KR101894983B1 - 증가된 카피 수를 가지는 변형 플라스미드 및 이의 용도 - Google Patents

증가된 카피 수를 가지는 변형 플라스미드 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 변형 플라스미드 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 높은 카피 수를 가지는 변형 플라스미드, 상기 변형 플라스미드에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터, 이를 포함하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 목적단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

증가된 카피 수를 가지는 변형 플라스미드 및 이의 용도 {Modified Plasmid Having Enhanced Copy Number and Uses Thereof}
본 발명은 변형 플라스미드 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 높은 카피 수를 가지는 변형 플라스미드, 상기 변형 플라스미드에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터, 이를 포함하는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 목적단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 속 미생물은 다양한 산업분야에서 적용되고 있는 균주이다. 주로 아미노산과 핵산 생산에 사용되는 균주로, 일반적으로 안전하다고 여겨지기 때문에 여러 대사물질, 식품 첨가물을 생산하는데도 사용된다. 이러한 여러 대사물질, 식품 첨가물 생산에만 사용되는 것이 아니라, 재조합 단백질을 생산하는 데에도 많이 사용된다. 이러한 코리네박테리움 속 균주를 이용하여 L-아라비노오스 이성화효소와 D-싸이코스-3-에피머화효소를 생산하고, 궁극적으로 싸이코스 생산에 성공하였음이 보고된 바 있다.
코리네박테리움 속 미생물을 이용한 공정에서 중요한 목적은 유효 비용으로 우수한 질을 갖는 가능한 다량의 산물을 수득하는 것이다. 이를 위해서는 목표 산물의 생산을 위한 재조합 단백질의 양이 중요한 요소가 되고, 이를 통해 재조합 단백질을 코딩하고 있는 플라스미드의 카피 수의 양이 중요함을 확인할 수 있는 것이다. 이러한 재조합 단백질의 발현양을 강화시키기 위하여 강한 전사 시스템인 프로모터나 비전사영역의 최적화를 시도한 바 있다.
그러나, 가장 큰 요소는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자의 양으로, 코리네박테리움 속 미생물에서 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위해서는 고효율의 유전자 발현 시스템이 필요하다.
최근, 유전자 치료 분야에서도 플라스미드가 주요해지면서, 일반적으로 특정 유전자의 발현량을 높이기 위한 방법으로 미생물이 가지는 유전자의 수를 높여주는 방법을 사용하며, 이를 위해 통상 카피 수가 높게 유지되는 플라스미드를 사용한다. 카피수가 높게 유지되는 플라스미드에 원하는 유전자를 삽입하고 이러한 재조합 플라스미드를 다시 미생물에 형질 전환시킴으로써 미생물당 플라스미드의 카피 수 만큼 유전자를 늘려주는 효과를 기대할 수 있다.
코리네박테리움 속 미생물에서 사용되는 플라스미드는 두 가지 복제 원점을 가지고 있다. 대장균에서 복제가 가능한 복제원점과 코리네박테리움 속 미생물에서 복제가 가능한 복제원점이 필요하다. 이 두 가지 복제원점 중에서 코리네박테리움 속 미생물의 복제원점이 개량되어야 카피 수의 개량이 일어날 수 있다.
예를 들어, pCES208 플라스미드 (Park et al., J Microbiol Biotechnol. 2008; 18:639-47.)는 그람-양성 세균 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)에서 분리된 것으로, 이를 이용하여 다양한 연구가 진행되었으며, 특히 재조합 단백질 생산 및 대사 물질의 생산에 사용되었다. pCES208 플라스미드는 3 kB의 분리된 pCG1 복제원점을 포함하고 있다. pCG1 복제원점은 rep 복제 단백질 및 복제와 관련된 두 가지 오픈 리딩 프레임(ORF들: ORFa, ORFa2 등)을 포함한다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 플라스미드를 더 높은 효율로 이용하기 위해서는 플라스미드의 카피 수를 늘려야 하고, pCG1 복제원점의 오픈 리딩 프레임에서의 변이를 통해 목적하는 카피 수가 증가된 플라스미드를 확보할 수 있음을 확인하고, 이를 포함한 재조합 미생물의 생산 및 이를 이용하여 목적단백질이 고발현될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 높은 카피 수를 가지는 변형 플라스미드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변형 플라스미드에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용하여 목적단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 orfA2 전체가 결실되거나, 서열번호 1의 orfA2가 미발현 또는 저발현되도록 변이된, 높은 카피 수를 가지는 변형 플라스미드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 변형 플라스미드에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따른 변형 플라스미드는 높은 카피 수를 가짐으로써 기존의 플라스미드 기반의 시스템에 비해 현저히 우수한 재조합 단백질 생산능을 나타내므로, 고효율 재조합 단백질 생산을 위한 재조합 벡터로 사용 가능하며, 산업적 적용에 매우 유용하다.
도 1은 변이 전 모체가 되는 pCES208 플라스미드의 모식도이다.
도 2는 형광 활성 세포 분류기를 통한 증가된 카피 수를 갖는 플라스미드를 스크리닝하는 과정을 나타낸 것이다. Ori는 야생형의 pCES208에서 형광단백질을 발현하고 있는 세포를 나타내고 1st부터 7th은 각 스크리닝을 진행한 뒤의 분석한 세포를 나타낸다. x 축은 세포의 상대적인 형광량을 나타낸다. 또한, M은 평균 형광량 값을 나타낸다.
도 3은 플라스미드 카피 수에 변화가 있는지 여부를 확인하기 위해서 BamHI 제한효소 처리 후 전기영동을 통해 플라스미드를 분석한 결과이다. Ori는 야생형을 말하고 7th은 7번째 스크리닝 이후 세포를 말한다. 이들 세포에서 분리한 플라스미드를 분석하였다.
도 4는 카피 수가 개량된 플라스미드의 형광단백질 생산량을 비교한 결과이다. 도 4a는 성장곡선을 나타내고 도 4b는 상대적인 형광량을 나타낸다. 삼각형과 원은 각각 야생형 pCES208 플라스미드 기반, 개량된 pHCP 기반의 형광단백질 생산 플라스미드의 성장곡선을 나타낸다. 검은 도형은 영양분이 충분한 배지에서의 조건이고 흰 도형은 최소한의 영양분의 배지에서의 조건이다.
도 5는 야생형과 개량된 플라스미드의 카피 수를 측정하고 안정성을 측정한 결과이다. 도 5a는 플라스미드 카피수를 확인한 결과이다. WT은 야생형, HCP는 개량된 플라스미드를 나타낸다. 도 5b는 플라스미드 안정성을 측정한 결과이다. 삼각형과 원은 각각 야생형 pCES208 플라스미드 기반, 개량된 pHCP 기반의 형광단백질 생산 플라스미드의 성장곡선을 나타낸다.
도 6는 엔도자일란네이즈 생산 결과이다. 도 6a는 세포내 단백질 발현양을 확인한 결과이다. 도 6a에서 1번부터 3은 pCES208 공 플라스미드, pCG-G-XynA, and pHCP-XynA를 가진 세포에서 생산된 단백질을 나타내고 T는 세포가 지닌 모든 단백질을 나타내고 S는 세포가 지닌 수용성인 단백질을 나타낸다. 화살표는 엔도자일란네이즈를 나타낸다. 도 6b는 분비 생산된 단백질을 나타낸다. 도 6b에서 1번부터 3은 pCES208 공 플라스미드, pCG-G-XynA, 및 pHCP-XynA를 가진 세포 밖으로 분비된 단백질을 나타낸다. c는 엔도자일란네이즈의 활성을 측정한 값이다.
도 7은 개량된 플라스미드를 이용하여 엔도자일란네이즈를 고배양 발효를 통해 생산한 결과이다. 도 7a는 생장곡선, 포도당 농도, 엔도자일란네이즈 농도를 나타낸 그래프이다. 도 7b는 분비생산된 단백질을 분석한 결과이다. 1부터 10은 0, 4, 7, 11, 15, 19, 24, 28, 33, 36 시간에서 샘플링한 것을 나타낸다.
도 8은 다양한 효소 생산 결과이다. 도 8a는 바이오플라스틱 생산 효소인 PhaA, PhaB, PhaC를 발현한 결과이다. 1번부터 3번은 공 플라스미드, pCES-H36-PhaCAB, pHCP-PhaCAB를 가진 세포에서 생산된 단백질을 나타낸다. 도 8b은 γ-Aminobutyric acid를 생산하는 효소인 gadB를 발현한 결과를 나타낸다. 1번부터 3번은 공 플라스미드, pHGmut (야생형), pHCP-Gmut를 가진 세포에서 생산된 단백질을 나타낸다. T는 세포가 지닌 모든 단백질을 나타내고 S는 세포가 지닌 수용성인 단백질을 나타낸다. 화살표는 각 세포에서 생산된 효소를 나타낸다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 orfA2 전체가 결실되거나, 서열번호 1의 orfA2가 미발현 또는 저발현되도록 변이된, 높은 카피 수를 가지는 변형 플라스미드에 관한 것이다.
본 출원의 발명자들은 증가된 카피 수를 갖는 개량된 플라스미드의 경우 모든 돌연변이체가 서열번호 1의 orfA2에 종결 코돈이 생기는 것으로 귀결되는 양태를 보임을 확인하고, 서열번호 1의 orfA2가 발현이 되지 않거나, 저발현되도록 변이되면 높은 수의 카피를 갖는 결과를 얻을 수 있음을 도출하였다.
본 발명에서 "orfA2"는 복제와 관련된 두 가지 오픈 리딩 프레임 중 하나로, 오픈 리딩 프레임은 아미노산 서열로 번역되는 DNA 염기서열로서, 번역개시 코돈(예: ATG)에서 종결 코돈(예: TGA, TAA, TAG)에 이르는 염기서열을 포함한다. orfA2는 서열번호 1의 핵산 서열로 표시되고, 본 발명에서 서열번호 1의 서열은 이와 90% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 의미로, 바람직하게 서열번호 1의 서열과 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 "상동성"은 두 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수(score), 동일성(identity), 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하여 확인할 수 있으며, BLAST 등 당업자에게 잘 알려진 방법을 통해 결정될 수 있다.
하나의 실시예에서, "미발현 되도록 변이"는 해당 유전자가 전혀 발현되지 않도록 하거나, 발현되더라도 목적하는 기능 또는 활성을 나타내지 않거나, 목적하는 기능 또는 활성을 전혀 나타내지 못하도록 하는 변형을 포괄한다.
"저발현 되도록 변이"는 목적하는 기능 또는 활성이 예를 들어 변형되지 않은 orfA2 유전자 발현에 의해 나타나는 정상 기능 또는 활성의 70% 이하로 발현이 저하되거나, 60% 이하로 발현이 저하되거나, 50% 이하로 발현이 저하되거나, 40% 이하로 발현이 저하되거나, 30% 이하로 발현이 저하되거나, 20% 이하로 발현이 저하되거나, 10% 이하로 발현이 저하되거나, 5% 이하로 발현이 저하되거나, 3% 이하로 발현이 저하되거나, 1% 이하로 발현이 저하되도록 하는 변형을 포괄한다.
하나의 실시예에서, 상기 미발현 또는 저발현 되도록 변이시키는 것은 서열번호 1 중 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실 또는 치환하는 것에 의해 달성될 수 있다.
본 발명에서 "결실"은 서열번호 1의 orfA2 유전자 전체를 삭제시키는 것을 포함할 뿐 아니라, 서열번호 1의 orfA2 중 하나 이상의 뉴클레오티드를 삭제시켜 해당 유전자가 미발현 또는 저발현 되도록 함을 의미한다.
본 발명에서 "치환" 서열번호 1의 orfA2 중 임의의 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 원래의 뉴클레오티드와 상이한 뉴클레오티드로 변경됨을 의미한다. 일 실시예에 따르면, 증가된 카피 수를 갖는 개량된 플라스미드를 스크리닝한 결과, 서열번호 1의 orfA2에 종결코돈이 형성되는 것으로 귀결되는 양태를 보임을 확인하였다.
이를 바탕으로, 하나의 실시예에서, 서열번호 1의 orfA2 중 5'에서 3' 방향으로 4 내지 21번째, 30 내지 61번째 또는 84 내지 175번째 뉴클레오티드가 종결코돈으로 치환될 수 있다. 상기 뉴클레오티드 치환을 통해 세개의 뉴클레오타이드로 이루어진 전령 RNA에서 번역의 중단을 하는 신호인 종결코돈으로 변형되도록 하며, orfA2의 뉴클레오티드 치환을 통해 예를 들어, TAG, TAA, 또는 TGA로 변형될 수 있다. 이에 의해, orfA2 유전자는 전혀 발현되지 못하거나, 발현되더라도 목적하는 기능 또는 활성을 나타내지 않을 수 있다.
바람직하게, 서열번호 1의 orfA2 중 5'에서 3' 방향으로 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함할 수 있다:
21번째, 30번째, 또는 84번째 뉴클레오티드가 A (아데닌)으로 치환; 및
4번째, 61번째 또는 175번째 뉴클레오티드가 뉴클레오티드가 T (티민)으로 치환.
구체적으로, 다음의 치환을 통해 종결코돈으로 변형될 수 있다:
i) 서열번호 1의 orfA2 중 5'에서 3' 방향으로 21번째, 30번째, 또는 84번째 뉴클레오티드로 C가 위치하였으나, 뉴클레오티드가 A (아데닌)으로 치환되어 TCG 코돈이 종결코돈인 TGA 코돈으로 변형되거나,
ii) 4번째, 또는 175번째 뉴클레오티드로 G가 위치하였으나, 뉴클레오티드가 T (티민)으로 치환되어 GAA 코돈이 종결코돈인 TAA 코돈으로 변형되거나, GAG 코돈이 종결코돈인 TAG 코돈으로 변형되거나, 또는
iii) 30번째, 또는 61번째 뉴클레오티드로 C가 위치하였으나, 뉴클레오티드가 T (티민) 또는 A (아데닌)으로 치환되어 TGC 코돈이 종결코돈인 TGA 코돈으로 변형되거나, CGA 코돈이 종결코돈인 TAG 코돈으로 변형될 수 있다.
본 발명에서 "카피 수"는 세포에 존재하는 평균 플라스미드 수를 의미한다. 카피 수는 복제 제어 부위의 복제 개시 원점이나 오픈 리딩 프레임을 조절함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 복제에 필수적인 오픈 리딩 프레임의 발현량을 조절하거나, 오픈 리딩 프레임에 돌연변이를 유도하여 조절할 수 있다.
본 출원의 발명자들은 높은 카피 수의 플라스미드를 스크리닝하기 위해서 형광단백질을 지표로 사용하였다. 개량된 높은 카피 수의 플라스미드에서는 형광단백질이 과잉 발현되기 때문에 야생형에 높은 카피 수를 가질 것으로 예상하였다. 플라스미드 카피 수를 확인하기 위해서 세포 내 플라스미드 DNA를 실시간 PCR을 이용하여 증폭하였다 (Lee C1, Kim J, Shin SG, Hwang S. J Biotechnol. 2006 May 29;123(3):273-80). 실시간 PCR은 형광 리포터를 검출하고, 이를 정량하여 수행될 수 있다. 형광 신호는 PCR 산물의 양에 직접적으로 비례하여 증가하고 이는 첫 번째 PCR이 이루어질 때의 주형의 양으로 정해진다. 정량 방법은 형광 프로브를 사용하거나, DNA-형광 결합 물질 (SYBR-그린)을 사용할 수 있다. 상대적인 유전자 발현을 위해서는 내부 지놈상에 존재하는 유전자를 이용하여 비교하여야 한다.
실시간 PCR 반응에 이어서, 기록된 형광 강도를 이용하여 유전자 발현의 상대적 정량을 위한 비교하기 위한 CT 방법 (ΔΔCT) (표적 서열의 상대 량이 선택된 참조 값 중 어느 것과 비교되고 결과가 참조값에 상대적으로 주어짐)에 의해 주형의 양을 정량하는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 복제 제어 부위는 예를 들어, pCES208(Park et al., J Microbiol Biotechnol. 2008;18:639-47.), pSR1(Archer et al., Microbiology 1993 139(8) 1753-9), pJC1 (Cremer et al., Mol Gene Genet 1999 220 478-80) 또는 pCG11 (Yonetani et al., Published Only in Database 1999)으로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 pCES208 유래의 복제 제어 부위는 pCG1 복제 원점을 포함할 수 있으며, 하나의 실시예에서 orfA2에 돌연변이가 유발된 서열번호 2 내지 서열번호 8로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 변이된 pCG1 복제 원점을 포함할 수 있다. 이와 같이 orfA2에 돌연변이가 유발된 pCG1 복제 원점을 포함하는 개량된 플라스미드를 본 출원의 발명자들은 "pHCP"로 명명하였다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 변형 플라스미드에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 "재조합 벡터"는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다
본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 리보좀 결합부위, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(enhancer) 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다.
상기 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택성 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선택성 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다.
또한, 상기 벡터가 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 또는 YAC(Yeast Artificial Chromosome) 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있으나, 다만 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.
본 발명에서 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 일 양태로, (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 포함할 수 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터들은 여러 개의 제한효소 절단부위를 모아놓은 멀티클로닝사이트(MCS)를 포함할 수 있으며, 이들은 lacZ 유전자 내에 위치할 수 있다. 멀티클로닝사이트는 lacZ 유전자의 리딩 프레임(reading frame)을 파괴하지 않으므로 적당한 숙주세포에서는 lacZ의 발현이 이루어져 생물학적 활성을 지닌 베타-갈락토시다제 효소를 합성해낸다. 숙주세포를 무색 화학물질인 X-gal을 포함하는 배지에서 배양하면 이 효소에 의해서 X-gal이 분해되어 불용성의 청색물질을 만들게 된다. 그러므로 MCS에 외래 DNA의 삽입이 이루어지지 않은 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포 콜로니는 청색을 띈다. 반대로 MCS에 외래 DNA가 삽입되면 플라스미드 벡터의 lacZ 리딩 프레임이 깨지면서 베타-갈락토시다제가 만들어지지 않고 그 결과 무색의 숙주세포 콜로니가 형성된다.
상기 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성할 수 있다. 본 발명에서 "형질전환"은 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포로 도입하여 폴리뉴클레오타이드가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.
형질전환을 위해 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개 형질전환 방법 등이 고려될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이를 바탕으로, 본 발명은 다른 관점에서 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다. 상기 재조합 미생물은 예를 들어 원핵세포일 수 있다.
상기 원핵세포는 예를 들어, E.coli 균주 DH5a, E.coli 균주 JM101, E.coli K12 균주 294, E.coli 균주 W3110, E.coli 균주 X1776, E.coli XL-1Blue(Stratagene) 및 E.coli B, 코리레박테리움 속 균주일 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 균주는 예를 들어 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스 일 수 있으며, 바람직하게 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현시키는 단계; 및 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 생산방법에 관한 것이다.
하나의 실시예에서, 상기 재조합 미생물이 코리네박테리움 속 미생물인 경우 당업계에 널리진 알려져 있는 코리네박테리움 속 미생물의 배양 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양방법의 예에는, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 예를 들어, 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양배지에 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 그 외에, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 경우에 따라서, 배지에 위 기술된 물질의 전구체가 포함될 수 있다. 기술된 물질들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
경우에 따라서, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃일 수 있다.
본 발명에서 목적단백질은 미생물로부터 분비 발현시키거나, 미생물을 이용하여 대량으로 생산하고자 하는 단백질 또는 산물을 의미하며, 예를 들어 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인 경우 포자를 형성하지 않는 그람 양성균으로 그람 양성균의 특성으로 인한 용이한 단백질 분비 생산에서 유리한 장점을 보유하고 있다.
상기 목적단백질은 의약, 산업 및 연구에 사용 가능한 유용 단백질로, 예를 들어 효소, 항체, 백신 또는 소재 단백질 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 재조합 벡터를 이용하여 미생물로부터 배양 및 생산한 결과, 엔도자일란네이즈의 생산량이 증대될 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 재조합 벡터를 이용하여 미생물로부터 배양 및 생산한 결과, 바이오플라스틱 생산 효소인 PhaA, PhaB, PhaC 효소 또는 γ-Aminobutyric acid를 생산하는 효소인 gadB 효소의 생산량이 증대될 수 있음을 확인하였다.
상기 재조합 미생물의 배양액으로부터 목적단백질의 회수는 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 세포 또는 배양 배지로부터 목적단백질을 분리해내는 것일 수 있다. 회수 방법의 예로서, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해, 크로마토그래피(예를 들면, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성, 소수성, 크기배제 또는 HPLC) 등의 방법이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 이러한 실시예는 예시의 목적일 뿐 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님은 당업자에 자명하다.
실시예 1: 형광 유세포 분리기를 통한 신호단백질 난발현 세포의 스크리닝
높은 카피 수를 지니는 플라스미드를 스크리닝하기 위해서 본 발명에서는 형광 유세포 분리기를 이용하였다. 형광 단백질을 발현하는 야생형 pCES-H36-GFP를 지닌 코리네박테리움 글루타미쿰을 Brain-heart infusion (BHI) medium 에서 30 oC에서 24시간 배양한 이후 유세포 형광분리기를 통해 분석 및 스크리닝을 진행하였다. 상위 10%의 형광 세기를 가진 세포를 구분하여 수득하여 새로운 BHI medium에 접종하여 키운 후 다시 계속 키워서 스크리닝을 반복 진행하였다. 총 7번의 스크리닝 결과 기존 야생형 대비 최대 4배의 형광세기가 증가한 세포를 얻을 수 있었다. 이를 바탕으로 플라스미드를 분석 진행하였다.
실시예 2: 발굴된 플라스미드 분석
야생형의 세포로부터 수득한 플라스미드를 Ori라고 명명하였고 7th번째 스크리닝 이후로 얻은 플라스미드를 7th라고 명명하였다. 이후 플라스미드를 제한 효소 BamHI 처리 후 DNA 전기영동을 진행하였다. 같은 양의 세포로부터 수득하였는데 야생형 대비 더 높은 농도의 플라스미드를 확인할 수 있었다. 이는 더 높은 카피 수를 가지고 있다는 것을 의미한다.
얻은 플라스미드의 서열 분석을 통해 특이적인 돌연변이를 찾고자 시도하였다. 서열 분석 결과 표 1의 결과를 얻을 수 있었다. pCES208 플라스미드의 복제에 관련된 영역에 존재하는 orfA2에만 돌연변이가 존재함을 확인하였고 이들 모든 돌연변이는 실질적으로 orfA2를 발현 못하는 것으로 귀결되었다. 이를 바탕으로 새로운 개량된 플라스미드를 제작하였다. orfA2에만 돌연변이를 줄 수 있도록 21번째 뉴클레오타이드를 G에서 T로만 변이를 주었다. 개량된 플라스미드를 pHCP로 명명하고 pHCP-H36-GFP를 제작하여 형광 분석을 하였다.
[표 1]
Figure 112017013117117-pat00001
pHCP 중 위 표 1에서 i) 클론 번호 1(clone number 1)의 변이, ii) 클론 번호 13, 24 및 29의 변이, iii) 클론 번호 7의 변이, iv) 클론 번호 8의 변이, v) 클론 번호 23의 변이, vi) 클론 번호 26의 변이 및 vii) 클론 번호 30의 변이를 포함하여 orfA2에 변이가 유발된 pCG1 복제 원점을 각각 서열번호 2 내지 서열번호 8에 나타내었다.
실시예 3: 개량된 플라스미드에서 형광단백질 발현 확인
개량된 플라스미드에서의 형광단백질 생산량을 확인하였다. 먼저 높은 카피수의 플라스미드가 세포 생장에 악영향을 줄 수 있기 때문에 영양분이 충분한 media와 영양분이 최소화된 media에서 배양하였다 (도 4a). 야생형 대비 개량된 플라스미드를 지닌 세포가 생장 속도가 느리지 않았다. 형광단백질 생산에 있어서도 개량된 플라스미드가 야생형 대비 증가된 형광량을 보여주었다 (도 4b). 어느 배지 조건이든 3배 이상의 형광량을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 개량된 플라스미드의 카피 수 및 안정성 확인
개량된 플라스미드의 실질적인 카피 수를 확인하기 위해 실시간 PCR을 통한 플라스미드 카피 수 정량 방법을 실시하였고 야생형 대비 11배 증가된 플라스미드 카피 수를 수득할 수 있었다 (도 5a). 이는 실질적으로 카피 수가 개량되었다는 것을 증명한다. 높은 카피 수의 플라스미드는 일반적으로 안정성이 떨어진다고 알려져 있다. 이를 확인하기 위해서 항생제가 없는 배지에서 배양을 하여 항생제가 있는 배양 조건과 비교하여 플라스미드가 유지되는 것을 확인하였다. 60 Generation 동안까지 야생형의 플라스미드 대비 계속해서 유지됨을 확인할 수 있었다 (도 5b). 이는 본 발명에서 제공하는 플라스미드가 유용함을 보여줄 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 개량된 플라스미드에서의 엔도자일란네이즈 생산
본 발명의 유용성을 높이기 위해서 유용 단백질 중에 하나인 엔도자일란네이즈를 생산하였다. 생산하기 위한 플라스미드의 경우 기존에 알려진 클로닝 방법을 사용하여 pHCP-G-XynA를 제작하였다. 기존에 제작했던 야생형 pCES208 기반의 pCG-G-XynA (Yim, Sung Sun, et al. Biotechnology and bioengineering 113.1 (2016): 163-172)과의 생산량 비교를 하였다. 세포 내의 단백질 발현을 확인하였을 때 야생형 대비 많은 발현양이 확인되었다 (도 6a). 분비 생산된 발현양 역시 기존 대비 많은 양이 확인되었다 (도 6b). 실제 효소 활성양도 기존 대비 4배 이상 증가되었다(야생형: 4.52 ± 0.98 U/mL, 개량된 플라스미드: 45.6 ± 5.0 U/mL).
실시예 6. 개량된 플라스미드 기반 발효조건에서 엔도자일란네이즈 고배양 생산
높은 카피 수를 가진 플라스미드가 고배양 조건에서도 제대로 작동하는지를 확인하기 위해서 고배양 조건인 유가배양을 진행하였다. 최종 세포 성장 농도도 상당히 높은 OD600 300을 달성하였고 엔도자일란네이즈 생산량 역시 1543 mg/L를 달성하였다 (도 7a). 이는 기존 논문이나 발명을 비교해서 가장 높은 생산량을 기록하였다. 또한 SDS-PAGE를 통한 단백질 분석에 있어서 많은 생산량을 보여주고 있다 (도 7b).
실시예 7. 개량된 플라스미드에서 다양한 효소 생산
엔도자일란네이즈 뿐만 아니라 다른 다양한 효소 생산에도 적용될 수 있는지를 확인하기위해 개량된 플라스미드에서 바이오 플라스틱을 생산하는 효소와 중요한 화학물 중에 하나인 γ-Aminobutyric acid을 생산하는 효소를 발현하였다. 기존에 제적했던 야생형 pCES208 기반의 바이오 플라스미드 생산 플라스미드 pCES-H36-PhaCAB (Choi, Jae Woong, et al. "Enhanced production of recombinant proteins with Corynebacterium glutamicum by deletion of insertion sequences (IS elements)." Microbial cell factories 14.1 (2015): 207.)와 개량된 플라스미드로 전환한 pHCP-H36-PhaCAB를 비교하였다. 발현결과 야생형 대비 많은 단백질이 개량된 플라스미드에서 생산되었다 (도 8a). γ-Aminobutyric acid 생산에서도 역시 야생형 기반 pHGmut (Choi, Jae Woong, et al. "Enhanced production of gamma-aminobutyrate (GABA) in recombinant Corynebacterium glutamicum by expressing glutamate decarboxylase active in expanded pH range." Microbial cell factories 14.1 (2015): 21.)을 개량된 플라스미드에서 제작한 pHCP-Gmut와 비교하였을 때 많은 GadB 발현양이 확인되었다 (도 8b).
구체적 구성을 참조하여 본 발명을 상세하게 기재하였으나, 이러한 기재는 바람직한 구현예에 관한 것이고, 발명의 범위를 제한하지 않음은 당업자에 자명한 것이다. 이에, 본 발명의 실질적 범위는 출원된 청구항 및 그 등가물에 의해 정의된다 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute Of Science And Technology <120> Modified Plasmid Having Enhanced Copy Number and Uses Thereof <130> 008 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> orfA2 <400> 1 gtggaggatc gaatcagttg cgcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 cgaggacggc gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctggaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402 <210> 2 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pCG1 <400> 2 gtggaggatc gaatcagttg agcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 cgaggacggc gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctggaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402 <210> 3 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pCG1 <400> 3 gtggaggatc gaatcagttg cgcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 cgaggacggc gcgcaaaata ttgatcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctggaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402 <210> 4 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pCG1 <400> 4 gtggaggatc gaatcagttg cgcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 cgaggacggc gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctgtaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402 <210> 5 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pCG1 <400> 5 gtggaggatc gaatcagttg cgcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 cgaggacggc gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctgtaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402 <210> 6 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pCG1 <400> 6 gtgtaggatc gaatcagttg cgcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 cgaggacggc gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctggaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402 <210> 7 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pCG1 <400> 7 gtggaggatc gaatcagttg cgcctactgc ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 tgaggacggc gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctggaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402 <210> 8 <211> 402 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pCG1 <400> 8 gtggaggatc gaatcagttg cgcctactga ggtggcctga ttcctccccg gcctgacccg 60 cgaggacggc gcgcaaaata ttgctcagat gcgtgtcgtg ccgcagccag ccgcgagcgc 120 gccaacaaac gccacgccga ggagctggag gcggctaggt cgcaaatggc gctggaagtg 180 cgtcccccga gcgaaatttt ggccatggtc gtcacagagc tggaagcggc agcgagaatt 240 atccgcgatc gtggcgcggt gcccgcaggc atgacaaaca tcgtaaatgc cgcgtttcgt 300 gtggccgtgg ccgcccagga cgtgtcagcg ccgccaccac ctgcaccgaa tcggcagcag 360 cgtcgcgcgt cgaaaaagcg cacaggcggc aagaagcgat aa 402

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 orfA2 전체가 결실되거나, 서열번호 1의 orfA2가 미발현 또는 저발현 되도록 서열번호 1 중 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실 또는 치환된, 높은 카피 수를 가지는 pCES208 유래 변형 플라스미드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 중 5'에서 3' 방향으로 4 내지 21번째, 30 내지 61번째 또는 84 내지 175번째 뉴클레오티드가 종결코돈으로 치환된 것을 특징으로 하는 변형 플라스미드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 중 5'에서 3' 방향으로 다음으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 플라스미드:
    21번째, 30번째, 또는 84번째 뉴클레오티드가 A (아데닌)으로 치환; 및
    4번째, 61번째 또는 175번째 뉴클레오티드가 T (티민)으로 치환.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 2 내지 4 및 서열번호 6 내지 8로 구성된 군에서 선택된 어느 하나의 변이된 pCG1 복제 원점을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형 플라스미드.
  6. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 변형 플라스미드에 목적단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 재조합 벡터.
  7. 제6항에 따른 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 코리네박테리움 속 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  10. 제7항의 재조합 미생물을 배양하여 목적단백질을 발현시키는 단계; 및
    상기 발현된 목적단백질을 회수하는 단계를 포함하는 목적단백질의 생산방법.
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