JP2019500050A - 高純度ｄ−プシコースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、前記第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応で再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法に関する。【選択図】図１
Description
本発明は、Ｄ−プシコースの製造方法に関する。より詳細には、製造工程において熱変性がなく高収率で高純度のＤ−プシコースを製造する方法に関する。
Ｄ−プシコースはフルクトースや砂糖と異なり、人体内で代謝されなくてカロリーがほとんどなく、体脂肪形成の抑制作用で体重増加に影響が少ない甘味料として報告されている（Ｍａｔｕｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ａｓｉａ Ｐａｃ． Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， １０， ２２３−２３７， ２００１；Ｍａｔｓｕｏ Ｔ． ａｎｄ Ｋ． Ｉｚｕｍｏｒｉ． Ａｓｉａ Ｐａｃ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， １３， Ｓ１２７， ２００４．）。
最近本発明者らはグルコースをフルクトースに異性化した後、これをＤ−プシコースエピメラーゼを生産する固定化菌体と反応させてＤ−プシコースを経済的に生産する方法を報告した（韓国特許出願第１０−２００９−０１１８４６５号）。
酵素反応で生産されたＤ−プシコースを含む反応液は、約２０〜３０％（ｗ／ｗ）のＤ−プシコース固形分を含む低純度の製品であるため、９８％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ−プシコースを製造するためには連続式クロマトグラフィーで高純度分離し結晶化して製造することが必要である。
前記方法でフルクトースから生産されたＤ−プシコースの酵素反応転換率が２０〜３０％（ｗ／ｗ）であるため、Ｄ−プシコースの生産量に比べて発生する母液、すなわち、工程において連続式クロマトグラフィーで分離されたフルクトース母液と結晶化分離母液の量が多くなる。その結果、Ｄ−プシコースの生産量の低下に起因する原単位の増加で製造原価が上昇し、産業的生産において非経済的という問題がある。
したがって、低収率による原単位の上昇を下げるために高収率で高純度のＤ−プシコースの製造が可能である方法の提供が要求される。
本発明の目的は、一実施形態において高収率で高純度のＤ−プシコースを製造する方法を提供することである。
本発明の一実施例において、
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
前記第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応に再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。
本発明の一実施例において、
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
前記第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応に再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。
本発明の他の実施例では、
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
前記第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液をＤ−プシコースエピマー化反応に再使用し、
前記Ｄ−プシコース結晶の時に生成された母液を、第１冷却及びイオン精製、第１濃縮及び第２冷却、およびクロマトグラフィーのいずれか一つ以上に再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
前記第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液をＤ−プシコースエピマー化反応に再使用し、
前記Ｄ−プシコース結晶の時に生成された母液を、第１冷却及びイオン精製、第１濃縮及び第２冷却、およびクロマトグラフィーのいずれか一つ以上に再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。
前記一実施例あるいは他の実施例において、クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液またはＤ−プシコース結晶化の時に生成された母液を再使用する前に、２５℃〜４５℃の範囲、具体的に３０℃〜４０℃の範囲で冷却する工程をさらに備えることができる。前記クロマトグラフィーは、例えば、連続式クロマトグラフィーである。
前記一実施例あるいは他の実施例において、第１冷却及び第３冷却は溶液または周囲温度の範囲を２５℃〜４５℃、具体的に３０℃〜４０℃で冷却することであり、第２冷却は溶液または周囲温度の範囲を４５℃〜６５℃、具体的に５０℃〜６０℃で冷却することである。
前記一実施例あるいは他の実施例において、前記第１濃縮は前記精製されたＤ−プシコース含有溶液におけるＤ−プシコース濃度を５０ｂｒｉｘ〜７０ｂｒｉｘの範囲にすることであり、前記第２濃縮は分離液中のＤ−プシコースの濃度を７５ｂｒｉｘ以上、例えば、８０ｂｒｉｘ以上にすることである。
前記一実施例あるいは他の実施例において前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液で純度７０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有分画物を使用し、前記Ｄ−プシコースの結晶化の時に生成された母液で純度９０％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース含有分画物を使用する。
前記一実施例あるいは他の実施例において前記Ｄ−プシコースエピマー化反応は、Ｄ−プシコースエピメラーゼ、その変異体、前記エピメラーゼを生成する菌株またはその培養物の存在下で、温度を４０℃〜７０℃、具体的に４０℃〜６０℃、より具体的に４０℃〜５０℃でエピマー化反応させる工程を備える。
前記一実施例あるいは他の実施例において、前記イオン精製は強酸性陽イオン交換樹脂および／または弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いる。
前記一実施例あるいは他の実施例において、Ｄ−プシコース含有分離液はＤ−プシコースを９３％（ｗ／ｗ）以上、具体的に９５％（ｗ／ｗ）以上を含む。
前記一実施例あるいは他の実施例において、第１ないし第３冷却は各々熱交換冷却である。熱交換冷却は伝熱面積が広くて流体の乱流発生で熱交換の速度が速く、スケールの形成が防止されるので性能の低下が非常に少なく、経済性が高い利点がある。
前記一実施例あるいは他の実施例において、得られた前記Ｄ−プシコース結晶の純度は９５％（ｗ／ｗ）以上、より具体的に９９％（ｗ／ｗ）以上である。
前記一実施例あるいは他の実施例において前記製造方法で製造されたＤ−プシコース結晶の収率は７５％以上、具体的に８５％以上である。
本発明の更に他の実施例において、本願に記載されたＤ−プシコースの製造方法で製造された純度９９％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコースが提供される。
本発明の一実施形態に係るＤ−プシコースの製造方法は、Ｄ−プシコースの熱変性を防止し、安定した工法によって高収率でＤ−プシコースを製造する。
また、本発明の一実施形態に係るＤ−プシコースの製造方法は、クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液および／またはＤ−プシコース結晶化の時に生成された母液を回収してプシコースエピマー化反応や第１冷却及びイオン精製、第１濃縮及び第２冷却、またはクロマトグラフィーなどで再使用することで、長期間にわたって循環してもクロマトグラフィーによるＤ−プシコースの安定的分離が可能であり、Ｄ−プシコースを高収率で得ることができる。
以下、本発明に関してより詳しく説明する。本明細書に記載のない内容は、本発明の技術分野または類似分野における熟練者なら十分に認識と類推できるため、その説明を省略する。
本発明の一実施例では、
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
前記第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応に再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。
本発明の他の実施例において、
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応で再使用し、前記Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液を、前記第１冷却及びイオン精製、前記第１濃縮及び第２冷却、またはクロマトグラフィーで再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液および／またはＤ−プシコース結晶化の時に生成された母液をＤ−プシコースエピマー化反応や第１冷却及びイオン精製、第１濃縮及び第２冷却、またはクロマトグラフィーなどに再使用することで、高収率のＤ−プシコースの生産が可能であり、これによって生産効率が向上し、製造原価を下げることができる利点がある。
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
前記第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応に再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。
本発明の他の実施例において、
フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応で再使用し、前記Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液を、前記第１冷却及びイオン精製、前記第１濃縮及び第２冷却、またはクロマトグラフィーで再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法が提供される。クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液および／またはＤ−プシコース結晶化の時に生成された母液をＤ−プシコースエピマー化反応や第１冷却及びイオン精製、第１濃縮及び第２冷却、またはクロマトグラフィーなどに再使用することで、高収率のＤ−プシコースの生産が可能であり、これによって生産効率が向上し、製造原価を下げることができる利点がある。
まず、エピマー化反応の基質として使用されるフルクトースの濃度は３０〜５０ｂｒｉｘ（％）であり、３０℃〜４０℃の温度の水に溶解させて使用する。または、フルクトースをクロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液と混合して３０℃〜４０℃の温度と３０〜５０ｂｒｉｘ（％）の濃度で使用することができる。ここで、前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液は、純度７０％（ｗ／ｗ）以上、具体的には７５％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有分画物を使用する。
前記Ｄ−プシコースエピマー化反応は、プシコースエピメラーゼ、その変異体、前記酵素を生成する菌株またはその培養物の存在下でフルクトースをエピマー化してＤ−プシコースを生成することである。本発明に使用できるＤ−プシコースエピメラーゼは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ ｐｌａｕｔｉ）、クロストリジウム・ハイレモンアエ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｙｌｅｍｏｎａｅ）などの様々な供与微生物由来の酵素または変異体である。前記形質転換用菌株として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属があるがこれらの菌株だけに限定されない。前記大腸菌で形質転換された菌株は、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４−ＡＴＰＥ［韓国公開特許第１０−２１１−００３５８０５号］、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ２４−ＡＴＰＥ−２［韓国登録特許第１０−１２０３８５６号］などがあり、前記のコリネバクテリウム属の菌株はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＣＪ−１−ＡＴＰＥ［韓国公開特許第１０−２０１１−００３５８０５号の寄託番号ＫＣＣＭ１１０４６］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＦＩＳ−１−ＡＴＰＥ−２［韓国登録特許第１０−１２０３８５６号の寄託番号ＫＣＣＭ１１２０４Ｐ］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＣＪＫＹ［韓国登録特許第１０−１４５５７５９号の寄託番号ＫＣＣＭ１１４０３Ｐ］、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２／ｐＦＩＳ−２−ＡＴＰＥ−２［韓国特許出願第１０−２０１５−００４７１１１号の寄託番号ＫＣＣＭ１１６７８Ｐ］などがある。
一実施例において前記エピマー化反応は、プシコースエピメラーゼ、その変異体、前記酵素を生成する菌株またはその培養物を、担体、例えば、アルギン酸ナトリウムに固定し、前記固定化された酵素を、異性化反応設備、例えばカラムに充填した後、前記充填されたカラムにフルクトースを含む溶液を供給する。前記設備内の温度はエピマー化反応のために、４０℃〜７０℃の温度、例えば、４０℃〜５５℃の温度を維持する。このとき、供給されるフルクトースを含む溶液の温度は、例えば、時間当たり５℃〜２０℃ずつ４０℃〜６０℃の温度、例えば５０℃の温度で熱交換器によって昇温させてＳＶ［Ｓｐａｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ：流量（Ｌ）／時間（Ｈｒ）／樹脂量（Ｌ）］を０．５〜３で通過させる。エピマー化反応により生成されたＤ−プシコースの純度は約１５％〜約３５％（ｗ／ｗ）、例えば、約２０％〜約３０％（ｗ／ｗ）である。
前記のように製造されたＤ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製する。前記第１冷却は前記溶液の温度又は周囲温度を２５℃〜４５℃の範囲、具体的に３０℃〜４０℃の範囲で冷却する工程である。一実施例において、Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液を第１冷却及びイオン精製ステップで再使用する。具体的に１時間当たり１℃〜１０℃ずつ徐々に冷却し、前記冷却には熱交換器を使用する。Ｄ−プシコースは、所定の温度にさらされ続けた場合には熱変性によりＤ−プシコースが破壊されて製造工程中でＤ−プシコースの純度が低下し、その結果、高収率のＤ−プシコースの生産が困難な短所がある（図４〜８を参照）。そこで、本発明では製造工程の各ステップにおける温度を制御することでＤ−プシコースの熱変性がなくなる。
その後、イオン精製することは、前記冷却された溶液を強酸性陽イオン交換樹脂および／または弱塩基性陰イオン交換樹脂が充填されたカラムによって精製することである。強塩基性陰イオン樹脂を使用する場合には２５℃〜４５℃の低温でもＤ−プシコースを変性されて純度が低下する恐れがあるので、高収率のＤ−プシコースを製造するために強酸性陽イオン交換樹脂または弱塩基性陰イオン交換樹脂を使用し、より具体的に１００％の弱塩基性陰イオン交換樹脂を使用することが好ましい。イオン成分を効果的に除去するために、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂を同時に使用することができる。この場合、陽イオン交換樹脂と陰イオン交換樹脂の比率は１：０．５〜１：３である。前記イオン精製の間に、２５℃〜４５℃の温度、具体的に３０℃〜４０℃の温度が維持されてＤ−プシコースの変性を防止することができる。これにより、Ｄ−プシコース含有溶液内の不純物として含まれたイオン成分の除去ができる。前記イオン精製の後におけるイオン性成分の含有量は、電気伝導計で測定した時に単位ｃｍ当たり２０マイクロジーメンス以下、具体的に１０マイクロジーメンス以下である。イオン精製された溶液中のＤ−プシコースの純度は約１０％（ｗ／ｗ）〜約３５％（ｗ／ｗ）である。
前記イオン精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却する。
前記第１濃縮は、前記イオン精製されたＤ−プシコース含有溶液をＤ−プシコース濃度が５０ｂｒｉｘ〜７０ｂｒｉｘの範囲、例えば、５５ｂｒｉｘ〜６５ｂｒｉｘの範囲になるように濃縮する工程である。具体的には、６０℃〜８０℃の温度で、例えば、６５℃〜７５℃で１分〜１時間、具体的には１分〜３０分間濃縮する。この濃縮の際、Ｄ−プシコース変性を防ぐため低温濃縮器を使用することができる。本明細書でｂｒｉｘは全体溶液の重量を基準にＤ−プシコースまたはフルクトースの重量の割合を意味する。前記第１濃縮後に第２冷却を実施することができる。第２冷却を実施する場合には、溶液または周囲温度は、前記第１濃縮時の温度よりも少なくとも１０℃程度低くなるように冷却することができる。具体的実施例において、第２冷却温度は５０℃〜６０℃の範囲である。具体的には１時間あたり５℃〜２５℃ずつ徐々に冷却させ、前記冷却には熱交換器を使用する。一実施例では、Ｄ−プシコースを結晶化する時に生成された母液を第１濃縮および／または第２冷却ステップで再使用する。
前記第１濃縮は、前記イオン精製されたＤ−プシコース含有溶液をＤ−プシコース濃度が５０ｂｒｉｘ〜７０ｂｒｉｘの範囲、例えば、５５ｂｒｉｘ〜６５ｂｒｉｘの範囲になるように濃縮する工程である。具体的には、６０℃〜８０℃の温度で、例えば、６５℃〜７５℃で１分〜１時間、具体的には１分〜３０分間濃縮する。この濃縮の際、Ｄ−プシコース変性を防ぐため低温濃縮器を使用することができる。本明細書でｂｒｉｘは全体溶液の重量を基準にＤ−プシコースまたはフルクトースの重量の割合を意味する。前記第１濃縮後に第２冷却を実施することができる。第２冷却を実施する場合には、溶液または周囲温度は、前記第１濃縮時の温度よりも少なくとも１０℃程度低くなるように冷却することができる。具体的実施例において、第２冷却温度は５０℃〜６０℃の範囲である。具体的には１時間あたり５℃〜２５℃ずつ徐々に冷却させ、前記冷却には熱交換器を使用する。一実施例では、Ｄ−プシコースを結晶化する時に生成された母液を第１濃縮および／または第２冷却ステップで再使用する。
その後、前記濃縮および冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーして母液とＤ−プシコース含有分離液を得る。
クロマトグラフィーはＤ−プシコースとイオン樹脂に付着した金属イオンとの間の弱い結合力の差を利用してＤ−プシコースを分離するものであり、例えば、連続式クロマトグラフィーがある。クロマトグラフィーで用いるイオン樹脂はＫ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ残基が付着した強酸性陽イオン交換樹脂であり得る。Ｄ−プシコースとフルクトースを分離するという面でＫ、Ｃａ、またはＮａがより好ましい。前記クロマトグラフィーによってフルクトース含有溶液とＤ−プシコース含有分離液を得ることができる。前記Ｄ−プシコース含有分離液は純度９０％（ｗ／ｗ）以上、例えば、純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース含有分画物である。具体的に、Ｄ−プシコース純度が９０〜９９％（ｗ／ｗ）以上である。
クロマトグラフィーはＤ−プシコースとイオン樹脂に付着した金属イオンとの間の弱い結合力の差を利用してＤ−プシコースを分離するものであり、例えば、連続式クロマトグラフィーがある。クロマトグラフィーで用いるイオン樹脂はＫ、Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ残基が付着した強酸性陽イオン交換樹脂であり得る。Ｄ−プシコースとフルクトースを分離するという面でＫ、Ｃａ、またはＮａがより好ましい。前記クロマトグラフィーによってフルクトース含有溶液とＤ−プシコース含有分離液を得ることができる。前記Ｄ−プシコース含有分離液は純度９０％（ｗ／ｗ）以上、例えば、純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース含有分画物である。具体的に、Ｄ−プシコース純度が９０〜９９％（ｗ／ｗ）以上である。
フルクトース含有溶液は純度７０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有分画物である。また、フルクトース含有溶液はＤ−プシコースエピマー化反応で再使用することができる。再使用する前に、２５℃〜４５℃、３０℃〜４０℃の範囲で冷却する工程をさらに備えることができる。
その後、前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る。クロマトグラフィーで分離された純度９０％（ｗ／ｗ）以上、例えば、純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース溶液を第２濃縮して分離液中におけるＤ−プシコースの濃度が７５ｂｒｉｘ以上、例えば、８０ｂｒｉｘ以上まで濃縮する。前記濃縮は、具体的には６０℃〜８０℃の温度で、例えば、６５℃〜７５℃の温度で１分〜１時間、具体的には、１分〜３０分間濃縮する。このとき、濃縮はＤ−プシコースの変性を防止するために低温濃縮器を使用することができる。前記第２濃縮後に第３冷却を実施することができる。第３冷却はＤ−プシコースを結晶化するための工程であり、溶液または周囲温度を３０℃〜４０℃の範囲で冷却する。より具体的に、時間当たり５℃〜２０℃ずつ徐々に冷却させて、２５℃〜４５℃、例えば、３０℃〜４０℃の範囲になるようにして、前記温度範囲内で昇温と冷却を５回〜１０回繰り返し、４０時間〜１２０時間にわたって結晶化する。得られたＤ−プシコース結晶は、更に脱水及び乾燥することができる。得られたＤ−プシコース結晶の純度は９５％以上、具体的に９９％以上であり、また、式１によるＤ−プシコース結晶の収率は７５％以上、８０％以上、８５％以上である。
［式１］
収率（％）＝（脱水及び乾燥されたＤ−プシコース結晶の重量／結晶化原液のＤ−プシコース重量）×１００
［式１］
収率（％）＝（脱水及び乾燥されたＤ−プシコース結晶の重量／結晶化原液のＤ−プシコース重量）×１００
前記収率を計算する際、結晶化の前において原液中のＤ−プシコース重量の測定は、ＨＰＬＣ分析を通じて原液中のＤ−プシコースｇ／Ｌを測定した後、予め測定された結晶化源液量（Ｌ）に応じて前記測定されたＤ−プシコースｇ／Ｌを代入し、特定の源液量（Ｌ）に含まれたＤ−プシコースの重量（ｇ）を計算する。
前記Ｄ−プシコース結晶化の時に生成されたＤ−プシコース結晶以外の母液は、前記各ステップで再使用することが可能であり、一実施例では、第１冷却及びイオン精製、第１濃縮及び第２冷却とクロマトグラフィー工程のいずれか一つ以上の工程で再使用する。Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液は再使用の前に２５℃〜４５℃の範囲で冷却して再使用する。Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液は、純度９０％（ｗ／ｗ）以上、純度９２％（ｗ／ｗ）以上、純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース含有分画物である。
以下、本発明の具体的な実施例によって本発明の構成と作用をもっと詳しく説明する。ただし、これは単に本発明の具体的な例であり、いかなる意味でもこれにより本発明が限定解釈されるべきではない。
ここに記載のない内容は、この技術分野における熟練者なら技術的に十分な類推が可能であるため、その説明を省略する。
実施例１
純度９９％（ｗ／ｗ）以上の結晶フルクトース、回収された約３０℃の連続式クロマトグラフィー母液、回収された約３０℃の結晶化母液と約３０℃の水を使用し、溶解槽内で撹拌混合して５０ｂｒｉｘ（％）で溶解し、酵素反応の基質溶液を準備した。
純度９９％（ｗ／ｗ）以上の結晶フルクトース、回収された約３０℃の連続式クロマトグラフィー母液、回収された約３０℃の結晶化母液と約３０℃の水を使用し、溶解槽内で撹拌混合して５０ｂｒｉｘ（％）で溶解し、酵素反応の基質溶液を準備した。
酵素反応は、韓国特許出願第１０−２００９−０１１８４６５号に開示のコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ １１０４６の菌株から分離されたＤ−プシコースエピメラーゼをアルギン酸ナトリウム担体に固定化して異性化反応設備（異性化塔、ハンジュ機械工業）に充填した後、用意した前記酵素反応基質溶液を熱交換器で１時間当たり５〜２０℃ずつ５０℃まで昇温させてＳＶ［Ｓｐａｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ：流量（Ｌ）／時間（Ｈｒ）／樹脂量（Ｌ）］０．５で反応させた。この時のＤ−プシコースの純度は約２４％（ｗ／ｗ）であった。
前記純度２４％（ｗ／ｗ）のＤ−プシコース溶液を熱交換器で１時間当たり５〜１０℃ずつ３０〜４０℃に第１冷却した後、プロトンで置換された強酸性陽イオン交換樹脂（Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ １６６８）及び水酸基で置換された弱塩基性陰イオン交換樹脂（Ｌｅｗａｔｉｔ Ｓ ４５２８）が充填されたカラムにＳＶ［Ｓｐａｃｅ Ｖｅｌｏｃｉｔｙ：流量（Ｌ）／時間（Ｈｒ）／樹脂量（Ｌ）］３で通液して酵素反応溶液中のイオン成分を除去し、イオン成分の除去の確認は電気伝導計の測定で単位ｃｍ当たり１０マイクロジーメンス以下になるように調節し、精製された酵素反応液のＤ−プシコースの純度は２４％（ｗ／ｗ）で維持された。
前記イオン精製されたＤ−プシコース含有溶液を低温濃縮器（強制薄膜濃縮装置（Ｆｏｒｃｅｄ Ｔｈｉｎ Ｆｉｌｍ Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ、ウェルクロンハンテック（Ｗｅｌｃｒｏｎｈａｎｔｅｃ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．））内に投入して、６５〜７５℃の温度で１０〜１５分の間短時間濃縮し濃度を６０ｂｒｉｘ（％）（Ｄ−プシコース溶液×１００／全溶液）に調整し、熱交換器で１時間当たり５〜２５℃ずつ第２冷却し、５０℃〜６０℃でカルシウム基が付着した強酸性陽イオン交換樹脂が充填されたカラムの連続式クロマトグラフィーによってＤ−プシコースの純度が９５％（ｗ／ｗ）以上の分画とフルクトースの純度が７５％（ｗ／ｗ）以上の分画に分離した。
前記連続式クロマトグラフィーで分離された母液、すなわち、純度７５％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース画分は回収して１時間当たり２０〜３０℃ずつ冷却して３０℃で酵素反応工程に再循環させた。
前記連続式クロマトグラフィーで分離された純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース溶液を６５〜７５℃の温度下で１０〜１５分間の短時間濃縮して濃度を８０ｂｒｉｘ（％）に調整し、濃縮された純度９５％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース溶液を熱交換器で１時間５〜２０℃ずつ４０℃の温度で急速に冷却した後、３５〜４０℃の範囲内で昇温と冷却を５〜１０回繰り返して８０〜１２０時間にわたって結晶化しＤ−プシコースを製造した（図１参照）。また、さらに、前記結晶化で分離された母液、すなわち、純度９０％以上のＤ−プシコース画分を回収して３０℃に冷却し、前記プロトンで置換された強酸性陽イオン交換樹脂と水酸基で置換された弱塩基性陰イオン交換樹脂が充填されたカラムに再循環させた。
前記過程を経て、低温濃縮器で短時間に濃縮するとともに、熱交換器を利用して工程内の温度を低温に調整することにより、生産収率が７５％以上で純度９９％以上の高純度Ｄ−プシコースを得た。
比較例１
実施例１において連続式クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液をプシコースエピマー化反応で再使用することと、プシコース結晶化の時に生成された母液を再使用することは実施し、第１冷却と第２冷却などの冷却過程がないこと以外は、実施例１と同様の方法で実行して純度９９％以上の高純度Ｄ−プシコースを生産した。この時の生産収率は６０％であった。
実施例１において連続式クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液をプシコースエピマー化反応で再使用することと、プシコース結晶化の時に生成された母液を再使用することは実施し、第１冷却と第２冷却などの冷却過程がないこと以外は、実施例１と同様の方法で実行して純度９９％以上の高純度Ｄ−プシコースを生産した。この時の生産収率は６０％であった。
これは、Ｄ−プシコースが所定濃度と所定時間が経過するに伴って純度が低下する特徴があるため（図４〜８を参照）、工程内の冷却ステップなしで連続式クロマトグラフィー分離フルクトース母液と結晶化分離母液が再循環を繰り返す回数が持続的に蓄積される場合には、連続式クロマトグラフィーに投入されるＤ−プシコースの純度が最初の２４％（ｗ／ｗ）から繰り返し回数に比例してその純度が低くなり、結晶化するための９５％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ−プシコース分画の分離収率が低くなる結果を示し、その原因は９５％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ−プシコースの回収率が低いため純度９９％以上の高純度Ｄ−プシコースの生産収率が低下することであると考えられる。また、Ｄ−プシコース由来の変性された不純物が連続式クロマトグラフィーの分離ステップでフルクトース分画に分離されるので、工程内の再循環の繰り返し回数が累積されることによって連続式クロマトグラフィー分離に問題を起こして累積する不純物を制御するために分離されたフルクトース画分の約５〜１０％（ｖ／ｖ）溶液を廃棄することになり、結果的に純度９９％以上の高純度Ｄ−プシコースの生産収率が低下する原因になる。
連続式クロマトグラフィーで分離されたフルクトース母液の約５〜１０％（ｖ／ｖ）を廃棄しない場合には、累積された不純物によって連続式クロマトグラフィーの投入原液のＤ−プシコース純度が持続的に減少するので、９５％（ｗ／ｗ）以上の高純度Ｄ−プシコースを分離するために連続式クロマトグラフィーの分離プログラムの条件を継続的に変更する必要があるが、これは産業的生産効率化を妨げる要因であり、連続式クロマトグラフィーで９５％（ｗ／ｗ）以上の高純度のＤ−プシコースを分離するために脱イオン水の使用量も増加するので、濃縮工程に負荷を与えて工程のボトルネックになり、生産量の低下と製造費用が上昇する結果をもたらす。
比較例２
実施例１において連続式クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液をプシコースエピマー化反応で再使用することと、プシコース結晶化の時に生成された母液を再使用することを省略したこと以外は、実施例１と同様の方法で実行して純度９９％以上の高純度Ｄ−プシコースを生産した。この時の生産収率は２０％であった（図３参照）。
実施例１において連続式クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液をプシコースエピマー化反応で再使用することと、プシコース結晶化の時に生成された母液を再使用することを省略したこと以外は、実施例１と同様の方法で実行して純度９９％以上の高純度Ｄ−プシコースを生産した。この時の生産収率は２０％であった（図３参照）。
以上で、本発明の特定部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこの具体的な記述は単に好ましい実施例であり、これにより本発明の範囲が限定されないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な保護範囲は添付された請求範囲とそれらの均等物によって定義されるべきである。
Claims (18)
- フルクトースをＤ−プシコースエピマー化反応させてＤ−プシコース含有溶液を生成し、
前記Ｄ−プシコース含有溶液を第１冷却及びイオン精製し、
前記精製されたＤ−プシコース含有溶液を第１濃縮及び第２冷却し、
第１濃縮及び第２冷却されたＤ−プシコース含有溶液をクロマトグラフィーしてフルクトース含有母液とＤ−プシコース含有分離液を得て、
前記Ｄ−プシコース含有分離液を第２濃縮及び第３冷却してＤ−プシコース結晶を得る工程を備え、
前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液を前記Ｄ−プシコースエピマー化反応で再使用することを含む、Ｄ−プシコースの製造方法。 - 前記Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液を、第１冷却及びイオン精製、前記第１濃縮及び第２冷却、またはクロマトグラフィーで再使用することをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液を前記第１冷却及びイオン精製で再使用することをさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記クロマトグラフィーは連続式クロマトグラフィーであることを特徴とする、請求項１に記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液、または前記Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液を、再使用する前に２５℃〜４５℃の範囲で冷却することをさらに含む、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 第１冷却及び第３冷却は溶液または周囲温度を２５℃〜４５℃の範囲で冷却し、
第２冷却は溶液または周囲温度を４５℃〜６５℃の範囲で冷却することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。 - 第１冷却及び第３冷却は溶液または周囲温度を３０℃〜４０℃の範囲で冷却し、
第２冷却は溶液または周囲温度を５０℃〜６０℃の範囲で冷却することを特徴とする、請求項６に記載のＤ−プシコースの製造方法。 - 前記第１濃縮は前記精製されたＤ−プシコース含有溶液のＤ−プシコース濃度を５０ｂｒｉｘ〜７０ｂｒｉｘの範囲にすることであり、
前記第２濃縮は分離液中のＤ−プシコースの濃度を７５ｂｒｉｘ以上にすることである、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。 - 前記クロマトグラフィーで生成されたフルクトース含有母液で純度７０％（ｗ／ｗ）以上のフルクトース含有分画物を使用することを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記Ｄ−プシコース結晶化の時に生成された母液で、純度９０％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース含有分画物を使用することを特徴とする、請求項２に記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記Ｄ−プシコースエピマー化反応は、Ｄ−プシコースエピメラーゼ、その変異体、前記酵素を生成する菌株またはその培養物の存在下で４０℃〜７０℃の温度で反応させる工程を備える、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記イオン精製は、強酸性陽イオン交換樹脂または弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記Ｄ−プシコース含有分離液はＤ−プシコースを９３％（ｗ／ｗ）以上含むことを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記第１ないし第３冷却は各々熱交換冷却であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記得られたＤ−プシコース結晶の純度が９５％以上であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記得られたＤ−プシコース結晶の純度が９９％以上であることを特徴とする、請求項１５に記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 前記Ｄ−プシコース結晶の収率が７５％以上であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一つに記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 請求項１ないし４のいずれか一つに記載の方法で製造された純度９９％（ｗ／ｗ）以上のＤ−プシコース。
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