CN105671155A - 焦磷酸测序法检测abcc10基因试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种焦磷酸测序法检测底物替诺福韦抗逆转录病毒个体化用药基因多态性试剂盒及方法。具体是指ABCC10基因nearGene-5区rs9349256(G>A)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ？ID？NO.1-3所示的引物。本发明的试剂盒可以实现准确、快捷、高通量对ABCC10基因多态性的检测，从而达到对底物替诺福韦高效抗逆转录病毒治疗实现安全合理有效的个体化给药。

Description

焦磷酸测序法检测ABCC10基因试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测ABCC10基因多态性的试剂盒及方法。

背景技术

替诺福韦是一种核苷酸类逆转录酶抑制剂，临床应用于治疗艾滋病、乙肝等的抗病毒药物。替诺福韦酯是替诺福韦的前药，口服药物替诺福韦酯具有水溶性，可被迅速吸收并降解成活性物质替诺福韦，替诺福韦然后被转变为活性代谢产物替诺福韦双磷酸盐。活性成分替诺福韦双磷酸盐可通过直接竞争性地与天然脱氧核糖底物相结合而抑制病毒聚合酶，及通过插入DNA中终止DNA链。该药通过干扰病毒DNA聚合酶的功能，抑制病毒复制，降低血清及组织内的病毒载量从而具有潜在的抗病毒的活性。替诺福韦几乎不经胃肠道吸收，通过肾小球过滤和主动小管转运系统排泄，约70％～80％以原形经尿液排出体外。近端肾小管上皮细胞是替诺福韦酯的主要作用靶点。因为近端小管的上皮细胞有复杂的药物转运机制，主要包括OAT1和OAT3转入蛋白及MRP-2、MRP-4和MRP-7转出蛋白等转运蛋白。其编码基因的SNP突变可能影响其蛋白活性从而导致替诺福韦的蓄积，毒副反应增加，疗效降低。MRP-7的编码基因为ABCC10,其nearGene-5区存在526G>A(rs9349256)突变，可能影响ABCC10的活性，从而影响MRP-7对替诺福韦的转出过程。rs9349256与尿无机磷消耗及β2小球蛋白显著相关，P值分别为0.02与0.04,等位基因A携带者发生慢性肾脏疾病的风险是等位基因G携带者的2.3倍(JInfectDis.2011Jul1；204(1):145-53.)。我们进一步研究发现，携带rs9349256突变纯合子AA和突变杂合子GA的在治疗48周后的CD4免疫应答分别为携带GG野生型纯合子的31.2％和40.8％，携带GA+AA型患者CD4免疫应答效应为携带GG型患者的38.6％，P＝0.002。

综上所述，对ABCC10基因nearGene-5区rs9349256单核苷酸多态性进行分析检测可作为替诺福韦不良反应及疗效预测的有效指标，为临床制定替诺福韦抗病毒治疗方案提供依据。开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测ABCC10基因多态性的试剂盒将为替诺福韦的临床个体化治疗起到积极的推动作用。

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。

发明内容

ABCC10基因多态性是替诺福韦不良反应预测的有效指标。本发明提供一种检测影响ABCC10rs9349256(G>A)单核苷酸多态性的试剂盒，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测替诺福韦个体化用药相关基因SNP。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案是：

所述焦磷酸测序法检测ABCC10基因多态性试剂盒，包括如下引物：

(1)扩增引物：

ABCC10(rs9349256)上游引物：5′-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3′(SEQIDNO.1)；

ABCC10(rs9349256)下游引物：5′-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3′(SEQIDNO.2)；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：

ABCC10(rs9349256)测序引物：5′-TTCACTCTCTCCTGACC-3′(SEQIDNO.3)；

其中，ABCC10rs9349256(G>A)目标序列：野生型CCTTTGTCCAA(SEQIDNO.4)、突变型CCTTTATCCAA(SEQIDNO.5)。

利用上述试剂盒检测ABCC10基因多态性的方法，不包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应

配制50μlPCR扩增体系，包含：10×PCRbuffer5.0μl，dNTP1.5μl，ABCC10-上游引物0.5μl，ABCC10下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水40μl，模板2μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95℃5min预变性；然后依次在95℃30S,55℃30S,72℃30S,进行36个循环；再在72℃保持3min，最终保持在4℃，得扩增产物；

(3)焦磷酸测序单链样本纯化；

(4)焦磷酸测序；

(5)焦磷酸测序结果分析。

本发明适用于对ABCC10基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上替诺福韦个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。

附图说明

图1为本发明ABCC10rs9349256(GG)焦磷酸测序结果图。

具体实施方式

实施例1

ABCC10(rs9349256)上游引物：5′-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3′(SEQIDNO.1)；

ABCC10(rs9349256)下游引物：5′-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3′(SEQIDNO.2)；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

ABCC10(rs9349256)测序引物5′-TTCACTCTCTCCTGACC-3′(SEQIDNO.3)；

1.DNA提取

1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：

(1)检查试剂盒保质期以及确保WashBuffer1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇(如无，可用无水乙醇替代)和75％乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mLEppendorf管和各类移液枪头。

1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；

1.3在1.5mLEppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；

1.4分别移取900uLCellLysisSolution加至灭菌的1.5mLEppendorf管；

1.5小心移取300uL全血转移至上述加有CellLysisSolution的1.5mLEP管；

1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；

1.713,000rpm室温离心20秒；

1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；

1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；

1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；

1.11移取300uLNucleiLysisSolution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；

1.12打开Eppendorf管，移取100uLProteinPrecipitationSolution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；

1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mLEppendorf管；

1.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；

1.1513,000rpm室温离心1min；

1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；

1.17移取300uL75％乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；

1.1813,000rpm室温离心1min；

1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；

1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；

1.21目测沉淀大小，加入50～100ulDNARehydrationSolution至沉淀；

1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydrationSolution溶解DNA。

1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；

1.24保存核酸标本至4℃冰箱；

2.聚合酶链反应

2.1在试剂准备区配制50μlPCR扩增体系(模板添加除外)，各组分及添加量如表1：

表1

10×PCR buffer	5.0μl
		dNTP	1.5μl
ABCC10-pyroF	0.5μl
		ABCC10-pyroR(5’-Bio标记)	0.5μl
rTaq	0.5μl
		水	40.0μl

2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加2μl至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；

2.3在扩增区进行PCR扩增反应，按照表2所示的循环参数设置扩增仪：

表2

2.4设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；

2.5点击“start”开始仪器运行。

3.焦磷酸测序单链样本纯化

3.1纯化前试剂和仪器准备：

进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。

3.2单链样本纯化操作：

3.2.1在PSQ96板中先加40μlAnnealingBuffer和2～3μl测序引物(10uM)；

3.2.2在振荡器上充分混匀SepharoseBeads；

3.2.3将所需SepharoseBeads量(每样本3μl计算)转移到1.5mLEppendorf管；

3.2.4在SepharoseBeads中加入BindingBuffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；

3.2.5将SepharoseBeads混合物加至约40μlPCR产物中，每样本加40μl；

3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；

3.2.7在Vacuumprepworkstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml70％乙醇、DenaturationBuffer和WashingBuffer；

3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；

3.2.9打开VacuumPrepWorkstation的真空泵和阀门，将VacuumPrepTool在纯水中清洗30秒；

3.2.10将VacuumprepTool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的SepharoseBeads；

3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了VacuumPrepTool上；

3.2.12将VacuumPrepTool放入70％乙醇中5秒；

3.2.13将VacuumPrepTool移到DenatureationBuffer中5秒；

3.2.14再将VacuumPrepTool移到WashingBuffer中清洗10秒；

3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；

3.2.16VacuumPrepTool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放SepharoseBeads；

3.2.17放有纯化样本的PSQ96板放在ThermoPlate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。

3.3纯化完毕后清洗：

3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗VacuumPrepTool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；

3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；

3.3.3关掉真空泵和阀门，将VacuumPrepTool侧放，室温晾干；

3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；

3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。

4.焦磷酸测序

4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；

4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；

4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。

5.焦磷酸测序结果分析

在“SNPRuns”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNPmode”，点击“AnalyzeAll”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQmode”，点击“AnalyzeAll”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测ABCC10rs9349256基因多态性,焦磷酸检测结果如图1。

Claims (2)

1.一种焦磷酸测序法检测ABCC10基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下引物：

(1)扩增引物：

ABCC10的rs9349256上游引物：5′-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3′；

ABCC10的rs9349256下游引物：5′-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3′；

其中，下游引物的5′进行生物素标记；

(2)测序引物：

ABCC10的rs9349256测序引物：5′-TTCACTCTCTCCTGACC-3′。

2.一种应用权利要求1所述的试剂盒检测ABCC10基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取；

(2)聚合酶链反应

配制50μlPCR扩增体系，包含：10×PCRbuffer5.0μl，dNTP1.5μl，ABCC10-上游引物0.5μl，ABCC10下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水40μl，模板2μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95℃5min预变性；然后依次在95℃30S,55℃30S,72℃30S,进行36个循环；再在72℃保持3min，最终保持在4℃，得扩增产物；

(3)焦磷酸测序单链样本纯化；

(4)焦磷酸测序；

(5)焦磷酸测序结果分析。