CN102643907B - 焦磷酸测序法检测cda基因多态性的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒及方法。所述试剂盒CDA基因多态性进行检查，具体是指rs60369023(G＞A)单核苷酸多态性。试剂盒包含如SEQ ID NO.2-4所示的引物。本发明的试剂盒及方法，可以实现准确、快捷、高通量CDA基因多态性的检测，从而达到对其底物吉西他滨实现安全合理有效的个体化给药。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒及方法。
背景技术
吉西他滨是临床上用于治疗胰腺癌，肺癌，乳腺癌和膀胱癌等肿瘤的一种抗代谢药物。吉西他滨系胞嘧啶核苷衍生物，通过人平衡型核苷载体1(hENTl)进入细胞内。在胞浆内，吉西他滨被脱氧胞苷激酶(dCK)磷酸化为双氟脱氧胞苷一磷酸(dFdCMP)，后者继续活化为双氟脱氧胞苷二磷酸(dFdCDP)及双氟脱氧胞苷三磷酸(dFdCTP)活性产物。dFdCDP抑制核苷酸还原酶(RR)的活性，使细胞内DNA合成与修复所必需的原料脱氧二磷酸核苷减少，从而进一步抑制DNA的合成；dFdCTP是一种DNA多聚酶抑制剂，抑制DNA链的延长，使DNA复制提前终止，它的浓度增加还将抑制dCMP脱氨酶，减少dFdCMP代谢，使药物活化增加，自我强化其细胞毒的作用。所以，吉西他滨是通过细胞内多靶位作用而抑制DNA合成的。胞苷脱氨酶(CDA)是吉西他滨主要代谢酶，使吉西他滨下发生不可逆的脱氨基反应，生成相对无活性的代谢产物双氟脱氧尿苷(dFdU)而排出细胞外；吉西他滨另一次要代谢途径是中间产物，dFdCMP在dCMP脱氮酶的作用下生成双氟一磷酸脱氧尿苷，进而生成双氟脱氧尿苷而失活。肿瘤组织中CDA高表达，吉西他滨耐药的原因之一，而CDA酶活性降低，则有可能使吉西他滨体内浓度增高，毒副反应增加。CDA基因2号外显子区存在208G>A(rs60369023，CDA*3，Ala70Thr)突变，该突变位于CDA活性区域附近的SNP可影响蛋白结构中a螺旋的形成，进而影响CDA的活性，导致CDA对吉西他滨的脱氨基作用大大降低。CDA*3携带者约占人群的8～10%。突变纯合子CDA*3/*3和突变杂合子CDA*1/*3体内CDA的脱氨基活性分别为CDA*1/*1野生型纯合子的12%和25%，CDA*3/*3突变型纯合子肿瘤病人体内吉西他滨的血药浓度为CDA*1/*1野生型纯合子的5倍。携带CDA*3/*3的胰腺癌患者对吉西他滨的药物毒性反应有明显的加重，如粒细胞减少症、血小板减少症、口腔炎、皮疹等。进一步的研究发现，CDA*3可导致胰腺癌患者的吉西他滨在体内的清除减少，血清内吉西他滨浓度升高，血清CDA活性下降，代谢产物dFdU浓度减低，体内吉西他滨的清除率降低。当CDA*3/*3和CDA*1/*3突变携带者联合铂类化疗时，几乎肯定将发生骨髓抑制、3级或3级以上粒细胞减少症，需严密关注血相。
综上所述，CDA基因多态性可作为吉西他滨不良反应预测的有效指标，开发快速、高效、准确、便捷、经济的检测CDA基因多态性的试剂盒将为吉西他滨的临床个体化治疗起到积极的推动作用。
焦磷酸测序(Pyro sequencing)技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，是一种通用型技术平台。该技术具有操作简便、检测成本低、所需样品量小、快捷、准确、高通量等特点，符合临床大样本检测要求。
发明内容
本发明旨在提供一种焦磷酸测序法检测CDA基因（SEQ ID NO.1）多态性的试剂盒及方法，以实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测吉西他滨个体化用药相关基因SNP。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒，包括如下引物：
（1）扩增引物：
上游引物：5′-AGG GTG CAA CAT AGA AAA T-3′（SEQ ID NO.2）；
下游引物：5′-TTG CCC TGA AAT CCT TGT ACC-3′（SEQ ID NO.3）；
其中，下游引物的5′进行生物素标记；
（2）测序引物：5′-TGT GCT GAA CGG ACC-3′（SEQ ID NO.4）；
试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂。
一种应用上述试剂盒检测CDA基因多态性的方法，包括如下步骤：
（1）DNA提取；
（2）聚合酶链反应：
配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer5.0μl，dNTP1.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水40μl，模板2μl；按照下面的循环参数设置扩增仪：95℃5min预变性；然后依次在95℃30S，52℃30S，72℃30S，进行35个循环；再在72℃保持5min，最终保持在4℃，得扩增产物；
（3）焦磷酸测序单链样本纯化；
（4）焦磷酸测序及结果分析。
本发明的试剂盒对CDA rs60369023(G>A)目标序列进行分析和检测，该目标序列包括：野生型GGACCGCTATCC（SEQ ID NO.5）和突变型GGACCACTATCC（SEQ IDNO.6）；扩增出的片段长为90bp。
由于设计了特异性高的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对CDA基因多态性进行快速检测，可广泛应用于临床上吉西他滨个体化用药方案制定的基因检测。与现有技术相比，其可以快速、准确地进行短DNA序列分析，便于构建标准化操作流程；具有高通量、低成本等特点；PCR产物即可直接用于测序，不需进行产物纯化等二次处理，操作极为简便，所需样品量小。
附图说明
图1为本发明的CDA rs60369023(GG)焦磷酸测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对上述试剂盒及检测方法进行详细描述。
实施例1
CDA-pyroF（上游引物）：5′-AGG GTG CAA CAT AGA AAA T-3′（SEQ ID NO.2）；
CDA-pyroR（下游引物）：5′-TTG CCC TGA AAT CCT TGT ACC-3′（SEQ ID NO.3）；
测序引物：5′-TGT GCT GAA CGG ACC-3′（SEQ ID NO.4）；
1.DNA提取
1.1实验前试剂材料准备与检查工作如下：
(1)检查试剂盒保质期以及确保Wash Buffer1和2中已添加乙醇，并在瓶上相应标识处打勾√；(2)异丙醇（如无，可用无水乙醇替代）和75%乙醇；(3)高压灭菌有效期内的1.5mL Eppendorf管和各类移液枪头。
1.2从4℃冰箱中取出装有全血的EDTA抗凝管，上下颠倒数次混匀；
1.3在1.5mL Eppendorf管对应标本唯一性标识做好标记；
1.4分别移取900uL Cell Lysis Solution加至灭菌的1.5mL Eppendorf管；
1.5小心移取300uL全血转移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；
1.6盖上Eppendorf管盖，室温孵育10min；
1.713,000rpm室温离心20秒；
1.8取出Eppendorf管，观察白色沉淀；
1.9开Eppendorf管盖，手持管底部，倾斜EP管口弃去部分红色上清，尽量将红色上清吸尽；
1.10盖上Eppendorf管，用手指弹击EP管底部，使白色沉淀重悬；
1.11移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，盖上管，上下颠倒数次混匀；
1.12打开Eppendorf管，移取100uL Protein Precipitation Solution入上述Eppendorf管中，盖上管管，振荡器上剧烈振荡20秒；13,000rpm室温离心3min；
1.13移取上清转移到新的已灭菌1.5mL Eppendorf管；
1.14移取300uL异丙醇入EP管，盖上管盖，上下颠倒数次混匀，可见白色絮状gDNA析出；
1.1513,000rpm室温离心1min；
1.16打开Eppendorf管，手捏管底部，倾斜管口弃去上清；
1.17移取300uL75%乙醇加入Eppendorf管，盖上管盖，轻柔上下颠倒洗涤沉淀；
1.1813,000rpm室温离心1min；
1.19打开Eppendorf管，手持管底部，倾斜管口弃去上清；
1.20在实验台上放置新滤纸，倒扣Eppendorf管，吸干液体，将Eppendorf管开盖侧放风干；
1.21目测沉淀大小，加入50～100ul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22过夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度计进行核酸浓度测定，核酸浓度大于50ng/ul视为合格，如浓度不够，加入乙醇再次沉淀DNA，然后重新加适量的DNARehydration Solution溶解DNA。
1.23在管壁和管盖上再次标清样本唯一性编号，并用透明胶带缠绕保护；
1.24保存核酸标本至4℃冰箱；
2.聚合酶链反应
2.1在试剂准备区配制50μl PCR扩增体系（模板添加除外），各组分及添加量如下表：
| 10×PCR buffer | 5.0μl |
| dNTP | 1.5μl |
| CDA-pyroF | 0.5μl |
| CDA-pyroR（5’-Bio标记） | 0.5μl |
| rTaq | 0.5μl |
| 水 | 40.0μl |
2.2在标本制备区对盛有gDNA模板短暂离心后添加2μl至扩增体系中，在PCR管壁上标记标本唯一性标识，管盖上标记检测项目代号。PCR管震荡混匀，桌面离心机上短暂离心；
2.3在扩增区进行PCR扩增反应，按照下面的循环参数设置扩增仪：
2.4设置程序后在随后的下拉菜单中选择“tube”；
2.5点击“start”开始仪器运行。
3.焦磷酸测序单链样本纯化
3.1纯化前试剂和仪器准备：
进行样本纯化前，确保所有溶液都达到室温；打开精密控温加热炉，使温度达到80℃。
3.2单链样本纯化操作：
3.2.1在PSQ96板中先加40μlAnnealing Buffer和2～3μl测序引物(10uM)；
3.2.2在振荡器上充分混匀Sepharose Beads；
3.2.3将所需Sepharose Beads量(每样本3μl计算)转移到1.5mL Eppendorf管；
3.2.4在Sepharose Beads中加入Binding Buffer，使得平均每个样品约有和PCR体系一样的体积，在振荡器上将混合物充分混匀；
3.2.5将Sepharose Beads混合物加至约40μl PCR产物中，每样本加40μl；
3.2.6常温下、在振荡器上将PCR板混匀10分钟；
3.2.7在Vacuum prep workstation中，四个液体槽中依次加入180ml纯水、120ml70％乙醇、Denaturation Buffer和Washing Buffer；
3.2.8倒掉与真空泵相连的废液收集桶中的废液；
3.2.9打开Vacuum Prep Workstation的真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool在纯水中清洗30秒；
3.2.10将Vacuum prep Tool移到PCR板孔中，抓取结合了生物素标记核酸的SepharoseBeads；
3.2.11拿起PCR板，检查Beads是否都被吸附在了Vacuum Prep Tool上；
3.2.12将Vacuum Prep Tool放入70％乙醇中5秒；
3.2.13将Vacuum Prep Tool移到Denatureation Buffer中5秒；
3.2.14再将Vacuum Prep Tool移到Washing Buffer中清洗10秒；
3.2.15把Tool悬放在Pyro反应板；
3.2.16Vacuum Prep Tool放入含有测序引物的反应板中，旋转摇动，以释放SepharoseBeads；
3.2.17放有纯化样本的PSQ96板放在Thermo Plate上，置于80℃加热炉中加热2min，取出后自然冷却到室温，进行下游Pyrosequencing反应。
3.3纯化完毕后清洗：
3.3.1不开真空泵和阀门，使用少量纯水清洗Vacuum Prep Tool，使少量未脱落的Beads洗脱下来；
3.3.2更换纯水后再打开真空泵和阀门，用约300mL纯水清洗Tool；
3.3.3关掉真空泵和阀门，将Vacuum Prep Tool侧放，室温晾干；
3.3.4清洗所有盛装试剂溶液的塑料槽，自然晾干；
3.3.5用湿布擦拭纯化设备表面。
4.焦磷酸测序
4.1调入前述设定的运行程序文件，点击“View”的下拉键，选择“Run”，按照软件自动计算本次实验的各试剂使用量，添加各试剂成分至试剂仓；
4.2把准备好的样本和试剂舱放入仪器相应的位置，点击屏幕右下端的“Run”开始焦磷酸测序；
4.3检测完成后，首先点击软件进程状态窗口的“close”键以保存测序结果。
5.焦磷酸测序结果分析
在“SNP Runs”文件夹中双击鼠标，打开上述运行文件，选择“SNP mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行基因型分析；选择“AQ mode”，点击“Analyze All”键，对所有检测标本进行等位基因频率分析。对样本检测CDA基因多态性，焦磷酸检测结果如图1。可以看出，采用本发明的试剂盒，能够简捷、直观、准确的对CDA基因型进行检测和判读。该图提示CDA为野生型纯合子，临床医生可根据CDA为野生型，而判断出患者使用吉西他滨时的毒副反应发生风险将降低。
综上，本发明所选取的靶序列，以及应用本发明的试剂盒能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测CDA基因型，能够满足临床检验实际工作的要求，利于CDA底物(如吉西他滨)的个体化使用。
Claims (2)
1.一种焦磷酸测序法检测CDA基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括如下引物：
（1）扩增引物：
上游引物：5’-AGG GTG CAA CAT AGA AAA T-3’；
下游引物：5’-TTG CCC TGA AAT CCT TGT ACC-3’；
其中，下游引物的5’进行生物素标记；
（2）测序引物：5’-TGT GCT GAA CGG ACC-3’。
2.如权利要求1所述的引物在制备检测CDA基因多态性试剂中的应用,
（1）DNA提取；
（2）聚合酶链反应：
配制50μl PCR扩增体系，包含：10×PCR buffer5.0μl，dNTP1.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，rTaq0.5μl，水40μl，模板2μl；循环程序为：95℃5min预变性；依次在95℃30S，52℃30S，72℃30S，进行35个循环；72℃保持5min，最终保持在4℃，得扩增产物；
（3）焦磷酸测序单链样本纯化；
（4）焦磷酸测序及结果分析。
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