CN105525005A - 一种检测mdr1基因多态性的引物及其方法 - Google Patents

一种检测mdr1基因多态性的引物及其方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测MDR1基因多态性的引物及其方法。本发明提供的MDR1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshot？PCR引物。本发明提供的MDR1基因多态性的引物具有特异性强，检测灵敏度好，准确性高的优点，实现了MDR1基因多态性的检测，可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效；同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不良反应风险。

Description

一种检测MDR1基因多态性的引物及其方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测MDR1基因多态性的引物及其方法。
背景技术
多药耐药基因(MDR1)编码P-糖蛋白（P-gp），它是人体药物转运中最重要的转运体，能主动将疏水性抗肿瘤药物泵出胞外，从而减少细胞内药物浓度。几乎所有的肿瘤，包括各种实体瘤、白血病、淋巴瘤等均有MDR1表达。
现代研究发现，MDR1基因多态性直接影响P-gp的表达，与抗肿瘤药物与免疫抑制剂等多种药物的代谢动力学有重要关联。rs1045642（C3435T）、rs1128503(C1236T)和rs2032582(G2677T/A)是蛋白编码区最常见的SNP位点，与药物代谢密切相关。MDR1基因3435 CC/CT型使得MDR1表达增加，增大肿瘤细胞的耐药性，使蒽环类抗肿瘤药疗效不显著，而TT型患者，能较好地吸收化疗药物，使药物在体内维持相对较高的血药浓度，对药物较为敏感。MDR1基因12外显子C1236T多态性，与脑胶质瘤替莫唑胺疗效相关，1236CC基因型患者的总生存期优于CT和TT基因型患者。MDR1基因G2677T/A多态性，与紫杉醇的疗效相关，2677GG基因型患者的总生存期差于GA、GT、TT、TA基因型患者。因此，检测MDR1基因多态性具有重大的临床意义。
中国专利CN102816845B公开了一种 MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，所述试剂盒包括红细胞裂解液、DNA 提取液、PCR 试剂、单链纯化试剂和测序试剂，可用于检测MDR1（G2677T/A）位点是否发生突变。但是，上述检测方法存在检测项目单一，灵敏度低的缺陷，不利于该检测试剂盒的推广和应用。
发明内容
为了解决现有技术中检测MDR1基因多态性的方法存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种检测MDR1基因多态性的引物及其方法，该引物主要用于检测MDR1基因的MDR1_C1236T (SNP: rs1128503)、MDR1_G2677T/A (SNP: rs2032582)、MDR1_C3435T (SNP:rs1045642)三个位点，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，为MDR1基因多态性提供了一种简单有效的检测方法。
本发明提供了一种检测MDR1基因多态性的引物，包括PCR扩增引物和SNaPshotPCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对MDR1_C1236T的上游引物5’-TCAGTTCCTATATCCTGTGTCTGTGAA-3’（SEQ ID NO.1）和下游引物5’-GCTGGACTGTTGTGCTCTTCC-3’（SEQ ID NO.2），针对MDR1_G2677T/A的上游引物5’-CCCATCATTGCAATAGCAGGAGT-3’（SEQ ID NO.3）和下游引物5’-GCATGAAAAAGATTGCTTTGAGGA-3’（SEQ ID NO.4），针对MDR1_C3435T的上游引物5’-GATGGCAAAGAAATAAAGCGACTG-3’（SEQ ID NO.5）和下游引物5’-ACTCGATGAAGGCATGTATGTTG-3’（SEQ ID NO.6）；所述SNaPshot PCR引物包括：针对MDR1_C1236T的SNaPshot PCR引物5’-CTCTGCACCTTCAGGTTCAG-3’（SEQ ID NO.7），针对MDR1_G2677T/A的SNaPshot PCR引物5’- TTTTTTATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG-3’（SEQ ID NO.8），针对MDR1_C3435T的SNaPshot PCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC-3’（SEQ ID NO.9）。
进一步地，所述PCR扩增引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A和MDR1_C3435T的引物浓度比为1:1:1，所述SNaPshot PCR引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A和MDR1_C3435T的引物浓度比为1:1:1。
另外，本发明提供一种检测MDR1基因多态性的方法，包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
进一步地，所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
进一步地，所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃ 保温。
进一步地，所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。
进一步地，所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
除此之外，本发明提供的所述的检测MDR1基因多态性的引物在制备检测MDR1基因多态性试剂中的用途。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优势：本发明提供的检测MDR1基因多态性的引物具有特异性好，不会发生交叉反应，准确性高的优点，实现了检测MDR1基因多态性的检测，可以有效的预测绝经期晚期乳腺癌患者接受芳香化酶抑制剂的治疗疗效；同时还可以预测多种抗肿瘤药物与免疫抑制剂疗效及不良反应风险。
附图说明
图1为本发明提供的MDR1_C1236T基因引物的扩增片段；
图2为本发明提供的MDR1_G2677T/A基因引物的扩增片段；
图3为本发明提供的MDR1_C3435T基因引物的扩增片段；
图4为本发明提供的MDR1基因SNaPshot PCR引物的检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
实施例一、引物
本发明提供的MDR1基因引物如表1所示，包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物，所述PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物是相对应的。本发明提供的所有引物序列均通过UCSC数据库比对，无已知SNP位点。
表1 本发明提供的引物
实施例二、引物的特异性
将本发明提供的引物于UCSC中进行Blasting，结果如下：
1)MDR1和CYP19A1基因特异引物于UCSC中进行Blast，所有引物的扩增片段均覆盖了相应的检测位点，无其它同源基因，MDR1_C1236T扩增片段位于chr7:87179522-87179674，长度为153bp，扩增序列图如图1；MDR1_G2677T/A扩增片段位于chr7:87160475-87160699，长度为225bp，扩增序列图如图2；MDR1_C3435T扩增片段位于chr7:87138602-87138791，长度为190bp，扩增序列图如图3。
2）使用表1中SNaPshot PCR引物，SNaPshot法进行检测，结果如图4所示，各产物峰的相对位置及测序反应掺入的碱基与预期相符。
实施例三、MDR1基因多态性的检测
1）提取EDTA抗凝外周血的DNA样品，提取方法参照TIANamp Blood DNA Kit（购自Tiagen，货号DP318）的说明书，将DNA样品稀释至100ng/μL，备用。
2）配制PCR扩增引物混合物：将PCR扩增引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A和MDR1_C3435T的引物浓度比为1:1:1混合，震荡混匀；短暂离心后备用；PCR扩增采用Q5™热启动超保真2X Master Mix（购自NEB公司，货号M0494L），反应体系如表2所示，震荡混匀，短暂离心后，分装18.0μL至标记好的PCR反应管；往标记好的PCR反应管加入引物混合物5.0μL，按照以下程序进行PCR扩增：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，2:9个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
表2、PCR试剂配制表格
3）按MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A和MDR1_C3435T的引物浓度比为1:1:1混合，SNaPshot PCR产物中加入1.0μL SAP酶，按照以下程序进行反应：37℃，15min；80℃，15min；4℃，保温。反应完毕后，毛细管电泳技术进行检测，对检测结果采用GENEMAPPERID V4.1软件进行分析，确定SNP位点及其基因型，结果如图4所示。
实施例四、检测MDR1基因多态性的方法的特异性
本发明的检测特异性定义为阴性符合率。本发明共对19例样本进行SNaPshot测序法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阴性结果Sanger测序法显示的结果相符，如表3所示。本发明的检测特异性为100%。
表3、MDR1 3SNPs检测特异性数据
实施例五、检测MDR1基因多态性的方法的灵敏度
本发明的检测灵敏度定义为阳性符合率。本发明共对19例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测出的阳性结果与Sanger法显示的结果相符，如表4所示。本发明的检测灵敏度为100%。
表4、 MDR1 3SNPs位点检测灵敏度的试验数据
实施例六、检测MDR1基因多态性的方法的准确度
本发明准确度定义为不同方法检测结果的一致性。本发明共对19例样本进行优化SNaPshot测序法检测，检测结果采用片段分析法或Sanger测序法进行验证。SNaPshot测序法检测结果与片段分析法或Sanger法显示的结果相符，如表5所示。本发明的准确度为100%。
表5、MDR1基因准确度的试验数据
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州金域检测科技股份有限公司
<120> 一种检测MDR1基因多态性的引物及其方法
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcagttccta tatcctgtgt ctgtgaa 27
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctggactgt tgtgctcttc c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccatcattg caatagcagg agt 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcatgaaaaa gattgctttg agga 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatggcaaag aaataaagcg actg 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
actcgatgaa ggcatgtatg ttg 23
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctctgcacct tcaggttcag 20
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ttttttattt agtttgactc accttcccag 30
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tttttttttt tttttgttgg cctcctttgc tgccctcac 39

Claims (8)

1.一种检测MDR1基因多态性的引物，其特征在于：包括PCR扩增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR扩增引物包括：针对MDR1_C1236T的上游引物5’-TCAGTTCCTATATCCTGTGTCTGTGAA-3’和下游引物5’- GCTGGACTGTTGTGCTCTTCC-3’，针对MDR1_G2677T/A的上游引物5’- CCCATCATTGCAATAGCAGGAGT-3’和下游引物5’-GCATGAAAAAGATTGCTTTGAGGA-3’，针对MDR1_C3435T的上游引物5’-GATGGCAAAGAAATAAAGCGACTG-3’和下游引物5’- ACTCGATGAAGGCATGTATGTTG-3’；所述SNaPshot PCR引物包括：针对MDR1_C1236T的SNaPshot PCR引物5’-CTCTGCACCTTCAGGTTCAG-3’，针对MDR1_G2677T/A的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTATTTAGTTTGACTCACCTTCCCAG-3’，针对MDR1_C3435T的SNaPshot PCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTTGTTGGCCTCCTTTGCTGCCCTCAC-3’。
2.根据权利要求1所述的检测MDR1基因多态性的引物，其特征在于：所述PCR扩增引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A和MDR1_C3435T的引物浓度比为1:1:1，所述SNaPshot PCR引物中MDR1_C1236T、MDR1_G2677T/A和MDR1_C3435T的引物浓度比为1:1:1。
3.一种检测MDR1基因多态性的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1提取DNA样品；
S2以步骤S1提取的DNA样本为模板，采用权利要求1中所述的PCR扩增引物进行多重PCR扩增，并对扩增产物进行纯化；
S3以步骤S2纯化后的PCR扩增产物为模板，采用权利要求1中所述的SNaPshot PCR引物进行SNaPshot PCR扩增，并对SNaPshot PCR扩增产物进行纯化；
S4采用毛细管电泳技术进行检测，对检测结果进行分析，确定SNP位点及其基因型。
4.根据权利要求3所述的检测MDR1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S1中的DNA样品为EDTA抗凝外周血的DNA样品。
5.根据权利要求3所述的检测MDR1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S2中的多重PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃ 3min；阶段2：98℃ 10s；阶段3：58℃ 30s；阶段4：72℃ 1min；阶段5：返回到阶段2，29个循环；阶段6：72℃ 5min；阶段7：25℃ 保温。
6.根据权利要求3所述的检测MDR1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S3中的SNaPshot PCR扩增反应条件包括：阶段1：96℃ 10s；阶段2：55℃ 5s；阶段3：60℃ 30s；阶段4：返回到阶段1，25个循环；阶段5：4℃ 保温。
7.根据权利要求3所述的检测MDR1基因多态性的方法，其特征在于：所述步骤S4中采用GENEMAPPERID V4.1软件对检测结果进行分析。
8.根据权利要求1所述的检测MDR1基因多态性的引物在制备检测MDR1基因多态性试剂中的用途。
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