CN105525001A - 一种检测cyp19a1基因多态性的引物及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测CYP19A1基因多态性的引物及其方法。本发明提供的CYP19A1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明提供的CYP19A1基因多态性的引物具有特异性强，检测灵敏度好，准确性高的优点，实现了CYP19A1基因多态性的检测，可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效；同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不良反应风险。

Description

一种检测CYP19A1基因多态性的引物及其方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测CYP19A1基因多态性的引物及其方法。
背景技术
多药耐药基因(MDR1)编码P-糖蛋白（P-gp），它是人体药物转运中最重要的转运体，能主动将疏水性抗肿瘤药物泵出胞外，从而减少细胞内药物浓度。几乎所有的肿瘤，包括各种实体瘤、白血病、淋巴瘤等均有MDR1表达。
芳香化酶是细胞色素P450酶超家族成员，编码基因为CYP19A1，可催化睾酮、雄烯二酮向雌酮、雌二醇转化，在雌激素生物合成中起最终的限速催化作用。芳香化酶抑制剂（AIs）通过抑制芳香化酶，使雌激素水平下降，从而消除雌激素对肿瘤生长的刺激作用。绝经后妇女的雌激素主要来源于雄激素前体物质在外周组织的芳香化，故该类药物主要用于自然绝经或人工绝经后的乳腺癌患者。阿那曲唑、来曲唑（第三代非甾体类AIs）对芳香化酶的抑制程度可达99％以上。
临床研究证实，CYP19A1基因多态性对芳香化酶抑制剂在乳腺癌的治疗效果有着很大的影响作用。在接受来曲唑治疗的绝经后激素受体阳性转移性乳腺癌患者，携带CYP19A1基因rs4646G＞T突变患者的的疾病进展时间比正常者明显延长。因此，CYP19A13’-UTRrs4646G＞T是乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂治疗疗效的有效预测指标。
因此，检测CYP19A1基因的多态性，可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效；同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不良反应风险，具有重要的临床价值。
中国专利CN101781684B公开了CYP19A1基因SNP检测液相芯片及检测方法，所述液相芯片包括有针对CYP19A1基因的SNP位点分别设计的野生型和突变型特异性ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成。该检测方法检测特异性好，可以实现多个SNP位点的并行检测。但是，上述检测操作繁琐，不利于大规模的推广和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测CYP19A1基因多态性的引物及其方法，该引物主要用于检测CYP19A1基因c.*161T>G(SNP:rs4646)位点，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，为CYP19A1基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
本发明提供了一种检测CYP19A1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物为：针对CYP19A1_rs4646的上游引物5’-TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3’（SEQIDNO.1）和下游引物5’-TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3’（SEQIDNO.2）；所述SNaPshotPCR引物为：针对CYP19A1_rs4646的SNaPshotPCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTCTATGGGTTGTCACCAAGCTAGGTGCTATT-3’（SEQIDNO.3）。
另外，本发明提供一种检测CYP19A1基因多态性的方法，包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：58℃30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃保温。
进一步地，所述步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃10s；阶段2：55℃5s；阶段3：60℃30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃保温。
进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。
除此之外，本发明提供的所述的检测CYP19A1基因多态性的引物在制备检测CYP19A1基因多态性试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：本发明提供的检测CYP19A1基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了检测CYP19A1基因多态性的检测，可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效；同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不良反应风险。
附图说明
图1为本发明提供的CYP19A1_rs4646基因引物的扩增片段；
图2为本发明提供的CYP19A1基因SNaPshotPCR引物的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一、引物
本发明提供的CYP19A1基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物，所述PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
表1本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性
将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：
1)CYP19A1基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点，无其它同源基因，CYP19A1_rs4646扩增片段位于chr15:51502778+51502903，长度为126bp，扩增序列图如图1。
2）使用表1中SNaPshotPCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图2所示，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。
实施例三、CYP19A1基因多态性的检测
1）提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANampBloodDNAKit（购自Tiagen，货号DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。
2）配制PCR扩增引物，震荡混匀；短暂离心后备用；PCR扩增采用Q5?热启动超保真2XMasterMix（购自NEB公司，货号M0494L），反应体系如表2所示，震荡混匀，短暂离心后，分装18.0μL至标记好的PCR反应管；往标记好的PCR反应管加入引物混合物5.0μL，按照以下程序进行PCR扩增：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：58℃30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，2:9个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃保温。
表2、PCR试剂配制表格
3）配置SNaPshotPCR扩增引物，SNaPshotPCR产物中加入1.0μLSAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，15min；80℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERIDV4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图2所示。
实施例四、检测CYP19A1基因多态性的方法的特异性
本发明的检测特异性定义为阴性符合率。本发明共对19例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阴性结果Sanger测序法显示的结果相符，如表3所示。本发明的检测特异性为100%。
表3、CYP19A1rs4646检测特异性数据
实施例五、检测CYP19A1基因多态性的方法的灵敏度
本发明的检测灵敏度定义为阳性符合率。本发明共对19例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阳性结果与Sanger法显示的结果相符，如表4所示。本发明的检测灵敏度为100%。
表4、CYP19A1rs4646位点检测灵敏度的试验数据
实施例六、检测CYP19A1基因多态性的方法的准确度
本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对19例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测结果与片段分析法或Sanger法显示的结果相符，如表5所示。本发明的准确度为100%。
表5、CYP19A1基因准确度的试验数据
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
<110>广州金域检测科技股份有限公司
<120>一种检测CYP19A1基因多态性的引物及其方法
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tcaaactcttggcctctgcttt22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tggcccatggcattttatagg21
<210>3
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttttttttttttttttctatgggttgtcaccaagctaggtgctatt46

Claims (7)

1.一种检测CYP19A1基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物为：针对CYP19A1_rs4646的上游引物5’-TCAAACTCTTGGCCTCTGCTTT-3’和下游引物5’-TGGCCCATGGCATTTTATAGG-3’；所述SNaPshotPCR引物为：针对CYP19A1_rs4646的SNaPshotPCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTTCTATGGGTTGTCACCAAGCTAGGTGCTATT-3’。
2.一种检测CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshotPCR引物进行SNaPshotPCR扩增，并对SNaPshotPCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
3.根据权利要求2所述的检测CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
4.根据权利要求2所述的检测CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：58℃30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃保温。
5.根据权利要求2所述的检测CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S3中的SNaPshotPCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃10s；阶段2：55℃5s；阶段3：60℃30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃保温。
6.根据权利要求2所述的检测CYP19A1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S4中采用GENEMAPPERIDV4.1软件对检测结果进行分析。
7.根据权利要求1所述的检测CYP19A1基因多态性的引物在制备检测CYP19A1基因多态性试剂中的用途。
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