CN114214352B - 一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法,包括以下步骤:先将原始pTargetF质粒改造为包含两个大肠杆菌基因组剪切位点的双J23119 promoter‑N20‑gRNA scaffold结构质粒,同时在质粒上插入用于修复大肠杆菌基因组的两段同源模板及lacY基因的调控序列,得到pTargetT;在大肠杆菌本底菌株转入pCas质粒后,使用阿拉伯糖诱导表达λ‑Red重组酶,随后转入pTargetT编辑质粒,培养过夜并经过筛选后去除pTargetT和pCas质粒,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。本发明克服大肠杆菌自身代谢乳糖的缺陷的同时能保证乳糖作为发酵底物的充分吸收,提高乳糖在发酵过程中的利用率,本方法适用不同lac操纵子的大肠杆菌改造,增加本底菌株的可选项,节省构建菌株时的成本。
Description
技术领域
本发明属于生物技术,具体涉及一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法。
背景技术
lac操纵子是大肠杆菌组最常见的表达调控单位,可使细胞摄入并代谢β-半乳糖苷类糖,如乳糖。其中三个代谢基因包括编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的lacZ基因,编码β-半乳糖苷通透酶(permease)的lacY基因以及编码β-半乳糖苷转乙酰基酶(transacetylase)的lacA。此外还包括了表达阻遏物(Lac repressor)的不可调控基因lacI。lac操纵子的转录调控对于诱导物的应答十分迅速,在不含β-半乳糖苷的条件下,每个细胞约含5个分子β-半乳糖苷酶,在加入适宜底物时,2-3min该酶即可表现出活性并且后续很快达到约5000个分子水平,并且β-半乳糖苷酶的量最高可达总可溶性蛋白的5%-10%,若除去底物,该酶的合成会立即停止。正是由于此特性,此结构往往被用于质粒改造或基因编辑,并使用不可降解的IPTG作为诱导底物控制目的基因的表达。
乳糖作为重要生命反应的重要成分,其代谢过程研究得较为清晰,具有成熟的工业生产工艺。目前,乳糖被广泛应用于食品与生化研究,在工业发酵方面具有广泛的应用前景。lac操纵子具备代谢乳糖的能力,如果以乳糖为底物进行生物合成就必须要限制细胞本身的乳糖代谢能力。目前大肠杆菌有lacZΔM15基因突变型限制自身乳糖代谢,此种突变是lacZ基因是通过缺失编码β-半乳糖苷酶中第11-41个氨基酸的片段,导致表达产物ω片段不具备酶学活性,如JM109系列、DH5α、TOP10等。该突变可通过携带编码α片段基因的lac操纵子通过载体DNA(如pUC19 DNA)补全得到具备活性的β-半乳糖苷酶,常用作菌株蓝白斑筛选。
如果选择以JM109系列等lacZ缺陷型的菌株作为本底菌株,首先会受到菌株选择的限制;其次lacZΔM15基因型的菌株,在诱导后由于启动子高效响应所产生大量缺陷的β-半乳糖苷酶分子会浪费细胞的许多资源和能量,这对发酵过程中细菌生长及产物收益会产生不利影响;此外lacZΔM15基因型所表达出的缺陷β-半乳糖苷酶分子仍具有约正常功能3%活性,这就使得细菌自身仍具备代谢少量乳糖的能力,在长时间的发酵过程中会降低底物的转化率。
大肠杆菌的许多株系均可用于工业生物合成,其中就有无缺陷lac操纵子的菌株如BL21系列等,由于可自身代谢乳糖,必须经过改造后才能使用。这就使它们在作为发酵本底菌株时必须经过比lacZΔM15基因型菌株更多的改造步骤才能发挥菌株效果,无疑增加了研发成本。
综上所述,以大肠杆菌为本底菌株发酵乳糖,现有技术存在以下缺陷:lacZΔM15基因型菌株在发酵过程中会产生大量有缺陷的β-半乳糖苷酶分子,会造成细胞代谢的资源浪费,增加细胞负担,同时有缺陷的β-半乳糖苷酶分子仍具备少量活性,不利于发酵收益;携带有完整lac操纵子的菌株自身具备了乳糖代谢能力,必须经过额外改造才能构建发酵菌株;不同lac操纵子基因型的菌株均存在一定缺陷,没有一个通用的改造方法同时适用于不同的大肠杆菌,这会造成在构建发酵菌株时消耗额外的研发成本,限制菌株选择。
发明内容
本发明的目的在于使用一种简单高效的方法,克服大肠杆菌自身代谢乳糖的缺陷,同时适用任意lac操纵子的大肠杆菌改造,增加本底菌株的可选项,节省构建菌株时的成本。
本发明采用如下技术方案:
一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法,包括以下步骤:在pTargetF质粒中引入用于定位Cas9蛋白切割位点的双N20序列以及包含lacY调控序列的重组同源模板,得到pTargetT质粒;之后将已经转入pCas质粒的本底菌株使用阿拉伯糖诱导,再转入pTargetT质粒,经过培养鉴定后消除pCas与pTargetT,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。上述方法具体为,先将原始pTargetF质粒改造为具备包含两个大肠杆菌基因组剪切位点的双J23119 promoter-N20 -gRNA scaffold结构质粒,同时在质粒上插入用于修复大肠杆菌基因组的两段同源模板及lacY基因的调控序列,得到大肠杆菌基因组编辑质粒pTargetT;在大肠杆菌本底菌株转入pCas质粒后,使用阿拉伯糖诱导表达λ-Red重组酶,随后转入pTargetT编辑质粒,培养过夜并经过筛选后去除pTargetT和pCas质粒,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。
本发明中,质粒模板为pTargetF质粒,将原本的pTargetF质粒sgRNA前面的碱基序列替换成所需要的PAM序列(NGG)前20个碱基序列(敲除序列的N20序列),本发明中,通过Gibson Assembly Master Mix试剂进行连接与插入。
本发明中,用于调控lacY表达水平的短片段可以选择为BBa_B0034(tctagagaaagaggagaaatactag)、BBa_B0030(tctagagattaaagaggagaaatactag)、BBa_B0032(tctagagtcacacaggaaagtactag)、BBa_J61101(tctagagaaagacaggacccactag)或其它RBS。在原核细胞调控基因表达的各种元件中,核糖体结合位点(RBS,ribosomebinding site)是影响基因表达水平的重要序列,可参考iGEM。
具体的,上述发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法步骤如下:
(1)设计待敲除序列的前N20序列、后N20序列,并设计包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对;再利用包含前N20序列的引物对扩增质粒模板得到包含前N20序列的质粒,利用包含后N20序列的引物对扩增质粒模板得到包含后N20序列的质粒;
(2)所述包含前N20序列的质粒经过扩增得到线性质粒;所述包含后N20序列的质粒经过扩增得到片段;
(3)以本底菌株的基因组为模板,分别利用HDL引物对、HDR引物对进行扩增,分别得到HDL扩增产物、HDR扩增产物;
(4)连接步骤(2)的线性质粒、片段、步骤(3)的HDL扩增产物、HDR扩增产物,然后转化感受态细胞,挑出阳性单克隆为编辑质粒;
(5)将pCas质粒转入本底菌株感受态细胞,抗性板培养后挑选单克隆,于卡那霉素抗性LB中培养后1:100转接,使用阿拉伯糖诱导培养,随后制备电转感受态细胞并导入编辑质粒;培养后挑选单克隆,消除引入的质粒,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化,即得到敲除目的基因的菌株。
本发明中,本底菌株为改造的大肠杆菌菌株,也可以为未改造的大肠杆菌菌株,比如BL21系列、JM109系列、K12、MG1655等;优选为大肠杆菌JM109菌株(lacZΔM15)和BL21(DE3)。本发明使用一种简单高效的方法,克服大肠杆菌自身代谢乳糖的缺陷,同时适用不同lac操纵子的大肠杆菌改造,增加本底菌株的可选项,节省构建菌株时的成本。
lacZ或lacZΔM15都存在不同的缺点,因此需要在基因组中需要将完整序列加以剔除,此为本发明发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化的目的之一。lacY基因编码的β-半乳糖苷通透酶是大肠杆菌将乳糖摄入细胞内的重要途径,在改造大肠杆菌需要加以保留。特别的,本发明优化方法中,创造性的引入调控lacY表达的RBS,解决了在改造乳糖操纵子后的菌株在细胞生长或乳糖利用方面存在的缺陷;保留的lacA可用于参与去除发酵后期发酵液中多余的乳糖。本发明从构建pTargetF质粒到pTargeT质粒,最后通过pCAS质粒进行基因组编辑的方法适用于所有大肠杆菌,在敲除大肠杆菌基因组中lacZ基因的同时,在lacY的序列之前加入了调控序列,确保了lacY能按需要发挥作用,并且这种编辑方式适用于所有lacZ及lacZΔM15的大肠杆菌,构建的pTargetT质粒同时包含了两个J23119 promoter-N20-gRNA scaffold结构、同源模板及两个同源模板之间需要插入的目的DNA序列。用本发明所构建的菌株避免了大肠杆菌自身的乳糖代谢,在以乳糖为底物的发酵过程中,能显著提高乳糖的利用效率,提高产物收益,且本发明基因编辑的方法能同时适用于不同基因型的的大肠杆菌,包括lacZ及lacZΔM15基因型菌株,另外,本发明所构建的pTargetT质粒结构在使用过程中操作简单,采用的双N20结构有较高的成功率。
附图说明
图1为pTargetF结构;
图2为双N20-gRNA scaffold结构;
图3为lacY及其调控结构;
图4为pTargetT结构;
图5为吸光值、酶活力单位标准曲线。
具体实施方式
本发明先将原始pTargetF质粒改造为具备包含两个大肠杆菌基因组剪切位点的双J23119 promoter-N20-gRNA scaffold结构质粒,同时在质粒上插入用于修复大肠杆菌基因组的两段同源模板及lacY基因的调控序列,得到大肠杆菌基因组编辑质粒pTargetT;在大肠杆菌本底菌株转入pCas质粒后,使用阿拉伯糖诱导表达λ-Red重组酶,随后转入pTargetT编辑质粒,培养过夜并经过筛选后去除pTargetT和pCas质粒,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。本发明克服大肠杆菌自身代谢乳糖的缺陷的同时能保证乳糖作为发酵底物的充分吸收,提高乳糖在发酵过程中的利用率,本发明的方法适用不同lac操纵子的大肠杆菌改造,增加本底菌株的可选项,节省构建菌株时的成本。实施例中未注明具体条件的实验方法,按照本领域常规条件或按照设备、试剂制造厂商所建议的条件进行,PCR试剂盒为现有常规产品,实施例来自TaKaRa公司。所有试剂都为现有产品。用于进行基因组编辑的质粒pTargetF、pCas均来源于市面上生物公司(生物风),JM109、BL21(DE3)菌株来自唯地生物公司。
实施例 JM109、BL21(DE3)菌株改造
1、确定替换的N20序列,选中的序列可同时应用于JM109、BL21(DE3)菌株。设计引物(pF1-F/pF1-R、pF2-F/pF2-R),以pTargetF质粒(图1)为模板,PCR获得线性质粒后,通过Gibson Assembly Master Mix连接环化后转化DH5a感受态细胞,并涂壮观霉素抗性板在37℃培养箱中培养过夜,次日挑选单克隆摇菌并测序,测序成功替换N20序列的质粒为阳性克隆,选择阳性克隆摇菌培养并提取质粒,获得lac-pTargetF1以及lac-pTargetF2质粒;所需序列如表1。
扩增条件均为:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,46℃退火15s,72℃延伸反应15s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温。
2、从构建好的lac-pTargetF1和lac-pTargetF2质粒分别扩增得到线性质粒和N20-2-gRNA(图2),引物以及产物见表2。
扩增条件为:
线性pTargetF1:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,49℃退火15s,72℃延伸反应15s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温。
N20-2-gRNA:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,55℃退火15s,72℃延伸反应7s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温。
3、分别以JM109、BL21(DE3)基因组为模板,设计引物(HDL-R/ HDL-F、HDR-R/ HDR-F)进行PCR,通过引物在两端的连接处插入lacY的表达调控序列(本实施例均采用RBS0030,参见图3),解决了两个菌株在同源模板序列上存在差异,得到适当大小的同源模板,所需序列如表3。
扩增条件为:
JM-HDL、BL-HDL:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,55℃退火15s,72℃延伸反应7s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温。
JM-HDR、BL-HDR:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,43℃退火15s,72℃延伸反应10s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温。
4、获得上述片段后,通过Gibson Assembly Master Mix连接后转化DH5a感受态细胞,并涂壮观霉素抗性板在37℃培养箱中培养过夜,再通过菌落PCR鉴定,挑选出阳性单克隆后通过测序验证即得用于基因组编辑的pTargetT质粒(图4)。其中,用于JM109的为JM-pTargetT、针对BL21(DE3)的为BL-pTargetT,质粒连接所需片段见表4,PCR鉴定所需引物见表5。
扩增条件为:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,54℃退火15s,72℃延伸反应40s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温。
5、通过pCas质粒以及构建的pTargetT质粒编辑JM109及BL21(DE3)基因组
将pCas质粒转入JM109感受态细胞,涂卡那霉素抗性板后30℃过夜培养,挑选单克隆,于卡那霉素抗性LB中30℃培养过夜后1:100转接,使用阿拉伯糖诱导培养4小时,随后制备电转感受态细胞并导入JM-pTargetT质粒,将电转过后菌株涂卡那霉素和壮观霉素双抗性LB平板,30℃培养过夜,次日挑单克隆PCR鉴定,引物见表6。上述鉴定完成后,挑选单克隆接种卡那霉素抗性LB培养基,使用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导过夜培养后划线,通过PCR鉴定pTargetT质粒消除情况,引物见表7。挑选已消除pTargetT质粒的单克隆,接种于无抗培养基42℃过夜培养,随后划线至无抗平板,通过PCR鉴定pCas质粒消除情况,鉴定成功后即得到目的菌株JM-01,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化,引物见表8。
将pCas质粒转入BL21(DE3)感受态细胞,涂卡那霉素抗性板后30℃过夜培养,挑选单克隆,于卡那霉素抗性LB中30℃培养过夜后1:100转接,使用阿拉伯糖诱导培养4小时,随后制备电转感受态细胞并导入BL-pTargetT质粒,将电转过后菌株涂卡那霉素和壮观霉素双抗性LB平板,30℃培养过夜,次日挑单克隆PCR鉴定,引物见表6。上述鉴定完成后,挑选单克隆接种卡那霉素LB培养基,使用IPTG( 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,0.5 mmol /L)诱导过夜培养后划线,通过PCR鉴定pTargetT质粒消除情况,引物见表7。挑选已消除pTargetT质粒的单克隆,接种于无抗培养基42℃过夜培养,随后划线至无抗平板,通过PCR鉴定pCas质粒消除情况,鉴定成功后即得到目的菌株BLD-01,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化,引物见表8。
扩增条件为:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,50℃退火15s,72℃延伸反应20s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温。
扩增条件为:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,57℃退火15s,72℃延伸反应20s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温
扩增条件为:98℃预变性2min后开始以下循环:98℃变性10s,50℃退火15s,72℃延伸反应20s,进行30个循环,最后72℃反应5min,4℃保温
6、通过试剂盒(Solarbio)检测β-半乳糖苷酶活性确认基因编辑效果
β-半乳糖苷酶分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,因此可通过测定吸光值升高速率来计算β-半乳糖苷酶活性,其中每mg组织蛋白每小时产生1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位,得到标准曲线,见图5;在0.5mM IPTG诱导4h后,所得菌株的β-半乳糖苷酶活性检测结果见表9。
说明在进行基因组改造后,β-半乳糖苷酶活性相对于改造前具有明显变化。
应用实施例
2-岩藻糖基乳糖(2’-FL)是具有市场潜力的食品添加剂,其生物合成需要以乳糖为底物,在α-1,2-岩藻糖基转移酶的催化作用下,与GDP-L-岩藻糖生成2’-FL。以JM-01、BLD-01、JM019、BL21(DE3)为本底菌株,构建2’-FL的发酵菌株,构建方法为现有成熟技术(参见:Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integratedexpression cassettes for the synthesis of 20-fucosyllactose);发酵均采用相同条件,使用5L规格发酵罐测试,采用pH关联补料,单次发酵乳糖加入量为80g,IPTG工作浓度为0.5mM,此为现有技术。对比产物收益见表10,*表示由对应的本底菌株构建。
实际收益为:BLD-01*>JM-01*>JM109*>BL21(DE3)*,即采用本方案的基因组优化方式能确保lacY有效发挥作用,提升乳糖的利用效率进一步提升发酵产量。
大肠杆菌基因编辑的研究较为透彻,编辑方法也较为成熟。CRISPR/Cas9是进行基因编辑的强大工具,可以对基因进行定点的精确编辑。在向导RNA(guide RNA,gRNA)和Cas9蛋白的参与下,待编辑的细胞基因组DNA将被看作病毒或外源DNA,被精确剪切。但是,CRISPR/Cas9的应用也有一些限制条件。首先,待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列(NGG)。其次,向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。本发明从构建pTargetF质粒到pTargeT质粒,最后通过pCAS质粒进行基因组编辑的方法适用于所有大肠杆菌,在敲除大肠杆菌基因组中lacZ基因的同时,在lacY的序列之前加入了调控序列,确保了lacY能发挥作用,并且这种编辑方式适用于所有lacZ及lacZΔM15,本发明构建的pTargetT质粒同时包含了两个J23119 promoter-N20-gRNA scaffold结构、同源模板及两个同源模板之间需要插入的目的DNA序列。使用本发明所构建的菌株避免了大肠杆菌自身的乳糖代谢,在以乳糖为底物的发酵过程中,能显著提高乳糖的利用效率从而提高产物收益,且本发明基因编辑的方法能同时适用于不同基因型的的大肠杆菌,包括lacZ及lacZΔM15基因型菌株,另外,本发明所构建的pTargetT质粒结构在使用过程中操作简单,采用的双N20结构有较高的成功率。
序列表
<110> 黄山同兮生物科技有限公司
<120> 一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctagagaaa gaggagaaat actag 25
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctagagatt aaagaggaga aatactag 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tctagagtca cacaggaaag tactag 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctagagaaa gacaggaccc actag 25
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtcacgacgt tgtaaaacga 20
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgacgttgt aaaacgagtt ttagagctag aaatagc 37
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgttttaca acgtcgtgac gctagcatta tacctaggac 40
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caactggtaa tggtagcgac 20
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<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggtaatgg tagcgacgtt ttagagctag aaatagc 37
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtcgctacca ttaccagttg actagtatta tacctaggac 40
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gtcgactcta gagaattcaa 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aattctctag agtcgacacg catctgtgcg gtatttc 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgatcgttg gcaaccatca aaaaaagcac cgactcg 37
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agctgtttcc tgtgtgaaat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtaatagatc taagcttcag tgccagctta aggctaa 37
<210> 18
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcacacagga aacagcttct agagattaaa gaggagaaat actagatgta ctatttaaaa 60
aacac 65
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agctgtttcc tgtgtgaaat 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggttgccaa cgatcagatg 20
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtaatagatc taagcttcag tgccagctta aggctaa 37
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcacacagga aacagcttct agagattaaa gaggagaaat actagatgta ctatttaaaa 60
aacac 65
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
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<400> 23
tggataaccg tattaccgcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
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<212> DNA
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<400> 25
ccattaagtt ctgtctcggc 20
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctgatatggt tgatgtcatg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
agaacatagc gttgccttgg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atttgccgac taccttggtg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gctagaccct ctgtaaattc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaggggaaat taataggttg 20
Claims (4)
1.一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法,其特征在于,包括以下步骤:设计待敲除序列的前N20序列、后N20序列,并设计包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对;再利用包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对在pTargetF质粒中引入用于定位Cas9蛋白切割位点的双N20序列;在pTargetF质粒中引入包含lacY调控序列的重组同源模板,得到pTargetT质粒;之后将已经转入pCas质粒的本底菌株使用阿拉伯糖诱导,再转入pTargetT质粒,经过培养鉴定后消除pCas与pTargetT,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化;本底菌株为lacZΔM15或lacZ基因型的大肠杆菌;前N20序列为gtcacgacgttgtaaaacga、后N20序列为caactggtaatggtagcgac;以本底菌株的基因组为模板,分别利用HDL引物对、HDR引物对进行扩增,分别得到HDL扩增产物、HDR扩增产物;将HDL扩增产物、HDR扩增产物引入pTargetF质粒中,实现在pTargetF质粒中引入包含lacY调控序列的重组同源模板;对于lacZΔM15基因型的大肠杆菌,HDL引物对为agctgtttcctgtgtgaaat、tggttgccaacgatcagatg,HDR引物对为gtaatagatctaagcttcagtgccagcttaaggctaa、tcacacaggaaacagcttctagagattaaagaggagaaatactagatgtactatttaaaaaacac;对于lacZ基因型的大肠杆菌,HDL引物对为agctgtttcctgtgtgaaat、tggttgccaacgatcagatg,HDR引物对为gtaatagatctaagcttcagtgccagcttaaggctaa、tcacacaggaaacagcttctagagattaaagaggagaaatactagatgtactatttaaaaaacac。
2.根据权利要求1所述发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法,其特征在于,将pCas质粒转入本底菌株感受态细胞,抗性板培养后挑选单克隆,于卡那霉素抗性LB中培养后转接,使用阿拉伯糖诱导培养,随后制备成电转感受态细胞并导入编辑质粒;培养后挑选单克隆鉴定,消除pCas与pTargetT,完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。
3.根据权利要求1所述发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法得到的改造菌株。
4.权利要求3所述改造菌株在发酵乳糖中的应用。
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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