CN102643904B - 焦磷酸测序法检测cyp19a1基因多态性的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性试剂盒及方法。所述试剂盒CYP19A1基因多态性进行检查，具体的是指rs4646(G＞T)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2-4引物。本发明的试剂盒，可以实现准确、快捷、高通量CYP19A1基因多态性的检测，从而达到对其底物芳香化酶抑制实现安全合理有效的个体化给药。

Description

焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

芳香化酶(Aromatase Enzyme)属于细胞色素P450酶超家族成员，编码基因为CYP19A1，定位于15q211。为醛固酮、皮质醇、雄激素生物合成不同阶段所必须的酶。CYP19A1可催化睾酮、雄烯二酮向雌酮、雌二醇转化，在雌激素生物合成中起最终的限速催化作用，因而又称雌激素合成酶。

芳香化酶抑制剂(Aromatase inhibitors，AIs)通过抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用。绝经后妇女的雌激素主要来源于雄激素前体物质在外周组织的芳香化，故该类药物主要用于自然绝经或人工绝经后的乳腺癌患者。由于其选择性较高，不影响糖皮质激素、盐皮质激素和甲状腺功能，大剂量使用对肾上腺皮质类固醇类物质分泌无抑制作用。按照作用机制的不同，AIs分为两类：甾体类及非甾体类。甾体类AIs包括第一代的睾内酯、第二代的福美坦和第三代的依西美坦。非甾体类AIs包括第一代的氨鲁米特、第二代的法屈唑和第三代的阿那曲唑、来曲唑。依西美坦是甾体类AIs，具有雄激素结构，与CYP19A1的底物雄烯二酮竞争，不可逆结合于CYP19A1催化中心，导致酶活性丧失。阿那曲唑和来曲唑属于非甾体类AIs，与CYP19A1中的亚铁血红素可逆性结合，对酶的抑制程度可达99％以上。

临床研究已证实CYP19A1的基因多态性对芳香化酶抑制剂在乳腺癌的治疗效果有着很大的影响作用。在接受来曲唑治疗的绝经后激素受体阳性转移性乳腺癌患者，携带CYP19A1基因rs4646(G＞T)突变患者的的疾病进展时间(TTP)比正常者明显延长(17.2月：6.4月，P＝0.02)。因此，CYP19A13’端非翻译区(3’-UTR)SNP突变(rs4646G＞T)是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标。

综上所述，CYP19A1基因多态性可作为芳香化酶抑制剂疗效预测的有效指标，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CYP219A1基因多态性的试剂盒将为芳香化酶抑制的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测CYP19A1基因(SEQ ID NO.1)多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测芳香化酶抑制个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

一种焦磷酸测序发检测CYP19A1基因多态性的试剂盒，包括如下引物：

(1)扩增引物：

上游引物：5′-TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3′(SEQ ID NO.2)；

下游引物：5′-TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3′(SEQ ID NO.3)；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：5′-CCAAGCTAGGTGCTATT-3′(SEQ ID NO.4)；

试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。

一种应用上述试剂盒检测CYP19A1基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应：

配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer 5.0μl，dNTP 2.0μl，CYP19A1-上游引物0.5μl，CYP19A1下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水39.5μl，模板2μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95℃5min预变性；然后依次在95℃30S，53℃30S，72℃30S，进行36个循环；再在72℃保持5min，最终保持在4℃，得扩增产物；

(3)焦磷酸测序单链样本纯化；

(4)焦磷酸测序及结果分析。

本发明的试剂盒对CYP19A1rs4646(G＞T)目标序列，该目标序列包括：野生型CCCTGGAAGG(SEQ ID NO.5)和突变型CGCTGGAAGG(SEQ ID NO.6)；扩增出的片段长为127bp。

由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对CYP19A1基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上芳香化酶抑制剂个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。

附图说明

图1为本发明CYP19A1rs4646(GG)焦磷酸测序结果；

图2为本发明CYP19A1rs4646(GT)焦磷酸测序结果；

图3为本发明CYP19A1rs4646(TT)焦磷酸测序结果。

具体实施方式

下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。

实施例1：

CYP19A1-pyroF(上游引物)：5′-TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3′(SEQ ID NO.2)；

CYP19A1-pyroR(下游引物)：5′-TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3′(SEQID NO.3)；

测序引物：5′-CCAAGCTAGGTGCTATT-3′(SEQ ID NO.4)；

1.DNA提取

11实验前试剂材料准备与检查工作如下：

(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。

1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；

1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；

1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；

1.5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；

1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；

1.713,000rpm室温离心20秒；

1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；

1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；

1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；

1.11移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；

1.12打开Eppendorf管，移取100uL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；

1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；

1.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；

1.1513,000rpm室温离心1min；

1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；

1.17移取300uL 75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；

1.1813,000rpm室温离心1min；

1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；

1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；

1.21目测沉淀大小，加入50～100ul DNA Rehydration Solution至沉淀；

1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNA Rehydration Solution溶解DNA。

1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；

1.24保存核酸标本至4℃冰箱；

2.聚合酶链反应

2.1在试剂准备区配制50μl PCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如下表：

10×PCR buffer	5.0μl
		dNTP	2.0μl
CYP19A1-pyroF	0.5μl
		CYP19A1-pyroR(5’-Bio标记)	0.5μl
rTaq	0.5μl
		水	39.5μl

2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加2μl至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；

2.3在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪：

2.4设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；

2.5点击“start”开始仪器运行。

3.焦磷酸测序单链样本纯化

3.1纯化前试剂和仪器准备：

进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。

3.2单链样本纯化操作：

3.2.1在PSQ 96板中先加40μlAnnealing Buffer和2～3μl测序引物(10uM)；

3.2.2在振荡器上充分混匀Sepharose Beads；

3.2.3将所需Sepharose Beads量(每样本3μl计算)转移到1.5mL Eppendorf管；

3.2.4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；

3.2.5将Sepharose Beads混合物加至约40μl PCR产物中，每样本加40μl；

3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；

3.2.7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml 70％乙醇、Denaturation Buffer和Washing Buffer；

3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；

3.2.9打开Vacuum Prep Workstation的真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool在纯水中清洗30秒；

3.2.10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的Sepharose Beads；

3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了Vacuum Prep Tool上；

3.2.12将Vacuum Prep Tool放入70％乙醇中5秒；

3.2.13将Vacuum Prep Tool移到Denatureation Buffer中5秒；

3.2.14再将Vacuum Prep Tool移到Washing Buffer中清洗10秒；

3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；

3.2.16Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放Sepharose Beads；

3.2.17放有纯化样本的PSQ 96板放在Thermo Plate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。

3.3纯化完毕后清洗：

3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；

3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；

3.3.3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放，室温晾干；

3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；

3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。

4.焦磷酸测序

4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；

4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；

4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。

5.焦磷酸测序结果分析

在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测CYP19A1基因多态性，焦磷酸检测结果如图1～3。可以看出，采用本发明的试剂盒及方法，能够简捷、直观、准确的对CYP19A1基因型进行检测和判读。图1～3提示CYP19A1分别为野生型纯合子、突变型杂合子、突变型纯合子，临床医生可根据CYP19A1基因型，判断出不同基因型患者使用芳香化酶抑制剂时的疗效。

综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测CYP19A1基因型，能够满足临床检验实际工作的要求，利于CYP19A1底物(如芳香化酶抑制剂)的个体化使用。

Claims (2)

1.一种焦磷酸测序法检测CYP19A1基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物：

（1）扩增引物：

     上游引物：5’-TCA AAC TCT TGG CCT CTG CTT T-3’；

     下游引物：5’-TGG CCC ATG GCA TTT TAT AGG-3’；

其中，下游引物的5’进行生物素标记；

（2）测序引物：5’-CCA AGC TAG GTG CTA TT-3’。

2.如权利要求1所述的引物在制备检测CYP19A1基因多态性试剂中的应用。