JP2005080503A - γ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】γ−グルタミルトランスペプチターゼを用いてγ−グルタミル化合物を製造する際に生じる副反応を抑制し、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物を効率的に製造する方法を提供する。
【解決手段】γ−グルタミルトランスペプチターゼの存在下で、γ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−Ｄ−グルタミル基をγ−グルタミル基受容体のアミノ基にアミド結合させることによりγ−Ｄ−グルタミル化合物を製造する方法であって、前記γ−グルタミルトランスペプチターゼが、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない酵素であるとともに、前記γ−グルタミル基受容体としてＤ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチド以外のアミノ基含有化合物を用いる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、γ−グルタミルトランスペプチターゼを用いたγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法に関し、より詳細には、副反応を抑制し、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物を効率的に製造することができるγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法に関する。

下記一般式で表されるγ−グルタミル化合物は、その呈味性やリラクゼーション効果から、食品、医薬品等の分野での利用が期待されている。

（上記一般式において、Ｒは、置換または無置換の炭化水素基である。）

例えば、γ−グルタミル化合物の１種であるＬ−テアニン（上記一般式にて、Ｒがエチル基）は緑茶のうま味成分として古くから知られている。また、Ｄ−テアニンもお茶に含まれ、Ｌ−テアニンと同様な呈味性を示すことが報告されている(E.-Ott et al. J. Agric. Food Chem., 45, 353-363 (1997))。このことから、Ｌ−テアニンで報告されているリラクゼーション効果(Kobayashi et al. 日本農芸化学会誌, 72, 153-157 (1998))がＤ−テアニンばかりでなく、様々なγ−Ｄ−グルタミル化合物においてより少ないドースで認められる可能性が考えられる。

また、興奮性のアミノ酸に対するアンタゴニストとして、γ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンをはじめとする多くのγ−Ｄ−グルタミルアミノ酸が有効であることが報告されている(Jones et al. Neuroscience,13(2), 573-581 (1984), Davis et al. Comp. Biochem. Physiol., 72C, 211-224 (1982))。

このようにγ−グルタミル化合物は食品、医薬品等の様々な分野での需要が期待できることから、γ−グルタミル化合物の効率的な製造方法の開発が望まれている。

γ−グルタミル化合物の酵素合成法としては、大腸菌由来のγ-グルタミルトランスペプチダーゼ(ＧＧＴ)を用いて様々なγ−グルタミル化合物を生成する方法が知られている。当該方法は、大腸菌由来のＧＧＴの存在下で、Ｌ−Ｇｌｎ等をγ-グルタミル基供与体として用い、γ−グルタミル基受容体のアミノ基にγ-グルタミル基をアミド結合させることにより、目的とするγ−グルタミル化合物を製造する方法である。

（上記一般式において、Ｒ₁は、水素、または、置換もしくは無置換の炭化水素基であり、Ｒ₂は、置換または無置換の炭化水素基である。）

大腸菌のＧＧＴを用いた酵素合成法の特徴としては、（１）γ−グルタミル基供与体として、グルタチオンより安価なＧｌｎを用いることができる、（２）γ-グルタミルシステイン合成酵素やグルタミン合成酵素を用いるγ−グルタミル化合物合成法と異なり、ＡＴＰなどのエネルギー源を必要としない（また、これらの酵素は生成物の一つであるＡＤＰによって強く阻害されるが、本法はその問題が生じない）、（３）大腸菌のＧＧＴがγ-グルタミル基受容体として多くのアミノ酸、ペプチド、その他のアミン化合物などを利用できるため、多種のγ−グルタミル化合物の合成が可能である、（４）広い反応ｐＨを選択できる；（５）多量のＧＧＴを容易に調製し供給できる、という特徴が挙げられる。

特公平４−２８１７８８公報 特開平２−２３１０８５公報 M. Orlowski & A. Meister, Isolation of γ-glutamyl transpeptidase from hog kidney, JBC, 240, 338〜347, 1964 Suzuki, H., H.Kumagai, T. Echigo, and T. Tochikura. 1998. Molecular cloning of Escherichia coli K-12 ggt and rapid isolation of γ-glutamyltranspeptidase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 150:33-38 Hashimoto, W., H. Suzuki, K. Yamamoto, and H. Kumagai. 1997. Analysis of low temperature inducible mechanism ofγ-glutamyltranspeptidase of Escherichia coli K-12. Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:34-39 Suzuki, H., H.Kumagai, and T. Tochikura. 1986. γ-glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12: formation and localization. J. Bacteriol. 168:1332-1335

しかしながら、様々なγ−グルタミル化合物の酵素合成法を開発する過程で、Ｌ−Ｇｌｎをγ-グルタミル基供与体として、反応性の低いγ-グルタミル基受容体（Ｘ）へγ-グルタミル基を転移させようとすると、目的とするγ−Ｌ−グルタミル化合物（γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｘ）の収率が低くなることが分かってきた。

これは、下記の副反応１、２に示すように、γ-グルタミル基供与体として用いたＬ−Ｇｌｎや、反応生成物であるγ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＸなどがＧＧＴによってγ-グルタミル基受容体として認識されてしまい、γ-Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｎやγ−Ｌ−Ｇｌｕ-γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｘが多量副生することが原因であると考えられる。

副反応１ 2L-Gln → γ-L-Glu-L-Gln ＋ H₂O
副反応２ L-Gln ＋ γ-L-Glu-X → γ-L-Glu-γ-L-Glu-X ＋ H₂O

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、反応副生物の生成を抑制し、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物を効率的に製造することができるγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記問題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、エシェリヒア コリに由来するγ−グルタミルトランスペプチターゼがＤ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないという性質を有することを発見し、このような性質を持つγ−グルタミルトランスペプチターゼの存在下で、γ−Ｄ−グルタミル化合物をγ-Ｄ−グルタミル基供与体として用いて反応を実施することにより、反応副生物の生成を抑制し、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物を効率的に製造することができることを見出し、本発明に想到した。なお、本発明において、「γ−Ｄ−グルタミル化合物」と記載する場合、γ-Ｄ−グルタミル基供与体として用いるγ−Ｄ−グルタミル化合物と、酵素反応による反応生成物として得られるγ−Ｄ−グルタミル化合物とがあるが、以下、特にことわりがない限り、「γ−Ｄ−グルタミル化合物」は、反応生成物としてのγ−Ｄ−グルタミル化合物と表すものとする。

従来、微生物に由来するＧＧＴにおいて、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないＧＧＴについての報告は見られず、本発明のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法は、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないという酵素の特性に着目して、反応副生物の生成を抑制するものである。また、本発明は、食品、医薬品等の様々な分野での需要が期待できるＤ体のγ−グルタミル化合物を、光学特異的に製造する方法を提供するものである。

即ち、本発明は以下の通りである。

〔１〕 γ−グルタミルトランスペプチターゼの存在下で、γ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−Ｄ−グルタミル基をγ−グルタミル基受容体のアミノ基にアミド結合させることによりγ−Ｄ−グルタミル化合物を製造する方法であって、
前記γ−グルタミルトランスペプチターゼが、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない酵素であるとともに、
前記γ−グルタミル基受容体としてＤ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチド以外のアミノ基含有化合物を用いることを特徴とするγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。

〔２〕 前記γ−グルタミルトランスペプチターゼが、エシェリヒア コリに由来するγ−グルタミルトランスペプチターゼであることを特徴とする〔１〕に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。

〔３〕 前記γ−Ｄ−グルタミル基供与体が、Ｄ−グルタミンであることを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。

〔４〕 前記γ−グルタミル基受容体が、Ｄ−アミノ酸以外のアミノ酸またはアミンであることを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。

〔５〕 前記γ−グルタミル基受容体が、グリシルグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、Ｌ−タウリン、及びエチルアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。

〔６〕 前記γ−グルタミル基受容体が、グリシルグリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、またはＬ−トリプトファンであることを特徴とする〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。

本発明により、食品、医薬品等の様々な分野での需要が期待できるＤ体のγ−グルタミル化合物を、光学特異的かつ効率的に酵素合成することができる。

さらに、反応性の低いγ-グルタミル基受容体の場合も、γ-グルタミル基供与体としてγ−Ｄ−グルタミル化合物を用いることにより、Ｌ体のγ-グルタミル基供与体を用いる場合に比べて目的とするγ−グルタミル化合物を効率よく生産することが可能となる。

以下に、本発明の実施形態について説明する。本発明にかかるγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法は、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないγ−グルタミルトランスペプチターゼの存在下で、γ−Ｄ−グルタミル化合物をγ−Ｄ−グルタミル基供与体として用いて反応を実施することにより、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物を効率的に製造することを特徴とする。

すなわち、本発明のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法は、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないという酵素の特性に着目して、反応副生物の生成を抑制するものである。

γ−グルタミル基受容体としてＬ型およびＤ型いずれのアミノ酸に対しても基質特異性を有するＧＧＴを用いると、このＧＧＴは、γ−グルタミル基供与体（例えば、Ｄ−グルタミン）をγ−グルタミル基供与体としてだけでなく、γ−グルタミル基受容体としても認識してしまう。ＧＧＴによってγ−グルタミル基供与体がγ−グルタミル基受容体として認識されてしまうと、γ−グルタミル基供与体に他のγ−グルタミル基供与体のγ−グルタミル基が転移する副反応が生じる。また、目的とするγ−グルタミル化合物が生成しても、このγ−グルタミル化合物のγ−グルタミル基におけるアミノ基に、さらにγ−グルタミル基が転移する副反応が生じると言った問題があった。

特に、反応性の良くないγ-グルタミル基受容体の場合では、γ−グルタミル化合物の生成速度が遅いため、副反応の反応速度の影響が大きく、副反応によってγ−グルタミル基供与体や目的生成物であるγ−グルタミル化合物が消費されてしまい、目的とするγ−グルタミル化合物の収率が低下する傾向が顕著であった。

これに対し、本発明では、ＧＧＴとして、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない酵素を用い、かつ、γ−グルタミル基供与体としてγ−Ｄ−グルタミル化合物を用いることを特徴とする。

Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないγ−グルタミルトランスペプチターゼは、γ−グルタミル基供与体として用いるＤ−Ｇｌｎや生成したγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｘをγ−グルタミル基受容体として認識しないため、γ-Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｇｌｎやγ−Ｄ−Ｇｌｕ-γ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｘ等の反応副生物の生成が抑制される。本発明は、このようなγ−グルタミルトランスペプチターゼの存在下で、γ−Ｄ−グルタミル基供与体としてγ−Ｄ−グルタミル化合物を用いて反応をすることにより、副反応を抑制し、目的とするγ−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｘの収率を向上させるものである。

以下、本発明について、
[I]γ−グルタミルトランスペプチターゼの取得方法
[II]γ−Ｄ−グルタミル基供与体
[III]γ−グルタミル基受容体
[IV]反応条件
の順に詳細に説明する。

[I]γ−グルタミルトランスペプチターゼの取得方法
本発明において、γ−グルタミルトランスペプチターゼ（ＧＧＴ）とは、γ−グルタミル基供与体のγ−グルタミル基をγ−グルタミル基受容体のアミノ基にアミド結合する反応を触媒する酵素を意味する。

（上記一般式において、Ｒ₁は、水素、または、置換もしくは無置換の炭化水素基であり、Ｒ₂は、置換または無置換の炭化水素基である。）

本発明においては、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないＧＧＴを用いる。ここで、「Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない」とは、γ−グルタミル基供与体のγ−グルタミル基を、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドのアミノ基に転移する反応を実質的に触媒しないことを意味する。

本発明に用いるＧＧＴは、γ−グルタミル基受容体としてＤ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドを認識しない酵素であって、かつ、γ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−Ｄ−グルタミル基をγ−グルタミル基受容体のアミノ基にアミド結合する反応を触媒する酵素であれば、特に限定なく使用することができる。

このようなＧＧＴとしては、エシェリヒア コリ由来のＧＧＴを好ましく用いることができる。特に、Escherichia coli ＡＪ１１０２５３ ＦＥＲＭ Ｐ−１９５０２株を好ましく用いることができる。尚、Escherichia coli ＡＪ１１０２５３ ＦＥＲＭ Ｐ−１９５０２株については下記の通り寄託されている。

(i)寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号305−8566）
(ii)寄託日：平成１５年８月２７日
(iii)寄託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９５０２

エシェリヒア コリ由来のＧＧＴは、γ-グルタミル基供与体としてＬ型およびＤ型いずれのγ-グルタミル化合物も利用できる。しかし、γ-グルタミル基受容体としてはＬ型のアミノ酸を用いることはできるがＤ型のアミノ酸は用いることができないことが本発明者らの研究により明らかにされた。

本発明に用いるＧＧＴの取得方法は特に限定されないが、(i)ＧＧＴ産生菌を微生物培養することによりＧＧＴを生成蓄積させる方法、または、(ii)組み換えＤＮＡ技術によりＧＧＴを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することによりＧＧＴを生成蓄積させる方法が好ましい。

組み換えＤＮＡ技術によりＧＧＴを生成する形質転換体については、公知の手法を用いて作製することができる。具体的には、非特許文献２〜４に記載されている。

ＧＧＴの取得源となる微生物（ＧＧＴ産生菌および形質転換体のいずれも含む）の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。

通気条件としては、好気条件を採用することが好ましい。培養温度としては、菌が発育し、ＧＧＴが生産される範囲であれば良い。従って、厳密な条件は無いが、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃である。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、ＧＧＴが最も生産される時間まで培養すれば良く、通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度である。

培養後、菌体を遠心分離（たとえば、１０，０００ｘｇ、１０分）により集菌する。ＧＧＴの大部分は菌体中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させることにより、ＧＧＴの可溶化を行う。菌体破砕には、超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。

ＧＧＴ産生菌由来のＧＧＴを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残査を除いた方が、精製に有利である。

ＧＧＴの精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー等を採用することができる。その結果、より比活性が高いＧＧＴ含有画分を得ることができる。

[II]γ−Ｄ−グルタミル基供与体
γ−Ｄ−グルタミル基供与体とは、γ−Ｄ−グルタミル基受容体にγ−Ｄ−グルタミル基を供与可能な化合物であり、γ−Ｄ−グルタミル化合物を用いる。γ−Ｄ−グルタミル基供与体としては、Ｄ−Ｇｌｎ、γ−Ｄ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド等を使用することができる。

本発明では、反応に用いるＧＧＴのγ−Ｄ−グルタミル基供与体に対する基質特異性に応じて、使用するγ−Ｄ−グルタミル基供与体を適宜選択すればよい。例えば、エシェリヒア コリ由来のＧＧＴを用いる場合は、γ−Ｄ−グルタミル基供与体として、Ｄ−Ｇｌｎ、γ−Ｄ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン（グルタチオン）等を用いることができる。

本発明に用いるＧＧＴは、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない酵素であるため、γ−Ｄ−グルタミル化合物であるＤ−Ｇｌｎなどのγ−Ｄ−グルタミル基供与体は、ＧＧＴにγ−グルタミル基受容体として認識されない。したがって、γ−Ｄ−グルタミル基供与体に他のγ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−グルタミル基が転移する副反応や、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物にさらにγ−グルタミル基が転移する副反応を抑制することができる。このため、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物の収率を向上させることができる。

[III]γ−グルタミル基受容体
本発明に用いるＧＧＴは、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない酵素であるため、γ−グルタミル基受容体としては、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチド以外のアミノ基含有化合物を使用する。

従って、γ−グルタミル基受容体としては、例えば、アミン、Ｄ−アミノ酸以外のアミノ酸、Ｎ末端がＤ−アミノ酸以外のペプチドなどを使用することができる。なお、ここでいう「Ｎ末端がＤ−アミノ酸以外のペプチド」は、Ｎ末端がＤ−アミノ酸以外であれば、ペプチド中に含まれるＮ末端以外のアミノ酸についてはＬ型、Ｄ型のいずれであってもよい。γ−グルタミル基受容体としてペプチドを用いる場合は、ペプチド結合数が１０以下のオリゴペプチドであることが好ましく、ジペプチドまたはトリペプチドがより好ましい。

本発明では、反応に用いるＧＧＴのγ−グルタミル基受容体に対する基質特異性に応じて、γ−グルタミル基受容体の種類を適宜選択すればよい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＧＧＴを用いる場合は、γ−グルタミル基受容体として、アミン、Ｄ−アミノ酸以外のアミノ酸、Ｎ末端がＤ−アミノ酸以外のペプチドなどを用いることができる。具体的には、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−タウリン、エチルアミンが好ましく、特に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、またはＬ−Ｔｒｐが好ましい。

γ−グルタミル基受容体のアミノ基に、γ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−Ｄ−グルタミル基がアミド結合されることによって、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物が生成する。

本発明に用いるＧＧＴは、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない酵素である。したがって、γ−Ｄ−グルタミル基供与体として用いるγ−Ｄ−グルタミル化合物、および、生成したγ−Ｄ−グルタミル化合物は、γ−グルタミル基受容体として認識されない。このため、γ−Ｄ−グルタミル基供与体に他のγ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−Ｄ−グルタミル基が転移する副反応や、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物にさらにγ−Ｄ−グルタミル基が転移する副反応を抑制することができる。このため、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物の収率を向上させることができる。

[IV]反応条件
本発明においては、前述のＧＧＴ、γ−Ｄ−グルタミル基供与体、およびγ−グルタミル基受容体を含む反応液を調製し、γ−グルタミル基転移反応を進行させることにより、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物を生成する。

本発明において、ＧＧＴは、γ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−Ｄ−グルタミル基をγ−グルタミル基受容体のアミノ基にアミド結合する反応を触媒可能な限り、いかなる形態で反応系に添加してもよい。すなわち、ＧＧＴを精製酵素として反応系に添加してもよいし、ＧＧＴを含有するＧＧＴ活性を有する組成物の形態で反応系に添加してもよい。

ここで「ＧＧＴ活性を有する組成物」とは、γ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−グルタミル基をγ−グルタミル基受容体のアミノ基にアミド結合する反応を触媒し、かつ、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないＧＧＴを含むものであればよく、具体的には培養物、培地（培養物から菌体を除去したもの）、菌体（培養菌体、洗浄菌体のいずれも含む）、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、前記培地および／または細胞を精製処理することにより得られるＧＧＴ活性を有する組成物（粗酵素液）などを含む。例えば、ＧＧＴ産生菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、γ−Ｄ−グルタミル化合物を製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からＧＧＴを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、ＧＧＴ活性を有する画分であれば、どのような形態であっても本発明のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法に使用することが可能である。

また、γ−Ｄ−グルタミル基供与体として用いるγ−Ｄ−グルタミル化合物の反応系への供給形態としては、このγ−Ｄ−グルタミル化合物の光学異性体であるγ−Ｌ−グルタミル化合物を実質的に含まない状態が好ましい。反応系にγ−Ｄ−グルタミル基供与体としてγ−Ｄ−グルタミル化合物を添加する際、このγ−Ｄ−グルタミル化合物の光学異性体であるγ−Ｌ−グルタミル化合物が不純物として反応系に混入することがあるが、この不純物γ−Ｌ−グルタミル化合物はＧＧＴによってγ−グルタミル基供与体およびγ−グルタミル基受容体のいずれとしても認識されるので、様々な副反応を生じさせ、目的とするγ−Ｄ−グルタミル化合物の収率を低下させる要因となる。したがって、反応液中におけるこの不純物γ−Ｌ−グルタミル化合物の混入率が低いほど好ましく、具体的にはγ−Ｄ−グルタミル基供与体として用いるγ−Ｄ−グルタミル化合物に対して、γ−Ｌ−グルタミル化合物が、５０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下、最も好ましくは０％である。

ＧＧＴまたはＧＧＴ活性を有する組成物を用いてγ−グルタミル基転移反応を進行させるには、γ−Ｄ−グルタミル基供与体、γ−グルタミル基受容体、および、ＧＧＴまたはＧＧＴ活性を有する組成物を含む反応液を２０〜５０℃の適当な温度に調製し、３０分〜５日静置、振とう、または攪拌すればよい。反応液のｐＨは、使用するＧＧＴがγ−グルタミル基転移反応を触媒するのに適当な範囲に設定すればよい。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＧＧＴを用いる場合は、ｐＨ７〜１１、好ましくはｐＨ８〜１０．５、より好ましくは至適ｐＨであるｐＨ９〜１０．５に保ちつつ、反応を実施することが好ましい。

以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

なお、実施例において、γ−Ｇｌｕ−タウリンとγ−Ｇｌｕ-γ−Ｇｌｕ−タウリンはＨＰＬＣを用いて測定した。Cosmosil SC18-ARカラム(10 x 250 mm; ナカライテスク製)で分離後（溶出液は0.05%のトリフルオロ酢酸を含む水）、２１３ｎｍの紫外吸収をＵＶ ディテクター(model L-7100; 日立製作所)で測定した。Tocris Cookson 社(St. Louis, MO, USA)から購入したγ−Ｇｌｕ−タウリンをもとにγ−Ｇｌｕ−タウリンのピークを同定した。γ−Ｇｌｕ-γ−Ｇｌｕ−タウリンのピークは以下のように同定した。ＨＰＬＣでγ−Ｇｌｕ−タウリンと分離した未知のピークを大腸菌のＧＧＴを用いてｐＨ５．５で加水分解した（このｐＨはＧＧＴの加水分反応の至適ｐＨである）。得られた加水分解物の成分がグルタミン酸：タウリン＝２：１であったことから、このピークがγ−Ｇｌｕ-γ−Ｇｌｕ−タウリンであると同定した。グルタミン、タウリン、γ−Ｇｌｕ-Ｇｌｎ 、テアニンは、Shim-pack Amino-Na columnを装着したＨＰＬＣ (model LC-9A; 島津製作所)を用い、ポストカラム法でｏ-フタルアルデヒドでラベル後、蛍光ディテクターで検出した。

また、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリン、Ｌ−テアニンの測定法については、下記の文献に記載に従って行った。

H. Suzuki, N. Miyakawa, and H. Kumagai. Enzymatic production of γ-L-glutamyltaurine through the transpeptidation reaction of γ−glutamyltranspeptidase from Escherichia coli K-12.
Enzyme Microb. Technol., 30(7), 883-888 (2002).

H. Suzuki, S. Izuka, N. Miyakawa, and H. Kumagai. Enzymatic production of theanine, an“umami” component of tea, from glutamine and ethylamine with bacterial γ−glutamyltranspeptidase.
Enzyme Microb. Technol., 31(6), 884-889 (2002).

また、実施例で用いたＧＧＴは、下記の方法によって調製した。
まず、非特許文献２に記載の方法に従って、ＧＧＴ産生形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２を調製した。具体的には、ｐＵＣ１８にEscherichia coli ＦＥＲＭ Ｐ−１０５７９株のＧＧＴ遺伝子を挿入し、当該プラスミドを導入したＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２を調製した。

次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２をアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地で、２０℃で培養した（非特許文献３および非特許文献４参照）。ペリプラズム画分を調製し（非特許文献４）、硫安分画および定法のクロマトグラフィーによってＧＧＴを精製した（非特許文献２参照）。

実施例１ γ-グルタミルタウリンの収量への影響の検討
γ-グルタミル基供与体として、Ｄ−Ｇｌｎを用いた場合とＬ−Ｇｌｎを用いた場合のγ-グルタミルタウリンの収量に及ぼす影響を検討した。

γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの合成は、２００ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎ、２００ｍＭ タウリン、０．２Ｕ／ｍｌ ＧＧＴを含有する反応組成液を調製し、ｐＨ１０、３７℃を保持しながら反応を実施した。

また、γ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンの合成は、２００ｍＭ Ｄ−Ｇｌｎ、２００ｍＭ タウリン、および０．２Ｕ／ｍｌ ＧＧＴを含有する反応組成液を調製し、ｐＨ１０、３７℃を保持しながら反応を実施した。

５時間反応後のγ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンは約５０ｍＭ、対グルタミン収率２５％であった（図１Ａ参照）。反応開始１時間目までに、Ｌ−Ｇｌｎ量は急激に減少し、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの蓄積が見られた。また、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｎやγ−Ｌ−Ｇｌｕ-γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの蓄積も見られた。しかし、その後γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリン量はほとんど変化がなく、Ｌ−Ｇｌｎとγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｎが減少し、これらがなくなるまでγ−Ｌ−Ｇｌｕ-γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンは増加した。このことから、一定量以上のγ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンが蓄積すると、ＧＧＴはＬ−Ｇｌｎやγ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｎからタウリンばかりでなく、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンにγ-グルタミル基を転移すると考えられた。

このように、タウリンのようなγ-グルタミル基受容体へγ-グルタミル基を転移させようとする場合、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−Ｌ−Ｇｌｎやγ−Ｌ−Ｇｌｕ-γ−Ｌ−Ｇｌｕ-Ｘが多量副生する。

次に、上記と同一反応条件で、Ｌ−ＧｌｎをＤ−Ｇｌｎに代えて反応すると図１Ｂに示した結果を得た。５時間反応後のγ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンは１４２ｍＭ、対グルタミン収率７１％であった。

したがって、Ｄ体のグルタミンを用いることにより、他のγ−グルタミル化合物が副生することなく、γ−Ｇｌｕ−タウリンの対グルタミン収率を飛躍的に増大できることが分かった（表１参照）。

実施例２ テアニン（γ-グルタミルエチルアミド）の収量への影響の検討
γ-グルタミル基供与体として、Ｄ−Ｇｌｎを用いた場合とＬ−Ｇｌｎを用いた場合のテアニンの収量に及ぼす影響を同様に調べた。

Ｌ−テアニンの合成は、２００ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎ、１５００ｍＭエチルアミン、０．４Ｕ／ｍｌ ＧＧＴを含有する反応組成液を調製し、ｐＨ１０、３７℃を保持しながら反応を実施した。

また、Ｄ−テアニンの合成は、２００ｍＭ Ｄ−Ｇｌｎ、１５００ｍＭエチルアミン、０．４Ｕ／ｍｌ ＧＧＴを含有する反応組成液を調製し、ｐＨ１０、３７℃を保持しながら反応を実施した。

当該条件下では、５時間反応後のＬ−テアニンは１２１ｍＭ 、対グルタミン収率６１％であった。反応開始１時間目までに、Ｌ−Ｇｌｎ量は急激に減少し、Ｌ−テアニンとともにγ−Ｌ−Ｇｌｕ-Ｇｌｎの蓄積が見られた。２時間目までＬ−テアニン量は増加したが、それ以降は、Ｌ−テアニン量、γ−Ｌ−Ｇｌｕ-Ｇｌｎ 量ともにほとんど変化はなく、γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの場合と同様の結果となった（図２（Ａ−１）、（Ａ−２）参照）。

一方、５時間反応後のＤ−テアニンは１４７ｍＭ、対グルタミン収率７４％であった（図２（Ｂ−１）、（Ｂ−２）参照）。したがって、Ｄ体のグルタミンを用いることにより、他のγ−グルタミル化合物が副生することなく、テアニンの対グルタミン収率が増大した。（表１参照）

表１にまとめたように、Ｄ−Ｇｌｎをγ-グルタミル基供与体とした場合の方が、Ｌ−Ｇｌｎの場合に比べて収量が高くなることが分かった。この現象はγ−Ｇｌｕ−タウリンの場合に特に顕著であった。

実施例３ 反応生成物の精製と同定
（１）γ−Ｇｌｕ−タウリンの場合
γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの至適生成条件は、２００ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎ、２００ｍＭタウリン、０．２Ｕ／ｍｌ ＧＧＴ、ｐＨ１０、３７℃であった。そこで、この条件下で１時間反応させることでγ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンを酵素合成した。また、２００ｍＭ Ｄ−Ｇｌｎ、２００ｍＭタウリン、０．２Ｕ／ｍｌ ＧＧＴ、ｐＨ１０、３７℃で５時間反応させることで、γ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンを酵素合成した。

γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンは図３に示した方法で精製した。一方、γ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンの場合はDowex カラムのみで、精製できた。これは、他のγ−グルタミル化合物が副生しないことの一つの利点である。

生成物５ｍｇを０．５ｍｌの重水に溶かし、ＮＭＲ分析に供した(Bruker 500 MHz spectrometer)。γ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンの結果は図５に示す。γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの結果はEnzyme Microb. Technol.,30, 883-888 (2002)に記載されている。また、生成物５ｍｇを１．２ｍｌの蒸留水に溶かし、旋光度を測定した(Jasco DIP-1000 polarimeter)。

この結果、Ｌ−Ｇｌｎとタウリンを基質とした場合はγ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンが、Ｄ−Ｇｌｎとタウリンを基質とした場合はγ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンが生成したことを確認できた。

（２）テアニンの場合
Ｌ−テアニンの酵素合成は、２０ｍＭ Ｌ−Ｇｌｎ、１５０ｍＭ エチルアミン、０．０４ Ｕ／ｍｌ ＧＧＴ、ｐＨ１０の反応液３０ｍｌを用い、３７℃で５時間反応させた。Ｄ−テアニンの酵素合成は、１５０ｍＭ Ｄ−Ｇｌｎ、１５０ ｍＭ エチルアミン、０．２Ｕ／ｍｌ ＧＧＴ、ｐＨ１０の反応液２２ｍｌを用い、３７℃で５時間反応させた。

テアニンは図６に示した方法で精製した。生成物５ｍｇを０．５ｍｌの重水に溶かし、ＮＭＲ分析に供した(Bruker 500 MHz spectrometer)。Ｄ−テアニンの結果を図８に示す。Ｌ−テアニンの結果は、Enzyme Microb. Technol., 31(6), 884-889 (2002)の中に示した。また、Ｄ−テアニン１０ｍｇを１．０ｍｌの蒸留水に溶かし、旋光度を測定した(Jasco DIP-1000 polarimeter)。

この結果、Ｄ−Ｇｌｎとエチルアミンを基質とした場合はＤ−テアニンが生成したことを確認できた。

実施例４ γ-グルタミル基受容体に対する基質特異性
次に、Ｄ−グルタミンをγ-グルタミル基供与体としたときのγ-グルタミル基受容体に対する基質特異性を比した。

γ-グルタミル基供与体として２０ｍＭ Ｄ−Ｇｌｎを使用した。反応ｐＨは８．７３、各γ−Ｄ−グルタミル化合物の生成量を経時的にアミノ酸分析機で測定し、反応速度を算出した。反応液中のＧＧＴ濃度はＧｌｙ−Ｇｌｙを基質とした場合の活性にして０．００５４３ｍｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌに相当する酵素量を用いた。そのときの活性値を１００％として、各基質（γ−グルタミル基受容体）に対する反応性を相対値で示した。結果を下記表４、および、図９、１０に示す。

この結果、これらの基質の中でも、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−タウリン、エチルアミン、特に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｐｈｅ、およびＬ−Ｔｒｐについて反応性が高いことを確認できた。

実施例５ 大腸菌ＧＧＴのＤ−／Ｌ−γ−グルタミル化合物に対するKm, kcat 値の比
次に、大腸菌のＧＧＴのＤ体／Ｌ体のγ−グルタミル化合物に対するアフィニティーと反応性を比した。

ＧｐＮＡ：グルタミル−ｐ−ニトロアニリド

Ｄ体のγ−グルタミル化合物に対するアフィニティーが１０倍以上低いことが分かったが、kcat 値はそれほど変わらないため、物質生産のように大過剰の基質を反応液に入れるような場合は全く問題ないと考えられる。

以上のように、本発明のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法は、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しないγ−グルタミルトランスペプチターゼを用いるとともに、γ−グルタミル基供与体としてγ−Ｄ−グルタミル化合物を用い、かつ、γ−グルタミル基受容体としてＤ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチド以外のアミノ基含有化合物を用いることで、さまざまなγ−Ｄ−グルタミル化合物を光学特異的かつ効率的に酵素合成できる。

さらに、反応性の低いγ-グルタミル基受容体の場合も、γ-グルタミル基供与体としてγ−Ｄ−グルタミル化合物を用いることにより、Ｌ体のγ-グルタミル基供与体を用いる場合に比べて目的とするγ−グルタミル化合物を効率よく生産することが可能となる。また、本発明によれば、食品、医薬品等の様々な分野での需要が期待できるＤ体のγ−グルタミル化合物を、光学特異的に製造することができる。

かかる特徴を有する本発明のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法は、γ−Ｄ−グルタミルペプチド化合物を効率的に製造することができるので、工業上、特に食品、医薬品等の分野で極めて有用である。

(Ａ−１)γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの合成反応における反応生成物濃度の時間変化、(Ａ−２)γ−Ｌ−Ｇｌｕ−タウリンの合成反応における基質濃度の時間変化、（Ｂ−１）γ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンの合成反応における反応生成物濃度の時間変化、および、（Ｂ−２）γ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンの合成反応における基質濃度の時間変化を示すグラフである。 γ−Ｇｌｕ−タウリン(-黒□-) γ−Ｇｌｕ-γ−Ｇｌｕ−タウリン(-黒△-) γ−Ｇｌｕ-Ｇｌｎ (-□-) Ｇｌｎ(-黒○-) タウリン(-○-) (Ａ−１) Ｌ−テアニンの合成反応における反応生成物濃度の時間変化、(Ａ−２) Ｌ−テアニンの合成反応における基質濃度の時間変化、（Ｂ−１）Ｄ−テアニンの合成反応における反応生成物濃度の時間変化、および、（Ｂ−２）Ｄ−テアニンの合成反応における基質濃度の時間変化を示すグラフである。 テアニン (-黒□-) γ−Ｇｌｕ-Ｇｌｎ (-□-) Ｇｌｎ (-黒○-) γ−Ｇｌｕ−タウリンの合成および精製工程を示すフローチャートである。 標準品として購入したγ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンのＮＭＲのチャートを示す図である。 生成したγ−Ｄ−Ｇｌｕ−タウリンのＮＭＲのチャートを示す図である。 テアニンの合成および精製工程を示すフローチャートである。 標準品として購入したＬ−テアニンのＮＭＲのチャートを示す図である。 生成したＤ−テアニンのＮＭＲのチャートを示す図である。 γ−Ｄ−グルタミル化合物（γ−Ｄ−Ｇｌｕ−アミノ酸）の生成量（ｍＭ）の経時変化を表すグラフである。 γ−Ｄ−グルタミル化合物（γ−Ｄ−Ｇｌｕ−アミノ酸）の生成量（ｇ／Ｌ）の経時変化を表すグラフである。

Claims (6)

1. γ−グルタミルトランスペプチターゼの存在下で、γ−Ｄ−グルタミル基供与体のγ−Ｄ−グルタミル基をγ−グルタミル基受容体のアミノ基にアミド結合させることによりγ−Ｄ−グルタミル化合物を製造する方法であって、
   前記γ−グルタミルトランスペプチターゼが、Ｄ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチドをγ−グルタミル基受容体として認識しない酵素であるとともに、
   前記γ−グルタミル基受容体としてＤ−アミノ酸およびＮ末端がＤ−アミノ酸残基であるペプチド以外のアミノ基含有化合物を用いることを特徴とするγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。
2. 前記γ−グルタミルトランスペプチターゼが、エシェリヒア コリに由来するγ−グルタミルトランスペプチターゼであることを特徴とする請求項１に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。
3. 前記γ−Ｄ−グルタミル基供与体が、Ｄ−グルタミンであることを特徴とする請求項１または２に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。
4. 前記γ−グルタミル基受容体が、Ｄ−アミノ酸以外のアミノ酸またはアミンであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。
5. 前記γ−グルタミル基受容体が、グリシルグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−バリン、Ｌ−タウリン、及びエチルアミンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。
6. 前記γ−グルタミル基受容体が、グリシルグリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、またはＬ−トリプトファンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のγ−Ｄ−グルタミル化合物の製造方法。