KR101939398B1 - 엘-아라비노스 기반 엘-리불로스 및 엘-리보스의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엘-아라비노스 기반의 엘-리보스 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 아라비노스를 포함한 배지에서 아라비노스로부터 엘-리보스 생산경로가 도입된 제1미생물을 배양하여 엘-리보스를 생성시키는 단계; 상기 배양 배지에서 제1미생물을 제거한 다음, 엘-리불로스 대사경로가 도입되어 있는 제2미생물을 접종하고 배양하여, 엘-아라비노스 및 엘-리불로스를 소모시킨 다음, 생성된 엘-리보스를 회수하는 단계를 포함하고 있다.
본 발명에 따른 엘-리보스 생산방법은 엘-리보스를 제외한 모든 당류를 대사에 사용하여 제거하므로, 발효산물에서 고순도의 엘-리보스를 생산할 수 있는 효과가 있으며, 상기 생산된 리보스는 다양한 엘-형태 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있어 유용하다.

Description

엘-아라비노스 기반 엘-리불로스 및 엘-리보스의 제조 방법{Preparing L-ribose and L-ribulose based on L-Arabinose}

본 발명은 엘-리보스(L-ribose) 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 (a) 탄소원으로 엘-아라비노스(L-arabinose)를 함유하는 배양 배지에서, 엘-리불로스(L-ribulose) 및 엘-리보스(L-ribose) 생산경로가 도입된 제1미생물을 배양하여 엘-리불로스 및 엘-리보스를 생성하는 단계; (b) 상기 배양 배지에서 상기 제1미생물을 제거한 다음, 엘-리불로스 대사경로가 도입된 제2미생물을 접종하고 배양하여, 엘-아라비노스 및 엘-리불로스를 소모시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 엘-리보스를 회수하는 단계를 포함하는 엘-리보스(L-ribose)의 고순도 생산방법에 관한 것이다.

엘-리보스(L-ribose)는 많은 엘-형태의 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 항바이러스제인 메틸-엘-리보플라노사이드(methyl-L-riboflanoside; "Bezimidavir"TM) 등의 합성에 사용되어 엘-리보스 및 그 유도체의 세계시장은 2001년 약 11억불이었고, 최근에는 새로운 항포진제(Antiherpes)로 개발되고 있는 BW1263W(Glaxo Wellcome)와 비(B)형간염 치료제로 개발되고 있는 L-FMAU(Bukwang & Triangle) 등의 핵심중간체로서 그 수요가 급증하고 있어, 산업적으로 이용 가능한 그의 제조방법을 개발하는 것은 동분야 많은 연구진들의 관심의 대상이다.

엘-리보스는 주로 엘-아라비노스, 엘-자일로스, 디-글루코스, 디-갈락토스, 디-리보스 또는 디-만노-1,4-락톤으로부터 화학 합성법으로 생산되어 왔다(Akagi, M., et al., Chem. Pharm. Bull.(Tokyo) 50:866, 2002; Takahashi, H., et al., Org. Lett. 4:2401, 2002; Yun, M., et al., Tetrahedron Lett. 46:5903, 2005). 그러나 화학적 합성 방법은 그 생산 과정에 있어 여러 가지 심각한 문제점을 가진다. 실제로 고온 및 고압을 요구하는 작업 환경상의 위험성, 화학 반응 후 부가적인 당류의 생성으로 인한 복잡한 엘-리보스의 분리 및 정제 과정 그리고 이 과정에서 생성되는 화학적 폐기물로 인한 환경오염 문제 등이 유발되고 있다.

상기와 같은 단점을 극복하기 위하여, 엘-리보스의 생물학적인 생산 방법을 연구한 바가 다음과 같이 있었다.구체적으로 클리비지엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia) 유래 아라비노스 이성화 효소, 슈도모나스 슈체리(Pseudomonas stutzeri) 유래 람노스 이성화 효소 (L-rhamnose isomerase), 스트렙토마이세스 루비지노시스(Streptomyces rubiginosus) 유래 자일로스 이성화 효소 (D-xylose isomease) 및 락토코코스 락티스(Lactococcus lactis) 유래 갈락토스-6-인산 이성화 효소 (galactose-6-phosphate isomerase)는 광범위한 기질 특이성을 지니고 있어서 엘-리불로스를 엘-리보스로 전환시킬 수 있지만 그 전환속도는 매우 느리다.

또한, 생촉매(Enzymatic)법을 이용한 공정의 경우 고순도의 기질이 요구되며 (효소의 broad 기질 특이성으로 인해), 소규모, 효소의 불안정성 (고정화 효소도 L-당 생산 효소의 경우 2-3일 안에 50% 이상 활성 손실)의 단점이 있으며 화학합성의 경우 고순도 기질을 사용해도 L-입체특이성 확보 어려우며, 그로 인해 정제 비용 상승하여 산물이 고가가 되는 단점이 있다.

이에 비해, 발효법을 이용한 공정은 저순도의 값싼 기질(바이오매스 가수분해물)을 출발기질로 이용가능하며 기본적으로 세포내 효소에 의한 전환이므로 L-입체 특이성 확보가 용이하고, 이온 교환수지를 통한 경제적 정제법으로 산물을 저가로 확보가 가능할 뿐만 아니라, 발효공정은 상온 상압의 안전한 공정인 장점이 있다.

따라서 고가의 오탄당 L-희소당을 바이오매스 산가수분해물을 정제 없이 직접 사용하여 저가의 기질(L-arabinose, D-xylose 혹은 xylitol, arabitol 등의 당알콜)로부터 고수율 발효법에 의해 L-희소당을 생산할 수 있는 당전환 원천기술의 확보는 향후 L-희소당 생산 과제의 핵심이 될 것으로 예상되고 있다.

특히 L-nucleoside 기반 의약품의 원료인 L-ribose는 발효법에 의해 kg 당 500불 이하에 공급 시 환경 친화적임은 물론 현재 kg당 2,000불에 공급하고 있는 화학적 제법 공정과 충분한 가격 경쟁력을 보유할 수 있을 것으로 예상되는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 엘-리보스 생합성 경로를 가진 미생물을 이용하여 아라비노스로부터 엘-리보스를 생산하고, 엘-리불로스 대사경로를 가진 다른 미생물을 이용하여 엘-리보스 이외의 부산물을 제거할 경우, 고순도의 엘-리보스를 생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 배경기술 부분에 기재된 상기 정보는 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것이며, 이에 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 있어 이미 알려진 선행기술을 형성하는 정보를 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 엘-리보스 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 엘-아라비노스로부터 엘-리보스 생합성 경로가 도입된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 엘-리불로스 대사경로가 도입된 재조합 미생물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 탄소원으로 엘-아라비노스(L-arabinose)를 함유하는 배양 배지에서, 엘-리불로스(L-ribulose) 및 엘-리보스(L-ribose) 생산경로가 도입된 제1미생물을 배양하여 엘-리불로스 및 엘-리보스를 생성하는 단계; (b) 상기 배양 배지에서 상기 제1미생물을 제거한 다음, 엘-리불로스 대사경로가 도입된 제2미생물을 접종하고 배양하여, 엘-아라비노스 및 엘-리불로스를 소모시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 엘-리보스를 회수하는 단계를 포함하는 엘-리보스(L-ribose)의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 아라비노스 대사능을 가지는 캔디다 속 균주를 제공한다.

본 발명은 또한, 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자, 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 및 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 리불로스 대사능을 가지는 캔디다 속 균주를 제공한다.

본 발명에 따른 엘-리보스 제조 방법은 엘-리보스를 제외한 모든 당류를 대사에 사용하여 제거하므로, 발효산물에서 고순도의 엘-리보스를 제조할 수 있는 효과가 있으며, 상기 생산된 리보스는 다양한 엘-형태 핵산당 의약품들의 합성 시작물질로서 의약품 등의 제조 시 유용하게 사용될 수 있어 유용하다.

도 1은 본 발명에서 도입한 아바리노스로부터 엘-리보스 대사경로를 타나낸 개략도이다.
도 2는 본 발명의 엘-리보스 제조 방법을 나타낸 개략도이다.
도 3의 A는 STP2 유전자(도입된 위치 그림 설명 요망), 23K AraA 및 RI 유전자를 도입하는 유전자 발현 카세트의 개념도이며, B는 도입된 유전자를 확인한 PCR 결과로서, Control은 대조군으로, STP2, 23K AraA, RI PCR 결과 band가 나타나지 않아, 유전자가 없음을 확인한 결과이며, Confirm은 실험군으로, transformation 실험을 통해, STP2, 23K AraA, RI PCR 결과 올바른 위치에 band가 나타나, 유전자가 잘 도입되었음을 확인한 결과이다.
도 4의 A는 STP2 유전자, AraA , AraB 및 AraD 유전자를 도입하는 유전자 발현 카세트의 개념도이며, B는 도입된 유전자를 확인한 결과이다.
도 5는 Candida tropicalis 균주에서 STP2 유전자 및 23K AraA 유전자, RI 유전자가 도입된 균주를 아라비노스를 포함하는 배지에서 배양하여 엘-리보스의 생산량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6의 (A)는 본 발명의 2단계 공정에 의해 생산되는 엘-리보스의 양을 배지 내에서 측정한 결과를 나타낸 그래프이며, (B)는 각 배양단계 별 샘플의 액체 크로마토그래피(LC) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 엘-리보스 생산경로가 도입된 미생물에서, 엘-리보스를 생산한 다음, 부산물을 2차 발효로 제거할 경우, 엘-리보스의 순도가 증가하는지 확인하고자 하였다.

본 발명에서는 캔디다 속 제1균주에 엘-아라비노스(L-arabinose)를 출발기질로 엘-리불로스(L-ribulose)를 거쳐 엘-리보스(L-ribose)를 생산할 수 있는 대사경로를 도입하여, 바이오매스 산 가수분해물로부터 엘-리보스 및 엘-리불로스를 생산한 다음, 캔디다 속 제2균주에 엘-아라비노스(L-arabinose) 및 엘-리불로스(L-ribulose) 생분해 대사경로를 도입하여, 엘-리보스를 제외한 엘-형태 부산당을 제거하는 2단계 발효공정을 수행하였다. 그 결과, 상기 2단계 발효공정을 거쳐 생산되는 엘-리보스의 순도(purity)가 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 아라비노스 대사능을 가지는 제1 Candida tropicalis 균주를 아라비노스를 탄소원으로 포함하는 배지에 배양하여 엘-리보스를 생산한 다음(도 6, A, 1^st stage), 상기 제1균주를 제거하고, 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자, 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 및 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 엘-리불로스 대사능을 가지는 제2 Candida tropicalis 균주를 상기 배양배지에 접종하여, 배양한 결과, 엘-리보스를 제외한 엘-형태 부산당이 모두 제거되어 고순도의 엘-리보스가 제조되는 것을 확인할 수 있었다(도 6, A, 2^nd stage, 도 6, B).

따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 탄소원으로 엘-아라비노스(L-arabinose)를 함유하는 배양 배지에서, 엘-리불로스(L-ribulose) 및 엘-리보스(L-ribose) 생산경로가 도입된 제1미생물을 배양하여 엘-리불로스 및 엘-리보스를 생성하는 단계; (b) 상기 배양 배지에서 상기 제1미생물을 제거한 다음, 엘-리불로스 대사경로가 도입된 제2미생물을 접종하고 배양하여, 엘-아라비노스 및 엘-리불로스를 소모시키는 단계; 및 (c) 상기 생성된 엘-리보스를 회수하는 단계를 포함하는 엘-리보스(L-ribose)의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 미생물은 아라비노스로부터 엘-리보스를 생산할 수 있는 대사경로가 도입된 미생물이면 모두 이용가능하며, 바람직하게는 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 제2미생물은 아라비노스 및 엘-리불로스 생분해 대사경로가 도입된 미생물이면 모두 이용가능하며, 바람직하게는 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자, 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 및 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 제1미생물 및 제2미생물은 발효를 할 수 있는 미생물이면 모두 이용가능하며, 바람직하게는 캔디다 속(Candida) 균주일 수 있고, 더욱 바람직하게는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 미생물의 배양과정은 통상적으로 알려진 배양방법을 사용하여 수행될 수 있고, 본 발명의 실시예에서 사용된 특정 배지 및 특정 배양방법 이외에도 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용할 수 있고, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용할 수 있다(Lee et al., Bioprocess Biosyst . Eng ., 26: 63, 2003; Lee et al., Appl . Microbiol. Biotechnol ., 58: 663, 2002; Lee et al., Biotechnol . Lett ., 25: 111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol . Biotechnol ., 54: 23, 2000; Lee et al., Biotechnol . Bioeng ., 72: 41, 2001).

아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 자일로오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으며; 인 공급원으로서 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있고; 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 리보스를 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 리보스를 수집할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서, 제1미생물을 제거하는 단계는 배양배지와 미생물을 분리하는 통상의 모든 방법이 이용가능하며, 바람직하게는 원심분리를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 제1미생물 또는 제2미생물에 도입되는 유전자는 코돈 최적화 된 것을 특징으로 할 수 있으며, 코돈 최적화는 제1미생물 또는 제2미생물이 선호하는 코돈으로 교체하는 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들어, Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)의 데이터를 이용하여 각각의 유전자의 코돈을 교체할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 도입되는 유전자는 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)의 프로모터와 선별마커인 URA3 유전자, 선별마커의 제거을 위한 반복서열(glu 또는 arg 유전자)을 포함하는 카세트에 클로닝하여, 미생물에 도입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 유전자 도입 방법은 모두 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자는 stp2인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 AraA인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자 RI인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 AraB인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자 AraD인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 아라비노스 대사능을 가지는 캔디다 속 (Candida) 균주에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자, 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 및 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 리불로스 대사능을 가지는 캔디다 속 (Candida) 균주에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 캔디다 속 (Candida) 균주는 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있고, 대한민국 특허 제10-124678호에 개시된 방법도 적용 가능하며, 바람직하게는 상동 재조합을 통해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자는 STP2인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 AraA인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자 RI인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 AraB인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자 AraD인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 글리세알데히드 -3-인산 탈수소효소의 프로모터와 터미네이터 서열 클로닝

캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)의 글리세알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 프로모터와 터미네이터를 클로닝하기 위해, 캔디다 트로피칼리스 유전체 DNA와 하기의 프라이머쌍을 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하여 1455bp의 프로모터 서열(서열번호: 1)과 309bp의 터미네이터 서열(서열번호: 2)을 확보하였다.

프로모터 PCR[94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분 30초), 72℃ 7분]:

PGAP-F(BglII): 5'-agatctaacgtggtatggttgtaagaaac-3'(서열번호: 3); 및

PGAP-R(XbaI_BamHI): 5'-ggatccgcgtctagatgtttaaattctttaattg-3'(서열번호: 4).

터미네이터 PCR[94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분), 72℃ 7분]:

TGAP-F(XbaI_Xho): 5'-tctagattgctcgagctatccaacaaactctag-3'(서열번호: 5); 및

TGAP-R(BamHI): 5'-ggatcctctggtttagaagtagggactgtatg-3'(서열번호: 6).

서열번호 1. 프로모터 서열

cagaaggtggcatattcctctgatcaggtgctttttttcggctgctgctgctcgtggtggtgtagtggtagtggtgtgtgtgcgtgtgcgtgagggaggccgctttttgctctctgactcctcccaatcagaagttgctgtagcagtgaaacaacacaatggatgataatgccccgggcggtgcgtgtccgacacaaaccactacattttttagctgggagcatactgccactacgacccacccacccatggtcaacaaaaaaattctgacaaattataaaataacccttggattcccccttggaaaaatttttggtatttctctctttcttttccttttcctttccctcttctttttccctccatcaatcaattgacgttcagtaactcaattaattacatcacatccctcaattaaagaatttaaaca

서열번호 2. 터미네이터 서열

ctatccaacaaactctaggggttgtgctttttgaaaaaaacatataggttttattgaaatagccacaatgtctgttgagaggacatttgatttgttttatattatcgtatatgtaccctggaatatattgcgttttttaacaaaagacaaacaacggtctttagtttttttttcaatcaatcaatgttcgtgatcgtagagagaaggagaaaaaaagagtaaacataaacaaacatctttctttttacaaacgagtacaagcaacagccatgtcacaagatgccatacagtccctacttctaaaccaga

실시예 2. STP2 , AraA , 23K AraA , AraB , AraD , RI 유전자 부호 최적화( codon optimization)

Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)의 데이터를 근거로 하여, 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 아라비노스 전이 단백질(arabinose transport protein), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)의 L-아라비노스 아이소머라이즈(L-arabinose isomerase; AraA), 대장균(Escherichia coli)의 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase; AraB), L-리불로스-5-포스페이트 4-에피머라이제(L-ribulose-5-phosphate 4-epimerase; AraD) 및 애시네토박터 속 균주 DL-28(Acinetobacter sp. strain DL-28)의 리보스 이성질화 효소(L-ribose isomerase, RI) 유전자 코돈을 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)가 선호하는 코돈으로 교체하여 유전자 서열번호: 7로 기재되는 염기서열 구성된 CoSTP2, 서열번호: 8로 기재되는 염기서열로 구성된 CoAraA 및 서열번호: 9로 기재되는 염기서열로 구성된 CoAraB, 서열번호: 10으로 기재되는 염기서열로 구성된 CoAraD 및 서열번호 11로 기재되는 염기서열로 구성된 CoRI를 합성였다(GENEART, 독일).

상기 유전자 결실 카세트에 개시된 유전자의 염기서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	이름	서열
7	coSTP2	cgctggtagaagatgtttgttgatggaaggtgccttgcaaatgaccgctacccaaatgaccattggtggtattttgttggctcacttgaagttggttggtccaattaccggtcacgctgttccattgatcgttttgattttgatctgtgtctacgtttccggtttcgcttggtcctggggtccattgggttggttggttccatccgaaatctacccattggaagttagaaacgctggttacttctgtgctgttgctatgaacatggtctgtacctttattatcggtcaattcttcttgtccgccttgtgtagattcagatccttgttgttcttcttcttcggtatcatgaacatcatcatgggtttgttcgtcgttttcttcttgcctgaaactaagggtgttccaattgaagaaatggctgaaaagagatggaaaacccacccaagatggaagaagtacttcaaggattag
8	CoAraA	atccatcttgcaatcccacatgttggaagttgatccatccttggcttccaacaagccaaagattatcgtttccccattgggtattggtgacagagaagatccagctagattggttttcgatggtaaggctggtgatggtgttgttgtttccatggctgatttcggtactcactacaagttgttgatcaacgaagtttccgctttcgaaccaaccgttccagctccaaacttgccagttgctagagttttgtgggaagttaagccaaacttccaagatggtgttaaggcttggttggaaaacggtggtggtcaccacactgttgtttctttgttcttgaccaccgatcaaatgattacctacgctaagttggtcgacttggaatacgttgttatcaagtaa
9	CoAraB	cgcttggtttggtagagttttgggttggccattggaacaattggctgctcaacacccagaattgaaaactcaaatcaacgcttcccaaaagcaattgttgccagctttgaccgaagcttgggctaagaacccatccttggatcacttgccagttgttttggattggttcaacggtagaagaaccccaaacgctaatcaaagattgaagggtgttatcaccgacttgaacttggctaccgatgctccattgttgttcggtggtttgattgctgctactgctttcggtgctagagctattatggaatgtttcaccgatcaaggtatcgctgtcaacaacgttatggctttgggtggtattgccagaaagaatcaagttatcatgcaagcttgttgtgacgtcttgaacagaccattgcaaatcgttgcttccgatcaatgttgtgctttgggtgctgctattttcgctgctgttgctgctaaggttcacgctgacattccatccgctcaacaaaagatggcttccgctgttgaaaagaccttgcaaccatgttccgaacaagctcaaagattcgaacaattgtatagaagataccaacaatgggctatgtccgctgaacaacactacttgccaacctccgctccagctcaagctgctcaagccgttgctaccttgtaa
10	CoAraD	atgttggaagatttgaagagacaagtcttggaagctaacttggctttgccaaagcacaacttggttaccttgacctggggtaacgtttccgctgttgatagagaaagaggtgttttcgttattaagccatccggtgttgattactccgttatgaccgctgatgatatggttgttgtttccattgaaaccggtgaagttgttgaaggtactaagaagccatcctccgataccccaacccacagattgttgtaccaagctttcccatccattggtggtatcgttcacacccactccagacacgctaccatttgggctcaagctggtcaatccattccagctaccggtactacccacgctgattacttctacggtactattccatgtaccagaaagatgaccgatgctgaaatcaacggtgaatacgaatgggaaaccggtaacgttatcgttgaaaccttcgaaaagcaaggtattgatgctgctcaaatgccaggtgttttggttcactcccacggtccattcgcttggggtaagaacgctgaagatgctgttcacaacgctatcgttttggaagaagttgcttacatgggtattttctgtagacaattggctccacaattgccagatatgcaacaaaccttgttggataagcactacttgagaaagcacggtgctaaggcttactacggtcaataa
11	CoRI	atgaccagaacctccatcactagaagagaatacgatgaatgggttagagaagctgctgctttgggtaaggctttgagatacccaattaccgaaaagatggtcaacgattccgctggtatcgttttcggtgctgatcaatacgatgctttcaagaacggtatgtggtccggtgaaccatacgaagctatgattattttcgaatccttgaacgaaccagctgttgatggtttgccaaccggtgctgctccatacgctgaatactccggtttgtgtgataagttgatgatcgttcacccaggtaagttctgtccaccacaccaccacggtagaaagaccgaatcctacgaagttgttttgggtgaaatggaagttttctactccccaaccccatccgctgaatccggtgttgaattgttgaacttctccggtatgccagttggttccccatggccagaaggtgttgctttgccaaagggtagagaatcctcctacgaaaagttgacctcctacgttagattgagagctggtgatccaaagttcgttatgcacagaaagcacttgcacgctttcagatgtccaccagattccgatgttccattggttgttagagaagtttccacctactcccacgaaccaaccgaagctgctgccggtaaccacgctccaattccatcctggttgggtatgcacgataacgatttcgtttccgatgctgctaacaccggtagattgcaaaccgctatttcctag
12	23K AraA	agctattttgggttcccacatgttggaagttgatccatccattgcttccgataagccaagagttgaagttcacccattggatattggtgataaggatgatccagctagattggttttcaccggtatgcaaggtgatgctgttgatgttaccatggctgattacggtgatgaattcaagttgatgtcctacgatgttagaggtaacaagccagaagctgataccccacacttgccagttgctaagcaattgtggaccccaaagcaaggtttgagagaaggtgctgttggttggttgaccgttggtggtggtcaccacaccgttttgtccttcgctgttgattccgaacaattgcaagatttgtcccacttgttcgatttgacctacgttaacatcaagtag

실시예 3: CoSTP2, CoAraA, 23K AraA , CoAraB, CoAraD 및 CoRI 발현 카세트 및 발현 균주 구축

실시예 2에서 합성한 최적화된 유전자들을 글리세롤알데히드-3-인산 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)의 프로모터와 선별마커의 제거를 위한 반복서열(glu 또는 arg 유전자)를 포함하는 카세트에 클로닝하여, XK3-CoSTP2, PAHfs-CoSTP2, PGtrpfs2-CoAraA, XK3-23K AraA, PAHfs-CoAraB, PAHfs2-CoAraD 및 XK4-CoRI를 각각 수득하였다(도 3 및 도 4).

3-1. 캔디다 트로피칼리스에서 CoSTP2, 23K AraA 및 CoRI 유전자를 발현하는 균주 구축

상기 카세트 PAHfs-CoSTP2를 야생형 캔디다 트로피칼리스 균주에 도입하여, 이를 유라실(Uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 한천가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치 배양하였다. 고체배지에서 형성된 콜로니는 카세트가 도입된 균주이며, 이를 YM 배지(포도당 20 g/L, 효모 추출물 3 g/L, 맥아 추출물 3 g/L, 펩톤 5 g/L) 4 ml에 접종하고, 12시간 동안 30℃에서 150 rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 상기 배양액을 5-FOA 고체배지(효모 질소 베이스 6.7 g/L, 포도당 20 g/L, 5-FOA 0.8 g/L, 유라실 0.1 g/L, 한천 가루 15 g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치 배양하였다.

고체배지에서 형성된 콜로니는 도입된 URA3 유전자가 제거된 균주이며, 동일한 방법으로 XK3-23K AraA, XK4-CoRI를 차례로 도입하여, CoSTP2, 23K AraA 및 CoRI를 발현하는 변이주 캔디다 트로피칼리스 K1 STP2 23K AraA RI를 제조하여 PCR로 원하는 위치에 유전자들이 도입된 것을 확인하였다.

PCR 조건은 [94℃ 30초, 30회 반복(94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 3분), 72℃ 7분]이고, 하기의 프라이머 세트를 이용하였다.

Primer 서열

XK_R : GTCTCTTCCATCTTAGCTAACATACC (서열번호 13)

RI_R : CTCGAGCTAGGAAATAGCGGTTTGC (서열번호 14)

23K AraA_R : GCTGGTGTCAACGCAGAATCGACC (서열번호 15)

HRG_R : AGATCTCCACGAACCATAAACCATTCC (서열번호 16)

STP2_R : CTCGAGCTAATCCTTGAAGTACTTCTTCCATC (서열번호 17).

그 결과, 도 3의 B에 개시된 바와 같이, XK_R-RI_R 조합을 이용하여 레인 1 및 3의 유전자 삽입을 확인하였고, XK_R-23K AraA_R 조합을 이요하여 Lane 2, 및 4의 유전자 삽입을 확인하였으며, HRG_R-STP2_R 조합을 이용하여 lane 5 및 6의 삽입을 확인할 수 있었다.

3-2. 캔디다 트로피칼리스에서 Costp2, CoAraA, CoAraB 및 CoAraD 유전자를 발현하는 균주 구축

실시예 3-1과 같은 방법으로 PGtrpfs2-CoAraA, PAHfs-CoAraB, PAHfs2-CoAraD, XK3-CoSTP2를 차례로 도입하여, CoAraA, CoAraB 및 CoAraD, CoSTP2를 발현하는 캔디다 트로피칼리스 변이 균주를 제조하여, PCR로 원하는 위치에 유전자들이 도입된 것을 확인하였다.

3-1과 같은 조건의 PCR을 이요하였으며 프라이머 서열은 하기와 같다.

Primer 서열

HRG_F : GGATCCGCATGTCTTTAGTTCTATGATG (서열번호 18)

TGAP_R : GGATCCTCTGGTTTAGAAGTAGGGACTGTATG (서열번호 19)

TRP_F : TTCGGAGACTGCACCTGTAAATCTTC (서열번호 20)

그 결과 도4의 B에 개시된 바와 같이, XK_R-STP2_R 조합을 이용항 lane 1의 유전자 삽입을 확인하였고, HRG_F-TGAP_R 조합을 이용하여 Lane 2의 유전자 삽입을 확인하였으며, HRG_R-TGAP_R 조합을 이용하여 Lane 3의 유전자 삽입을 확인하였고, TRP_F-TGAP_R조합을 이용하여 lane 4의 유전자 삽입을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 1단계 발효공정을 통한 엘-리보스 함유 발효액 생산

생산배지(아라비노스 30 g/L, 포도당 20 g/L, 효모 추출물 10 g/L, 인산이수소칼륨(KH₂PO₄) 5 g/L 및 황산마그네슘(MgSO₄7H₂O) 0.2 g/L) 50 ml에 실시예 3-1에서 제조한 균주를 접종한 후, 37시간 동안 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하였으며, 배양 개시 후 12시, 20시, 26시 및 32시에 각각 포도당 2.5 g/L씩 첨가하여 생산되는 발효산물을 측정하였다.

그 결과, 발효가 진행됨에 따라, 아라비노스의 농도가 감소하고, 리불로스 및 리보스가 생산되는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

실시예 5: 2단계 발효공정에 의한 고순도 리보스 생산 확인

실시예 4의 배양액에서 L-arabinose:L-ribulose:L-ribose가 7:1:2의 비율로 생산되는 것을 확인한 다음(도 6 A, 1^st stage), 원심분리하여(조건 개시요망) 균주를 제거하고 배양배지를 회수하였다.

상기 배양배지에 실시예 3-2에서 제조한 균주를 접종한 다음, 동일한 조건에서 배양하여, 엘-아라비노스 및 엘-리불로스는 소모되고, 엘-리보스(L-ribose)만 생산되는 것을 액체 크로마토그래피를 통해 확인하였다(도 6, B).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Preparing L-ribose based on L-Arabinose <130> P16-B273 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_Promoter <400> 1 aacgtggtat ggttgtaaga aacatattgc aactggagat agcgatcgtt caatttattc 60 cgattttgtg ggggaagtcg cccgctggtg ggcgtgcgcg aatggcaaaa gaaactcgac 120 catgcttttc atcatccctt aacagagcaa tcatatttta aacgttcaag caaaaagaaa 180 cgttggtttc ggctaatgat cacctgaaag gcaaaatcct tccatgtatg aacatgtagg 240 ttattccttt tttttgcaac accctcgggc agttgttcat attcccggaa aacaccacca 300 ctcggggcta agtggaagtt ctacaatccc ggggaaataa ggagccccgg tgagcacgcg 360 cacacaccac cttcacttca ttttgtccga gggaagcagc acgtgaagtc ggaacacgag 420 aggagcattt cttctatttt tttcttctct actgtgagtg catgattata tatgtaatca 480 aaagcgatca acttatggta gggtcgtgca cggcgcaccg ggttccaaaa tgatctgtga 540 gggacaaaat tctttttttt ttccagcatg ccgctggtgg caaataccgt ggtggtatga 600 tgcaccctat gccattgatt cacaccacca ccattaatca acaattgaga gaggacaaaa 660 gtgaactatt ggtggtcgtc aggttatact cgtcagcttc ggaatattac gtcccttcag 720 tttgtgaaat gtcatcctgg cgatgttcga gagagatcag tccgagagcg cgtggtagga 780 gaaacggagc actgcagcaa caaaaaaaaa atccaaaccc aggggggagg aagaagaaca 840 gccagggaaa ttgttcaccg acctgaccgt aaatttgctg ctgaaagaaa cgtgtcaaac 900 aagaccaatt ggctcaattg accctgaggg agtactttgt ctgccaccaa tgcttccacc 960 aaaacgctac ttttgttttg caatcggatg gtgtgggtct ggggtccacc tgttttgtta 1020 agctacagaa ggtggcatat tcctctgatc aggtgctttt tttcggctgc tgctgctcgt 1080 ggtggtgtag tggtagtggt gtgtgtgcgt gtgcgtgagg gaggccgctt tttgctctct 1140 gactcctccc aatcagaagt tgctgtagca gtgaaacaac acaatggatg ataatgcccc 1200 gggcggtgcg tgtccgacac aaaccactac attttttagc tgggagcata ctgccactac 1260 gacccaccca cccatggtca acaaaaaaat tctgacaaat tataaaataa cccttggatt 1320 cccccttgga aaaatttttg gtatttctct ctttcttttc cttttccttt ccctcttctt 1380 tttccctcca tcaatcaatt gacgttcagt aactcaatta attacatcac atccctcaat 1440 taaagaattt aaaca 1455 <210> 2 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_Terminator <400> 2 ctatccaaca aactctaggg gttgtgcttt ttgaaaaaaa catataggtt ttattgaaat 60 agccacaatg tctgttgaga ggacatttga tttgttttat attatcgtat atgtaccctg 120 gaatatattg cgttttttaa caaaagacaa acaacggtct ttagtttttt tttcaatcaa 180 tcaatgttcg tgatcgtaga gagaaggaga aaaaaagagt aaacataaac aaacatcttt 240 ctttttacaa acgagtacaa gcaacagcca tgtcacaaga tgccatacag tccctacttc 300 taaaccaga 309 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGAP-F(BglII) <400> 3 agatctaacg tggtatggtt gtaagaaac 29 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGAP-R(XbaI_BamHI) <400> 4 ggatccgcgt ctagatgttt aaattcttta attg 34 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGAP-F(XbaI_Xho) <400> 5 tctagattgc tcgagctatc caacaaactc tag 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGAP-R(BamHI) <400> 6 ggatcctctg gtttagaagt agggactgta tg 32 <210> 7 <211> 1497 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> costp2 <400> 7 atggctgttg gttccatgaa cgttgaagaa ggtactaagg ctttcccagc taagttgact 60 ggtcaagttt tcttgtgttg tgttattgct gctgttggtg gtttgatgtt cggttacgat 120 attggtattt ccggtggtgt tacctccatg gatactttct tgttggattt cttcccacac 180 gtctacgaaa agaagcacag agttcacgaa aacaactact gtaaattcga cgaccaattg 240 ttgcaattgt tcacctcttc cttgtacttg gctggtattt tcgcttcctt catttcatcc 300 tacgtttcca gagctttcgg tagaaagcca accattatgt tggcttctat cttcttcttg 360 gttggtgcta ttttgaactt gtccgctcaa gaattgggta tgttgattgg tggtagaatc 420 ttgttgggtt tcggtattgg tttcggtaat caaaccgttc cattgttcat ttccgaaatt 480 gctccagcta gatacagagg tggtttgaac gttatgttcc aattcttgat taccatcggt 540 attttggctg cttcctacgt caactacttg acctccacct tgaagaacgg ttggagatac 600 tccttgggtg gtgctgctgt tccagctttg attttgttga ttggttcctt cttcattcac 660 gaaaccccag cttcattgat tgaaagaggt aaggacgaaa agggtaagca agttttgaga 720 aagatcagag gtatcgaaga tatcgaattg gaattcaacg aaatcaagta cgctaccgaa 780 gttgctacca aggttaagtc cccattcaaa gaattgttca ccaagtccga aaacagacca 840 ccattggttt gtggtacttt gttgcaattc ttccaacaat tcaccggtat caacgttgtt 900 atgttctacg ctccagtttt gttccaaacc atgggttccg gtgataacgc ttccttgatt 960 tccaccgttg tcaccaacgg tgtcaacgct attgctaccg ttatttcctt gttggttgtt 1020 gatttcgctg gtagaagatg tttgttgatg gaaggtgcct tgcaaatgac cgctacccaa 1080 atgaccattg gtggtatttt gttggctcac ttgaagttgg ttggtccaat taccggtcac 1140 gctgttccat tgatcgtttt gattttgatc tgtgtctacg tttccggttt cgcttggtcc 1200 tggggtccat tgggttggtt ggttccatcc gaaatctacc cattggaagt tagaaacgct 1260 ggttacttct gtgctgttgc tatgaacatg gtctgtacct ttattatcgg tcaattcttc 1320 ttgtccgcct tgtgtagatt cagatccttg ttgttcttct tcttcggtat catgaacatc 1380 atcatgggtt tgttcgtcgt tttcttcttg cctgaaacta agggtgttcc aattgaagaa 1440 atggctgaaa agagatggaa aacccaccca agatggaaga agtacttcaa ggattag 1497 <210> 8 <211> 1425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CoAraA <400> 8 atgttgacca ccggtaagaa agaattctgg ttcgttgttg gttcccaaca cttgtacggt 60 gaagaaacct tggctgaagt tagagcccac gctcaagcta tgaccgatgc tttgaacgaa 120 tccgctgttt tgccataccc attggtcttg caagatttgg ctgtcaacgc tgataagatt 180 acctccatta tgaaggaagt caactacaga gatgaagttg ctggtgttat tacctggatg 240 cacaccttct caccagctaa gatgtggatt agaggtacta agttgttgca aaagccattg 300 ttgcacttgg ctacccaatt caacgaatcc attccatggc caaccattga tatggatttc 360 atgaacttga atcaatccgc tcacggtgat agagaatacg gtttcattaa cgccagattg 420 aagaagcaaa acaaggttgt tgtcggttac tgggaaagac cagaagttca acaacaaatt 480 gctgaatgga tggatgttgc tgttgcttac aacgaatcct tcaacattaa ggttgctaga 540 ttcggtgaca acatgagaaa cgttgctgtt accgaaggtg ataagattga agctcaaatt 600 caattcggtt ggaccgttga ttacttcggt attggtgatt tggtccaata cgtcaacgct 660 gttaccgatg aagaaatcaa cagattgttc gctgaatacg ctgacttgta cgaattcgat 720 tacggtactt actccagaga agattgggaa aagtccgtta aggttcaagc ttcctacgaa 780 attgccatca agagattctt ggatgatggt ggttacaacg ctttcaccac caacttcgaa 840 gatttgtacg gtatgaagca attgccaggt ttggctgttc aaagattgat ggctcaaggt 900 tacggtttcg ctggtgaagg tgattggaaa accgctgctt tggatagatt gttgaaggtt 960 atgtccagaa atcaatccac cggtttcatg gaagattaca cctacgaatt ggctgctggt 1020 caagaatcca tcttgcaatc ccacatgttg gaagttgatc catccttggc ttccaacaag 1080 ccaaagatta tcgtttcccc attgggtatt ggtgacagag aagatccagc tagattggtt 1140 ttcgatggta aggctggtga tggtgttgtt gtttccatgg ctgatttcgg tactcactac 1200 aagttgttga tcaacgaagt ttccgctttc gaaccaaccg ttccagctcc aaacttgcca 1260 gttgctagag ttttgtggga agttaagcca aacttccaag atggtgttaa ggcttggttg 1320 gaaaacggtg gtggtcacca cactgttgtt tctttgttct tgaccaccga tcaaatgatt 1380 acctacgcta agttggtcga cttggaatac gttgttatca agtaa 1425 <210> 9 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CoAraB <400> 9 atggctatcg ccattggttt ggatttcggt tccgattccg ttagagcttt ggctgttgat 60 tgtgctaccg gtgaagaaat tgctacctcc gttgaatggt atccaagatg gcaaaagggt 120 caattctgtg atgctccaaa caatcaattc agacaccacc caagagacta cattgaatcc 180 atggaagctg ctttgaaaac cgttttggct gaattgtccg ttgaacaaag agctgctgtt 240 gttggtattg gtgttgattc caccggttcc accccagctc caattgatgc tgatggtaac 300 gttttggctt tgagaccaga attcgctgaa aacccaaacg ctatgttcgt tttgtggaag 360 gatcacaccg ctgttgaaga agctgaagaa attaccagat tgtgtcacgc tccaggtaac 420 gttgattact ccagatatat tggtggtatc tactcctccg aatggttctg ggctaaaatc 480 ttgcacgtta ccagacaaga ttccgctgtt gctcaatccg ctgcttcctg gattgaattg 540 tgtgattggg ttccagcttt gttgtccggt actaccagac cacaagatat tagaagaggt 600 agatgttccg ctggtcacaa gtccttgtgg cacgaatcct ggggtggttt gccaccagct 660 tcattcttcg atgaattgga cccaattttg aacagacact tgccatcccc attgttcacc 720 gatacctgga ccgctgatat tccagttggt actttgtgtc cagaatgggc tcaaagattg 780 ggtttgccag aatccgttgt tatttccggt ggtgctttcg attgtcacat gggtgctgtt 840 ggtgctggtg ctcaaccaaa cgctttggtt aaggttattg gtacttccac ctgtgacatt 900 ttgattgctg ataagcaatc cgttggtgaa agagctgtta agggtatttg tggtcaagtt 960 gatggttccg ttgttccagg ttttattggt ttggaagctg gtcaatccgc tttcggtgat 1020 atctacgctt ggtttggtag agttttgggt tggccattgg aacaattggc tgctcaacac 1080 ccagaattga aaactcaaat caacgcttcc caaaagcaat tgttgccagc tttgaccgaa 1140 gcttgggcta agaacccatc cttggatcac ttgccagttg ttttggattg gttcaacggt 1200 agaagaaccc caaacgctaa tcaaagattg aagggtgtta tcaccgactt gaacttggct 1260 accgatgctc cattgttgtt cggtggtttg attgctgcta ctgctttcgg tgctagagct 1320 attatggaat gtttcaccga tcaaggtatc gctgtcaaca acgttatggc tttgggtggt 1380 attgccagaa agaatcaagt tatcatgcaa gcttgttgtg acgtcttgaa cagaccattg 1440 caaatcgttg cttccgatca atgttgtgct ttgggtgctg ctattttcgc tgctgttgct 1500 gctaaggttc acgctgacat tccatccgct caacaaaaga tggcttccgc tgttgaaaag 1560 accttgcaac catgttccga acaagctcaa agattcgaac aattgtatag aagataccaa 1620 caatgggcta tgtccgctga acaacactac ttgccaacct ccgctccagc tcaagctgct 1680 caagccgttg ctaccttgta a 1701 <210> 10 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CoAraD <400> 10 atgttggaag atttgaagag acaagtcttg gaagctaact tggctttgcc aaagcacaac 60 ttggttacct tgacctgggg taacgtttcc gctgttgata gagaaagagg tgttttcgtt 120 attaagccat ccggtgttga ttactccgtt atgaccgctg atgatatggt tgttgtttcc 180 attgaaaccg gtgaagttgt tgaaggtact aagaagccat cctccgatac cccaacccac 240 agattgttgt accaagcttt cccatccatt ggtggtatcg ttcacaccca ctccagacac 300 gctaccattt gggctcaagc tggtcaatcc attccagcta ccggtactac ccacgctgat 360 tacttctacg gtactattcc atgtaccaga aagatgaccg atgctgaaat caacggtgaa 420 tacgaatggg aaaccggtaa cgttatcgtt gaaaccttcg aaaagcaagg tattgatgct 480 gctcaaatgc caggtgtttt ggttcactcc cacggtccat tcgcttgggg taagaacgct 540 gaagatgctg ttcacaacgc tatcgttttg gaagaagttg cttacatggg tattttctgt 600 agacaattgg ctccacaatt gccagatatg caacaaacct tgttggataa gcactacttg 660 agaaagcacg gtgctaaggc ttactacggt caataa 696 <210> 11 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CoRI <400> 11 atgaccagaa cctccatcac tagaagagaa tacgatgaat gggttagaga agctgctgct 60 ttgggtaagg ctttgagata cccaattacc gaaaagatgg tcaacgattc cgctggtatc 120 gttttcggtg ctgatcaata cgatgctttc aagaacggta tgtggtccgg tgaaccatac 180 gaagctatga ttattttcga atccttgaac gaaccagctg ttgatggttt gccaaccggt 240 gctgctccat acgctgaata ctccggtttg tgtgataagt tgatgatcgt tcacccaggt 300 aagttctgtc caccacacca ccacggtaga aagaccgaat cctacgaagt tgttttgggt 360 gaaatggaag ttttctactc cccaacccca tccgctgaat ccggtgttga attgttgaac 420 ttctccggta tgccagttgg ttccccatgg ccagaaggtg ttgctttgcc aaagggtaga 480 gaatcctcct acgaaaagtt gacctcctac gttagattga gagctggtga tccaaagttc 540 gttatgcaca gaaagcactt gcacgctttc agatgtccac cagattccga tgttccattg 600 gttgttagag aagtttccac ctactcccac gaaccaaccg aagctgctgc cggtaaccac 660 gctccaattc catcctggtt gggtatgcac gataacgatt tcgtttccga tgctgctaac 720 accggtagat tgcaaaccgc tatttcctag 750 <210> 12 <211> 1425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23K_AraA <400> 12 atgttgaaca ccgaaaacta cgaattctgg ttcgttaccg gttcccaatc cttgtacggt 60 gaagaaacct tgagatccgt tgaaaaggat gctaaagaaa tcgtcgaaaa gttgaacgct 120 tcccaccaat tgccataccc aatcgttttc aagttggttg ctaccaccgc tgataacatt 180 accaaggtta tgaaggaagc taactacaac gatcacgttg ctggtgttat tacctggatg 240 cacaccttct caccagctaa gaactggatt agaggtacta agttgttgca aaagccattg 300 ttgcacttgg ctacccaatt cttgaacaag attccatacg ataccatcga cttcgactac 360 atgaacttga atcaatccgc tcacggtgat agagaatacg ctttcattaa cgctagattg 420 agaaagaaca acaagatcat ttccggttac tggggtgatg aagatgttca aaaggctatg 480 gctaagtgga tggatgttgc tgttgcttac aacgaatcct tcaagattaa ggttgttacc 540 ttcgctgaca agatgagaaa cgttgctgtt accgatggtg ataaggttga agctcaaatc 600 aagttcggtt ggaccgttga ttactggggt gttggtgatt tggttgctga agttaacgct 660 gtttccgaag ctgatattga tgctaagtac gctgacttgc aaaaagaata cgatttcgtc 720 gaaggtcaaa acaccccaga aaagttcgaa cacaacgtta agtaccaaat cagagaatac 780 ttcggtttga agaaattcat ggacgataga ggttacaccg ctttcaccac caacttcgaa 840 gatttggttg gtttggaaca attgccaggt ttggctgctc aattgttgat ggctgaaggt 900 tacggtttcg ctggtgaagg tgattggaaa accgctgctt tggatagatt gttgaagatt 960 atggctcaca acgaaaagac cgttttcatg gaagattaca ccttggattt gagacaaggt 1020 cacgaagcta ttttgggttc ccacatgttg gaagttgatc catccattgc ttccgataag 1080 ccaagagttg aagttcaccc attggatatt ggtgataagg atgatccagc tagattggtt 1140 ttcaccggta tgcaaggtga tgctgttgat gttaccatgg ctgattacgg tgatgaattc 1200 aagttgatgt cctacgatgt tagaggtaac aagccagaag ctgatacccc acacttgcca 1260 gttgctaagc aattgtggac cccaaagcaa ggtttgagag aaggtgctgt tggttggttg 1320 accgttggtg gtggtcacca caccgttttg tccttcgctg ttgattccga acaattgcaa 1380 gatttgtccc acttgttcga tttgacctac gttaacatca agtag 1425 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XK_R <400> 13 gtctcttcca tcttagctaa catacc 26 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RI_R <400> 14 ctcgagctag gaaatagcgg tttgc 25 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23K AraA_R <400> 15 gctggtgtca acgcagaatc gacc 24 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRG_R <400> 16 agatctccac gaaccataaa ccattcc 27 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STP2_R <400> 17 ctcgagctaa tccttgaagt acttcttcca tc 32 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRG_F <400> 18 ggatccgcat gtctttagtt ctatgatg 28 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGAP_R <400> 19 ggatcctctg gtttagaagt agggactgta tg 32 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRP_F <400> 20 ttcggagact gcacctgtaa atcttc 26

Claims (19)

1. 삭제
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5. 삭제
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12. 하기의 단계를 포함하는 엘-리보스(L-ribose)의 제조 방법:
    (a) 탄소원으로 엘-아라비노스(L-arabinose)를 함유하는 배양 배지에서, 아라비노스전이단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 및 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입된 제1미생물을 배양하여 엘-리불로스 및 엘-리보스를 생성하는 단계;
    (b) 상기 배양 배지에서 상기 제1미생물을 제거한 다음, 아라비노스전이단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자, 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자, 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 및 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자가 도입된 제2미생물을 접종하고 배양하여, 엘-아라비노스 및 엘-리불로스를 소모시키는 단계; 및
    (c) 상기 생성된 엘-리보스를 회수하는 단계.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 제1미생물 및 제2미생물은 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파랍실로시스(C. parapsilosis) 및 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엘-리보스의 제조 방법.
    
14. 제12항에 있어서, 상기 유전자는 코돈 최적화된 것을 특징으로 하는 엘-리보스의 제조 방법.
    
15. 제12항에 있어서, 상기 아라비노스 전이 단백질(arabinose transporter protein)을 코딩하는 유전자는 STP2인 것을 특징으로 하는 및 엘-리보스의 제조 방법.
    
16. 제12항에 있어서, 상기 아라비노스 이성질화 효소(arabinose isomerase)를 코딩하는 유전자 AraA인 것을 특징으로 하는 엘-리보스의 제조 방법.
    
17. 제12항에 있어서, 상기 리보스 이성질화 효소(ribose isomerase)를 코딩하는 유전자 RI인 것을 특징으로 하는 엘-리보스의 제조 방법.
    
18. 제12항에 있어서, 상기 리불로스 인산화 효소(L-ribulose kinase)를 코딩하는 유전자 AraB인 것을 특징으로 하는 엘-리보스의 제조 방법.
    
19. 제12항에 있어서, 상기 리불로스 에피머화 효소(L-ribulose-5-phosphate-4-epimerase)를 코딩하는 유전자 AraD인 것을 특징으로 하는 엘-리보스의 제조 방법.
    

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