TWI565417B - Can be given thick flavor agent - Google Patents

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Megumi Kaneko
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Reiko Yasuda
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Ajinomoto Kk
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Description

可賦予濃厚味用劑
本發明係有關由具有CaSR促效劑活性之胜肽構成之可賦予濃厚味用劑，以及複合可賦予濃厚味用劑。且本發明係有關含有一定濃度以上之具有CaSR促效劑活性之胜肽之食品組成物。
近年來由於飲食生活的多樣化等原因，消費者對味覺的要求正日漸提高，隨之而來的是對於無法僅以甜味、鹹味、酸味、苦味、鮮味等表示的5種基本味道說明，厚度、成熟度、連續性、調和形式等前述基本味道周邊的味道亦增強的味覺，亦即可賦予「濃厚味」的優異之可賦予濃厚味用劑的需求，正日漸增加。
另一方面，鈣離子感應受器(Calcium Sensing Receptor：CaSR)，亦稱為鈣離子受器，該受器可調節各式各樣的生物體內功能，且可使用具有CaSR促效劑活性的物質為賦予濃厚味用劑(專利文件1及2、非專利文件3)。
上述的「濃厚味」存在有各式各樣的呈味型式，目前正尋求可賦予中後味型的濃厚味，且更高力價之可賦予濃厚味用劑。另外由於賦予濃厚味物質一般係使用於食品等，亦需尋求具優異安定性者。
因此，本發明探索許多具有CaSR促效劑活性的變異化合物後，發現具有更優異的可賦予濃厚味作用，特別係具有前味型的可賦予濃厚味作用，且具優異安定性之簡便且可以低成本生產之可賦予濃厚味之物質，且正尋求可提供由該物質構成之可賦予濃厚味用劑，以及將該物質與其他具有CaSR促效劑活性的物質併用所構成之複合可賦予濃厚味用劑。
另外，目前已知在酵素活性研究等領域中，將在N端有許多γ-麩氨醯基之γ-麩氨醯胜肽合成為基質之例(專利文件3、非專利文件1及2)，但目前尚未有實際將γ-Glu-Nva-Gly使用於食品方面之例或天然存在之例。
上述專利文件1中記載γ-Glu-X-Gly(X係氨基酸或氨基酸衍生物)係具有CaSR促效劑活性的化合物，但針對γ-Glu-Nva-Gly，實施例中並無實際合成及評價的內容記載，且無具體的揭示。本說明書之記載係包含專利文件1及2的內容。
先前技術文件
專利文件
專利文件1：國際公開第2007/055393號小冊子
專利文件2：國際公開第2008/139945號小冊子
專利文件3：國際公開第2007/066430號小冊子
非專利文件
非專利文件1：Molecular Pharmacology(1982),21(3),629-36
非專利文件2：Biokhimiya(Moscow)(1972),37(4),757-61
非專利文件3：The Journal of Biological Chemistry,(2010),285(2),1016-22
本發明於探索許多具有CaSR促效劑活性的變異化合物後，發現具有更優異的可賦予濃厚味作用，特別係具有中後味型的高力價之可賦予濃厚味作用，且具優異安定性，可賦予濃厚味之物質，本發明係以提供由該物質構成之可賦予濃厚味用劑，以及由該物質與其他具有CaSR促效劑活性的物質構成之複合可賦予濃厚味用劑為課題。進而以提供含有一定濃度之該物質之食品組成物為課題。
本發明團隊探索許多種化合物後，發現令人驚訝的是γ-Glu-Nva-Gly(L-γ-麩氨醯基-L-正纈氨醯基-甘氨酸)，具有高CaSR促效劑活性與極優異之可賦予濃厚味效果，特別其呈味形式屬中後味型之可賦予濃厚味效果。進而，發現γ-Glu-Nva-Gly，與同樣的三胜肽之γ-Glu-Val-Gly比較為10倍以上，具有高力價且安定性優異，加之其屬中後味強之呈味形式。進而發現γ-Glu-Nva-Gly單獨即可成為有效的可賦予濃厚味用劑。另外藉由添加γ-Glu-Nva-Gly，可獲得增強濃厚味，令人滿意的食品組成物。進而發現可將該物質與其他具有CaSR促效劑活性的物質併用，構成複合可賦予濃厚味用劑，本發明遂至完成。
亦即，本發明係提供由γ-Glu-Nva-Gly構成之可賦予濃厚味用劑。
本發明亦提供含有γ-Glu-Nva-Gly的食品組成物(以下亦稱作「本發明之食品組成物」)。另外，本發明係提供一種複合可賦予濃厚味用劑，其係併用(a)γ-Glu-Nva-Gly，與選自(b)γ-Glu-X-Gly(X係表示氨基酸或氨基酸衍生物，但除了Nva以外)、γ-Glu-Val-Y(Y係表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-Glu-Nva、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu及γ-Glu-Cys(S-Me)所成群之1種或2種以上的氨基酸或胜肽。
根據本發明可提供具有極優異之可賦予濃厚味作用，特別係呈味形式為如圖1所示之具有獨特的中後味型的強力的可賦予濃厚味作用，且具優異安定性之簡便且可以低成本生產之可賦予濃厚味用劑，以及提供複合可賦予濃厚味用劑。根據本發明，亦可提供含有一定濃度之具有可賦予濃厚味作用之物質之優異的食品組成物。
因使用本發明之可賦予濃厚味用劑，可賦予低脂肪食品之呈味具有脂肪般的濃厚感及滑順度，即便使含脂肪食品中的脂肪含量降低，亦可保持與原先食品同樣的濃厚感，而可使用於高健康取向之食品。該等食品可舉出含肉類食品及乳製品等。特別係食用含本發明之可賦予濃厚味用劑之食品，不僅在入口的瞬間，在之後亦可感受到脂肪般的濃厚感及滑順此一優點度。
[解決課題之手段]
本發明中作為對象之γ-Glu-Nva-Gly係由3個氨基酸以胜肽鍵結後構成之L-γ-麩氨醯基-L-正纈氨醯基-甘氨酸及/或其鹽，特別包含可食性的鹽。
由於γ-Glu-Nva-Gly具優異的可賦予濃厚味效果，可使用為可賦予濃厚味用劑。相對於可賦予濃厚味之食品組成物之重量，可使γ-Glu-Nva-Gly以0.1 ppb～99.9質量%為佳，1 ppb～10質量%更佳，0.01 ppm～1質量%最佳之含量添加後使用。亦即，本發明另一個實施方式係有關含γ-Glu-Nva-Gly之食品組成物，以含有0.1 ppb～99.9質量%之γ-Glu-Nva-Gly之食品組成物為佳。更佳係有關含有0.01～50重量ppm之γ-Glu-Nva-Gly之食品組成物。
另外本發明之可賦予濃厚味用劑，即γ-Glu-Nva-Gly係藉由將至少1種選自麩氨醯酸鈉(MSG)等氨基酸類、次黃呤核酸-磷酸(IMP)等核酸類、氯化鈉等無機鹽類、檸檬酸等有機酸類、各種酵母萃取物等物質，與其他調味原料組合使用，與單獨使用其他調味原料之情形相比，可提供更增濃厚味且更佳之調味料。
本發明中「濃厚味」係意指無法僅以甜味(sweet taste)、鹹味(salty taste)、酸味(sour taste)、苦味(bitter taste)、鮮味(umami)等表示的5種基本味道(five basic tastes)說明，且不僅基本味道，厚度(thickness)、成熟度(growth(mounthfulness))、連續性(continuity)、調和形式(harmony)等基本味的周邊味道(marginal tastes)亦增強之味道。此處「可賦予濃厚味」係指可增強以甜味、鹹味、酸味、苦味、鮮味等表示的5種基本味道，與賦予伴隨其之厚度、成熟度、調和形式等基本味道周邊的味道。另外亦可將其表現為呈味增強作用。因此本發明之可賦予濃厚味用劑之γ-Glu-Nva-Gly，亦可表現為呈味增強劑(Flavor Enhancer)。本發明之可賦予濃厚味用劑之γ-Glu-Nva-Gly，亦可使用為甜味增強劑、鹹味增強劑、酸味增強劑、苦味增強劑或鮮味增強劑。
味覺會隨飲食後的時間經過而變化，自剛飲食後依序稱為前味(initial taste)、中味(middle taste)以及後味(after taste)。其係相對的概念，一般而言，前味、中味以及後味分別為飲食後0至2秒、2秒至5秒以及5秒以後感覺到之呈味。另外0至5秒稱為「前中味」，2秒以後至約30秒前後為「中後味」(參照圖1)。針對分為3個區分之評價，由於飲食者對評價的集中有困難，一般常用的是分為2個區分之評價。
具有CaSR促效劑活性的物質對於濃厚味及呈味形式之效果，可藉由人類味覺試驗等方法進行確認。該等藉由人類的味覺官能試驗，可舉出例如本說明書中實施例所示之試驗，但並非限定於該等例示。
本說明書中「CaSR」係意指鈣離子感應受器(Calcium Sensing Receptor)，係屬於7個穿膜段型受體的Class C，亦稱為鈣離子受器。本說明書中「CaSR促效劑」係意指與前述之CaSR結合，且可活性化CaSR之物質。本說明書中「活性化CaSR」係意指與CaSR配位體結合，活性化鳥糞嘌呤核甘酸結合蛋白並傳達訊息之意。另外，與CaSR結合，活性化CaSR之物質稱作「CaSR促效劑活性」。
以下具體揭示篩選具有CaSR促效劑活性化合物之方法，但並非限定於該等步驟。
1)於CaSR活性測定系中添加為測定CaSR活性之受檢物質後，再測定CaSR活性。
2)比較添加受檢物質後之CaSR活性與未添加受檢物質時之CaSR活性。
3)添加受檢物質後時選擇具有CaSR促效劑活性之被檢物質。
CaSR活性測定例如可使用表現CaSR之細胞測定系進行。前述細胞可為內在性地表現CaSR之細胞，亦可為外來地導入CaSR基因之基因轉殖細胞。前述之CaSR活性測定系，可於前述之表現CaSR之細胞中，加入具CaSR特異性的細胞外配位體(活性化物質)時，若為可檢測出活性化物質與CaSR之結合(反應)，或與活性化物質與CaSR之結合(反應)相對應之於細胞內可檢出之訊息傳遞物質，則無特別限制而可加以使用。藉由與受檢物質的反應而檢出CaSR活性時，可判定該受檢物質係具有CaSR刺激活性。
上述之CaSR可例舉出登錄於GenBank Accession No.NM_000388之由人類CaSR基因編碼之人類CaSR。且CaSR並未限定依據前述序列之基因所編碼的蛋白質，只要具有CaSR功能之蛋白質，並依據與前述序列相同性為60%以上為佳，80%更佳，90%以上最佳之基因編碼之蛋白質亦可。CaSR功能係於具該等基因之細胞表現，可藉由測定添加鈣離子時之電流變化及細胞內鈣離子濃度的變化而調查。
並未特別限制上述CaSR之來源，不僅上述之人類CaSR，亦可舉出來自小鼠、大鼠、犬之任一種動物之CaSR。
如上所述，CaSR活性可利用表現CaSR或其片段之活細胞、表現CaSR或其片段之細胞膜、含有CaSR或其片段之蛋白質之in vitro系等進行確認。
以下揭示使用活細胞之一例，但並未限定於此例。
使CaSR於非洲有爪水生蛙卵母細胞、倉鼠卵巢細胞及人類胎兒腎臟細胞等培養細胞進行表現。可將於擔載外來基因之質體經轉殖CaSR者，以質體的狀態或以其為鑄型後之cRNA進行導入。反應檢出可使用電器生理學之方法及細胞內鈣離子上升之螢光顯示試藥。
CaSR的表現最初可依鈣離子或具特異性的活化劑之反應而確認。對於約5 mM濃度之鈣離子可使用觀察細胞內電流的卵母細胞，或觀察螢光顯示試藥之螢光之培養細胞。改變鈣離子濃度測定濃度依存性。其次調製受檢物質為約1μM～1mM，再添加至卵母細胞或培養細胞，藉由於前述受檢物質存在下測定CaSR活性，可測定前述受檢物質之CaSR促效劑活性。
更具體而言，CaSR促效劑活性試驗可舉出例如本申請說明書中試驗例所示之試驗，但並未限定於此。
本發明之複合賦予濃厚味用劑中，與γ-Glu-Nva-Gly併用之氨基酸或胜肽，可為選自γ-Glu-X-Gly(X係表示除了Nva以外之氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-Glu-Val-Y(Y係表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-Glu-Nva、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu及γ-Glu-Cys(S-Me)所成群之1種或2種以上的氨基酸或胜肽，此處之氨基酸係Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met、Asn、Gln、Pro、Hyp、t-Leu等中性氨基酸，Asp、Glu等酸性氨基酸，Lys、Arg、His等鹼基性氨基酸，Phe、Tyr、Trp等芳香族氨基酸，亦包含絲氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、α-氨基丁酸、氨基戊酸、2-氨基己酸、牛磺酸等。另外亦可為第三白胺酸、環白氨酸、α-氨基異丁酸、青黴胺等非天然(非蛋白質構成)之胺基酸。胜肽於r-Glu-X-Gly中，X可為如前述之氨基酸或氨基酸衍生物之任一種，但以Cys以外之胺基酸或其衍生物為佳。其中，併用之胜肽以r-Glu-Val-Gly、r-Glu-Abu-Gly、r-Glu-tLeu-Gly、r-Glu-Nva以及r-Glu-Abu等為佳。
本發明之複合可賦予濃厚味用劑由r-Glu-Nva-Gly構成由於具有如圖1所示之獨特的中後味型之優異的可賦予濃厚味作用，具有與該等輪廓相異輪廓之胜肽，例如以將前味傾向之r-Glu-Abu-Gly、r-Glu-Abu等組合使用為佳。
本說明書中氨基酸殘基的簡寫係表示下述之氨基酸。
(1)Gly：甘氨酸
(2)Ala：丙氨酸
(3)Val：纈氨酸
(4)Leu：白氨酸
(5)lle：異白氨酸
(6)Met：蛋氨酸
(7)Phe：苯氨基丙酸
(8)Tyr：酪氨酸
(9)Trp：色氨酸
(10)His：組氨酸
(11)Lys：離氨酸
(12)Arg：精氨酸
(13)Ser：絲氨酸
(14)Thr：蘇氨酸
(15)Asp：天門冬氨酸
(16)Glu：麩氨酸
(17)Asn：天門冬醯酸
(18)Gln：麩胺酸醯胺
(19)Cys：半胱氨酸
(20)Pro：脯氨酸
(21)Orn：鳥氨酸
(22)Sar：肌氨酸
(23)Cit：瓜氨酸
(24)N-Val(或Nva)：正纈氨酸(2-氨基戊酸)
(25)N-Leu(或Nle)：2-氨基己酸
(26)Abu：氨基丁酸
(27)Tau：牛磺酸
(28)Hyp：羥脯氨酸
(29)t-Leu：第三白胺酸
(30)Cle：環白氨酸
(31)Aib：α-氨基異丁酸(a-Aminoisobutyric acid,2-甲基丙胺酸)
(32)Pen：青黴胺(Penicillamine)
(33)allo-Thr：別蘇氨酸
(34)allo-Ile：別異白氨酸
氨基酸衍生物係上述氨基酸之各種衍生物，例如可舉出特殊氨基酸及非天然氨基酸、胺基醇、或末端羧基及胺基、半胱氨酸的硫基等胺基酸支鏈被各種取代基取代者。取代基可舉出烷基、醯基、氫氧基、胺基、烷胺基、硝基、磺酸基及各種保護基，例如可含有Arg(NO2)：N-γ-硝基精氨酸、Cys(SNO)：S-硝基半胱氨酸、Cys(S-Me)：S-甲基半胱氨酸、Cys(S-ally1)：S-醯基半胱氨酸、Val-NH2：纈氨酸醯胺、Val-ol：纈氨醇(2-胺基-3-甲基-1-丁醇)等。本說明書中γ-Glu-Cys(SNO)-Gly係具有下述構造式者，且前述之γ-Glu-Met(O)以及γ-Glu-Cys(S-Me)(O)式中之(O)係意指亞碸構造。γ-Glu之(γ)係意指介由麩氨酸γ位置之羧基與其他胺基酸結合。
一氧化氮麩氨基硫(S-Nitrosoglutathione(GNSO))
本發明之γ-Glu-Nva-Gly以及與其併用之胺基酸或胜肽，於販售時可使用市售品，或可適當地藉由其他(1)化學合成方法，或(2)藉由酵素反應合成方法等周知之方法取得，以化學合成較為簡便。本發明中使用之γ-Glu-Nva-Gly由於所含之胺基酸殘基數為3，屬於較短者，以化學合成方法較為簡便，有利於產業。另外，以化學方法合成本發明之γ-Glu-Nva-Gly以及與其併用之胺基酸或胜肽時，該寡胜肽可藉由胜肽合成機進行合成或半合成。化學合成方法可舉出例如胜肽固相合成法等。如此進行合成之胜肽可再藉由一般方法，例如離子交換層析儀、逆相高速液相層析儀、親和層析儀等進行純化。胜肽固相合成法以及接續之胜肽純化係於該分野中習知者。
以酵素反應生產本發明之γ-Glu-Nva-Gly以及與其併用之胺基酸或胜肽時，亦可使用例如國際公開小冊子WO2004/011653號記載之方法。亦即，將其中一方的胺基酸或雙胜肽的羧基端進行酯化或醯胺化後之胺基酸或雙胜肽，與胺基酸處於自由狀態之胺基酸(例如羧基被保護之胺基酸)，於胜肽生成酵素存在下進行反應，藉由生成之雙肽或三肽而可生產。胜肽生成酵素可舉出具有生成胜肽能力之微生物培養物、自該培養物分離之微生物菌體、或該微生物之菌體處理物、又或來自該微生物之胜肽生成酵素。另外本說明書之記載包含WO2004/011653號記載之事項。
進而，除上述之酵素性之方法及化學合成方法以外，本發明中所使用之胜肽，有時存在於蔬菜及水果等植物、酵母等微生物、其他天然物質中。存在於天然物質之情況時，可由該等物質萃取後使用。
本發明之可賦予濃厚味用劑或複合可賦予濃厚味用劑，可直接使用，或與於食品上許可之載體及其他調味原料混合，而作為調味料。其他調味料可舉出例如香料、糖類、甜味料、食物纖維、維他命類、麩氨醯酸鈉(MSG)等胺基酸類、次黃呤核酸-磷酸(IMP)等核酸類、氯化鈉等無機鹽類、檸檬酸等有機酸類，進而可舉出各種酵母萃取物。
含有本發明之可賦予濃厚味用劑或複合可賦予濃厚味用劑之食品組成物以低脂肪食品為佳，其係含有原有脂肪之食品，特別係其脂肪含量被降低之食品。此處之「脂肪」係與「油脂」同義，包含固體與液體二種，可為動物性脂肪及植物性脂肪之任一種。
該等低脂肪食品可舉出牛奶、優格、奶油、鮮奶油等乳製品、乳瑪琳、咖啡用奶精、醬汁、高湯塊等含動物油脂及/或植物油脂之食品、沙拉醬、美乃滋等乳化食品等、含有已調理完成之肉類之各種咖哩及白醬濃湯、含肉類萃取物之各種湯品等。另外，由已調理完成的低脂肪牛肉所構成之牛排及烤肉類等，以及不使用油炸處理之烤薯片等。該等物質中低脂肪食品以一般食品之脂肪含量之1/2～1/3為佳。
藉由使本發明之可賦予濃厚味用劑含有上述之低脂肪食品，食用該等食品時，不僅在入口的瞬間，在之後亦可感受到脂肪般的濃厚感及滑順。
有關牛奶及優格，相對於一般品之脂肪含量為3～4%，已知亦有零脂肪品(脂肪約0.1%)。本發明之可賦予濃厚味用劑或複合可賦予濃厚味用劑亦可適用於該等零脂肪品。
本發明之可賦予濃厚味用劑或複合可賦予濃厚味用劑，特別以添加於含有豬肉原料之食品為佳。亦即，本發明亦提供含γ-Glu-Nva-Gly與豬肉之食品組成物。並未特別限制含有豬肉原料之食品，可舉出例如豬肉萃取物、香腸、速食麵等。並未特別限制豬肉原料之含量，於本發明之食品組成物中可舉出例如為0.005～80重量%。
本發明之可賦予濃厚味用劑或複合可賦予濃厚味用劑，以添加於含有牛肉原料之食品為佳。亦即，本發明亦提供含γ-Glu-Nva-Gly與牛肉之食品組成物。並未特別限制含有牛肉原料之食品，可舉出例如牛肉萃取物、醃漬牛肉、使用牛肉之湯品、使用牛肉之醬汁等。並未特別限制牛肉原料之含量，例如於食品組成物中為0.005～80重量%。
本發明中使用之γ-Glu-Nva-Gly及與其併用之胺基酸或胜肽亦包含鹽的形態。本發明之γ-Glu-Nva-Gly及與其併用之胺基酸或胜肽可形成鹽的形態時，該鹽若為藥理學上許可且為可食性之鹽即可，例如可舉出相對於羧基等酸性基，銨鹽、與鈉、鉀等鹼金屬鹽、與鈣、鎂等鹼土金屬鹽、鋁鹽、鋅鹽、與三乙基胺、乙醇胺、嗎啉、吡咯啶、六氫吡啶、哌嗪、雙環己胺等有機胺之鹽、與精胺酸、離胺酸等鹽基性胺基酸之鹽。另外，相對於鹽基性基，可舉出與鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、溴化氫等之無機酸鹽、與醋酸、檸檬酸、安息香酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、琥珀酸、單寧酸、酪酸、hibenzate、pamoate、庚酸、癸酸、teoclate、水楊酸、乳酸、草酸、杏仁酸、蘋果酸等有機羧酸之鹽、甲基磺酸、苯基磺酸、對甲苯磺酸等有基磺酸之鹽。
本發明之可賦予濃厚味用劑、食品組成物、或複合可賦予濃厚味用劑，不限制於乾燥粉末、醬汁、溶液等物性可使用為任何型態。
本發明之可賦予濃厚味用劑、食品組成物、或複合可賦予濃厚味用劑可與食品、飲料、調味料等各種食品混合使用。
本發明之可賦予濃厚味用劑、食品組成物、或複合可賦予濃厚味用劑與食品、飲料、調味料等各種食品混合使用時，若為可達到期望效果，並未限制γ-Glu-Nva-Gly及與其併用之胺基酸或胜肽最終的量，γ-Glu-Nva-Gly及/或胺基酸或胜肽之量，以食品、飲料或調味料等全質量為基準時，分別以0.1 ppb～99.9重量%為佳，1 ppb～10質量%更佳，0.01 ppm～1質量%最佳。
與本發明之可賦予濃厚味用劑、食品組成物、或複合可賦予濃厚味用劑混合之食品、飲料、調味料等各種飲食品中，可進而與飲食品上許可之任一種固體或液體載體，適當的調味原料等混合。
上述載體可舉出例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、澱粉、甘露糖、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基澱粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、明膠、白蛋白、胺基酸、水、生理食鹽水等。
上述之調味原料，若為相關業者使用之任一種調味原料則無特別限制，具體可舉出為以上既述者。
並未特別限制上述之載體及其他的調味原料等任一種之含量。
上述調味原料中，並未限制酵母萃取物之來源菌體、培養條件、萃取處理方法之任一項，可使用隨意的酵母萃取物，進而亦可施以加熱處理、酵素處理、濃縮、粉末化處理等。
本發明之另一特徵係以使各種飲食品之製造中間品含有1質量ppb～99.9質量%而添加γ-Glu-Nva-Gly，並提供各種飲食品之製造方法。此處之各種飲食品以低脂肪食品為佳。
本發明之特徵係於各種飲食品之製造中間品中添加本發明之食品組成物，並提供各種飲食品之製造方法。此處之各種飲食品以低脂肪食品為佳。
針對使用本發明之可賦予濃厚味用劑之製造中間品的製造方法，包含將由γ-Glu-Nva-Gly構成之增強呈味劑，添加混合於飲食品原料(例如鮮味原料、蛋白水解物、畜肉萃取物)之步驟，以及因應需要進而調理所得之飲食品原料混合物之步驟，飲食品或飲食品之製造中間品之製造方法為佳。
此處將由γ-Glu-Nva-Gly構成之增強呈味劑，添加混合於飲食品原料之步驟，以包含使飲食品之製造中間品的γ-Glu-Nva-Gly濃度為0.01～999900重量ppm之步驟為佳，更佳係包含使濃度為0.1～200000重量ppm之步驟。
另外，將飲食品之製造中間品添加於其他的飲食品原料(例如農產物、水產物、畜肉、乳製品或該等之加工食品)時，以包含使所得飲食品之γ-Glu-Nva-Gly濃度為0.01～50重量ppm之步驟為佳，更佳係進而包含使濃度為0.05～20重量ppm之步驟。
將由γ-Glu-Nva-Gly構成之增強呈味劑，添加混合於飲食品原料之步驟，以包含使飲食品的γ-Glu-Nva-Gly濃度為0.01～50重量ppm之步驟為佳，更佳係包含使濃度為0.05～20重量ppm之步驟。
上述之製造方法中，飲食品以含有豬肉原料之食品為佳。此時，以含有0.01～50重量ppm之γ-Glu-Nva-Gly，及0.005～80重量%之豬肉原料，及其他食品原料為佳。
上述之製造方法中，飲食品以含有牛肉原料之食品為佳。此時，以含有0.01～50重量ppm之γ-Glu-Nva-Gly，及0.005～80重量%之牛肉原料，及其他食品原料為佳。
另外，本發明之對象食品除上述之食品外，可舉出冰淇淋、蜂蜜、橘子果醬及草莓果醬等以甜味為主的甜點、零食等食品(甜味系食品)，及雞湯等以鹹味為主之加工食品、熟食、零食等食品(鹹味系食品)亦屬於適合之食品。
以下舉實施例進而詳細說明本發明，但本發明並未限定於此。
[實施例]
(合成例1)合成γ-Glu-Nva-Gly(γ-L-麩氨醯基-L-正纈氨醯基-甘氨酸)
將Boc-Nva(t-Butoxycarbonyl-L-norvaline，4.44g，20.4 mmol)與Gly-OBzl‧HCl(Glycine benzyl ester hydrochloride，4.12g，20.4 mmol)溶解於二氯甲烷(CH2Cl2，100 ml)中。保持反應液於0℃，並加入三乙胺(Et3N，3.13 ml，1.1當量，22.4 mmol)、HOBt‧H2O(1-Hydroxybenzotriazole hydrate，3.44g，1.1當量，22.4 mmol)以及WSC‧HCl(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，4.30g，1.1當量，22.4 mmol)。反應液溫度緩緩上升，於室溫下攪拌一晚(16小時)。將反應液減壓濃縮，再於殘渣中加入醋酸乙酯(150 ml)，將有機層依序以水(50 ml)、5%檸檬酸水溶液(50 ml)洗淨2次，再以飽和食鹽水(50 ml)、5%碳酸氫鈉水溶液(50 ml)洗淨2次，及使用飽和食鹽水(50 ml)洗淨，並使用無水硫酸鎂進行乾燥。過濾去除硫酸鎂之後，將濾液減壓濃縮。由於殘渣中加入正己烷會產生結晶化，過濾結晶並收集，進行減壓乾燥後得Boc-Nva-Gly-OBzl(6.88g，18.9 mmol)之結晶。
於Boc-Nva-Gly-OBzl(6.88g，18.9 mmol)中加入4N的HCl/二噁烷溶液(94.5 ml)，於室溫下攪拌1小時。減壓濃縮後去除二噁烷，於殘渣中加入正己烷(30 ml)並重複3次減壓濃縮操作後以定量的回收率得H-Nva-Gly-OBzlHCl。
將H-Nva-Gly-OBzlHCl溶解於二氯甲烷(130 ml)，保持反應液於0℃。反應液中加入Z-Glu-OBzl(N-α-Carbobenzoxy-L-glutamic acid α-benzyl ester，7.03g，18.9 mmol)，三乙胺(2.90 ml，1.1當量，20.8 mmol)、HOBt‧H2O(3.20g，1.1當量，20.8 mmol)以及WSC‧HCl(3.98g，1.1當量，20.8 mmol)。反應液溫度緩緩上升，於室溫下攪拌一晚(16小時)。將反應混合物減壓濃縮，再於殘渣中加入醋酸乙酯(1000 ml)，將有機層依序以水(100 ml)、5%檸檬酸水溶液(100 ml)洗淨2次，再以飽和食鹽水(100 ml)、5%碳酸氫鈉水溶液(100 ml)洗淨2次，及使用飽和食鹽水(100 ml)洗淨，並使用無水硫酸鎂進行乾燥。使溶液加熱至50℃後過濾去除硫酸鎂之後，將濾液減壓濃縮。當開始出現結晶時加入正己烷使結晶充分析出。過濾結晶並收集，進行減壓乾燥後得Z-Glu(Nva-Gly-OBzl)-OBzl(10.16g，16.4 mmol)之結晶。
於乙醇(250 ml)與水(30 ml)之混合液中加入Z-Glu(Nva-Gly-OBzl)-OBzl(10.16g，16.4 mmol)及5%鈀碳(5% palladium/carbon，1.20 g)，於50℃下進行一晚(14小時)，氫氣氛圍下之接觸還原反應。反應過程中將水(100 ml)分多次少量加入。過濾去除鈀碳後，將濾液減壓濃縮。將殘渣以少量水與乙醇進行再結晶，得γ-Glu-Nva-Gly白色結晶(4.59g，15.1 mmol)其特性值如下所示。
ESI-MS：(M+H)+=304.1
1H-NNR(400 MHz，D2O) δ(ppm)：0.82(3H，t，J=7.4Hz)，1.23-1.37(2H，m)，1.55-1.75(2H，m)，2.01-2.09(2H，m)，2.38-2.48(2H，m)，3.72(1H，t，J=6.4Hz)，3.87(1H，dd，J=17.8和20.9Hz)，4.21(1H，dd，J=4.4和8.9Hz)。
(試驗例1)調製CaSR表現質體
CaSR表現質體之調製係如下述進行。
以登錄於NCBI之DNA序列(CaSR(鈣離子受器)：NM_000388，序列編號1、2)為基礎，以使用於PCR合成之寡DNA
(前置引子(序列編號3：ACTAATACGACTCACTATAGGGACCATGGCATTTTATAGCTGCTGCTGG)，以及反置引子(序列編號4：TTATGAATTCACTACGTTTTCTGTAACAG)進行合成。
以來自人類腎臟之cDNA(Clontech公司製)作為材料，使用上述引子及Pfu Ultra DNA Polymerase(Stratagene)，以下述條件實施PCR。94℃3分鐘後、94℃30秒、55℃30秒、72℃2分鐘重複35個循環後，於72℃下反應7分鐘。進行瓊膠電泳及以DNA染色試藥染色後，藉由紫外線照射可檢出PCR的增幅是否成功。另外，藉由與同時進行電泳的已知大小的DNA標記相比較，可確認PCR產物鏈長。
以限制酵素EcoRV(Takara公司製)切斷質體載體pBR322，再使用Ligation kit(Promega公司製)連結藉由PCR增幅該切斷部位之基因片段。以該反應溶液對escherichia coli DH5α株進行轉型(transformation)，再選拔出保持有已選殖PCR增幅產物之質體之轉型體，進而藉由分析DNA鹽基序列以確認PCR增幅產物。
使用該基因轉殖之質體製作人類CaSR表現質體hCaSR/pcDNA3.1。
(試驗例2)評價CaSR促效劑活性
將293E細胞(表現EBNA1之HEK293細胞，ATCC No.CRL-10852)，於200μg/ml之G418(建那黴素(geneticin))存在下，培養於含10%牛胎兒血清之DMEM/Ham's-F12(含3.15/ml Glucose之Dulbecco's Modified Eagle Medium，NACALAI)。以3×106 cells/10 ml播於F25燒瓶中，再靜置於CO2培育箱內(5% CO2，37℃)24小時後，以轉染(Transfection)試藥Fugene6(Roche)，對人類CaSR表現質體hCaSR/pcDNA3.1進行轉染。靜置於CO2培育箱內6～7小時後，將細胞以含10%牛胎兒血清之DMEM/Ham's-F12進行回收，再以70,000 cells/well播於poly-D-lysine coat 96well plate(BD-Biocoat)。
靜置於CO2培育箱內24小時後，自播有該細胞之96 well plate去除培養液，添加200μl/well之溶解於Assay Buffer(146mM NaCl，5mM KCl，1mM MgSO4，1mg/ml Glucose，20mM HEPES(pH7.2)，0.75～1.25 mM CaCl2)之Ca2+螢光指示藥劑Calcium 4 Assay Kit(Molecular Devices)，於37℃下靜置1小時，再於室溫下靜置10分鐘使指示藥劑吸收。
於該96 well plate添加50μl/well之溶解於含0.1%BSA之Assay Buffer的受檢化合物，再使用FLEX Station(Molecular Devices)測定3分鐘螢光強度變化。
(EC50計算法)
根據FLEX Station的自動計算，求得添加化合物前後之螢光強度的最大值與最小值之差(RFU(Max-Min))。以添加最大濃度之化合物時之RFU(Max-Min)為100%，並計算出將使用不含受檢化合物之含0.1% BSA之Assay Buffer時之RFU(Max-Min)定義為0%時之活性率，再以計算軟體Xfit或GraphPad Prism進行曲線配適(curve fitting)，求得活性率50%時化合物濃度作為EC50。結果如表1所示。另外作為比較例之進行相同測定之三胜肽的數據示於表2、表3。表3記載之數據係揭示於非專利文件3。
自該結果可知，γ-Glu-Nva-Gly發現了未預期之具有與其他具γ-Glu-X-Gly構造之胜肽，相同程度高之CaSR活性。
實施例1　可賦予濃厚味活性之評價
針對γ-Glu-Nva-Gly，藉由定量的官能評價試驗調查可賦予濃厚味活性之強度。
定量的官能評價試驗係以下述方式實施。於含有麩氨醯酸鈉(0.05 g/dl)、次黃呤核酸-磷酸(0.05 g/dl)、氯化鈉(0.5 g/dl)之蒸餾水中，混合作為試料之化合物類0.000001～0.1 g/dl，並測定可賦予濃厚味活性之強度。針對試料溶解後未添加對照組之呈酸性之檢體，以NaOH對未添加對照組者以符合pH±0.2之幅度後使用。官能評點為對照組：0點，強：3點，非常強：5點，同時為使尺度更為明確，將γ-Glu-Cys-Gly之前中味、後味各定為3.0點。評點係使用直線尺度法，亦即使用相對於表示-5～0～5點位置之直線上，記入該當評點位置之方法。另外，啟用已累積食品調味開發1年以上經驗，且可判定經於鮮味鹽味溶液中添加γ-Glu-Cys-Gly與γ-Glu-Val-Gly之力價之差為10倍前後者(定期性地確認)為測試者。評價以n=4實施。另外「前中味」係含於口中後，0～5秒之呈味，後味則為其之後之呈味。受檢化合物係於上述添加濃度時可顯示廣泛的可賦予濃厚味活性，代表性的濃度之結果示於表4。
該結果針對γ-Glu-Nva-Gly以外之三胜肽，均為最大之穀胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)之約10倍左右的活性，令人驚訝的是γ-Glu-Nva-Gly進而顯示具有更高之100倍強之高活性。
γ-Glu-Nva-Gly與γ-Glu-Cys-Gly比較約100倍，與γ-Glu-Val-Gly等比較，可賦予濃厚味活性至少高10倍左右。進而不如γ-Glu-Ala-Gly、γ-Glu-Abu-Gly、γ-Glu-tLeu-Gly有異味(後味的澀味等)，可得知γ-Glu-Nva-Gly為優異。
實施例2　可賦予濃厚味活性之評價
針對γ-Glu-Nva-Gly，為確認其為中後味型，以其他評價項目藉由定量的官能評價試驗調查可賦予濃厚味活性之強度。
定量的官能評價試驗係以下述方式實施。為容易分辨中後味，有關評價溶液，不使用次黃呤核酸-磷酸，以減低中後的鮮味。亦即測定於含有麩氨醯酸鈉(0.1 g/dl)、氯化鈉(0.4 g/dl)之蒸餾水中混合有作為試料之化合物類0.000001～0.1 g/dl時之可賦予濃厚味活性之強度。針對試料溶解後未添加對照組之呈酸性之檢體，以NaOH對未添加對照組者以符合pH±0.2之幅度後使用。官能評點為對照組：0點，強：3點，非常強：5點，同時為使尺度更為明確，將γ-Glu-Cys-Gly之前味、中後味各定為3.0點。評點係使用直線尺度法，亦即使用相對於表示-5～0～5點位置之直線上，記入該當評點位置之方法。另外，啟用已累積食品調味開發1年以上經驗，且可判定經於鮮味鹽味溶液中添加γ-Glu-Cys-Gly與γ-Glu-Val-Gly之力價之差為10倍前後者(定期性地確認)為測試者。評價以n=4實施。另外「前味」係含於口中後，0～2秒之呈味，中後味則為其之後之呈味。受檢化合物係於上述添加濃度時可顯示廣泛的可賦予濃厚味活性，代表性的濃度之結果示於表5。
該結果亦發現γ-Glu-Val-Gly具有穀胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)之約10倍左右的活性，γ-Glu-Nva-Gly則顯示具有更高之100倍強之高活性。
γ-Glu-Nva-Gly具優異之可賦予濃厚味活性，其呈味形式係具有中後味特質，可得知其無異味(澀味等)且為優異之可賦予濃厚味活性物質。另外，γ-Glu-Nva-Gly與γ-Glu-Cys-Gly相比為約100倍，由於與γ-Glu-Val-Gly相比為可賦予濃厚味活性至少高10倍，可以極低濃度使用。因此可提供更簡便且低成本之可賦予濃厚味用劑，非常有利於產業上之應用。
實施例3　食品中可賦予濃厚味活性之評價
對於實際將γ-Glu-Nva-Gly使用於食品之情況，藉由高力價之γ-Glu-Val-Gly，藉由官能評價試驗調查是否具極高的效果。
官能評價試驗係以下述方式實施。考慮中後味強之食品，以甜味為主的甜點、零食等食品(甜味系食品)的代表係使用市售之冰淇淋、蜂蜜、橘子果醬及草莓果醬。以鹹味為主之加工食品、熟食、零食等食品(鹹味系食品)的代表係使用雞湯、於馬鈴薯泥中加入0.1重量%市售粉末胡椒的馬鈴薯糊、於馬鈴薯泥中加入市售的薑泥及2重量%奶油之馬鈴薯糊。針對比較用之γ-Glu-Val-Gly的混合量，使用效果明顯的0.002重量%。針對γ-Glu-Nva-Gly以0.0000001～0.01重量%混合時，測定整體呈味的增強(可賦予濃厚味活性之強度)。對照組係未添加之食品。有關官能評點為使不產生小數點差，以對照組：±，稍強：+，強：++，非常強：+++。以+為1，++為2，+++為3，平均數值若為2.2則2=++，四捨五入。另外，啟用已累積食品調味開發1年以上經驗，且可判定經於鮮味鹽味溶液中添加γ-Glu-Cys-Gly與γ-Glu-Val-Gly之力價之差為10倍前後者(定期性地確認)為測試者。評價以n=4實施。針對γ-Glu-Val-Gly，係於上述添加濃度時可顯示廣泛的可賦予濃厚味活性，可明確比較之濃度之結果示於表7及表8。
自該結果可知，相對於為穀胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)之約10倍左右的可賦予濃厚味活性之γ-Glu-Val-Gly，γ-Glu-Nva-Gly顯示進而具有5～13倍之顯著的高活性。
針對γ-Glu-Nva-Gly，實際上自鹹味系食品至甜味性食品之具中後味為特徵之所有食品，可得知整體的呈味提昇且具有發展潛力之可賦予濃厚味活性。進而γ-Glu-Nva-Gly於實際的食品中，與γ-Glu-Val-Gly相比，顯示具有5～13倍強的顯著的可賦予濃厚味活性。因此於欲進行改善時，為維護品質安定性，無法混合更多原料時，可藉由使用γ-Glu-Nva-Gly，以極微量即可改善品質。另外，亦可以低成本提供可賦予濃厚味用劑。
實施例4　γ-Glu-Nva-Gly賦予豬肉萃取物之效果
針對γ-Glu-Nva-Gly，已知可賦予濃厚味活性較γ-Glu-Cys-Gly(穀胱甘肽)及γ-Glu-Val-Gly於飲食後，在較早時間即增強。因此相對於並不完全屬於中味型而是稍早即呈味強之豬肉萃取物，藉由官能試驗調查γ-Glu-Nva-Gly具有較γ-Glu-Cys-Gly(穀胱甘肽)及γ-Glu-Val-Gly更顯著之效果。
官能試驗係如下述實施。取市售豬肉萃取物(固形份55.1重量%，鹽份9.3重量%)使其以5.0重量%之比例溶解於熱水中，調製為豬肉萃取物溶液。於該豬肉萃取物溶液中混合γ-Glu-Nva-Gly，γ-Glu-Cys-Gly或γ-Glu-Val-Gly。測定係使用2點識別試驗法，比較評價(1)0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly與同樣可賦予濃厚味活性之0.02重量%之γ-Glu-Cys-Gly，(2)0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly與同等量之0.0003重量%之γ-Glu-Val-Gly，(3)0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly與同等之可賦予濃厚味活性之0.002重量%之γ-Glu-Val-Gly，以“不改變豬肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”之方式判斷。實施評價N=9。評價0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly為“不改變豬肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”之測試者示於表9。
自該結果可顯示即使如同(1)與(3)具有同樣的賦予濃厚味力價，以γ-Glu-Nva-Gly明顯具有“不改變豬肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”。
針對γ-Glu-Nva-Gly，可得知其較具同等可賦予濃厚味活性之濃度之γ-Glu-Cys-Gly及γ-Glu-Val-Gly，具有“不改變豬肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”之極特異之效果。豬肉原料係廣泛地使用於世界上的調味料、湯品、畜肉萃取物、調理加工品、零食、薯片等。因此γ-Glu-Nva-Gly可以更低成本且微量的改善食品，亦非常有利於產業上之應用。
實施例5　γ-Glu-Nva-Gly賦予牛肉萃取物之效果
針對γ-Glu-Nva-Gly，已知可賦予濃厚味活性較γ-Glu-Cys-Gly(穀胱甘肽)及γ-Glu-Val-Gly於飲食後，在較早時間即增強。因此相對於並不完全屬於中味型而是稍早即呈味強之牛肉萃取物，藉由官能試驗調查γ-Glu-Nva-Gly具有較γ-Glu-Cys-Gly(穀胱甘肽)及γ-Glu-Val-Gly更顯著之效果。
官能試驗係如下述實施。取市售牛肉萃取物(固形份61.2重量%，鹽份12.2重量%)使其以3.0重量%之比例溶解於熱水中，調製為牛肉萃取物溶液。於該牛肉萃取物溶液中混合γ-Glu-Nva-Gly，γ-Glu-Cys-Gly或γ-Glu-Val-Gly。測定係使用2點識別試驗法，比較評價(1)0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly與同樣可賦予濃厚味活性之0.02重量%之γ-Glu-Cys-Gly，(2)0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly與同等量之0.0003重量%之γ-Glu-Val-Gly，(3)0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly與同等之可賦予濃厚味活性之0.002重量%之γ-Glu-Val-Gly，以“不改變牛肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”之方式判斷。實施評價N=9。評價0.0003重量%之γ-Glu-Nva-Gly為“不改變牛肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”之測試者示於表10。
自該結果可顯示即使如同(1)與(3)具有同樣的賦予濃厚味力價，以γ-Glu-Nva-Gly明顯具有“不改變豬肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”。
針對γ-Glu-Nva-Gly，可得知其較具同等可賦予濃厚味活性之濃度之γ-Glu-Cys-Gly及γ-Glu-Val-Gly，具有“不改變牛肉萃取物呈味及風味的平衡且加強者為佳”之極特異之效果。牛肉原料係廣泛地使用於世界上的調味料、湯品、畜肉萃取物、調理加工品、零食、薯片等。因此γ-Glu-Nva-Gly可以更低成本且微量的改善食品，亦非常有利於產業上之應用。
[圖1]圖1係表示中後味型的可賦予濃厚味用劑之味覺輪廓。
<110>　Ajinomoto Co.,Inc.
<120>　Kokumi imparting agent
<130>　Y1R-0608
<160>　4
<170>　PatentIn version 3.1
<210>　1
<211>　4924
<212>　DNA
<213>　Homo sapiens
<220>
<221>　CDS
<222>　(373)..(3609)
<223>
<400>　1
<210>　2
<211>　1078
<212>　PRT
<213>　Homo sapiens
<400>　2
<210>　3
<211>　49
<212>　DNA
<213>　Artificial
<220>
<223>　primer
<400>　3
<210>　4
<211>　29
<212>　DNA
<213>　Artificial
<220>
<223>　primer
<400>　4

Claims (14)

  1. 一種可賦予濃厚味用劑，其係由濃度1ppb~10質量%之γ-Glu-Nva-Gly構成。
  2. 一種複合可賦予濃厚味用劑，其係併用(a)γ-Glu-Nva-Gly與選自(b)γ-Glu-X-Gly(X係表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-Glu-Val-Y(Y係表示氨基酸或氨基酸衍生物)、γ-Glu-Nva、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu及γ-Glu-Cys(S-Me)所成群之1種或2種以上的氨基酸或胜肽而構成。
  3. 一種食品組成物，其係含0.1ppb~99.9重量%之γ-Glu-Nva-Gly。
  4. 如申請專利範圍第3項之食品組成物，其係含有0.01~50重量ppm之γ-Glu-Nva-Gly、0.005~80重量%之豬肉原料與其它的食品原料。
  5. 如申請專利範圍第3項之食品組成物，其係含有0.01~50重量ppm之γ-Glu-Nva-Gly、0.005~80重量%之牛肉原料與其它的食品原料。
  6. 一種飲食品或飲食品之製造中間品的製造方法， 其係包含於飲食品原料中添加混合由γ-Glu-Nva-Gly構成的增強呈味劑之步驟，以及因應需要進而調理所得之飲食品原料混合物之步驟。
  7. 如申請專利範圍第6項之飲食品或飲食品原料之製造中間品的製造方法，其中於飲食品原料中添加混合由γ-Glu-Nva-Gly構成的增強呈味劑之步驟，係包含使飲食品之製造中間品的γ-Glu-Nva-Gly濃度為0.01~999,900重量ppm之步驟。
  8. 如申請專利範圍第7項之飲食品的製造方法，其係進而包含將飲食品之製造中間品添加至其它的飲食品原料後，使所得之飲食品的γ-Glu-Nva-Gly濃度為0.01~50重量ppm之步驟。
  9. 如申請專利範圍第7項之飲食品的製造方法，其中於飲食品原料中添加混合由γ-Glu-Nva-Gly構成的增強呈味劑之步驟，係包含使飲食品的γ-Glu-Nva-Gly濃度為0.01~50重量ppm之步驟。
  10. 如申請專利範圍第6~9項中任一項之飲食品的製造方法，其中，該飲食品係含有豬肉原料之食品。
  11. 如申請專利範圍第6~9項中任一項之飲食品的製造方法，其中，該飲食品係含有牛肉原料之食品。
  12. 一種飲食品或飲食品之製造中間品，其係根據如申請專利範圍第6~11項中任一項之方法而得。
  13. 一種飲食品的增強呈味方法，其係具有於飲食品中添加含有γ-Glu-Nva-Gly之組成物之步驟。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中增強呈味係可賦予濃厚味。
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