の利用によれば容易に短時間で目
的とするテアニン乃至その関連物質が合成できることを
見出し、ここに本発明を完成するに至った。
より鋭意研究を重ねた結果、本発明者らが先に開発し特
許出願した耐塩性グルタミナーゼ（特開平２−２６１３
７９号公報）がＧＧＴ活性を有することに着目し、該Ｇ
ＧＴ活性を有する酵素の利用によれば容易に短時間で目
的とするテアニン乃至その関連物質が合成できることを
見出し、ここに本発明を完成するに至った。
【０００７】即ち本発明は、ＧＧＴ活性を有する酵素の
存在下に、Ｌ−γ−グルタミル基を有する化合物と低級
アルキルアミンもしくはその塩とを反応させてＬ−γ−
グルタミル低級アルキルアミドを得ることを特徴とする
Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミドの製造方法に係
わる。
存在下に、Ｌ−γ−グルタミル基を有する化合物と低級
アルキルアミンもしくはその塩とを反応させてＬ−γ−
グルタミル低級アルキルアミドを得ることを特徴とする
Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミドの製造方法に係
わる。
【０００８】本発明によれば、目的とするＬ−γ−グル
タミル低級アルキルアミドを容易に短時間で効率よく収
得できる。しかるに、従来よりＧＧＴ活性を有する酵素
は、各種起源のものが種々知られているが、之等の殆ど
はペプチドやアミノ酸をアクセプターとする場合の転位
活性につき検討がなされるのみで、その活性もアクセプ
ター特異性のあることが報告されており、各種アミンを
アクセプターとした場合の転位活性については尚充分な
解明はなされていない。本発明は、上記ＧＧＴ活性を有
する酵素、殊に本発明者らの先の研究に係わるバチルス
ズブチリス（Bacillus subtilis ）由来の耐塩性グル
タミナーゼが、上記各種アミンをアクセプターとするＬ
−グルタミル基の転位活性において、所望の優れた特性
を有することを見出し完成されたものである。
タミル低級アルキルアミドを容易に短時間で効率よく収
得できる。しかるに、従来よりＧＧＴ活性を有する酵素
は、各種起源のものが種々知られているが、之等の殆ど
はペプチドやアミノ酸をアクセプターとする場合の転位
活性につき検討がなされるのみで、その活性もアクセプ
ター特異性のあることが報告されており、各種アミンを
アクセプターとした場合の転位活性については尚充分な
解明はなされていない。本発明は、上記ＧＧＴ活性を有
する酵素、殊に本発明者らの先の研究に係わるバチルス
ズブチリス（Bacillus subtilis ）由来の耐塩性グル
タミナーゼが、上記各種アミンをアクセプターとするＬ
−グルタミル基の転位活性において、所望の優れた特性
を有することを見出し完成されたものである。
【０００９】本発明に利用するＧＧＴ活性を有する酵素
としては、上記の通り、低級アルキルアミンをアクセプ
ターとして利用して、これにＬ−γ−グルタミル基を転
位できる活性を有するものから選択される。その代表例
としては、「グルタミナーゼダイワＣ１００」（大和化
成株式会社）として市販のバチルス属起源の耐塩性グル
タミナーゼ（特開平２−２６１３７９号公報参照）を例
示できる。本発明に利用する酵素は、ＧＧＴ活性を有す
る限り特に上記に限定されるものではなく、バチルス
属、エシェリヒア属等に由来する同様の活性を有する各
種の酵素であってもよく、之等はその起源微生物より常
法に従い単離されてもよく、また之等を含む市販の酵素
剤より単離されてもよい。
としては、上記の通り、低級アルキルアミンをアクセプ
ターとして利用して、これにＬ−γ−グルタミル基を転
位できる活性を有するものから選択される。その代表例
としては、「グルタミナーゼダイワＣ１００」（大和化
成株式会社）として市販のバチルス属起源の耐塩性グル
タミナーゼ（特開平２−２６１３７９号公報参照）を例
示できる。本発明に利用する酵素は、ＧＧＴ活性を有す
る限り特に上記に限定されるものではなく、バチルス
属、エシェリヒア属等に由来する同様の活性を有する各
種の酵素であってもよく、之等はその起源微生物より常
法に従い単離されてもよく、また之等を含む市販の酵素
剤より単離されてもよい。
【００１０】本発明方法は、上記ＧＧＴ活性を有する酵
素を利用して、その存在下に、Ｌ−γ−グルタミル基を
有する化合物と低級アルキルアミンもしくはその塩とを
反応させることにより実施される。ここでＬ−γ−グル
タミル基を有する化合物（ドナー）としては、代表的に
はＬ−グルタミンを例示できるが、これに限定されず、
例えばＤ−グルタミン、グルタチオン、Ｌ−γ−グルタ
ミルペプチドやＬ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリ
ド等のＬ−γ−グルタミル基を有する各種の化合物のい
ずれでもよい。また上記ドナーと反応させる、アクセプ
ターとしての低級アルキルアミンもしくはその塩として
は、例えばメチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピル
アミン、ｎ−ブチルアミン等や之等の塩酸塩等の酸付加
塩等の各種のもののいずれでもよい。上記ドナーとアク
セプターとの使用割合は、特に限定されるものではな
く、両者を等モル比で用いることもできるが、一般には
アクセプターを過剰に用いるのがよく、通常ドナーに対
してアクセプターを１０〜１５倍モル量程度の範囲で用
いるのが好ましい。反応は酵素が安定に所期の活性を発
揮できるように一般に水系で実施されるが、両原料化合
物の濃度は、両者が上記使用割合を保って溶解でき、し
かも酵素が安定である限り、できるだけ高濃度であるの
が好ましい。
素を利用して、その存在下に、Ｌ−γ−グルタミル基を
有する化合物と低級アルキルアミンもしくはその塩とを
反応させることにより実施される。ここでＬ−γ−グル
タミル基を有する化合物（ドナー）としては、代表的に
はＬ−グルタミンを例示できるが、これに限定されず、
例えばＤ−グルタミン、グルタチオン、Ｌ−γ−グルタ
ミルペプチドやＬ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリ
ド等のＬ−γ−グルタミル基を有する各種の化合物のい
ずれでもよい。また上記ドナーと反応させる、アクセプ
ターとしての低級アルキルアミンもしくはその塩として
は、例えばメチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピル
アミン、ｎ−ブチルアミン等や之等の塩酸塩等の酸付加
塩等の各種のもののいずれでもよい。上記ドナーとアク
セプターとの使用割合は、特に限定されるものではな
く、両者を等モル比で用いることもできるが、一般には
アクセプターを過剰に用いるのがよく、通常ドナーに対
してアクセプターを１０〜１５倍モル量程度の範囲で用
いるのが好ましい。反応は酵素が安定に所期の活性を発
揮できるように一般に水系で実施されるが、両原料化合
物の濃度は、両者が上記使用割合を保って溶解でき、し
かも酵素が安定である限り、できるだけ高濃度であるの
が好ましい。
【００１１】本発明方法における上記酵素によるドナー
とアクセプターとの転位反応は、一般にアルカリ域で酵
素活性が高くなり、微酸性域では該酵素の加水分解反応
の活性が高くなる。従って、本発明方法では酵素が安定
に作用することを前提として、できるだけ高ｐＨ条件を
採用するのが望ましい。酵素として耐塩性グルタミナー
ゼを用いる場合を例にとり詳述すれば、上記ｐＨ条件
は、通常１０〜１０．３付近であるのが好ましい。
とアクセプターとの転位反応は、一般にアルカリ域で酵
素活性が高くなり、微酸性域では該酵素の加水分解反応
の活性が高くなる。従って、本発明方法では酵素が安定
に作用することを前提として、できるだけ高ｐＨ条件を
採用するのが望ましい。酵素として耐塩性グルタミナー
ゼを用いる場合を例にとり詳述すれば、上記ｐＨ条件
は、通常１０〜１０．３付近であるのが好ましい。
【００１２】上記耐塩性グルタミナーゼ等の酵素の添加
配合量は、特に限定はなく、比較的多量に添加配合する
場合も、目的とするテアニン乃至その関連物質の加水分
解及びそれによる収率低下のおそれは殆どない。一般に
上記酵素は原料１ｇ対して通常約２０単位以上、好まし
くは約８０〜１４０単位の範囲から選択されるのが望ま
しい。また上記反応の温度は、酵素が作用できる限り特
に限定はされず、例えば１５℃程度の低温でも反応は進
行するが、通常約３０〜５０℃程度の加温下に行われる
のが望ましい。反応時間は用いる基質（ドナー及びアク
セプター）の濃度、酵素添加量等に応じて適宜決定でき
るが、副産物としてＬ−γ−グルタミルペプチド（Ｌ−
γ−グルタミル−グルタミンやＬ−γ−グルタミル−グ
ルタミン酸等）が生成される可能性を考慮すれば、通常
０．５〜５時間程度、長くとも２４時間以内とするのが
適当である。
配合量は、特に限定はなく、比較的多量に添加配合する
場合も、目的とするテアニン乃至その関連物質の加水分
解及びそれによる収率低下のおそれは殆どない。一般に
上記酵素は原料１ｇ対して通常約２０単位以上、好まし
くは約８０〜１４０単位の範囲から選択されるのが望ま
しい。また上記反応の温度は、酵素が作用できる限り特
に限定はされず、例えば１５℃程度の低温でも反応は進
行するが、通常約３０〜５０℃程度の加温下に行われる
のが望ましい。反応時間は用いる基質（ドナー及びアク
セプター）の濃度、酵素添加量等に応じて適宜決定でき
るが、副産物としてＬ−γ−グルタミルペプチド（Ｌ−
γ−グルタミル−グルタミンやＬ−γ−グルタミル−グ
ルタミン酸等）が生成される可能性を考慮すれば、通常
０．５〜５時間程度、長くとも２４時間以内とするのが
適当である。
【００１３】かくして、本発明方法により得られる目的
化合物は、通常用いられる各種の方法に従って精製する
ことができる。該方法としては例えば電気透析、膜分
離、溶媒沈殿、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマト
グラフィー等を例示できる。
化合物は、通常用いられる各種の方法に従って精製する
ことができる。該方法としては例えば電気透析、膜分
離、溶媒沈殿、イオン交換樹脂を用いるカラムクロマト
グラフィー等を例示できる。
【００１４】
【発明の効果】本発明方法によれば、簡単な操作で、短
時間に高収率で目的とするＬ−γ−グルタミルアルキル
アミドを製造することができ、この方法は従来の化学合
成方法や培養細胞法、酵素合成法等に比べて、その工業
的実施に非常に優れたものである。
時間に高収率で目的とするＬ−γ−グルタミルアルキル
アミドを製造することができ、この方法は従来の化学合
成方法や培養細胞法、酵素合成法等に比べて、その工業
的実施に非常に優れたものである。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を更に詳しく説明するため、利
用する耐塩性グルタミナーゼ、ＧＧＴの調製例及び試験
例を参考例として挙げ、次いで本発明方法の実施例を挙
げる。尚、各例におけるＧＧＴ活性測定は次の方法によ
った。
用する耐塩性グルタミナーゼ、ＧＧＴの調製例及び試験
例を参考例として挙げ、次いで本発明方法の実施例を挙
げる。尚、各例におけるＧＧＴ活性測定は次の方法によ
った。
【００１６】〈ＧＧＴ活性測定法〉２．５ｍＭ Ｌ−γ
−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、５０ｍＭグリシル
−グリシン及び１００ｍＭ緩衝液からなる混合液を３７
℃で５分間プレインキュベーションした後、酵素液を添
加して反応を開始（反応系の最終容積は１ｍｌに調整す
る）させ、１０分間反応後、１．５Ｎ酢酸２ｍｌ添加し
て反応を停止させ、４１０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。尚、上記緩衝液としては、ＮａＨＣＯ3−Ｎａ2 Ｃ
Ｏ3 （ｐＨ１０．０）を用いた。ＧＧＴ活性の１単位と
は、上記条件下で１分間に１μモルのｐ−ニトロアニリ
ンを遊離する酵素量とする。
−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、５０ｍＭグリシル
−グリシン及び１００ｍＭ緩衝液からなる混合液を３７
℃で５分間プレインキュベーションした後、酵素液を添
加して反応を開始（反応系の最終容積は１ｍｌに調整す
る）させ、１０分間反応後、１．５Ｎ酢酸２ｍｌ添加し
て反応を停止させ、４１０ｎｍにおける吸光度を測定し
た。尚、上記緩衝液としては、ＮａＨＣＯ3−Ｎａ2 Ｃ
Ｏ3 （ｐＨ１０．０）を用いた。ＧＧＴ活性の１単位と
は、上記条件下で１分間に１μモルのｐ−ニトロアニリ
ンを遊離する酵素量とする。
【００１７】〈テアニンの定量法〉テアニンの定量は、
予めｏ−フタルアルデヒド（以下ＯＰＡと略す）とβ−
メルカプトプロピオン酸で以下の通りＯＰＡ化を行なっ
た後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣにて分析することに
より実施した（プレカラム法）。即ち、１００ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ９．２）３００μｌに１％（ｗ／ｖ）Ｏ
ＰＡ溶液１００μｌ（１５％エタノールを含む）、１％
（ｖ／ｖ）β−メルカプトプロピオン酸１００μｌ及び
適当に希釈したサンプル液１００μｌをこの順序で添加
し、よく混合した後、５０℃で１分間放置し、正確に４
分後に１０μｌをインジェクトした。逆相カラムによる
分析は、以下の条件で行なった。
予めｏ−フタルアルデヒド（以下ＯＰＡと略す）とβ−
メルカプトプロピオン酸で以下の通りＯＰＡ化を行なっ
た後、逆相カラムを用いたＨＰＬＣにて分析することに
より実施した（プレカラム法）。即ち、１００ｍＭホウ
酸緩衝液（ｐＨ９．２）３００μｌに１％（ｗ／ｖ）Ｏ
ＰＡ溶液１００μｌ（１５％エタノールを含む）、１％
（ｖ／ｖ）β−メルカプトプロピオン酸１００μｌ及び
適当に希釈したサンプル液１００μｌをこの順序で添加
し、よく混合した後、５０℃で１分間放置し、正確に４
分後に１０μｌをインジェクトした。逆相カラムによる
分析は、以下の条件で行なった。
【００１８】カラム：ＳＴＲＯＤＳ−Ｍ、ガードカラム
Shim-pack G-ODS(4) 移動相： Ａ液＝１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８） Ｂ液＝Ａ液：アセトニトリル：メチルセロソルブ＝１５
０：３００：４．５ 溶出：下記タイムプログラムによるＡ液とＢ液のステッ
プワイズグラジエント 温度：室温 検出：蛍光検出（Ｅｘ＝３５０ｎｍ，Ｅｍ＝４５０ｎ
ｍ） 流速：１．０ｍｌ／分
Shim-pack G-ODS(4) 移動相： Ａ液＝１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８） Ｂ液＝Ａ液：アセトニトリル：メチルセロソルブ＝１５
０：３００：４．５ 溶出：下記タイムプログラムによるＡ液とＢ液のステッ
プワイズグラジエント 温度：室温 検出：蛍光検出（Ｅｘ＝３５０ｎｍ，Ｅｍ＝４５０ｎ
ｍ） 流速：１．０ｍｌ／分
【００１９】
【参考例１】バチルス・ズブチリス（Bacillus subtili
s ）由来の耐塩性グルタミナーゼの調製 市販酵素製剤「プロチンＭ３Ｘ」（大和化成社製）４０
０ｇを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
し、同緩衝液に対して充分に透析後、遠心分離（１２０
００rpm ×１５分）により不溶物を除き、得られる透明
液を予め２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（２．８×３２ｃ
ｍ、和光純薬社製）に吸着させた。２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む）で洗
浄後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、０．３
Ｍ ＮａＣｌを含む）でグルタミナーゼを溶出させた。
s ）由来の耐塩性グルタミナーゼの調製 市販酵素製剤「プロチンＭ３Ｘ」（大和化成社製）４０
０ｇを２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解
し、同緩衝液に対して充分に透析後、遠心分離（１２０
００rpm ×１５分）により不溶物を除き、得られる透明
液を予め２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平
衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（２．８×３２ｃ
ｍ、和光純薬社製）に吸着させた。２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５、０．１Ｍ ＮａＣｌを含む）で洗
浄後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５、０．３
Ｍ ＮａＣｌを含む）でグルタミナーゼを溶出させた。
【００２０】次いで得られたグルタミナーゼを含む０．
３Ｍ ＮａＣｌ溶出画分に硫安を０．８飽和の濃度で加
えて一晩、４℃で放置後、遠心分離（１２０００rpm ×
１５分）してグルタミナーゼ活性画分を回収した。
３Ｍ ＮａＣｌ溶出画分に硫安を０．８飽和の濃度で加
えて一晩、４℃で放置後、遠心分離（１２０００rpm ×
１５分）してグルタミナーゼ活性画分を回収した。
【００２１】得られた硫安沈澱物を、再度２０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、同緩衝液に対して
透析後、予め同緩衝液で平衡化したヒドロキシルアパタ
イト（２．８×１０ｃｍ、ナカライテスク（Nacalai te
sque) 社製、１００〜３５０メッシュ）に吸着させ、同
緩衝液で洗浄後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
から４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液濃
度を連続的に高めつつグルタミナーゼを溶出させた。
酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、同緩衝液に対して
透析後、予め同緩衝液で平衡化したヒドロキシルアパタ
イト（２．８×１０ｃｍ、ナカライテスク（Nacalai te
sque) 社製、１００〜３５０メッシュ）に吸着させ、同
緩衝液で洗浄後、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）
から４００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に緩衝液濃
度を連続的に高めつつグルタミナーゼを溶出させた。
【００２２】緩衝液濃度３５０ｍＭに溶出されたグルタ
ミナーゼ活性画分を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む）で平衡化したセフ
ァクリールＳ−２００カラム（２．８×４１ｃｍ、ファ
ルマシア社製）にのせ、１２ｍｌ／時間の流速で２ｍｌ
ずつ分取した。
ミナーゼ活性画分を、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む）で平衡化したセフ
ァクリールＳ−２００カラム（２．８×４１ｃｍ、ファ
ルマシア社製）にのせ、１２ｍｌ／時間の流速で２ｍｌ
ずつ分取した。
【００２３】最後に、活性画分を集め、硫安の０．８飽
和で酵素を回収し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に対して透析し、次いで凍結乾燥して、部分精
製標品を得た。本標品の比活性は３．２単位／ｍｇであ
った。
和で酵素を回収し、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に対して透析し、次いで凍結乾燥して、部分精
製標品を得た。本標品の比活性は３．２単位／ｍｇであ
った。
【００２４】
【実施例１】テアニンの製造 Ｌ−グルタミン７．３ｍｇと塩酸エチルアミン８．１ｍ
ｇとを含む１００ｍＭＮａＨＣＯ3 −Ｎａ2 ＣＯ3 （ｐ
Ｈ１０．０）１ｍｌに、市販のグルタミナーゼ（グルタ
ミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製、ＧＧＴとして
０．４単位）を添加し、３７℃で１７時間反応させた。
ｇとを含む１００ｍＭＮａＨＣＯ3 −Ｎａ2 ＣＯ3 （ｐ
Ｈ１０．０）１ｍｌに、市販のグルタミナーゼ（グルタ
ミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製、ＧＧＴとして
０．４単位）を添加し、３７℃で１７時間反応させた。
【００２５】得られた反応液を、ＯＰＡ化処理し、ＨＰ
ＬＣにて分析した結果、１．６ｍｇのテアニンの生成が
確認された。
ＬＣにて分析した結果、１．６ｍｇのテアニンの生成が
確認された。
【００２６】
【実施例２】テアニンの製造 Ｌ−グルタミン１５０ｍｇと塩酸エチルアミン１２００
ｍｇとを４００ｍＭＮａＨＣＯ3 −Ｎａ2 ＣＯ3 （ｐＨ
１０．０）１．５ｍｌに溶解し、液のｐＨを２０％（ｗ
／ｖ）ＮａＯＨにて１０．０に調節した後、水を加えて
全量を３ｍｌとした。上記液に市販のグルタミナーゼ
（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製、ＧＧ
Ｔとして１０単位）を添加し、３７℃で１８０分間反応
させて、テアニンを製造した。
ｍｇとを４００ｍＭＮａＨＣＯ3 −Ｎａ2 ＣＯ3 （ｐＨ
１０．０）１．５ｍｌに溶解し、液のｐＨを２０％（ｗ
／ｖ）ＮａＯＨにて１０．０に調節した後、水を加えて
全量を３ｍｌとした。上記液に市販のグルタミナーゼ
（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製、ＧＧ
Ｔとして１０単位）を添加し、３７℃で１８０分間反応
させて、テアニンを製造した。
【００２７】得られた反応液中のテアニン量はＨＰＬＣ
分析の結果１０８ｍｇであった。
分析の結果１０８ｍｇであった。
【００２８】
【実施例３】テアニン合成における最適ｐＨ ５０ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１００ｍＭ塩酸エチルア
ミンを含む１００ｍＭの各種ｐＨの緩衝液に、市販のグ
ルタミナーゼ（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化
成社製）を添加し、３７℃で反応を開始した。反応開始
後１７時間目にサンプリングを行い、生成したテアニン
をＨＰＬＣにより定量した。尚、使用した緩衝液はｐＨ
７．２５〜９．０がトリス−塩酸、ｐＨ１０．０〜１
０．６がホウ砂−Ｎａ2 ＣＯ3 、ｐＨ１１．１がＮａＨ
ＰＯ4 −ＮａＯＨであった。
ミンを含む１００ｍＭの各種ｐＨの緩衝液に、市販のグ
ルタミナーゼ（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化
成社製）を添加し、３７℃で反応を開始した。反応開始
後１７時間目にサンプリングを行い、生成したテアニン
をＨＰＬＣにより定量した。尚、使用した緩衝液はｐＨ
７．２５〜９．０がトリス−塩酸、ｐＨ１０．０〜１
０．６がホウ砂−Ｎａ2 ＣＯ3 、ｐＨ１１．１がＮａＨ
ＰＯ4 −ＮａＯＨであった。
【００２９】得られた結果を図１（縦軸；ピーク面積
（１×１０-4）、横軸；ｐＨ）に示す。
（１×１０-4）、横軸；ｐＨ）に示す。
【００３０】
【実施例４】アクセプター特異性 ２．５ｍＭ Ｌ−γ−グルタミル−Ｐ−ニトロアニリ
ド、各種濃度のアクセプター及び１００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ８．５）からなる混合液に、市販のグルタミナ
ーゼ（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製、
ＧＧＴとして０．０２５〜０．０５単位）を添加し（最
終液量１ｍｌ）、３７℃で反応を開始した。１５分後、
１．５Ｎ酢酸２ｍｌを反応液に加え、反応を停止し、４
１０ｎｍにおける吸光度を測定した。
ド、各種濃度のアクセプター及び１００ｍＭトリス−塩
酸（ｐＨ８．５）からなる混合液に、市販のグルタミナ
ーゼ（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製、
ＧＧＴとして０．０２５〜０．０５単位）を添加し（最
終液量１ｍｌ）、３７℃で反応を開始した。１５分後、
１．５Ｎ酢酸２ｍｌを反応液に加え、反応を停止し、４
１０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３１】各種アクセプターを用いた時の酵素の相対
活性を、Ｇｌｙ−Ｇｌｙをアクセプターとした時の値を
１００として、表１に示す。
活性を、Ｇｌｙ−Ｇｌｙをアクセプターとした時の値を
１００として、表１に示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【実施例５】酵素濃度の影響 ２００ｍＭホウ砂−Ｎａ2 ＣＯ3 （ｐＨ９．７）、０．
２８２ＭＬ−グルタミン及び３．９７Ｍ塩酸エチルアミ
ンからなる基質混合液に、各濃度で市販のグルタミナー
ゼ（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製）を
添加し、３７℃で２時間と１８．５時間反応を行った
後、生成したテアニンをＨＰＬＣにより分析した。得ら
れた結果を表２に示す。
２８２ＭＬ−グルタミン及び３．９７Ｍ塩酸エチルアミ
ンからなる基質混合液に、各濃度で市販のグルタミナー
ゼ（グルタミナーゼダイワＣ１００、大和化成社製）を
添加し、３７℃で２時間と１８．５時間反応を行った
後、生成したテアニンをＨＰＬＣにより分析した。得ら
れた結果を表２に示す。
【００３４】
【表２】
【図１】実施例３におけるテアニン合成に与えるｐＨ影
響で示すグラフである。
響で示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性
を有する酵素の存在下に、Ｌ−γ−グルタミル基を有す
る化合物と低級アルキルアミンもしくはその塩とを反応
させてＬ−γ−グルタミル低級アルキルアミドを得るこ
とを特徴とするＬ−γ−グルタミル低級アルキルアミド
の製造方法。 - 【請求項２】γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性
を有する酵素が、バチルス属由来のものである請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】γ−グルタミル低級アルキルアミドがテア
ニンである請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4089199A JPH05284983A (ja) | 1992-04-10 | 1992-04-10 | Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミドの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4089199A JPH05284983A (ja) | 1992-04-10 | 1992-04-10 | Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミドの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05284983A true JPH05284983A (ja) | 1993-11-02 |
Family
ID=13964048
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4089199A Pending JPH05284983A (ja) | 1992-04-10 | 1992-04-10 | Ｌ−γ−グルタミル低級アルキルアミドの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05284983A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2006001296A1 (ja) * | 2004-06-28 | 2008-04-17 | 太陽化学株式会社 | テアニンの製造法 |
| CN102181501A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-09-14 | 南京工业大学 | 一种酶法合成l-茶氨酸的方法 |
| JP2014023449A (ja) * | 2012-07-25 | 2014-02-06 | Unitika Ltd | 含硫システイン化合物の製造方法 |
-
1992
- 1992-04-10 JP JP4089199A patent/JPH05284983A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2006001296A1 (ja) * | 2004-06-28 | 2008-04-17 | 太陽化学株式会社 | テアニンの製造法 |
| JP4874105B2 (ja) * | 2004-06-28 | 2012-02-15 | 太陽化学株式会社 | テアニンの製造法 |
| CN102181501A (zh) * | 2011-03-18 | 2011-09-14 | 南京工业大学 | 一种酶法合成l-茶氨酸的方法 |
| JP2014023449A (ja) * | 2012-07-25 | 2014-02-06 | Unitika Ltd | 含硫システイン化合物の製造方法 |
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|---|---|---|---|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Effective date: 20050414 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 |
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