JP5757674B2 - カルシウム受容体活性化剤 - Google Patents
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Description
本発明はD−Cys、ペプチドを含有するカルシウム受容体活性化剤及び該カルシウム受容体活性化剤を有効成分として含有する医薬組成物、並びに該カルシウム受容体活性化剤を用いた、カルシウム受容体活性化阻害物質のスクリーニング方法に関する。
これまでカルシウム受容体活性化剤として、上記の如く多くの特異的活性化剤が開発されているが、生体内に存在する化合物は少なく、また、生体内に存在する化合物である場合はその活性が極めて低かった。そのため、これらの活性化剤を含有してなる各種疾患に対する治療薬は、副作用、透過性及び活性の点で大きな問題があった。例えば、カルシウム受容体にアミノ酸が作用することが知られているが、活性が極めて弱いので活性化剤として具体的な応用は困難と考えられていた。また、上述の如くポリアルギニンのような巨大分子が活性化剤として報告されているが、不定構造である多荷カチオンとしての作用に
よるものと推測されている。すなわち、特定の構造を持ったペプチドがカルシウム受容体活性化剤として有用であることは知られていない。
Nature. 1993 Dec 9;366(6455):575-80. J Endocrinol. 2000 May;165(2):173-7. Eur J Pharmacol. 2002 Jul 5;447(2-3):271-8. Cell Calcium. 2004 Mar;35(3):209-16.
(6) 本発明に用いられるペプチド及びアミノ酸から選択される物質のカルシウム受容体活性化剤としての使用。
(7) 本発明に用いられるペプチド及びアミノ酸から選択される物質をカルシウム受容
体と接触させることを含む、カルシウム受容体の活性化方法。
本発明のカルシウム受容体活性化剤は、γ−Glu−Cys−Gly、γ−Glu−Cys(SNO)−Gly、γ−Glu−Ala、γ−Glu−Gly、γ−Glu−Cys、γ−Glu−Met、γ−Glu−Thr、γ−Glu−Val、γ−Glu−Orn、Asp−Gly、Cys−Gly、Cys−Met、Glu−Cys、Gly−Cys、Leu−Asp、D−Cys、γ−Glu−Met(O)、γ−Glu−Val−Val、γ−Glu−Val−Glu、γ−Glu−Val−Lys、γ−Glu−γ−Glu−Val、γ−Glu−Val−NH2、γ−Glu−Val−ol、γ−Glu−Ser、γ−Glu−Tau、γ−Glu−Cys(S−Me)(O)、γ−Glu−Leu、γ−Glu−Ile、γ−Glu−t−Leu、γ−Glu−Cys(S−allyl)−Gly、γ−Glu−Gly−Gly、γ−Glu−Val−Phe、γ−Glu−Val−Ser、γ−Glu−Val−Pro、γ−Glu−Val−Arg、γ−Glu−Val−Asp、γ−Glu−Val−Met、γ−Glu−Val−Thr、γ−Glu−Val−His、γ−Glu−Val−Asn、γ−Glu−Val−Gln、γ−Glu−Val−Cys、γ−Glu−Val−Orn、γ−Glu−Ser−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)、γ−Glu−Abu−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)−Gly、およびγ−Glu−Val−Glyから選ばれる1種または2種以上を含有してなる。尚、本明細書中において各アミノ酸及び各ペプチドを構成するアミノ酸は、特に断わらない限りいずれもL−体である。
本明細書においてアミノ基残基の略号は以下のアミノ酸を意味する。
(1)Gly:グリシン
(2)Ala:アラニン
(3)Val:バリン
(4)Leu:ロイシン
(5)Ile:イソロイシン
(6)Met:メチオニン
(7)Phe:フェニルアラニン
(8)Tyr:チロシン
(9)Trp:トリプトファン
(10)His:ヒスチジン
(11)Lys:リジン
(12)Arg:アルギニン
(13)Ser:セリン
(14)Thr:トレオニン
(15)Asp:アスパラギン酸
(16)Glu:グルタミン酸
(17)Asn:アスパラギン
(18)Gln:グルタミン
(19)Cys:システイン
(20)Pro:プロリン
(21)Orn:オルニチン
(22)Sar:サルコシン
(23)Cit:シトルリン
(24)N−Val:ノルバリン
(25)N−Leu:ノルロイシン
(26)Abu:α−アミノ酪酸
(27)Tau:タウリン
(28)Hyp:ヒドロキシプロリン
(29)t−Leu:tert−Leucine
(30)Cys(S−Me):、S−メチルシステイン
(31)Cys(S−allyl):S−アリルシステイン
(32)Val−NH2:バリンアミド
(33)Val−ol:バリノール(2−アミノ−3−メチル−1−ブタノール)
尚、上記γ−Glu−Cys(SNO)−Glyは下記の構造式を有するものであり、上記γ−Glu−Met(O)およびγ−Glu−Cys(S−Me)(O)式中の(O)はスルフォキシド構造であることを意味する。γ−Gluの(γ)とは、グルタミン酸のγ位のカルボキシ基を介して他のアミノ酸が結合していることを意味する。
l−Pro、γ−Glu−Val−Arg、γ−Glu−Val−Asp、γ−Glu−Val−Met、γ−Glu−Val−Thr、γ−Glu−Val−His、γ−Glu−Val−Asn、γ−Glu−Val−Gln、γ−Glu−Val−Cys、γ−Glu−Val−Orn、γ−Glu−Ser−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)、γ−Glu−Abu−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)−Gly、およびγ−Glu−Val−Glyがカルシウム受容体を活性化することが本発明者らによって示された。したがって、γ−Glu−Cys−Gly、γ−Glu−Cys(SNO)−Gly、γ−Glu−Ala、γ−Glu−Gly、γ−Glu−Cys、γ−Glu−Met、γ−Glu−Thr、γ−Glu−Val、γ−Glu−Orn、Asp−Gly、Cys−Gly、Cys−Met、Glu−Cys、Gly−Cys、Leu−Asp、D−Cys、γ−Glu−Met(O)、γ−Glu−Val−Val、γ−Glu−Val−Glu、γ−Glu−Val−Lys、γ−Glu−γ−Glu−Val、γ−Glu−Val−NH2、γ−Glu−Val−ol、γ−Glu−Ser、γ−Glu−Tau、γ−Glu−Cys(S−Me)(O)、γ−Glu−Leu、γ−Glu−Ile、γ−Glu−t−Leu、γ−Glu−Cys(S−allyl)−Gly、γ−Glu−Gly−Gly、γ−Glu−Val−Phe、γ−Glu−Val−Ser、γ−Glu−Val−Pro、γ−Glu−Val−Arg、γ−Glu−Val−Asp、γ−Glu−Val−Met、γ−Glu−Val−Thr、γ−Glu−Val−His、γ−Glu−Val−Asn、γ−Glu−Val−Gln、γ−Glu−Val−Cys、γ−Glu−Val−Orn、γ−Glu−Ser−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)、γ−Glu−Abu−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)−Gly、およびγ−Glu−Val−Gly(以下、本発明に用いられるペプチド又はアミノ酸ともいう)はカルシウム受容体の活性化剤として用いることができる。本発明において、本発明に用いられるペプチド又はアミノ酸は単独で用いてもよく、また任意の2種又は3種以上を混合して用いることもできる。
上記ペプチド及びアミノ酸は、市販されているものであれば、市販品を用いることが可能である。また、ペプチドは、(1)化学的に合成する方法、又は(2)酵素的な反応により合成する方法等の公知手法を適宜用いることによって取得することができる。本発明において用いられるペプチドは、含まれるアミノ酸の残基数が2〜3残基と比較的短いので、化学的に合成する方法が簡便である。化学的に合成する場合は、該オリゴペプチドをペプチド合成機を用いて合成あるいは半合成することにより行うことができる。化学的に合成する方法としては、例えばペプチド固相合成法が挙げられる。そのようにして合成したペプチドは通常の手段、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することができる。このようなペプチド固相合成法、およびそれに続くペプチド精製はこの技術分野においてよく知られたものである。
リウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロへキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミノ酸との塩を挙げることができる。式中に塩基性基が存在する場合の塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸などの無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。
以下に生きた細胞を用いた一例を示すが、この一例に限定されるものではない。
カルシウム受容体は、アフリカツメガエル卵母細胞やハムスター卵巣細胞やヒト胎児腎臓細胞等の培養細胞に発現させる。これは外来遺伝子を保持するプラスミドにカルシウム受容体遺伝子をクローニングしたものを、プラスミドの状態もしくはそれを鋳型にしたcRNAを導入することで可能となる。反応の検出には電気生理学的手法や細胞内カルシウム上昇の蛍光指示試薬を用いることができる。
カルシウム受容体の発現は、初めにカルシウムもしくは特異的活性化剤による応答で確認する。5mM程度の濃度のカルシウムに対して、細胞内電流が見られた卵母細胞もしくは蛍光指示試薬の蛍光が見られた培養細胞を使用する。カルシウムの濃度を変えて濃度依存性を測定する。次に、ペプチドを1μM〜1mM程度に調製し、卵母細胞もしくは培養細胞に添加することで、ペプチド等がカルシウム受容体に対して活性化剤として作用するかを測定する。
−Glu−Ser、γ−Glu−Tau、γ−Glu−Cys(S−Me)(O)、γ−Glu−Leu、γ−Glu−Ile、γ−Glu−t−Leu、γ−Glu−Cys(S−allyl)−Gly、γ−Glu−Gly−Gly、γ−Glu−Val−Phe、γ−Glu−Val−Ser、γ−Glu−Val−Pro、γ−Glu−Val−Arg、γ−Glu−Val−Asp、γ−Glu−Val−Met、γ−Glu−Val−Thr、γ−Glu−Val−His、γ−Glu−Val−Asn、γ−Glu−Val−Gln、γ−Glu−Val−Cys、γ−Glu−Val−Orn、γ−Glu−Ser−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)、γ−Glu−Abu−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)−Gly、およびγ−Glu−Val−Glyから選ばれる1種または2種以上に加えて、更に、カルシウム受容体活性化作用を有する化合物を1種または2種以上含むものであってもよい。
スクリーニングに用いる上記試験物質には、低分子化合物、糖類、ペプチド、タンパク質などを用いることができる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
カルシウム受容体の遺伝子の調製は以下のように行った。NCBIに登録されたDNA
配列(カルシウム受容体:NM_000388)を元に、PCRに使う合成オリゴDNA(フォワードプライマー(N)、及びリバースプライマー(C))を設計した(表1)(配列番号1及び2)。
。その切断部位にPCRによって増幅された各遺伝子断片をLigation Kit(Promega社製)を用いて連結した。この反応溶液でエシェリヒア・コリDH5α株を形質転換し、PCR増幅産物がクローニングされたプラスミドを保持する形質転換体を選抜した。PCR増幅産物をDNA塩基配列解析によって確認した。この組換えプラスミドを鋳型とし、cRNA作製キット(Ambion社)を用いてカルシウム受容体遺伝子のcRNAを作製した。
L型アミノ酸試料として、各々特級グレードのアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、オルニチン、タウリン(上記、味の素株式会社)、ヒドロキシプロリン(ナカライテスク株式会社)の23種類を用いた。D−CysおよびD−Trp(ナカライテスク株式会社)並びに塩化カルシウムは特級グレードのものを用いた。また、ペプチド試料として、γ−Glu−Cys−Gly(シグマアルドリッチジャパン株式会社)、γ−Glu−Cys(SNO)−Gly(株式会社同仁化学研究所)、γ−Glu−Ala(Bachem Feinchemikalien AG)、γ−Glu−Gly(Bachem Feinchemikalien AG)、γ−Glu−Cys(シグマアルドリッチジャパン株式会社)、γ−Glu−Met(Bachem Feinchemikalien AG)、γ−Glu−Abu−Gly(Abu:α−アミノ酪酸、Bachem Feinchemikalien AG)、γ−Glu−Thr(国産化学株式会社)、γ−Glu−Val(国産化学株式会社)、γ−Glu−Leu(受託合成品)、γ−Glu−Ile(受託合成品)、γ−Glu−Orn(国産化学株式会社)、Asp−Gly(受託合成品)、Cys−Gly(受託合成品)、Cys−Met(受託合成品)、Glu−Cys(受託合成品)、Gly−Cys(受託合成品)、Leu−Asp(受託合成品)、γ−Glu−Val−Val(受託合成品)、γ−Glu
−Val−Glu(受託合成品)、γ−Glu−Val−Lys(受託合成品)、γ−Glu−γ−Glu−Val(受託合成品)、γ−Glu−Gly−Gly(受託合成品)、γ−Glu−Val−Phe(受託合成品)、γ−Glu−Val−Ser(受託合成品)、γ−Glu−Val−Pro(受託合成品)、γ−Glu−Val−Arg(受託合成品)、γ−Glu−Val−Asp(受託合成品)、γ−Glu−Val−Met(受託合成品)、γ−Glu−Val−Thr(受託合成品)、γ−Glu−Val−His(受託合成品)、γ−Glu−Val−Asn(受託合成品)、γ−Glu−Val−Gln(受託合成品)、γ−Glu−Val−Cys(受託合成品)、γ−Glu−Val−Orn(受託合成品)、γ−Glu−Ser−Gly(受託合成品)を用いた。グルタミン、システインは用事調製し、他の試料は調製後、−20℃に保存した。ペプチドは純度90%以上のものを用いた。γ−Glu−Cysのみ純度80%以上のものを用いた。各試料を溶解した後、pHが酸性、アルカリ性のものについては、NaOH、HClを用いて中性前後に調整した。アミノ酸、ペプチドの溶解液、アフリカツメガエル卵母細胞の調製用の溶液、卵母細胞の培養用の溶液は、以下の組成のものを使用した。NaCl 96mM / KCl 2mM / MgCl2 1mM / CaCl2 1.8mM / Hepes 5mM / pH=7.2。
Boc−Val−OH(8.69 g, 40.0 mmol)とGly−OBzl・HCl(8.07 g, 40.0 mmol)を塩化メチレン(100 ml)に溶解し、溶液を0℃に保った。トリエチルアミン(6.13 ml, 44.0 mmol)、HOBt(1−Hydroxybenzotriazole, 6.74 g, 44.0 mmol)及びWSC・HCl(1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride, 8.44 g, 44.0 mmol)を溶液に加え、室温で一夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を酢酸エチル(200 ml)に溶解した。溶液を水(50 ml)、5%クエン酸水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(50 ml x 2回)、飽和食塩水(50 ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。残渣を酢酸エチル−n−ヘキサンから再結晶してBoc−Val−Gly−OBzl(13.2 g, 36.2 mmol)を白色結晶として得た。
Boc−Val−Gly−OBzl(5.47 g, 15.0 mmol)を4N−HCl/ジオキサン溶液(40 ml)に加え、室温で50分撹拌した。ジオキサンを減圧濃縮で除き、残渣にn−ヘキサン(30 ml)を加え減圧濃縮した。この操作を3回繰り返し、H−Val−Gly−OBzl・HClを定量的に得た。
上記H−Val−Gly−OBzl・HCl及びZ−Glu−OBzl(5.57 g, 15.0 mmol)を塩化メチレン(50 ml)に溶解し、溶液を0℃に保った。トリエチルアミン(2.30 ml, 16.5 mmol)、HOBt(1−Hydroxybenzotriazole, 2.53 g, 16.5 mmol)及びWSC・HCl(1−Ethyl−3−(3−dimethylaminopropyl)carbodiimide Hydrochloride, 3.16 g, 16.5
mmol)を溶液に加え、室温で二夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣を加熱した酢酸エチル(1500 ml)に溶解した。溶液を水(200 ml)、5%クエン酸水溶液(200 ml x 2回)、飽和食塩水(150 ml)、5%炭酸水素ナトリウム水溶液(200 ml x 2回)、飽和食塩水(150 ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、硫酸マグネシウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。析出した結晶を濾取、減圧乾燥してZ−Glu(Val−Gly−OBzl)−OBzl(6.51 g,10.5 mmol)を白色結晶として得た。
上記Z−Glu(Val−Gly−OBzl)−OBzl(6.20 g, 10.0
3 mmol)をエタノール(200 ml)に懸濁し、10%パラジウム炭素(1.50 g)を加え、水素雰囲気下に55℃で5時間還元反応を行った。この間、全量で100 mlの水を徐々に加えた。触媒を桐山ロートで濾過して除き、濾液を半分に減圧濃縮した。反応液を更にメンブランフィルターで濾過し、濾液を減圧濃縮した。残渣を少量の水に溶かした後にエタノールを加えて結晶を析出させ、結晶を濾過して集め減圧乾燥してγ−Glu−Val−Glyの白色粉末(2.85 g, 9.40 mmol)を得た。
ESI−MS:(M+H)+=304.1.
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):0.87 (3H, d, J=6.8 Hz), 0.88 (3H, d, J=6.8 Hz), 1.99−2.09 (3H, m), 2.38−2.51 (2H, m), 3.72 (1H,
t, J=6.35 Hz), 3.86 (1H, d, J=17.8 Hz),
3.80 (1H, d, J=17.8 Hz), 4.07 (1H, d, J=6.8 Hz).
還元型グルタチオン(15.0 g, 48.8 mmol)を水(45 ml)に加え、窒素を吹き込みながら水酸化ナトリウム(4.52 g, 2.2当量, 107 mmol)を少しずつ加えた。ヨウ化メチル(4.56 ml, 1.5当量, 73 mmol)を加え、密栓して室温で2時間撹拌した。濃塩酸で反応液のpHを2〜3に調整し、エタノール(150 ml)を加え冷蔵庫に一夜保存した。油状物が分離したので、上澄みを除いた。残った油状物を水に溶かしエタノールを徐々に加えると、一部結晶を伴う油状物が析出したので再度上澄みを除いた。残渣を水(300 ml)に溶解し、イオン交換樹脂(Dowex 1−acetate, 400 ml)を充填したカラムに吸着させ、水洗した後に1N−酢酸水溶液で溶出した。溶出液を減圧濃縮し、水−エタノールから再沈殿させ、γ−Glu−Cys(S−Me)−Glyの白色粉末(5.08 g, 15.8 mmol)を得た。
FAB−MS:(M+H)+=322.
1H−NMR(400MHz, D2O)δ(ppm):2.14 (3H, s), 2.15−2.22 (2H, m), 2.50−2.58 (2H, m), 2.86 (1H, dd, J=9.0 Hz, J=14.0 Hz), 3.03 (1H, dd, J=5.0 Hz, J=14.0 Hz), 3.84 (1H, t, J=6.5 Hz), 3.99 (2H, s), 4.59 (1H, dd,
J=5.0 Hz, J=9.0 Hz).
γ−Glu−Met(O)、γ−Glu−Val−NH2、γ−Glu−Val−ol、γ−Glu−Ser、γ−Glu−Tau、γ−Glu−Cys(S−Me)(O)、γ−Glu−t−Leu、γ−Glu−Cys(S−allyl)−Gly、γ−Glu−Cys(S−Me)、は実施例3および実施例4に準じて合成した。
カルシウム受容体の活性化作用の評価には、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いたCa濃度イオン依存性Clイオン電流測定法を用いた。カルシウム受容体を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞に、各活性化剤を添加すると、細胞内のCaイオンが増加する。次にCa濃度イオン依存性Clチャネルが開き、イオン電流として細胞内電流値が変
化する。この細胞内電流値の変化を測定することで、カルシウム受容体の活性化作用の有無を知り得ることができる。
実施例6に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するカルシウムの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、カルシウム(2mM、5mM、10mM、20mM)を添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。結果は図1に示した。この結果より、卵母細胞に注入したカルシウム受容体のcRNAが機能的に発現していることが確認された。また、水を注入した卵母細胞は、高い濃度のカルシウムにも反応していないことから、卵母細胞自身にはカルシウム受容体が発現していないことが確認された。
実施例6に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するL型アミノ酸の活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、アラニン(10mM)、アルギニン(10mM)、アスパラギン(10mM)、アスパラギン酸(10mM)、システイン(10mM)、グルタミン(10mM)、グルタミン酸(10mM)、グリシン(10mM)、ヒスチジン(10mM)、イソロイシン(10mM)、ロイシン(10mM)、リジン(10mM)、メチオニン(10mM)、フェニルアラニン(10mM)、プロリン(10mM)、セリン(10mM)、トレオニン(10mM)、トリプトファン(10mM)、チロシン(10mM)、バリン(10mM)、オルニチン(10mM)、タウリン(10mM)、又はヒドロキシプロリン(10mM)を添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。結果は図2に示した。この結果より、システイン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。なお、上記アミノ酸についてはProc Natl Acad Sci U S A. 2000 Apr 25;97(9):4814-9で活性化作用が報告されている。
実施例6に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するD−システインの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、D−システイン(10mM)、L−システイン(10mM)、D−トリプトファン(10mM)又はL−トリプトファン(10mM)を添加し、Ca濃度イオン依存
性Cl応答電流を測定した。結果は図3に示した。この結果より、D−システインがカルシウム受容体に対する明瞭な活性化作用を有することが示された。
実施例6に記載した方法を用い、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。すなわち、カルシウム受容体のcRNAもしくは滅菌水を注入した卵母細胞を調製し、2電極膜電位固定法により−70mVに膜電位固定した。膜電位固定された卵母細胞に、γ−Glu−Cys−Gly(50μM)、γ−Glu−Cys(SNO)−Gly(50μM)、γ−Glu−Ala(50μM)、γ−Glu−Gly(500μM)、γ−Glu−Cys(50μM)、γ−Glu−Met(500μM)、γ−Glu−Thr(50μM)、γ−Glu−Val(50μM)、γ−Glu−Orn(500μM)、Asp−Gly(1mM)、Cys−Gly(1mM)、Cys−Met(1mM)、Glu−Cys(50μM)、Gly−Cys(500μM)、Leu−Asp(1mM)を添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。結果は図4に示した。この結果より、上記ペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが示された。
実施例10と同様に、カルシウム受容体に対するペプチドの活性化作用を評価した。膜に電位固定された卵母細胞に、表2の各ペプチドについて、1000μM、300μM、100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μMを添加し、Ca濃度イオン依存性Cl応答電流を測定した。電流が検出された最低濃度を表2に活性として示した。この結果より、これら32種類のペプチドは、カルシウム受容体に対する活性化作用を有することが明らかとなった。
カルシウム受容体の生体内分布を示すために、ラットから得たRNAを材料として、定量的RT−PCR法を用い、カルシウム受容体の組織発現を以下のように調べた。
ラット組織からのRNA調製は以下のように行った。15週令の雄F344ラットから、大脳、小脳、肺、心臓、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、膵臓、脾臓、食道、胃上部、胃底部、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、精巣、副精巣、膀胱、骨髄、ヒフク筋、ヒラメ筋、骨格筋、脂肪、前立腺、舌、舌下腺、胸腺を単離した。Total RNAの調製はIsogen(日本ジーン社製)を用いて行った。Fast Prep(BIO101)またはポリトロンホモジェナイザーを用いて各組織をホモジェナイズし、ホモジェネートからTotal RNAを抽出した。Total RNAをテンプレートとし、OligodTプライマー、SuperscriptIII 逆転写酵素(Invitrogen社製)を用いてcDNA合成を行った。カルシウム受容体のRT−PCRは、表1に示すプライマー(rCASR_f:配列番号3及びrCASR_r:配列番号4)を合成し、以下のように行った。各組織のcDNAをテンプレートとし、SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO社製) 、ABI PRISM 7700 Sequence Detectorを用いた定量PCR法により、カルシウム受容体遺伝子の発現量を解析した。組織発現分布を表3に示した。なお、膵臓のみヒトトータルRNA(Stratagene社製)を用いた。
この結果より、カルシウム受容体が副甲状腺および腎臓だけではなく、生体内に広く発
現していることが確認された。このことから、カルシウム受容体が副甲状腺および腎臓の機能だけではなく、末梢組織、末梢臓器の様々な生理機能に関わっていることが示唆された。
ペプチドの薬理効果を動物実験で確認した。副甲状腺ホルモン(parathyroid hormone ; PTH)は、カルシウムホメオスタシスに関与する主要なタンパク質である。PTHの量が増減する事に起因する直接的な疾患として、副甲状腺機能亢進症及び副甲状腺機能低下症が知られている。PTHは副甲状腺のC細胞より分泌されるが、カルシウム受容体が活性化されると、PTHの分泌阻害が起こることが知られている。動物は、Sprague-Dawley系統ラットの10週齢の雄を用いた。PTHの測定は、Immutopics社の「Rat Intact PTH ELISA Kit」を用い、使用手順書に従って実施した。生理的食塩水にγGlu-Val-Glyペプチドを100mg/mlに溶解し、ラット体重100g当り0.1mlを尾静脈より注入した。比較には、生理的食塩水をラット体重100g当り0.1mlを尾静脈より注入した。右鎖骨下静脈より採血し、遠心分離によりラット血清を得た。各群3匹で実施し、PTHの変化は以下に、平均値±標準誤差で示した。ペプチド投与群では、投与前が148±72.5pg/ml、投与15分後が9.44±2.94pg/mlであった。生理的食塩水投与群では、投与前が89.4±49.5pg/ml、投与15分後が41.1±11.6pg/mlであった。この結果、ペプチド投与によってPTHが減少する事が認められた。
GPCRに属するカルシウム受容体の活性化剤の治療薬応用の範囲は、実施例12、表3に示すように、カルシウム受容体が広範な組織に分布していることから、幅広い疾患に対して適用可能であることが予見される。
本発明は、好ましい実施形態を参照して詳細に説明されているが、本発明の範囲から逸脱しないかぎり、多様な変更、均等物の使用が可能であることは当業者にとって明らかである。本明細書における全ての引用文献は本明細書の一部として参考のために示す。
Claims (5)
- γ−Glu−Gly、γ−Glu−Met、γ−Glu−Thr、γ−Glu−Val、γ−Glu−Orn、γ−Glu−Met(O)、γ−Glu−Val−NH2、γ−G
lu−Val−ol、γ−Glu−Ser、γ−Glu−Tau、γ−Glu−Cys(S−Me)(O)、γ−Glu−Leu、γ−Glu−Ile、γ−Glu−t−Leu、およびγ−Glu−Cys(S−Me)から選択される1種または2種以上(各ペプチドを構成するアミノ酸はいずれもL−体である。)を有効成分として含有してなる7回膜
貫通型カルシウムセンシング受容体活性化剤(食品を除く)。 - カルシウム受容体活性化作用を有する他の化合物を、更に1種または2種以上含有するものである、請求項1に記載の7回膜貫通型カルシウムセンシング受容体活性化剤(食品を
除く)。 - 前記カルシウム受容体活性化作用を有する他の化合物の少なくとも1種はカチオンである、請求項2に記載の7回膜貫通型カルシウムセンシング受容体活性化剤(食品を除く)。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の7回膜貫通型カルシウムセンシング受容体活性化剤
を有効成分として含有する副甲状腺ホルモンの分泌を阻害するための医薬組成物。 - 請求項1〜3のいずれか1項に記載の7回膜貫通型カルシウムセンシング受容体活性化剤
を用いることを特徴とする、7回膜貫通型カルシウムセンシング受容体の活性化阻害物質
をスクリーニングする方法。
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