JPWO2008062569A1 - 耐熱性ｌ−リボースイソメラーゼとその製造方法並びに用途 - Google Patents

Abstract

課題：耐熱性Ｌ-リボースイソメーゼの提供。解決手段：分子量３２，０００（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）、至適温度４５℃、至適ｐＨ ９．０（グリシン-ＮａＯＨ緩衝液）、温度安定性ｐＨ９．０における１０分間の熱処理において４５℃まで安定の理化学的性質を有する、Ｌ-リボ-スを異性化してＬ-リブロ-スを生成し、また、逆に、Ｌ-リブロ-スを異性化してＬ-リボ-スを生成する作用を有する耐熱性Ｌ-リボ-スイソメラ-ゼ。（１）RaoultellaornithinolyticaMB426（NITE BP-277）由来の酵素である。Ｌ-リボ-ス、Ｄ-リキソ-ス、Ｄ-タロ-ス、Ｄ-マンノ-ス、Ｌ-アロ-スおよびＬ-グロ-スから選ばれるアルド-スに、上記の耐熱性酵素を作用させて該アルド-スを異性化し、それぞれ対応するＬ-リブロ-ス、Ｄ-キシルロ-ス、Ｄ-タガト-ス、Ｄ-フラクト-ス、Ｌ-プシコ-スおよびＬ-ソルボ-スから選ばれるケト-スを生成させるか、または、Ｌ-リブロ-ス、Ｄ-キシルロ-ス、Ｄ-タガト-ス、Ｄ-フラクト-ス、Ｌ-プシコ-スおよびＬ-ソルボ-スから選ばれるケト-スに、該Ｌ-リボ-スイソメラ-ゼを作用させて該ケト-スを異性化し、それぞれ対応するＬ-リボ-ス、Ｄ-リキソ-ス、Ｄ-タロ-ス、Ｄ-マンノ-ス、Ｌ-アロ-スおよびＬ-グロ-スから選ばれるアルド-スを生成させることを特徴とするアルド-スとケト-スとの変換方法。

Description

本発明は、耐熱性Ｌ−リボースイソメーゼとその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、Ｌ−リボースをＬ−リブロースに異性化し、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに異性化する耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼとその製造方法、それを産生する微生物、並びに該酵素を用いるケトースおよびアルドースの製造方法に関する。

近年、生化学工業が発達し、糖質化学の分野において希少糖の生物活性への関心が高まっており、（非特許文献１）、従来、殆ど必要としなかった各種希少糖質の需要が起こりつつあり、これらの糖質の安定な製造方法の確立が望まれている。これらの糖質の製造方法は、有機化学的手法によっても行うことができるが、一般的には、その製造条件が苛酷で、目的糖質の収率が低く、工業的生産方法としては不適である。一方、生化学的手段としては、酵素による糖質変換方法が想定され、Ｌ−リボースの工業的製造に関しては、特許文献１に示すとおり、本発明者らの成果によって、ひとつの道が拓かれたといえる。本発明者らはＬ−リボースイソメラーゼの製造と利用に関してさらに研究を進め、特許文献１に開示されたＬ−リボースイソメラーゼの部分アミノ酸配列に基づいて、該酵素の産生能を有する微生物の染色体ＤＮＡを広く検索し、その結果、アシネトバクター（Acinetobacter）属に属する微生物から上記部分アミノ酸配列を含む一連のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのクローン化に成功した（特許文献２）。そして、クローン化されたＤＮＡを用いて、組換え型ポリペプチドの製造を試みたところ、Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが効率的に製造できることが確認された。
特開平１０−１５５４８０号公報 特開２００２−２５３２５４号公報 Rare Sugar Congress in Kagawa : 2005. Proc 2nd Symp Int Soc Rare Sugars, Takamatsu, Japan.

Ｌ−リボースに対する近年の需要の高まりを鑑みると、Ｌ−リボースを生成する酵素の製造の確立や斯かる酵素の性質において、なお改善すべき必要がある。また、工業的に糖質を製造する上で、できるだけ少ない種類の酵素の利用により、できるだけ多種類の糖質を製造する方法の確立が強く望まれる。本発明は、工業的にＬ−リボースやＤ−タロース等の希少糖質を製造する方法においてより有用な性質を有し、かつ、多種類の糖質を製造することができる酵素を産生する微生物の探索を目的とする。さらに、該微生物からＬ−リボースをＬ−リブロースに異性化し、Ｌ−リブロースをＬ−リボースに異性化する有用な性質を有し、かつ、多種類のケトースまたはアルドースを基質とする酵素、並びに該酵素を用いるケトースおよびアルドースの製造方法の提供を目的とする。

本発明は、下記（１）〜（４）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを要旨とする。
（１）下記の理化学的性質を有する、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有する耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。
１）分子量３２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
２）至適温度 ４５℃
３）至適ｐＨ ９．０（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）
４）温度安定性 ｐＨ９．０における１０分間の熱処理において４５℃まで安定
（２）Ｌ−リボースイソメラーゼが、Raoultella属に属する微生物由来の酵素である（１）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。
（３）Raoultella ornithinolyticaに属する微生物由来の酵素である（２）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。
（４）Raoultella属菌体MB426（NITE BP-277）由来の酵素である（２）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。

本発明は、下記の（５）〜（８）の耐熱性L-リボースイソメラーゼの製造方法を要旨とする。
（５）Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養物から下記の理化学的性質を有する、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有する耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性L-リボースイソメラーゼの製造方法。
１）分子量３２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
２）至適温度 ４５℃
３）至適ｐＨ ９．０（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）
４）温度安定性 ｐＨ９．０における１０分間の熱処理において４５℃まで安定
（６）微生物がRaoultella属に属する微生物である（５）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの製造方法。
（７）微生物がRaoultella ornithinolyticaに属する微生物である（６）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの製造方法。
（８）微生物がRaoultella属菌体MB426（NITE BP-277）由来の酵素である（６）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの製造方法。

本発明は、下記（９）または（１０）のRaoultella属に属する微生物を要旨とする。
（９）下記の理化学的性質を有する、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有する耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有するRaoultella属に属する微生物。
１）分子量３２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
２）至適温度 ４５℃
３）至適ｐＨ ９．０（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）
４）温度安定性 ｐＨ９．０における１０分間の熱処理において４５℃まで安定
（１０）Raoultellaに属する微生物が、Raoultella ornithinolytica MB426（NITE BP-277）またはその変異株である（９）の微生物。

本発明は、下記（１１）または（１２）のケトースの製造方法を要旨とする。
（１１）Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースに、（１）、（２）、（３）または（４）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて生成した、それぞれ対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
（１２）耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である（１１）のケトースの製造方法。

本発明は、下記（１３）または（１４）のアルドースの製造方法を要旨とする。
（１３）Ｌ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースに、（１）、（２）、（３）または（４）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて生成した、それぞれ対応するＬ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースを採取することを特徴とするアルドースの製造方法。
（１４）耐熱性 Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である（１３）のアルドースの製造方法。

本発明は、下記（１５）または（１６）のアルドースとケトースとの変換方法を要旨とする。
（１５）Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースに、（１）、（２）、（３）または（４）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて該アルドースを異性化し、それぞれ対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースを生成させるか、または、Ｌ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースに、該Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて該ケトースを異性化し、それぞれ対応するＬ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースを生成させることを特徴とするアルドースとケトースとの変換方法。
（１６）耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である（１５）のアルドースとケトースとの変換方法。

本発明は、下記（１７）〜（２１）のＬ−リボースの製造方法を要旨とする。
（１７）Ｌ−リブロースに（１）、（２）、（３）または（４）の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させる工程と、生成したＬ−リボースを採取する工程とを含んでなるＬ−リボースの製造方法。
（１８）Ｌ−リブロースが、リビトールをグルコバクター属またはアセトバクター属に属する微生物によって酸化反応させて得られたものである（１７）のＬ−リボースの製造方法。
（１９）耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である（１７）または（１８）のＬ−リボースの製造方法。
（２０）生成したＬ−リボースを、濾過、遠心分離、脱色、脱塩、濃縮、乾燥、カラムクロマトグラフィー、結晶化および／または分蜜を含む工程により採取する（１７）、（１８）または（１９）のＬ−リボースの製造方法。
（２１）カラムクロマトグラフィーに、イオン交換樹脂を用いる（２０）のＬ−リボースの製造方法。

既に得られているL-リボースイソメラーゼは熱安定性が低く、異性化反応時に失活するため菌体をトルエン処理した後、直ぐに使用するという方法が用いられている。この方法であると、毎回培養した菌体が一回のみの使用となり大量のL-リボースの生産には適さない。そのため安定性が高い酵素が必要であり、耐熱性の酵素を用いたバイオリアクターを構築する方法が期待されるものである。

耐熱性を有するL-リボースイソメラーゼを有する微生物を検索するためには、L−リボースを炭素源とする無機塩培地に様々な土壌を添加し、比較的高い温度で培養し微生物を分離することで、これまでの酵素よりも熱安定性において優れたものを取得できると期待できる。しかし、これまでL-リボースイソメラーゼを生産する微生物の分離は困難であった。その理由はL-リボースが高価であり、多くの分離源から、多数の微生物を分離するに足る十分量のL-リボースを用意できなかったことに大きく起因する。
本発明者らは特許文献1の既に分離しているL-リボースイソメラーゼを用いて、十分量のL-リボースを得ることが可能となったことにより、本発明のために用いるL-リボースを用意できたことによって目的とする微生物を得ることが可能となった。

また、L-リボースイソメラーゼの生産菌株を分離する方法として、L-リボースを炭素源として用い、培養後の培養液中のL―リブロースの生産をシステイン・カルバゾール法により高感度で測定し、これを指標として多数の微生物分離起源からの検索を行うのが有効な方法であった。

本発明の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼは、多種の糖質変換に有利に利用され、しかも、必ずしも高度に精製して作用させる必要もなく、希少糖質の工業生産に有利に利用することができる。本発明によって、従来極めて入手困難であった多種類の希少糖質を効率的に容易に提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学工業など多方面に及ぶことが期待され、その工業的意義は極めて大きい。

Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの活性に及ぼすｐＨの影響示す図面である。 なお、表中、Acetateは５０ｍM酢酸緩衝液（ｐH２〜６）を、Na-Pは５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐH６〜８）を、Tris-HClは５０ｍMトリス-塩酸緩衝液（ｐH８〜９）を、Gly-NaOHは５０ｍMグリシン-水酸化ナトリウム（ｐH９〜１１）を表す。 ｐＨ９．０のGly-NaOHを使用する条件が本酵素の至適な条件（至適ｐＨ）である。同じｐＨのトリス-塩酸緩衝液では極端に活性が低いが、これは一般的にトリスがイソメラーゼの活性を非拮抗阻害するためである。 Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す図である。 ４５℃を使用する条件が本酵素の至適な条件（至適温度）である。 Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ（MB426と記載）の温度安定性をアシネトバクター・カルコアセティカス由来のＬ−リボースイソメラーゼ（DL-28と記載）の温度安定性と比較して示す図面である。 本発明のＬ−リボースイソメラーゼの温度安定性が、アシネトバクター・カルコアセティカス由来のものと比べ、優れていることを示している。 Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼにより基質L-リボースを反応させ、L-リブロースが生じていることを示す図面である。 Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼにより基質D-フラクトースを反応させ、D-マンノースが生じていることを示す図面である。 Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼにより基質D-タガトースを反応させ、D-タロースが生じていることを示す図面である。 Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼにより基質L-プシコースを反応させ、L-アロースが生じていることを示す図面である。

本発明者らは上記課題を解決するために、できるだけ多種類の糖質に作用する酵素、とりわけ、L-リボースイソメラーゼに着目して、その酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、香川県木田郡三木町の河川敷土壌から分離したMB426株はRaoultella属に属する新規な微生物で、多種類の糖質に作用する新規L-リボースイソメラーゼを産生すること、その産生量の多いこと、更には、至適温度、温度安定性が比較的高く、しかも至適ｐＨにおける安定性が高く、本酵素を工業的に利用する上で極めて有利であることを見出し、基質であるケトースまたはアルドースを含有する溶液に作用させることにより、多種類の希少糖質が容易に製造しうることなどを見出し、本発明を完成した。

本発明者が単離したMB426株は、Raoultella属に属する新規微生物である。
本発明の新規微生物であるRaoultella ornithinolyticaに属する菌株「Raoultella ornithinolytica MB426」は、日本国独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に２００６年１１月１３日に国内寄託している（NITE AP-277）。このたび国際出願をするに際し、原寄託（NITE AP-277）を上記の原寄託をした国際寄託当局に移管請求をし、２００７年３月２２日に該国際寄託当局より原寄託についての受託証（NITE BP-277）が発行された。

MB426株の単離のために、０．５%(w／w)の L-リボースを単一炭素源として含む無機塩液体培地を用い３７℃で微生物分離を行った。この条件で生育し、L- リボースイソメラーゼを生産する菌株を分離することができた。微生物の単離や保存に用いる寒天培地もL-リボースを単一炭素源とする無機塩培地を用いた。
分離した菌株について種々その酵素生産能力や、酵素生産条件を検討した。その結果、安価な炭素源で安定してL-リボース・イソメラーゼを大量に産出できることを見出した。すなわち、２％TSB（トリプティック ソイ ブロース）にD-リキソースを少量（０．１％〜３％、望ましい濃度は０．１〜０．５％）添加した液体培地もしくは、D-リキソースを添加しないTSB培地においても酵素を大量に生産することを見出した。

本菌株から抽出された１６ＳｒＲＮＡ領域のDNAを配列決定し、他の微生物から得た既知の複数の１６ＳｒＲＮＡと比較した。このデータはRaoultella ornithinolyticaからの配列に対し９７％の同一性を示した。このエビデンスならびに表２に記載のその他の生理学的特徴に基づき、本菌株がRaoultella ornithinolyticaに該当するものであるとの結論を得た。なおＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、公知の方法、例えば、サンガー法(Molecular Cloning、第２巻、１３．３頁、１９８９年）、ＰＣＲをベースにした方法等によって行うことができる。通常は、Beckman Coulter社のGenomeLab DTCS Quick Start Kit（蛍光ダイデオキシタミネーターを含有するシークエンシングキット）等を使って反応を行い、Beckman Coulter社の自動シークエンサー（CEQ 8000等）で塩基配列を決定する。

以下、本発明のRaoultella属に属する微生物MB426株の同定試験結果を表１に示す。

［表１］
Raoultella ornithinolytica MB426株
グラム染色 陰性
運動性 なし
生育温度 ３７度（４〜４０まで生育可能、３７度が望ましい）
酸素要求性 好気性
形状 長桿菌
生育状態コロニー 淡黄色の半透明状のコロニーを形成

培地
（培養のｐＨは例えば５〜９であり、好ましくは６〜８．５である。培養は振とうあるいは通気撹拌などの好気条件下で行う。）
１．TSB（トリプティック ソイ ブロース）培地 １〜２％
ＴＳＢ：Becton, Dickinson 社製
２．肉エキス培地
（肉エキス（和光純薬工業(株)製）0.5％、ポリペプトン（和光純薬工業(株)製）0.5％、塩化ナトリウム（和光純薬工業(株)製）0.5％、ｐＨ7.0）
３．酵母エキス培地
（酵母エキス（和光純薬工業(株)製）0.5％、ポリペプトン0.5％（和光純薬工業(株)製）、塩化ナトリウム0.5％、ｐＨ7.0）
４．無機塩培地組成
硫酸アンモニウム ０．２６％、KH₂PO₄ ０．２４％、K₂HPO₄ ０．５６％、硫酸マグネシウム ０．０１％、酵母エキス ０．０５％
なお、寒天培地の場合は上記培地に寒天を終濃度2％添加する。

〈Ａ 細胞形態〉（TSB寒天培地 ３７℃） 通常直径０．３ないし１．０μｍ、長さ０．６ないし６．０μｍの長桿菌。単独。運動性なし。無胞子。グラム陰性。

〈Ｂ 培養的性質〉（肉汁寒天平板培養３７℃） 形状： 円形。大きさは２日間培養で０．１ないし５ｍｍ。周縁：全縁。 隆起 ：半レンズ状。 光沢：鈍光。 表面：平滑。 色調： 不透明淡い黄色。

本発明では、上記菌株のみならず、Raoultellaに属し、Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有する他の菌株やこれらの変異株なども適宜使用することができる。

本発明の微生物の培養に用いる培地は微生物が生育でき、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを産生するものであればよく、合成培地および天然培地のいずれでもよい。炭素源としては、例えば、アルドース、ケトース、などから選ばれる１種または２種以上が適宜選ばれる。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、および、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分としては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩などが適宜用いられる。培養条件は、微生物が生育し、本発明の酵素を産生する温度が適しており、通常、約４〜４０℃、望ましくは、約２０〜３７℃、ｐＨは約５〜９、望ましくは、約６〜８．５から選ばれる条件で好気的に行われる。

このようにして、微生物を培養した後、得られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性は、主に菌体に認められ、菌体自身を酵素剤として利用してもよく、また、培養物全体を酵素剤として用いることもできる。菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体から抽出し、粗酵素として用いることもできる。粗酵素は、そのまま用いることもできるが、常法に従って、更に精製することもできる。例えば、菌体磨砕抽出液をポリエチレングリコール分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどを組み合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることができる。

本発明のＬ−リボースイソメラーゼの活性は次のようにして測定する。０．０５Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．０５ｍｌ、０．０５Ｍ Ｌ−リボース０．０５ｍｌ、および酵素液を加えて全容を０．５ｍｌとし、４５℃で酵素反応を行い、生成するＬ−リブロースをシステイン・カルバゾール法により測定する。酵素活性１単位は、１分間に１μｍｏｌのＬ−リブロースを生成するに要する酵素量とする。

本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、基質として、L-リボース、L-リブロース、L-アロース、L-プシコース、D-タガトース、D-タロース、D-マンノース、D-フラクトース、D-リキソース、D-キシルロースなど、第２位の炭素に結合するアルコール基（ＨO−Ｃ−Ｈ）がL−グリセロ配位を有する多種のケト基（Ｃ＝Ｏ）を有している多種のケトースとアルドースとの間の変換反応に利用できる。従って、１種の酵素で多種の糖質を産生できることとなり、工業的に極めて有利である。

本発明の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼは、必ずしも高度に精製して用いる必要はなく、例えば、本耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを有する微生物をトルエン処理したものをそのまま用いることは、工業的に糖質変換反応する上で好都合である。また、本発明の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを固定化して、例えば公知の方法で菌体を破壊して内部の酵素を抽出し、固定化して用いることも有利に実施できる。例えば、本酵素活性を有する微生物または部分精製酵素を、包括法、吸着法、共有結合法などの固定化方法により固定化して、バッチ反応で繰り返し利用することも、また、カラムなどに充填して連続的に利用することも随意である。

反応温度は、酵素が失活しない温度、例えば、４〜６０℃、望ましくは１０〜５０℃で反応すればよい。反応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グラム当たり約０．１ないし１００単位の酵素使用量で、０．１ないし１００時間程度である。

このようにして得られる反応液には、通常、アルドースとケトースの両者を含有している。反応液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＣＯ_３型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品にすることも、乾燥して粉末状製品にすることも、更には、結晶性糖質を結晶製品に仕上げることも随意である。必要ならば、更に高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分画、アルカリ処理によるケトースの分解除去などの方法で高純度の糖質を得ることも容易である。このようにして得られる各種糖質は、試薬はもとより、甘味料、品質改良剤などとして食品工業に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学工業など多くの用途に有利に利用できる。

とりわけ、Ｌ−リボースの光学異性体であるＤ−リボースは、細胞の増殖と密接に関連しているＲＮＡの必須成分であるので、Ｌ−リボース自体を、または、これを原料として誘導体としたものを、核酸の複製阻害剤などとして用いることができ、例えば、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗エイズ剤、抗癌剤などの医薬品に利用することも有利に実施できる。以上述べたようにＬ−リボースは、本発明のＬ−リボースイソメラーゼを用いることによりＬ−リブロースから容易に製造できる。Ｌ−リブロースの出所・由来は問わない。例えば、リビトールを原料として、グルコノバクター属やアセトバクター属に属する微生物、具体的には、例えば、グルコノバクター・フラテウリやアセトバクター・アセチなどによる、酸化反応で、Ｌ−リブロースを容易に得ることができる。

本発明の詳細を実施例で説明する。本発明はこれらの実施例によってなんら限定されるものではない。

［精製酵素の性質］
〈方法〉
酵素反応は、基質にL-リボースを５０ｍM使用し、4５℃で10分間反応をさせたのちに、生じたケトース量（L-リブロース）をシステイン-カルバゾール法にて測定した。温度安定性については、各温度で10分処理後に酵素活性測定した。至適ｐHの条件は、基質にL-リボース５０ｍMを使用し、５０ｍM酢酸緩衝液（ｐH２〜６）、５０ｍMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐH６〜８）、５０ｍMトリス-塩酸緩衝液（ｐH８〜９）、５０ｍMグリシン-水酸化ナトリウム（ｐH９〜１１）にて酵素反応を４５℃で１０分間行い、そののちに生じたケトース量（L-リブロース）をシステイン・カルバゾール法（表２）にて測定した。酵素反応は表２に示した組成で４５℃、10分間反応させ（表３）、反応の停止は10％のTCA（トリクロロ酢酸）を50μl加えて行った。システイン・カルバゾール法は表２に示したように酵素反応後のサンプル0.5mlに1.5％システイン溶液100μL、70％硫酸3mlを順次加えた後、撹拌して水中に置き、0.12％カルバゾール溶液100μLを加え撹拌して、20℃で20分間反応させた。反応終了後、紫外可視分光光度計 V530（日本分光株式会社）を用いて、540nmの吸光度を測定した。なお、1分間あたりに1μmolのL‐リブロースを生産する酵素量を1Uと定義した。

（酵素の精製）
本発明の菌株MB426を２％ ＴＳＢに０．１％のＤ-リキソースを添加した液体培地３Lにて３７度２日間培養し、超音波破砕にて粗酵素液を抽出した。これを硫安分画し、その後にＱ-セファロース、リソース-Ｑ、フェニルセファロースの順にカラムクロマトグラフィーによってＬ-リボースイソメラーゼを精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）により単一であることを確認した。精製酵素は、０．８１４Ｕ/ｍｇで収率は、７．４％であった。

〈精製酵素の性質〉
分子量 ３２,０００ （SDS-PAGE）
至適pH pH９．０ （グリシン‐NaOH緩衝液）（図1）
至適温度 45℃（図２）
温度安定性 ｐH 9.0における１０分間の熱処理において４５℃まで安定である。（図3）
DL-28は、Acinetobacter sp. DL-28株（特許文献1記載の寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５３３５）の結果であり温度安定性がそれほどないL-リボースイソメラーゼと比較したものである。Acinetobacter sp. DL-28株の生産する酵素と比較して、本酵素は同一条件で温度安定性が約１５℃高いことを示しており耐熱性が高いことを示している。

［基質特異性］
活性測定法に準じて、各種アルドースを基質にした場合の本酵素の活性を測定した。L-リボースを１００％とした時の各種アルドースに対する相対活性を表４に示す。

［表４］
L-リボース 100
D-タロース 56.9
D-リキソース 15.3
L-アロース 2.2

Raoultella ornithinolytica由来の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼにより、基質L-リボースを反応させ、L-リブロースが生じていることを図4に、基質D-フラクトースを反応させ、D-マンノースが生じていることを図5に、基質D-タガトースを反応させ、D-タロースが生じていることを図6に、基質L-プシコースを反応させ、L-アロースが生じていることを図7にそれぞれ示す。

（酵素反応生産物の確認）
２％TSBに０．１％のD-リキソースを添加した培地にて37度2日間培養し、超音波破砕にて抽出した粗酵素液（０．６５Ｕ/ｍｌ）を１５０μｌ、基質５０ｍＭ、４０度、２４時間にてＬ−リボース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−タガトース、Ｌ−プシコースの各ケトースを反応させた。反応後、熱湯で2分間加熱し酵素を失活させた後、12,000rpmで5分間遠心して上清を回収した。それにミクロスパチュラ約2杯分の脱塩樹脂（IRA411:SKIB = 2:1の割合で混合し乾燥させたもの）を添加して転倒混和した。1時間後、この液を0.45μmのフィルターを用いてろ過し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に供した。カラムとしてHitachi HPLC カラム GL-C611（日立化成工業社製）を用い、検出器としては示差屈折計（L-7490 refractive index detector、日立ハイテク社製）を用いた。カラムを６０℃に保ち、溶離液としては10^-4 M 水酸化ナトリウム溶液を流速１.0ｍＬ／分で用いた。得られたシグナルを、データ解析ソフトウェア（SmartChrom、KYAテクノロジーズ社製）を用いて収集し、同ソフトを用いて解析した。

表２の結果からも明らかなように、本酵素はL-リボースに対して最も高い活性を示した。他にD-タロース、D-リキソース、D-マンノース、L-アロース活性を示した。これらのアルドース、ケトースに作用する反応様式について検討した結果、それらの反応様式は共通しており、その一例としてL-リボースの場合を示すと化１のとおりである。

化１から明らかなように、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、第２位の炭素に結合するアルコール基（ＨO−Ｃ−Ｈ）がL−グリセロの配位を持つアルドース、アルドケトースに作用する。第２位の炭素に結合するアルコール基がD−グリセロの配位を持つＤ−グルコース、Ｄ−アロース及びD-アルトロースなどには活性を示さない。

上記から明らかなように、本発明のＬ−リボースイソメラーゼは、多種の糖質変換に有利に利用され、しかも、必ずしも高度に精製して作用させる必要もなく、希少糖質の工業生産に有利に利用することができる。本発明によって、従来極めて入手困難であった多種類の希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学工業など多方面に及ぶことが期待され、その工業的意義は極めて大きい。

Claims (21)

1. 下記の理化学的性質を有する、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有する耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。
   （１）分子量３２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
   （２）至適温度 ４５℃
   （３）至適ｐＨ ９．０（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）
   （４）温度安定性 ｐＨ９．０における１０分間の熱処理において４５℃まで安定
2. Ｌ−リボースイソメラーゼが、Raoultella属に属する微生物由来の酵素である請求項１の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。
3. Raoultella ornithinolyticaに属する微生物由来の酵素である請求項２の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。
4. Raoultella属菌体MB426（NITE BP-277）由来の酵素である請求項２の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ。
5. Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有する微生物を培養し、培養物から下記の理化学的性質を有する、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有する耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを採取することを特徴とする耐熱性L-リボースイソメラーゼの製造方法。
   （１）分子量３２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
   （２）至適温度 ４５℃
   （３）至適ｐＨ ９．０（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）
   （４）温度安定性 ｐＨ９．０における１０分間の熱処理において４５℃まで安定
6. 微生物がRaoultella属に属する微生物である請求項５の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの製造方法。
7. 微生物がRaoultella ornithinolyticaに属する微生物である請求項６の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの製造方法。
8. 微生物がRaoultella ornithinolytica ＭＢ４２６（NITE BP-277）由来の酵素である請求項５の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼの製造方法。
9. 下記の理化学的性質を有する、Ｌ−リボースを異性化してＬ−リブロースを生成し、また、逆に、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生成する作用を有する耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ産生能を有するRaoultella属に属する微生物。
   （１）分子量３２，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
   （２）至適温度 ４５℃
   （３）至適ｐＨ ９．０（グリシン−ＮａＯＨ緩衝液）
   （４）温度安定性 ｐＨ９．０における１０分間の熱処理において４５℃まで安定
10. Raoultellaに属する微生物が、Raoultella ornithinolytica ＭＢ４２６（NITE BP-277）またはその変異株である請求項９の微生物。
11. Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースに、請求項１、２、３または４の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて生成した、それぞれ対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースを採取することを特徴とするケトースの製造方法。
12. 耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である請求項１１のケトースの製造方法。
13. Ｌ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースに、請求項１、２、３または４の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて生成した、それぞれ対応するＬ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースを採取することを特徴とするアルドースの製造方法。
14. 耐熱性 Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である請求項１３のアルドースの製造方法。
15. Ｌ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースに、請求項１、２、３または４の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて該アルドースを異性化し、それぞれ対応するＬ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースを生成させるか、または、Ｌ−リブロース、Ｄ−キシルロース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フラクトース、Ｌ−プシコースおよびＬ−ソルボースから選ばれるケトースに、該Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させて該ケトースを異性化し、それぞれ対応するＬ−リボース、Ｄ−リキソース、Ｄ−タロース、Ｄ−マンノース、Ｌ−アロースおよびＬ−グロースから選ばれるアルドースを生成させることを特徴とするアルドースとケトースとの変換方法。
16. 耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である請求項１５のアルドースとケトースとの変換方法。
17. Ｌ−リブロースに請求項１、２、３または４の耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼを作用させる工程と、生成したＬ−リボースを採取する工程とを含んでなるＬ−リボースの製造方法。
18. Ｌ−リブロースが、リビトールをグルコバクター属またはアセトバクター属に属する微生物によって酸化反応させて得られたものである請求項１７のＬ−リボースの製造方法。
19. 耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼが、耐熱性Ｌ−リボースイソメラーゼ活性を有する微生物のトルエン処理により得られたものおよび／または固定化酵素である請求項１７または１８のＬ−リボースの製造方法。
20. 生成したＬ−リボースを、濾過、遠心分離、脱色、脱塩、濃縮、乾燥、カラムクロマトグラフィー、結晶化および／または分蜜を含む工程により採取する請求項１７、１８または１９のＬ−リボースの製造方法。
21. カラムクロマトグラフィーに、イオン交換樹脂を用いる請求項２０のＬ−リボースの製造方法。