JP5532920B2 - 低脂肪食品 - Google Patents

Description

本発明は、低脂肪食品、及び、低脂肪食品の呈味に脂肪様濃厚感及び滑らかさを付与するために用いられる呈味改善剤に関する。

近年、カロリーや脂肪の過剰摂取からくる生活習慣病に関する問題が注目されてきている。食品産業においてはその様な背景のもと、消費者ニーズの多様化、健康志向の高まりから、低カロリー、低脂肪、無脂肪食品などへの関心は益々高まってきている。これら需要のもと、様々な分野で商品開発が進められている。しかし、元来食品のおいしさへの脂肪の寄与は大きく、低脂肪、無脂肪食品ではその呈味は一般的にさっぱり、淡泊でコク味が弱く、脂肪由来の濃厚感やなめらかさも弱いのが課題となっており、消費者の嗜好を十分満足できるものではないのが現状である。
また、乳製品分野では、特に乳脂肪を植物油脂等へ代替する製品群が多いが、その呈味の違いが明確に現れることが多い。
これまでも、これら課題を解決する為に様々な取組みが行われてきており、例えば、乳製品関連では水溶性食物繊維を含有させることによる呈味改良法（特許文献１）、化工澱粉等を併用する品質改良法（特許文献２、３）、寒天を利用した呈味改良法（特許文献４）などがある。また、脂肪代替物関連としては構成脂肪酸に着目した油脂組成物に関する技術（特許文献５）など様々報告されている。
しかし、いずれも香り、風味、呈味、食感等おいしさの面から、また製造工程、価格の面からも十分に消費者の要求を満足するには至っていないのが現状である。

ところで、カルシウム受容体は、カルシウムセンシング受容体（Calcium Sensing Receptor：CaSR）とも呼ばれ、７回膜貫通型受容体（Ｇ蛋白質結合型受容体；GPCR）のクラスＣに分類されるアミノ酸１０７８個からなる受容体である。このカルシウム受容体は、１９９３年に遺伝子のクローニングが報告され（非特許文献１）、カルシウム等で活性化されると細胞内カルシウム上昇等を介して様々な細胞応答を引き起こすことが知られている。ヒトカルシウム受容体の遺伝子配列はGenBank Accession No NM_000388として登録されており、動物間でよく保存されている。

上記カルシウム受容体は、生体内機能に促進的にはたらく場合もあれば、抑制的にはたらく場合もある。このため、現在、神経疾患、肝臓疾患、循環器疾患、消化器疾患、その他の疾患において、カルシウム受容体に対する活性化作用を利用した治療薬と抑制作用を利用した治療薬が病態に応じて使い分けられている。例えば、カルシウム受容体は、副甲状腺において血中カルシウム濃度の上昇を感知し、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌を抑制し、血中カルシウム濃度を是正する働きを有する。従って、カルシウム受容体活性化剤は血中カルシウム濃度を低下させる効果が期待される。実際に、カルシウム受容体活性化剤を血液透析患者の続発性副甲状腺機能亢進症の治療に用いたとき、カルシウム濃度やリン濃度は上昇させずにPTH濃度を低下させることが明らかになっている。

カルシウム受容体の機能解析は、主としてカルシウムホメオスタシスに関して行われてきたため、今日までの応用研究もカルシウム調節が関わる骨代謝性疾患が中心であった。しかし、遺伝子発現解析などの結果から、カルシウム受容体が副甲状腺や腎臓以外の生体内に広く分布していることが明らかになり（非特許文献２、３）、様々な生体機能、疾患病因に関わっている可能性が提起された。例えば、カルシウム受容体が、肝臓、心臓、肺、消化管、リンパ球、膵臓、の機能に関わることが推測されている。本発明者もラットの各組織から抽出したＲＮＡを材料とした、ＲＴ−ＰＣＲによる解析から、生体内において広範囲の組織に発現していることを確認した。上記観点から、現在、カルシウム受容体の活性化剤や阻害剤の応用価値が急速に高まっている。

また、カルシウム受容体活性化剤としてはカルシウムの他に、ガドリニウムなどのカチオン、ポリアルギニンなどの塩基性ペプチド、スペルミンなどのポリアミン、フェニルアラニンなどのアミノ酸、などが報告されている（非特許文献４）。非特許文献５には、低分子ペプチドであるグルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）がＣaＳＲ活性化剤であることが報告されているが、ＣａＳＲが味覚受容に関わっている可能性については全く言及されていない。

現在まで、特定の構造を持ったアミノ酸又はペプチドがカルシウム受容体活性化剤として有用であることは知られていなかった。また、カルシウム受容体活性化作用を有するアミノ酸又はペプチドが、低脂肪食品の呈味に脂肪様濃厚感及び滑らかさを付与し得ることは知られていなかった。
特開２００６−１５８２３２ 特開２００４−２１５５６３ 特開２００４−２６７１６０ 特開２００６−１８０７９２ 特開２００２−１３８２９６ Nature, 1993, Vol.366(6455), p.575-580 J. Endocrinol., 2000, Vol.165(2), p.173-177 Eur. J. Pharmacol., 2002, Vol.447(2-3), p.271-278 Cell Calcium, 2004, Vol.35(3), p.209-216 J. Biol. Chem, 2006, Vol.281(13), p.8864-8870

本発明は、呈味に脂肪様濃厚感及び滑らかさが付与された低脂肪食品を提供することを課題とする。

本発明者は、カルシウム受容体の活性化剤を探索する過程で、カルシウム受容体活性化作用を有するアミノ酸及びペプチドを見出し、それらが低脂肪食品の呈味、特に脂肪様濃厚感及び滑らかさを改善することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）カルシウム受容体活性化作用を有する化合物が１重量ｐｐｂ〜９９．９重量％添加された低脂肪食品。
（２）前記化合物が、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ｇｌｙ（Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｙ（Ｙはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ、Ｌｅｕ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕおよびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）、からなる群から選択される１種または２種以上のアミノ酸またはペプチドである、（１）記載の低脂肪食品。
（３）前記ＸがＣｙｓ（ＳＮＯ）、Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）、Ａｂｕ、ｔＬｅｕ、Ｃｌｅ、Ａｌｂ、ＰｅｎまたはＳｅｒであり、前記ＹがＧｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｏｒｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、ＧｌｙＡまたはＬａｃＡである、（２）記載の低脂肪食品。
（４）前記化合物が、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙから選択される、（２）又は（３）記載の低脂肪食品。
（５）低脂肪食品が、乳製品、動物油脂及び／又は植物油脂含有食品、乳化食品からなる群から選択される１種又は２種以上である、）（１）〜（４）のいずれかひとつに記載の低脂肪食品。
（６）低脂肪食品の呈味に脂肪様濃厚感及び滑らかさを付与するための呈味改善剤であって、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む低脂肪食品用呈味改善剤。

カルシウム受容体に対するカルシウムの作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。任意の濃度の塩化カルシウム溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。１０ｍＭのＬ型アミノ酸溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するＤ型アミノ酸の作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。１０ｍＭのＤ型アミノ酸溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。 カルシウム受容体に対するペプチドの作用を示す図。 アフリカツメガエル卵母細胞にヒトのカルシウム受容体ｃＲＮＡをマイクロインジェクションした。任意の濃度のペプチド溶液を添加した時に、流れる細胞内応答電流値を記録した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。コントロールとして、蒸留水をマイクロインジェクションした卵母細胞では応答しないことを確認した。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物、好ましくはペプチド又はアミノ酸を含む低脂肪食品である。また、本発明の他の形態は、低脂肪食品の呈味に脂肪様濃厚感及び滑らかさを付与するために低脂肪食品に添加される呈味改善剤であって、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む脂肪食品用呈味改善剤である。本発明の脂肪食品用呈味改善剤は、低脂肪食品に添加して喫食したときに、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善する効果を有する。また、本発明の別の形態は、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を含む脂肪食品用呈味改善剤が添加されてなる低脂肪食品である。

まず、カルシウム受容体活性化作用を有するアミノ酸又はペプチドについて説明する。
本発明者らは、カルシウム受容体活性化作用を有するアミノ酸又はペプチドが、食品にコク味（kokumi）を付与し得ることを見出している。一般には、「コク味」とは、甘味（sweet taste）、塩味（salty taste）、酸味（sour taste）、苦味（bitter taste）、うま味（umami）で表される５基本味（five basic tastes）では表せない味を意味し、基本味だけではなく、厚み（thickness）・ひろがり（growth (mouthfulness)）・持続性（continuity）・まとまり（harmony）など基本味の周辺の味（marginal tastes）をも増強した味をいう。本発明者らは、コク味の中でも、特に低脂肪食品に脂肪様濃厚感（fat-like richness）及び滑らかさ（smoothness）を、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物が付与し得ることを見出した。
本発明において「低脂肪食品」とは、元来脂肪を含む食品であって、その脂肪含量が低減された食品をいう。ここでいう「脂肪」は「油脂」と同義であり、固体である狭義の脂肪、常温液体の脂肪油の両方を含む。また、動物性脂肪及び植物性脂肪の両方を含む。
本発明に用いるアミノ酸又はペプチドは、脂肪を含む食品に、脂肪の含量により程度の差があるとしても、脂肪様濃厚感及び滑らかさを付与することができる。したがって、脂肪含量の「低減」の程度に制限はないが、脂肪様濃厚感の付与の効果からは、通常の同種の脂肪含有食品であって、脂肪含量を低減する処理を施していない食品よりも脂肪の含有量が少ない食品であることが好ましい。
また、「脂肪様濃厚感及び滑らかさ」を付与するとは、脂肪様濃厚感及び滑らかさがほとんど感じられない食品に脂肪様濃厚感及び滑らかさを持たせること、及び、食品が元来持つ脂肪様濃厚感及び滑らかさを高めることの両方を含む。本明細書にいう「脂肪様濃厚感及び滑らかさの改善」も同義である。
低脂肪食品として具体的には、牛乳、ヨーグルト、バター、クリーム等の乳製品、マーガリン、コーヒー用ミルク、 ソース、ルーなどの動物油脂及び／又は植物油脂含有食品、ドレッシング、マヨネーズなどの乳化食品等が挙げられる。

一方、本発明において「脂肪様濃厚感」とは、脂肪を含む食品を喫食したときに感じる、主に中味（middle taste）から後味（aftertaste）を中心とした濃厚感（richness）をいう。また、「滑らかさ」とは、脂肪を含む食品を喫食したときに感じる、カドのないまとまり（mildness, roundness）のことをいう。一般的にはそれら二つが組み合わさることにより、口腔内又は舌の周りに味がカドがなくまとわりつき（sticky）、残る様なしっかりとした脂肪様の呈味（lasting pronounced and fatty taste）を感じる。味覚は、喫食後の時間経過とともに変化するが、喫食直後から順に、先味（initial taste）、中味（middle taste）及び後味（aftertaste）という。これらは相対的な概念であるが、典型的には、先味、中味及び後味は、それぞれ喫食後０から２秒まで、３秒から４秒まで、及び５秒以降に感じる呈味である。以下、脂肪様濃厚感及び滑らかさを併記する場合を除いて、これらをまとめて単に「脂肪様濃厚感（fat-like richness）」と記載することがある。

本明細書中において「カルシウム受容体」とは、カルシウムセンシング受容体もしくはCalcium Sensing Receptor（ＣａＳＲ）と呼ばれる、７回膜貫通型受容体のクラスＣに属するものを指す。本明細書中において「カルシウム受容体活性化剤」とは、上記カルシウム受容体に結合し、カルシウム受容体を活性化するものをいう。また、本明細書中において「カルシウム受容体を活性化する」とは、カルシウム受容体にリガンドが結合し、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を活性化して、シグナルを伝達することを意味する。また、カルシウム受容体がこのシグナルを伝達することを「カルシウム受容体活性」という。
本明細書中において各アミノ酸及び各ペプチドを構成するアミノ酸は、特に断わらない限りいずれもＬ体である。

＜１＞カルシウム受容体活性化作用を有する化合物
カルシウム受容体活性化作用を有する化合物は、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善する効果を有する限り、アミノ酸、ペプチドもしくはこれらの誘導体や、各種低分子化合物であってもよい。また、新規な化合物であってスクリーニングにより得られるものであっても良い。例えば、カルシウム受容体と被検物質とを反応させ、カルシウム受容体活性を検出することにより取得することができる。このようにして得られる化合物について、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善する効果を有することを確認することが好ましい。

以下に、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物をスクリーニングする方法を具体的に示すが、これらのステップに限定されるものではない。
１）カルシウム受容体活性を測定するためのカルシウム受容体活性測定系に被検物質を添加して、カルシウム受容体活性を測定する。
２）被験物質を添加したときのカルシウム受容体活性と、被験物質を添加しなかったときのカルシウム受容体活性を比較する。
３）被験物質を添加したときに高いカルシウム受容体刺激活性を示す被験物質を選択する。

カルシウム受容体活性の測定は、例えば、カルシウム受容体を発現する細胞を用いた測定系を用いて行われる。上記細胞はカルシウム受容体を内在的に発現している細胞であっても、外来のカルシウム受容体遺伝子が導入された組み換え細胞であってもよい。上記カルシウム受容体活性測定系は上記カルシウム受容体を発現する細胞に、カルシウム受容体に特異的な細胞外リガンド（活性化剤）を加えたときに、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）を検出することができるか、又は、活性化剤とカルシウム受容体との結合（反応）に応答して細胞内に検出可能なシグナルを伝達するものであれば、特に制限なく使用することができる。被検物質との反応によりカルシウム受容体活性が検出された場合、当該被検物質はカルシウム受容体刺激活性を有し、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善し得る物質であることが判別される。

一方、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善する効果は、ヒトによる味覚試験などの方法によって確認することができる。また、被験物質として用いるアミノ酸及びペプチドは特に制限はないが、ペプチドとしては２〜１０のアミノ酸残基からなるペプチド又はその誘導体が好ましく、２又は３個のアミノ酸残基からなるペプチド又はその誘導体がより好ましい。また、ペプチドのＮ末端側のアミノ酸残基は、γ−グルタミン酸であることが好ましい。

上記カルシウム受容体は、その由来は特に制限されず、上記ヒトのカルシウム受容体のみならず、マウス、ラット、イヌなど含めた動物由来のカルシウム受容体が挙げられる。

上述の如く、カルシウム受容体活性は、カルシウム受容体又はその断片を発現した生きた細胞、カルシウム受容体又はその断片を発現した細胞膜、カルシウム受容体又はその断片のタンパク質を含むインビトロの系などを利用して確認することが出来る。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。

カルシウム受容体は、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスタ−卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞で発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにカルシウム受容体遺伝子をクロ−ニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたｃＲＮＡを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。

カルシウム受容体の発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確認する。５ｍＭ程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が見られた卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が見られた培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、ペプチド等の被験物質を１μＭ〜１ｍＭ程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加することで、上記ペプチド等の被験物質のカルシウム受容体活性を測定する。

本発明において使用される化合物は、カルシウム受容体活性化作用を有する各種アミノ酸、ペプチド、もしくはこれらの誘導体、または各種低分子化合物が挙げられる（以下、単に「アミノ酸」、「ペプチド」というときは、それぞれアミノ酸およびアミノ酸誘導体、ペプチドおよびペプチド誘導体のいずれをも含有する意味に用いられる場合もある）。本発明において使用されるカルシウム受容体活性化作用を有するアミノ酸又はペプチドは、低脂肪食品に添加して喫食したときに、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善する効果を有するアミノ酸又はペプチドであればよい。このようなアミノ酸又はペプチドとしては、例えば、γ-Glu-X-Gly （Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y (Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu- Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）（以下、下記のペプチド誘導体と合わせて、本発明のペプチド等ともいう）が挙げられる。本発明においては、これらのペプチド等は１種を用いてよく、これらの２種以上を併用してもよい。

また、ペプチドは、γ−Ｇｌｕ−Ｘ−ＯＣＨ（Ｚ）ＣＯ₂Ｈの構造を有するペプチド誘導体であってもよい。ここに、式中Ｘはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表し、ＺはＨ（水素原子）又はＣＨ₃（メチル基）を表す。また、前記式γ-Glu-Val-Yにおいて、YがGlyAまたはLacAである化合物であってもよい。具体例としては、γ-Glu-Val-GlyA、γ-Glu-tLeu-GlyA、γ-Glu-Abu-GlyA、γ-Glu-Val-LacA、γ-Glu-tLeu-LacA、及びγ-Glu-Abu-LacA等が好適に挙げられる。なお、GlyAとは、グリコール酸を表し、LacAとは、酪酸を表す。酪酸はＳ体とＲ体のいずれでも良いが、好ましくはＳ体である。これらの化合物の構造式を以下に記す。

ここで、アミノ酸とは、Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Cys, Met, Asn, Gln, Pro, Hyp，t-Leu, などの中性アミノ酸、Asp, Gluなどの酸性アミノ酸、Lys, Arg, Hisなどの塩基性アミノ酸、Phe, Tyr, Trpなどの芳香族アミノ酸や、ホモセリン、シトルリン、オルニチン、α-アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、タウリンなども含有する。また、tert−ロイシン、シクロロイシン、α−アミノイソブチル酸、Ｌ−ペニシラミンなどの非天然（非タンパク質構成）アミノ酸であっても良い。尚、ペプチドγ-Glu-X-Glyにおいて、Xは上記のようなアミノ酸又はその誘導体のいずれでもよいが、Cys以外のアミノ酸又はその誘導体が好ましい。

本明細書においてアミノ基残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
（１）Ｇｌｙ：グリシン
（２）Ａｌａ：アラニン
（３）Ｖａｌ：バリン
（４）Ｌｅｕ：ロイシン
（５）Ｉｌｅ：イソロイシン
（６）Ｍｅｔ：メチオニン
（７）Ｐｈｅ：フェニルアラニン
（８）Ｔｙｒ：チロシン
（９）Ｔｒｐ：トリプトファン
（１０）Ｈｉｓ：ヒスチジン
（１１）Ｌｙｓ：リジン
（１２）Ａｒｇ：アルギニン
（１３）Ｓｅｒ：セリン
（１４）Ｔｈｒ：トレオニン
（１５）Ａｓｐ：アスパラギン酸
（１６）Ｇｌｕ：グルタミン酸
（１７）Ａｓｎ：アスパラギン
（１８）Ｇｌｎ：グルタミン
（１９）Ｃｙｓ：システイン
（２０）Ｐｒｏ：プロリン
（２１）Ｏｒｎ：オルニチン
（２２）Ｓａｒ：サルコシン
（２３）Ｃｉｔ：シトルリン
（２４）Ｎ−Ｖａｌ：ノルバリン
（２５）Ｎ−Ｌｅｕ：ノルロイシン
（２６）Ａｂｕ：α−アミノ酪酸
（２７）Ｔａｕ：タウリン
（２８）Ｈｙｐ：ヒドロキシプロリン
（２９）ｔ−Ｌｅｕ：ｔｅｒｔ−ロイシン
（３０）Ｃｌｅ：シクロロイシン
（３１）Ａｉｂ：α−アミノイソブチル酸（α-aminoisobutyric acid、2−メチルアラニン）
（３２）Ｐｅｎ：Ｌ−ペニシラミン（penicillamine）

また、アミノ酸誘導体とは、上記アミノ酸の各種誘導体であって、例えば、特殊アミノ酸や非天然アミノ酸、アミノアルコール、或いは末端カルボニル基やアミノ基、システインのチオール基などのアミノ酸側鎖が各種置換基により置換したものが挙げられる。置換基としては、アルキル基、アシル基、水酸基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、スルフォニル基や各種保護基などが挙げられ、例えば、Ａｒｇ（ＮＯ₂）：Ｎ−γ−ニトロアルギニン、Ｃｙｓ（ＳＮＯ）：Ｓ−ニトロシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）：Ｓ−メチルシステイン、Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）：Ｓ−アリルシステイン、Ｖａｌ−ＮＨ₂：バリンアミド、Ｖａｌ−ｏｌ：バリノール（２−アミノ−３−メチル−１−ブタノール）などが含まれる。

尚、本明細書において、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙは下記の構造式を有するものであり、上記γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）およびγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）式中の（Ｏ）はスルフォキシド構造であることを意味する。γ-Gluの(γ)とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシ基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。

γ-Glu-X-Gly （Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y (Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu- Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）は、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善する。
従って、γ-Glu-X-Gly （Xはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す）、γ-Glu-Val-Y (Yはアミノ酸又はアミノ酸誘導体を表す)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu- Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）（以下、本発明に用いられるペプチド又はアミノ酸ともいう）は、低脂肪食品の呈味に脂肪様濃厚感を付与するために、低脂肪食品に添加される、低脂肪食品用呈味改善剤として用いることができる。

本発明に用いられる化合物は単独で用いてもよく、また任意の２種又は３種以上を混合して用いることもできる。これらの中でも、γ-Glu-X-Gly （X はCys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、Abu、t-Leu、Cle、Aib、PenまたはSerである）、又はγ-Glu-Val-Y (YはGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、 Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、Cys、Gln、GlyAまたはLacAである)の構造式を有する化合物が好ましい。これらの化合物のうち、中でも好ましい化合物は、γ-Glu-Val-Gly、及びγ-Glu-Abu-Glyである。

上記本発明に用いられる化合物は、市販されているものであれば、市販品を用いることが可能である。また、ペプチドの場合は、（１）化学的に合成する方法、又は（２）酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。本発明において用いられるペプチドは、含まれるアミノ酸の残基数が２〜３残基と比較的短いので、化学的に合成する方法が簡便である。化学的に合成する場合は、該オリゴペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続くペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。

また、本発明において用いられるペプチドを、酵素的な反応により生産することも出来る。例えば、国際公開パンフレットＷＯ２００４／０１１６５３号に記載の方法を用いることが出来る。即ち、一方のアミノ酸又はジペプチドのカルボキシル末端をエステル化又はアミド化したアミノ酸又はジペプチドと、アミノ基がフリーの状態であるアミノ酸（例えばカルボキシル基が保護されたアミノ酸）とを、ペプチド生成酵素の存在下において反応せしめ、生成したジペプチド又はトリペプチドを精製することによっても生産することもできる。ペプチド生成酵素としては、ペプチドを生成する能力を有する微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体、又は、該微生物の菌体処理物、又は、該微生物に由来するペプチド生成酵素が挙げられる。
尚、上述した様な酵素的な方法や化学的合成法以外にも本発明において用いられるペプチドが、野菜や果物等の植物、酵母等の微生物、酵母エキス等に存在する場合がある。天然に存在する場合には、これらから抽出して用いてもかまわない。
また、単離して用いる必要はなく、本発明のペプチドを多く含んでいる画分を用いてもかまわない。

本発明において用いられる低分子化合物としてはシナカルセット（(R)-N-(3-(3-(トリフルオロメチル)フェニル)プロピル)-1-(1-ナフチル)エチルアミン）及びその類縁化合物が挙げられる。シナカルセットの類縁化合物としては、下記化学式（１）で示される化合物（(R)-N-[(４−エトキシ−３−メチルフェニル)メチル]-1-(1-ナフチル)エチルアミン））または化学式（２）で示される化合物（(R)-N-(3-フェニルプロプ-2-エニル)-1-(3-メトキシフェニル)エチルアミン）等が挙げられる。これらの化合物は、例えば、米国特許第6211244号公報に記載されるような公知の方法により合成することができる。また、市販品を用いることもできる。

本発明において用いられる化合物は塩の形態をも包含する。本発明のペプチド及びアミノ酸が塩の形態を成し得る場合、その塩は薬理学的に許容されるものであればよく、例えば、式中のカルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。式中に塩基性基が存在する場合の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸などの無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。

＜２＞脂肪食品用呈味改善剤及び低脂肪食品
本発明に用いられる化合物、好ましくはペプチド及びアミノ酸は、低脂肪食品の脂肪様濃厚感を改善するために低脂肪食品に添加される低脂肪食品用呈味改善剤として用いることができる。前記化合物は、１種のみでもよく、２種以上の混合物であってもよい。また、本発明に用いられる化合物は、低脂肪食品に配合することにより、脂肪様濃厚感が改善された低脂肪食品を構成することができる。

本発明の低脂肪食品用呈味改善剤は、例えば、上記本発明に用いられる化合物から選ばれる１種または２種以上のみで構成されていても良く、さらに、低脂肪食品用の呈味を改善する作用を有する他の化合物や各種添加物等を任意に添加され、構成されることも可能である。

低脂肪食品に添加する低脂肪食品用呈味改善剤の量は、低脂肪食品の呈味、特に脂肪様濃厚感を改善し得る量であれば特に制限されないが、具体的には例えば、低脂肪食品中、化合物の量として、１重量ｐｐｂ〜９９．９重量％、好ましくは１０重量ｐｐｂ〜１０重量％、より好ましくは１重量ｐｐｍ〜１重量％程度である。

本発明の低脂肪食品は、本発明に用いられる化合物を含む。前記化合物は、１種のみでもよく、２種以上の混合物であってもよい。本発明の低脂肪食品の成分は、前記化合物を含む以外は、従来の低脂肪食品と特に変るところはない。その製法も、前記化合物を添加する以外は、通常の低脂肪食品と同様にして製造することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

〔参考例１〕カルシウム受容体遺伝子（ｃＲＮＡ）の調製
カルシウム受容体の遺伝子の調製は以下のように行った。ＮＣＢＩに登録されたＤＮＡ配列（カルシウム受容体：NM_000388）を元に、ＰＣＲに使う合成オリゴＤＮＡ（フォワードプライマー（配列番号１）、及びリバースプライマー（配列番号２））を合成した。

ヒト腎臓由来のｃＤＮＡ（Clontech社製）を材料として、前記プライマー、及びPfu ultra DNA Polymerase（Stratagene社製）を用い、以下の条件でＰＣＲを実施した。９４℃で３分の後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分を３５回繰り返した後、７２℃で７分反応させた。ＰＣＲによって増幅がなされたか否かをアガロース電気泳動を行い、ＤＮＡ染色試薬で染色した後、紫外線照射によって検出した。同時に電気泳動したサイズ既知のＤＮＡマーカーと比較することで、ＰＣＲ産物の鎖長を確認した。プラスミドベクターｐＢＲ３２２を制限酵素ＥｃｏＲＶ（Takara社製）によって切断した。その切断部位にＰＣＲによって増幅された遺伝子断片をLigation Kit（Promega社製）を用いて連結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリＤＨ５α株を形質転換し、ＰＣＲ増幅産物がクローニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜した。ＰＣＲ増幅産物をＤＮＡ塩基配列解析によって確認した。この組換えプラスミドを鋳型とし、ｃＲＮＡ作製キット（Ambion社）を用いてカルシウム受容体遺伝子のｃＲＮＡを作製した。

〔参考例２〕各種試料の調製
Ｌ型アミノ酸試料として、各々特級グレードのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン（上記、味の素株式会社）、ヒドロキシプロリン（ナカライテスク株式会社）の２３種類を用いた。Ｄ−ＣｙｓおよびＤ−Ｔｒｐ（ナカライテスク株式会社）及び塩化カルシウムは特級グレードのものを用いた。

また、ペプチド試料として、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙ（株式会社同仁化学研究所）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ（Ａｂｕ：α−アミノ酪酸、Ｂａｃｈｅｍ Ｆｅｉｎｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ ＡＧ）、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（国産化学株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（国産化学株式会社）、γ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ（国産化学株式会社）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（受託合成品）、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（受託合成品）、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ（受託合成品）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（受託合成品）、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（受託合成品）、Ｌｅｕ−Ａｓｐ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｏｒｎ（受託合成品）、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（受託合成品）を用いた。グルタミン、システインは用事調製し、他の試料は調製後、−２０℃に保存した。ペプチドは純度９０％以上のものを用いた。γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓのみ純度８０％以上のものを用いた。

各試料を溶解した後、ｐＨが酸性、アルカリ性のものについては、ＮａＯＨ、ＨＣｌを用いて中性前後に調整した。アミノ酸、ペプチドの溶解液、アフリカツメガエル卵母細胞の調製用の溶液、卵母細胞の培養用の溶液は、以下の組成のものを使用した。９６ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１．８ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２。

〔参考例３〕γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの合成
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（８．６９ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）とＧｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ（８．０７ ｇ， ４０．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１００ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（６．１３ ｍｌ， ４４．０ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ， ６．７４ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ８．４４ ｇ， ４４．０ ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル（２００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（５０ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−ｎ−ヘキサンから再結晶してＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（１３．２ ｇ， ３６．２ ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。

Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ（５．４７ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ）を４Ｎ−ＨＣｌ／ジオキサン溶液（４０ ｍｌ）に加え、室温で５０分撹拌した。ジオキサンを減圧濃縮で除き、残渣にｎ−ヘキサン（３０ ｍｌ）を加え減圧濃縮した。この操作を３回繰り返し、Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌを定量的に得た。
上記Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ及びＺ−Ｇｌｕ−ＯＢｚｌ（５．５７ ｇ， １５．０ ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５０ ｍｌ）に溶解し、溶液を０℃に保った。トリエチルアミン（２．３０ ｍｌ， １６．５ ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ， ２．５３ ｇ， １６．５ ｍｍｏｌ）及びＷＳＣ・ＨＣｌ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ， ３．１６ ｇ， １６．５ ｍｍｏｌ）を溶液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル（１５００ ｍｌ）に溶解した。溶液を水（２００ ｍｌ）、５％クエン酸水溶液（２００ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（１５０ ｍｌ）、５％炭酸水素ナトリウム水溶液（２００ ｍｌ ｘ ２回）、飽和食塩水（１５０ ｍｌ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。析出した結晶を濾取、減圧乾燥してＺ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．５１ ｇ，１０．５ ｍｍｏｌ）を白色結晶として得た。

上記Ｚ−Ｇｌｕ（Ｖａｌ−Ｇｌｙ−ＯＢｚｌ）−ＯＢｚｌ（６．２０ ｇ， １０．０３ ｍｍｏｌ）をエタノール（２００ ｍｌ）に懸濁し、１０％パラジウム炭素（１．５０ ｇ）を加え、水素雰囲気下に５５℃で５時間還元反応を行った。この間、全量で１００ ｍｌの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロートで濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を少量の水に溶かした後にエタノールを加えて結晶を析出させ、結晶を濾過して集め減圧乾燥してγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙの白色粉末（２．８５ ｇ， ９．４０ ｍｍｏｌ）を得た。

ＥＳＩ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３０４．１．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：０．８７ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）， ０．８８ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）， １．９９−２．０９ （３Ｈ， ｍ）， ２．３８−２．５１ （２Ｈ， ｍ）， ３．７２ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．３５ Ｈｚ）， ３．８６ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．８ Ｈｚ）， ３．８０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１７．８ Ｈｚ）， ４．０７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝６．８ Ｈｚ）．

〔参考例４〕γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）−Ｇｌｙの合成［Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）：Ｓ−メチルシステイン］
還元型グルタチオン（１５．０ ｇ， ４８．８ ｍｍｏｌ）を水（４５ ｍｌ）に加え、窒素を吹き込みながら水酸化ナトリウム（４．５２ ｇ， ２．２当量， １０７ ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。ヨウ化メチル（４．５６ ｍｌ， １．５当量， ７３ ｍｍｏｌ）を加え、密栓して室温で２時間撹拌した。濃塩酸で反応液のｐＨを２〜３に調整し、エタノール（１５０ ｍｌ）を加え冷蔵庫に一夜保存した。油状物が分離したので、上澄みを除いた。残った油状物を水に溶かしエタノールを徐々に加えると、一部結晶を伴う油状物が析出したので再度上澄みを除いた。残渣を水（３００ ｍｌ）に溶解し、イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ １−ａｃｅｔａｔｅ， ４００ ｍｌ）を充填したカラムに吸着させ、水洗した後に１Ｎ−酢酸水溶液で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、水−エタノールから再沈殿させ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）−Ｇｌｙの白色粉末（５．０８ ｇ， １５．８ ｍｍｏｌ）を得た。

ＦＡＢ−ＭＳ：（Ｍ＋Ｈ）⁺＝３２２．
¹Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， Ｄ₂Ｏ）δ（ｐｐｍ）：２．１４ （３Ｈ， ｓ）， ２．１５−２．２２ （２Ｈ， ｍ）， ２．５０−２．５８ （２Ｈ， ｍ）， ２．８６ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９．０ Ｈｚ， Ｊ＝１４．０ Ｈｚ）， ３．０３ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝５．０ Ｈｚ， Ｊ＝１４．０ Ｈｚ）， ３．８４ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝６．５ Ｈｚ）， ３．９９ （２Ｈ， ｓ）， ４．５９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝５．０ Ｈｚ， Ｊ＝９．０ Ｈｚ）．

〔参考例５〕その他ペプチドの合成
γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ＮＨ₂、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−ｏｌ、γ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、γ−Ｇｌｕ−Ｔａｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）（Ｏ）、γ−Ｇｌｕ−ｔ−Ｌｅｕ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−ａｌｌｙｌ）−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（Ｓ−Ｍｅ）は参考例３および参考例４に準じて合成した。

〔参考例６〕カルシウム受容体の活性化作用の評価
カルシウム受容体の活性化作用の評価には、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたＣａ濃度イオン依存性Ｃｌイオン電流測定法を用いた。カルシウム受容体を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に、各活性化剤を添加すると、細胞内のＣａイオンが増加する。次にＣａ濃度イオン依存性Ｃｌチャネルが開き、イオン電流として細胞内電流値が変化する。この細胞内電流値の変化を測定することで、カルシウム受容体の活性化作用の有無を知り得ることができる。

具体的には、アフリカツメガエル腹部を切開し、卵塊を取り出した後、１％コラゲナ−ゼ溶液により２０℃で２時間処理することで個々の卵母細胞を得た。１個あたりの卵母細胞に、マイクロガラスキャピラリ−を用いて５０ｎｌの１μｇ／μｌ受容体ｃＲＮＡもしくは５０ｎｌの滅菌水を導入し、１８℃で２〜３日培養した。培養時には、参考例２で示した溶液に２ｍＭピルビン酸と１０Ｕ／ｍｌペニシリンと１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたものを使用した。培養後、ｃＲＮＡを注入した卵母細胞もしくは滅菌水を注入した卵母細胞に対し、試験溶液を添加した。電気生理学的測定は、増幅器Ｇｅｎｅｃｌａｍｐ５００（Ａｘｏｎ社製）および記録用ソフトＡｘｏＳｃｏｐｅ９．０（Ａｘｏｎ社製）を用いて行った。卵母細胞を２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌイオンを介した細胞内電流を測定した。細胞内電流の最大値を応答電流値とした。

〔参考例７〕カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用の評価
参考例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、カルシウム（２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図１に示した。この結果より、卵母細胞に注入したカルシウム受容体のｃＲＮＡが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のカルシウムにも反応していないことから、卵母細胞自身にはカルシウム受容体が発現していないことが確認された。

〔参考例８〕カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の活性化作用の評価
参考例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するＬ型アミノ酸の活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、アラニン（１０ｍＭ）、アルギニン（１０ｍＭ）、アスパラギン（１０ｍＭ）、アスパラギン酸（１０ｍＭ）、システイン（１０ｍＭ）、グルタミン（１０ｍＭ）、グルタミン酸（１０ｍＭ）、グリシン（１０ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ）、イソロイシン（１０ｍＭ）、ロイシン（１０ｍＭ）、リジン（１０ｍＭ）、メチオニン（１０ｍＭ）、フェニルアラニン（１０ｍＭ）、プロリン（１０ｍＭ）、セリン（１０ｍＭ）、トレオニン（１０ｍＭ）、トリプトファン（１０ｍＭ）、チロシン（１０ｍＭ）、バリン（１０ｍＭ）、オルニチン（１０ｍＭ）、タウリン（１０ｍＭ）、又はヒドロキシプロリン（１０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図２に示した。この結果より、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。なお、上記アミノ酸についてはＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００ Ａｐｒ ２５；９７（９）：４８１４−９で活性化作用が報告されている。

〔参考例９〕カルシウム受容体に対するＤ−システインの活性化作用の評価
参考例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するＤ−システインの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、Ｄ−システイン（１０ｍＭ）、Ｌ−システイン（１０ｍＭ）、Ｄ−トリプトファン（１０ｍＭ）又はＬ−トリプトファン（１０ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図３に示した。この結果より、Ｄ−システインがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。

〔参考例１０〕カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用の評価
参考例６に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のｃＲＮＡもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、２電極膜電位固定法により−７０ｍＶに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（ＳＮＯ）−Ｇｌｙ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ（５００μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ（５００μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ（５０μＭ）、γ−Ｇｌｕ−Ｏｒｎ（５００μＭ）、Ａｓｐ−Ｇｌｙ（１ｍＭ）、Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（１ｍＭ）、Ｃｙｓ−Ｍｅｔ（１ｍＭ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（５０μＭ）、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（５００μＭ）、Ｌｅｕ−Ａｓｐ（１ｍＭ）を添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。結果は図４に示した。この結果より、上記ペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが示された。

〔参考例１１〕カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用の評価
参考例１０と同様に、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。膜に電位固定された卵母細胞に、表１の各ペプチドについて、１０００μＭ、３００μＭ、１００μＭ、３０μＭ、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭを添加し、Ｃａ濃度イオン依存性Ｃｌ応答電流を測定した。電流が検出された最低濃度を表１に活性として示した。この結果より、これら３２種類のペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが明らかとなった。

〔参考例１２〕本発明に用いられるペプチド及びアミノ酸のコク味付与活性
カルシウム受容体活性化作用が見出された、γ-Glu-X-Gly （X はCys(SNO)、Cys(S-allyl)、Gly、Cys(S-Me)、AbuまたはSerである）、γ-Glu-Val-Y (YはGly、Val、Glu、Lys、Phe、Ser、Pro、Arg、Asp、Met、Thr、His、Orn、Asn、CysまたはGlnである)、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu- Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH₂、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys（S-Me）（O）、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leuおよびγ-Glu-Cys（S-Me）、の中から代表例を選んで、官能評価試験によりコク味付与活性の有無を調べた。

官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化カルシウム（１ｍＭ）を含有する蒸留水に、試料としてアリイン（ａｌｌｉｉｎ: S-allyl-cysteine sulfoxide、コク味付与活性のコントロール）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌをそれぞれ０．２ｇ／ｄｌで混合した場合の、コク味付与活性の有無を判定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせてから使用した。結果を表２に示した。

〔参考例１３〕本発明に用いられるペプチドのコク味付与活性
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、γ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌをそれぞれ０．１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせて使用した。尚、グルタチオンは、食品にコク味を付与し得ることが知られているため、比較対照として用いた。官能評点について、コントロール：０点、グルタチオン添加：３点として、ｎ＝３で実施し、結果を表３に示した。尚、「先中味」とは、先味と中味を合わせたものである。

〔参考例１４〕本発明に用いられるペプチドのコク味付与活性
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．１ｇ／ｄｌ、必要に応じて０．０１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、グルタチオン添加：３点として、ｎ＝５で実施し、結果を表４に示した。

〔参考例１５〕本発明に用いられるペプチドのコク味付与活性
カルシウム受容体活性化作用が見出されたペプチドについて定量的な官能評価試験によりコク味付与活性の強度を調べた。

定量的官能評価試験は以下のように実施した。グルタミン酸ナトリウム（０．０５ｇ／ｄｌ）、イノシン酸一リン酸（０．０５ｇ／ｄｌ）、塩化ナトリウム（０．５ｇ／ｄｌ）を含有する蒸留水に、試料としてγ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、γ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙ、又はγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙをそれぞれ０．１ｇ／ｄｌ、もしくは０．０１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、コク味付与活性の強度を測定した。なお試料溶解後に酸性を呈したサンプルについては、ＮａＯＨでｐＨ６．８〜７．２に合わせて使用した。官能評点について、コントロール：０点、グルタチオン添加：３点として、ｎ＝１２で実施し、結果を表５に示した。

〔実施例１〕低脂肪牛乳（Ｉ）
カルシウム受容体活性化作用、及びコク味付与活性が見出されたペプチドについて、定量的な官能評価試験により低脂肪牛乳における脂肪様濃厚感付与の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。市販低脂肪牛乳（無脂乳固形分8.6％以上、乳脂肪分1.5％）に対し、γ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（グルタチオン）、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ又はγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙをそれぞれ０．００００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、脂肪様濃厚感付与の強度を測定した。
なお各ペプチドを低脂肪乳に溶解した後に、ｐＨが低下した試料については、ペプチドを添加しない低脂肪乳のｐＨに対して±０．２となるようにＮａＯＨでｐＨを調整した。
脂肪様濃厚感及び滑らかさについての官能評点は、コントロール（ペプチド無添加）：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝１２で試験を実施した。上記添加濃度で幅広く呈味改善活性を示したが、代表的な濃度での結果を表６に示した。表６から分かるように、本発明のペプチドはグルタチオンよりも低濃度で脂肪様濃厚感、及び滑らかさを低脂肪牛乳に付与することが確認できた。

〔実施例２〕ローカロリーマヨネーズ（ローカロリーサラダクリーミードレッシング）（Ｉ）
カルシウム受容体活性化作用、及びコク味付与活性が見出されたペプチドについて、定量的な官能評価試験によりローカロリーマヨネーズにおける脂肪様濃厚感付与の強度を調べた。
低脂肪牛乳に代えて、市販ローカロリーマヨネーズ（通常品比脂肪分50％カット）を使用した以外は、実施例１と同様にして、各ペプチドの脂肪様濃厚感付与の強度を測定した。
各ペプチドは、種々の濃度で幅広く呈味改善活性を示したが、代表的な濃度での結果を表７に示した。表７から分かるように、本発明のペプチドはグルタチオンよりも低濃度で、ローカロリーマヨネーズに脂肪様濃厚感、及び滑らかさを付与することが確認できた。

〔実施例３〕低脂肪牛乳（II）
カルシウム受容体活性化作用、及びコク味付与活性が見出されたペプチド、及びカルシウム受容体活性化作用を有することが知られているシナカルセットについて、定量的な官能評価試験により低脂肪牛乳における脂肪様濃厚感付与の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。市販低脂肪牛乳（無脂乳固形分8.6％以上、乳脂肪分1.5％）に対し、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、シナカルセットをそれぞれ０．００００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、脂肪様濃厚感付与の強度を測定した。
なお各試料を低脂肪乳に溶解した後に、ｐＨが低下した試料については、試料を添加しない低脂肪乳のｐＨに対して±０．２となるようにＮａＯＨでｐＨを調整した。
脂肪様濃厚感及び滑らかさについての官能評点は、コントロール（試料無添加）：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝１２で試験を実施した。上記添加濃度で幅広く呈味改善活性を示したが、代表的な濃度での結果を表８に示した。表８から分かるように、シナカルセットは、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙと同程度の濃度で脂肪様濃厚感、及び滑らかさを低脂肪牛乳に付与することが確認できた。

〔実施例４〕ローカロリーマヨネーズ（ローカロリーサラダクリーミードレッシング）（II）
カルシウム受容体活性化作用、及びコク味付与活性が見出されたペプチド、及びカルシウム受容体活性化作用を有することが知られているシナカルセットについて、定量的な官能評価試験によりローカロリーマヨネーズにおける脂肪様濃厚感付与の強度を調べた。
実施例２と同様にして、各試料の脂肪様濃厚感付与の強度を測定した。
各試料は、種々の濃度で幅広く呈味改善活性を示したが、代表的な濃度での結果を表９に示した。表９から分かるように、シナカルセットはγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙと同程度の濃度で、ローカロリーマヨネーズに脂肪様濃厚感、及び滑らかさを付与することが確認できた。

〔実施例５〕低脂肪ヨーグルト
カルシウム受容体活性化作用、及びコク味付与活性が見出されたペプチド、及びカルシウム受容体活性化作用を有することが知られているシナカルセットについて、定量的な官能評価試験により低脂肪ヨーグルトにおける脂肪様濃厚感付与の強度を調べた。
定量的官能評価試験は以下のように実施した。市販低脂肪ヨーグルト（無脂乳固形分10.0％、乳脂肪分1.0％）に対し、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ、シナカルセットをそれぞれ０．００００１〜１ｇ／ｄｌにて混合した場合の、脂肪様濃厚感付与の強度を測定した。
なお各試料を低脂肪ヨーグルトに溶解した後に、ｐＨが低下した試料については、試料を添加しない低脂肪乳のｐＨに対して±０．２となるようにＮａＯＨでｐＨを調整した。
脂肪様濃厚感及び滑らかさについての官能評点は、コントロール（試料無添加）：０点、強い：３点、非常に強い：５点として、ｎ＝１２で試験を実施した。上記添加濃度で幅広く呈味改善活性を示したが、代表的な濃度での結果を表１０に示した。表１０から分かるように、シナカルセット及びγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙは、同程度の濃度で脂肪様濃厚感、及び滑らかさを低脂肪ヨーグルトに付与することが確認できた。

本発明のカルシウム受容体活性化作用を有する化合物、好ましくはアミノ酸又はペプチドを含む低脂肪食品は、呈味、特に脂肪様濃厚感及び滑らかさに優れている。従って、乳製品、乳化食品等に広く利用され得る。また、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物は低脂肪食品の呈味に脂肪様濃厚感を付与するために低脂肪食品に添加される呈味改善剤として利用され得る。

Claims (4)

1. γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙから選択される１種または２種のペプチド（各ペプチドを構成するアミノ酸はいずれもＬ体である。）が１重量ｐｐｂ〜９９．９重量％添加された、脂肪含量が低減された低脂肪食品であって、乳製品、動物油脂及び／又は植物油脂含有食品、乳化食品からなる群から選択される１種又は２種以上である、脂肪含量が低減された低脂肪食品。
2. 前記ペプチドが、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙである、請求項１に記載の脂肪含量が低減された低脂肪食品。
3. γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ及びγ−Ｇｌｕ−Ａｂｕ−Ｇｌｙから選択される１種または２種のペプチドを含む、乳製品、動物油脂及び／又は植物油脂含有食品、乳化食品からなる群から選択される１種又は２種以上である、脂肪含量が低減された低脂肪食品用の呈味改善剤。
4. 前記ペプチドが、γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙである、請求項３に記載の脂肪含量が低減された低脂肪食品用呈味改善剤。

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