CN102181501A

CN102181501A - 一种酶法合成l-茶氨酸的方法

Info

Publication number: CN102181501A
Application number: CN2011100663059A
Authority: CN
Inventors: 姚忠; 胡国梅; 王浩琦; 徐虹; 韦萍
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-03-18
Also published as: CN102181501B

Abstract

本发明公开了一种以L-谷氨酰胺的二价金属离子配合物为供体，酶法制备L-茶氨酸的方法，包括：利用化学法合成L-谷氨酰胺的二价金属离子配合物，这些金属离子包括Zn(II)、Ca(II)、Mg(II)、Fe(II)；将γ-谷氨酰转肽酶加入到含有底物L-谷氨酰胺二价金属离子配合物和乙胺的混合水溶液中反应。利用本方法可有效避免自转肽问题，大大提高对供体的转化率，工艺简单，条件温和，成本低，适合茶氨酸生产的实际应用。

Description

一种酶法合成L-茶氨酸的方法

技术领域

本发明涉及一种L-茶氨酸的合成方法，尤其涉及一种以L-谷氨酰胺的二价金属离子配合物为谷氨酰供体，利用γ-谷氨酰转肽酶催化合成L-茶氨酸的方法。

背景技术

茶氨酸是绿茶、红茶和乌龙茶中所含的一种特殊氨基酸，属酰胺类化合物，是茶叶的特征氨基酸，也是茶叶的主要呈味物质之一。天然存在的茶氨酸均为L型，除了调味之外，还具有消除疲劳、促进大脑机能增强学习记忆能力、降血压、改善睡眠、放松情绪的功能，可用于抑郁症的预防和临床治疗；抗肿瘤作用和提高抗癌药物的疗效；因此，L-茶氨酸可用于药品，保健品，化妆品等各行业。

目前L-茶氨酸的生产方法主要有化学合成法、发酵法和提取法。化学合成法制备L-茶氨酸采用的均为谷氨酸的衍生物与乙胺或乙胺化合物反应，涉及到谷氨酸的保护与脱保护，反应路线复杂，条件苛刻，副反应多，且容易产生消旋体，同时大量有机溶剂会污染环境。而发酵法有以下不足：产物浓度和转化率较低、发酵时间过长、下游分离难度大、设备成本高。提取法就是从茶叶组织中直接提取，由于茶氨酸在茶叶中含量很低，因而提取法并不适于大量制备。

近年来，由于L-茶氨酸的生理功能不断被发现，L-茶氨酸的应用研究受到越来越多的重视。目前，L-茶氨酸已在日本和欧洲被正式批准为食品添加剂，并广泛应用；L-茶氨酸在药品中的应用也在开发之中。随着L-茶氨酸的市场需求日益扩大，有关其合成技术的研究也受到广泛的关注。

专利WO2004016798公开了一种酶法合成茶氨酸的方法。该方法从自然界土壤中分离选定香茅醇假单胞菌GEA作为具有γ-谷氨酰基转移活性的茶氨酸生产菌，在pH为9～12的条件下，以L-谷氨酰胺和乙胺为底物，将来自该菌的谷氨酰胺酶用于催化制备茶氨酸。专利WO2006001296在前述专利方法上做了扩展改进，使用来自芽孢杆菌属、霉菌或酵母中的一种或两种以上的来自微生物的谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺和乙胺衍生物反应，生成L-茶氨酸。该方法主要考察了不同菌种、不同活性的酶对反应进行催化。但是上述酶法均以L-谷氨酰胺为底物，存在自转肽问题，即由于L-谷氨酰胺具有α-氨基，在实际反应中也可作为γ-谷氨酰受体，形成谷氨酰谷氨酰胺(Glu-Gln)。

专利200810024835.5公开了以L-谷氨酰胺-铜(II)配合物为酰基供体，乙胺盐酸盐为受体，在水相中实现了茶氨酸的高效合成。该方法保护了L-谷氨酰胺的α-氨基，可有效抑制自转肽反应和底物消旋化，供体转化率高；同时，由于形成的产物-茶氨酸-铜(II)溶解度较低，可通过直接浓缩、结晶进行分离纯化，简化了下游过程。但是铜作为一种重金属元素，具有一定的毒性，铜离子能够使人体的蛋白质的结构发生不可逆的改变，蛋白质的结构改变功能就会丧失，导致体内的酶就不能够催化化学反应，细胞膜表面的载体就不能运入营养物质、排出代谢废物，肌球蛋白和肌动蛋白就无法完成肌肉收缩，所以体内细胞就无法获得营养，排除废物，无法产生能量，细胞结构崩溃和功能丧失。在食品国家标准中铜的最高限量为10mg/kg左右，远远低于锌，钙，镁的最高限量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酶法合成L-茶氨酸的方法，以避免自转肽副反应，同时简化茶氨酸的合成工艺。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种酶法合成L-茶氨酸的方法，该方法包括如下步骤：

(1)利用化学法分别制成含有L-谷氨酰胺-金属离子配合物的反应液，调反应液pH至8.0～11.0，所述的金属离子为Zn(II)、Ca(II)、Mg(II)或Fe(II)；

(2)向上述含有L-谷氨酰胺-金属离子配合物的反应液中加入乙胺水溶液和γ-谷氨酰转肽酶，使得反应体系中，L-谷氨酰胺的起始浓度为10～30mmol/L，乙胺的起始浓度为50～500mmol/L，γ-谷氨酰转肽酶的加入量为0.2～0.5U/mL，反应pH为8.0～11.0，反应温度为35～45℃，反应时间为2～5小时，得L-茶氨酸-金属离子配合物；

(3)在反应液中加入盐酸使L-茶氨酸-金属离子配合物解离出茶氨酸；

(4)将所得茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。

步骤(1)中，化学法合成L-谷氨酰胺-二价金属离子配合物是本领域技术人员已知技术。底物L-谷氨酰胺通过金属配位，保护了L-谷氨酰胺上的α-氨基和α-羧基，解决了L-谷氨酰胺的自转肽问题，从而提高转化率。

步骤(1)中，用浓度为10～20g/L的NaOH来调节反应液的pH值。

步骤(2)中，反应受体乙胺的比例高，有利于供体转化率的提高。其反应方程式如下：

其中：M＝Ca，Mg，Zn，Fe。

步骤(2)中，以反应体系中所含的L-谷氨酰胺计算，不论是以配合物的形式存在还是以单体形式存在，与受体乙胺的起始摩尔比优选1∶5～1∶20，最优选1∶12～18。

步骤(2)中，优选纯度大于95％的γ-谷氨酰转肽酶。

上述γ-谷氨酰转肽酶可通过如下方法制备：

a、常规方法培养Bacillus subtillis NX-2，发酵产γ-谷氨酰转肽酶。

b、利用蛋白分离纯化系统制备γ-谷氨酰转肽酶。

步骤a中，产酶微生物枯草芽孢杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCC No.0833)的培养条件为：以单糖或双糖作为碳源，如葡萄糖、蔗糖或麦芽糖；氮源以有机氮源为佳，效果最好的是玉米浆和酵母膏。该菌是好氧培养菌，在pH8～9、温度30～40℃的通气条件下，生长良好。在发酵时使用液体培养，一般发酵周期在20～30小时。

步骤b中，可采用

^TM explorer 100蛋白纯化仪(Amersham Pharmacia公司生产)分离纯化γ-谷氨酰转肽酶，该纯化方法对本领域普通技术人员而言，属于一般的分离纯化过程。设备使用的依照该系统的使用手册即可。

步骤(3)中，加入盐酸的目的是破坏L-茶氨酸-二价金属离子配合物的结构，利用酸性条件下氨基酸金属螯合物解离而得到茶氨酸。若选用1mol/L盐酸，则加入体积为步骤2得到的反应液体积的6～10％。

步骤(4)中，可利用乙醇沉淀法分离纯化L-茶氨酸。用乙醇沉淀法分离纯化茶氨酸技术为本领域技术人员公知技术。

本发明的有益效果如下：

1、本发明采用配合物L-谷氨酰胺-Zn(II)、L-谷氨酰胺-Ca(II)、L-谷氨酰胺-Mg(II)、L-谷氨酰胺-Fe(II)为反应供体，L-谷氨酰胺的α-氨基用金属离子螯合保护，解决了L-谷氨酰胺在γ-谷氨酰转肽酶催化下会发生自转肽的问题，从而使反应相对供体谷氨酰胺的转化率得到很大提高。同时，可防止L-谷氨酰胺在碱性条件下的自发消旋，产物光学纯度高。

2、本发明采用γ-谷氨酰转肽酶催化L-谷氨酰胺-二价金属离子配合物与乙胺转肽反应，仅需一步就可以得到L-茶氨酸-二价金属离子配合物，加入盐酸即可得到产物L-茶氨酸。与化学合成法相比，反应简单，收率高，不需对游离羧基进行复杂的保护与脱除，反应过程中也不会产生消旋体。

3、本发明不需要将生成的L-谷氨酰胺-二价金属离子配合物分离出来，减少了分离纯化L-谷氨酰胺-二价金属离子配合物的工作步骤，且避免了分离纯化配合物过程带来的配合物的损失，提高了最终产物的得率，更有利于茶氨酸实际生产的需要。

4、本发明采用的γ-谷氨酰转肽酶是通过分离纯化得到的精制酶，反应在碱性的水溶液中进行，转化率高(详见实施例转化效果)。

5、本发明扩大了与L-谷氨酰胺配合的二价金属离子范围，研究了在食品药品应用中更安全的金属离子Zn(II)，Mg(II)，Ca(II)等与L-谷氨酰胺形成的配合物作为供体，酶法合成茶氨酸的方法，转化率比L-谷氨酰胺-铜(II)配合物更高。同时，该方法无需对已形成的L-谷氨酰胺配合物进行分离，进一步简化了工艺流程。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

取蔗糖15g，玉米浆30g，蛋白胨15g，K₂HPO₄15g，MgSO₄0.5g，pH7.5加自来水配制成1L液体培养基，按此配方配制3.5L装入5L发酵罐中0.1MPa高压蒸汽灭菌25分钟备用。同时分装50mL培养基到500mL，加8层纱布，用牛皮纸包好后，与发酵罐一起灭菌备用。

将冰箱内保存的菌种——枯草芽抱杆菌Bacillus subtillis NX-2(保藏号为CGMCCNo.0833)取出后，接在新鲜斜面培养基(斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，琼脂20)上，活化培养24小时，接入种子培养基(种子培养基(g/L)：葡萄糖15，玉米浆10，蛋白胨10，K₂HPO₄2，MgSO₄0.25)在33℃、220r/min振荡培养20小时。培养结束接入发酵罐，于33℃、200r/min，发酵培养40小时。

发酵结束后，8000r/min离心25分钟，收集上清液。以60％～90％饱和度的硫酸铵梯度进行蛋白质分级沉淀，分离出的蛋白用等体积Tris-HCl(pH8.0，0.05mol/L)复溶，用疏水层析分离，收集30％洗脱液(pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl)浓度处的洗脱峰，10万分子量的透析袋透析过夜，PEG20000浓缩，再用DEAE离子交换层析分离，20％～75％洗脱液(pH8.0，0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl)(约25min)梯度洗脱处第一个洗脱峰得到纯的(纯度＞95％)γ-谷氨酰转肽酶(比活为59.6U/mg蛋白)。(疏水层析及DEAE离子交换层析的方法为本领域普通技术人员公知的技术)。

1个酶活力单位是指在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。比酶活为每毫克酶蛋白所含的活力单位。酶活的单位是U，比酶活单位是U/mg或U/g。

实施例2：

称取L-谷氨酰胺43.85mg(0.3mmol)，用pH 9.0的Tris-HCl定容到10ml(L-谷氨酰胺浓度为0.1mol/L)。取该L-谷氨酰胺溶液2.5mL，加入2.5mL 500mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶1.48U，混合均匀置于水浴锅反应2小时，反应温度为37℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Hypersil ODS25μm C18；检测波长为200nm；流动相为96％水(含1‰三氟乙酸)，4％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为59.1％。将所得茶氨酸溶液经常规乙醇沉淀法分离、浓缩、结晶，制得L-茶氨酸纯品。

实施例3：

称取87.7mg(0.6mmol)L-谷氨酰胺，50.4mg碳酸氢钠溶解于10mL水中，制成混合反应液，用恒压漏斗将10ml的ZnSO₄·7H₂O(0.3mmol)溶液流加至上述Gln与碳酸氢钠的混合水溶液中，60℃水浴恒温搅拌反应2.5小时。用NaOH溶液将该反应液pH调到9.0。

实施例4：

取实施例3得到的混合反应液2.5ml，加入2.5mL 500mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶1.48U，此时该体系中以各种形式存在的L-谷氨酰胺的浓度为15mmol/L，混合均匀置于水浴锅反应2小时，反应温度为37℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Hypersil ODS25μm C18；检测波长为200nm；流动相为96％水(含1‰三氟乙酸)，4％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为89.5％。将所得茶氨酸溶液经常规乙醇沉淀法分离、浓缩、结晶，制得L-茶氨酸纯品。

实施例5：

称取87.7mg(0.6mmol)L-谷氨酰胺，50.4mg碳酸氢钠溶解于10mL水中，制成混合反应液，用恒压漏斗将10ml的CaCl₂(0.3mmol)溶液流加至上述Gln与碳酸氢钠的混合水溶液中，60℃水浴恒温搅拌反应2.5小时。用NaOH溶液将该反应液pH调到9.0。

实施例6：

取实施例5得到的混合反应液2.5mL，加入2.5mL 500mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶1.48U，此时该体系中以各种形式存在的L-谷氨酰胺的浓度为15mmol/L，混合均匀置于水浴锅反应2小时，反应温度为37℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Hypersil ODS25μm C18；检测波长为200nm；流动相为96％水(含1‰三氟乙酸)，4％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为83.2％。将所得茶氨酸溶液经常规乙醇沉淀法分离、浓缩、结晶，制得L-茶氨酸纯品。

实施例7：

称取87.7mg(0.6mmol)L-谷氨酰胺，50.4mg碳酸氢钠溶解于10mL水中，制成混合反应液，用恒压漏斗将10ml的MgCl₂.6H₂O(0.3mmol)溶液流加至上述Gln与碳酸氢钠的混合水溶液中，60℃水浴恒温搅拌反应2.5小时。用NaOH溶液将该反应液pH调到9.0。

实施例8：

取实施例7得到的混合反应液于2.5ml，加入2.5mL 500mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶1.48U，此时该体系中以各种形式存在的L-谷氨酰胺的浓度为15mmol/L，混合均匀置于水浴锅反应2小时，反应温度为37℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Hypersil ODS25μm C18；检测波长为200nm；流动相为96％水(含1‰三氟乙酸)，4％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为81.1％。将所得茶氨酸溶液经常规乙醇沉淀法分离、浓缩、结晶，制得L-茶氨酸纯品。

实施例9：

称取87.7mg(0.6mmol)L-谷氨酰胺，50.4mg碳酸氢钠溶解于10mL水中，制成混合反应液，用恒压漏斗将10ml的ZnSO₄·7H₂O(0.2mmol)溶液流加至上述Gln与碳酸氢钠的混合水溶液中，60℃水浴恒温搅拌反应2.5小时。用NaOH溶液将该反应液pH调到9.0。

实施例10：

取实施例9得到的混合反应液2.5ml，加入2.5mL 100mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶1.48U，此时该体系中以各种形式存在的L-谷氨酰胺的浓度为15mmol/L，混合均匀置于水浴锅反应3小时，反应温度为40℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Hypersil ODS25μm C18；检测波长为200nm；流动相为96％水(含1‰三氟乙酸)，4％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为73.4％。将所得茶氨酸溶液经常规乙醇沉淀法分离、浓缩、结晶，制得L-茶氨酸纯品。

实施例11：

称取87.7mg(0.6mmol)L-谷氨酰胺，100.8mg碳酸氢钠溶解于10mL水中，制成混合反应液，用恒压漏斗将10ml的CaCl₂(0.6mmol)溶液流加至上述Gln与碳酸氢钠的混合水溶液中，60℃水浴恒温搅拌反应2.5小时。用NaOH溶液将该反应液pH调到10.0。

实施例12：

取实施例11得到的混合反应液2.5mL，加入2.5mL 500mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶1.2U，此时该体系中以各种形式存在的L-谷氨酰胺的浓度为15mmol/L。混合均匀置于水浴锅反应1小时，反应温度为42℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Hypersil ODS25μm C18；检测波长为200nm；流动相为96％水(含1‰三氟乙酸)，4％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为67.3％。将所得茶氨酸溶液经常规乙醇沉淀法分离、浓缩、结晶，制得L-茶氨酸纯品。

实施例13：

称取87.7mg(0.6mmol)L-谷氨酰胺，50.4mg碳酸氢钠溶解于10mL水中，制成混合反应液，用恒压漏斗将10ml的MgCl₂.6H₂O(0.3mmol)溶液流加至上述Gln与碳酸氢钠的混合水溶液中，60℃水浴恒温搅拌反应2.5小时。用NaOH溶液将该反应液pH调到8.0。

实施例14：

取实施例13得到的混合反应液于2.5ml，加入2.5mL 100mmol/L的乙胺，再加入实施例1得到的γ-谷氨酰转肽酶3.2U，此时该体系中以各种形式存在的L-谷氨酰胺的浓度为15mmol/L，混合均匀置于水浴锅反应4小时，反应温度为57℃。反应结束后，反应液加入1mol/L盐酸(体积为反应液10％)混匀，用高效液相色谱系统分析检测(色谱分离条件：色谱柱为：Hypersil ODS25μm C18；检测波长为200nm；流动相为96％水(含1‰三氟乙酸)，4％乙腈；流速：1mL/min)，对谷氨酰胺的转化率为70.4％。将所得茶氨酸溶液经常规乙醇沉淀法分离、浓缩、结晶，制得L-茶氨酸纯品。

Claims

1.一种酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(2)向上述含有L-谷氨酰胺-金属离子配合物的反应液中加入乙胺水溶液和γ-谷氨酰转肽酶，使得反应体系中，L-谷氨酰胺的起始浓度为10～30mmol/L，乙胺的起始浓度为50～500mmol/L，γ-谷氨酰转肽酶的加入量为0.2～0.7U/mL，反应pH为8.0～11.0，反应温度为35～45℃，反应时间为2～5小时，得L-茶氨酸-金属离子配合物；

(3)在反应液中加入盐酸使L-茶氨酸-金属离子配合物解离出L-茶氨酸；

(4)将所得L-茶氨酸溶液分离，浓缩，结晶。

2.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(1)中，用浓度为10～20g/L的NaOH来调节反应液的pH值。

3.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸方法，其特征在于步骤(2)中，所述γ-谷氨酰转肽酶的纯度大于95％。

4.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(3)中，加入体积为反应液体积6～10％的1mol/L盐酸。

5.根据权利要求1所述的酶法合成L-茶氨酸的方法，其特征在于步骤(4)中，利用乙醇沉淀法分离纯化L-茶氨酸。