CN117683771A - 谷氨酸棒杆菌启动子库及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物化工技术领域，具体公开了谷氨酸棒杆菌启动子库及其应用。本发明的启动子库，包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子，其中，n代表a、t、c、g中的任意一种。本发明构建的启动子库具有不同表达强度的启动子，尤其具备高强度表达的启动子，可根据基因表达需求，从启动子库中选择合适的启动子用以更精准地调控基因的表达量。

Description

谷氨酸棒杆菌启动子库及其应用

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，具体地说，涉及谷氨酸棒杆菌启动子库及其应用。

背景技术

基因表达的调控对合成生物学和代谢工程至关重要，其中启动子和核糖体结合位点(RBS)的序列影响与RNA聚合酶和核糖体的结合，直接决定了基因转录和翻译过程。从转录起始位点到起始密码子的非翻译区(5’UTR)和靶基因的连接往往影响基因的表达水平。目前发现，在细菌、古菌等生物中一些mRNA能够在转录起始位点(TSP)处启动翻译，而不存在5’UTR。这种类型的转录本被称为leaderless mRNA(lmRNA)，控制lmRNA转录的启动子被称为leaderless启动子，例如谷氨酸棒杆菌中的一些人工启动子H36，H30等启动子(Biotechnology&Bioengineering,2013,110(11):2959-2969)。尽管这些人工启动子具有很高的表达强度，已被广泛应用于基因表达调控，但仍有必要研究具有不同强度，尤其是更高强度的启动子用于基因工程菌的设计和改造。

发明内容

本发明的目的之一在于提供具有不同梯度强度的启动子文库及其应用。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种启动子库，所述启动子库包含核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的启动子，其中，n代表a、t、c、g中的任意一种。

本发明构建了启动子H36的双顺反子表达系统，并在-35区和-10区引入多义碱基的突变，通过创新性的设计，在启动子H36后插入一段62bp的前顺反子序列，获得了拥有更高表达强度的表达元件，并进一步通过对H36启动子进行突变库设计和筛选，建立了具有不同梯度强度的启动子文库，可用于精准地调控基因的表达量。

本发明SEQ ID NO.1所示启动子的第62-64位和第85位存在不同碱基情况。

本发明中，所述启动子库包含核苷酸序列如SEQ ID NO.2-11所示的启动子。

第二方面，本发明提供一种启动子，所述启动子为上述启动子库中的启动子中的任一条。

第三方面，本发明提供一种表达盒，所述表达盒包含上述启动子库中的启动子。

本发明中，表达盒为将启动子与目的基因连接后得到的重组核酸分子。

第四方面，本发明提供一种载体，所述载体包含上述启动子库中的启动子，或包含上述表达盒。

本发明所述的载体可为质粒载体或病毒载体。

第五方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述启动子库中的启动子，或包含上述表达盒，或包含上述载体。

本发明中，所述宿主细胞为棒杆菌属的微生物细胞。优选为，谷氨酸棒杆菌。

第六方面，本发明提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包括上述启动子库中的启动子。

第七面，本发明提供上述启动子库或启动子或表达盒或载体或宿主细胞的以下任意一种应用：

(1)在调控微生物中基因转录和/或表达中的应用；

(2)在微生物基因编辑中的应用；

(3)在通过基因工程改造微生物中的应用；

(4)在构建用于生产目标产物的微生物中的应用；

(5)在利用微生物发酵生产目标产物中的应用。

第八方面，本发明提供一种调控基因转录和/或表达的方法，所述方法包括将上述启动子库中的启动子与目标基因可操作性地连接的步骤。

本发明的有益效果至少在于：

本发明提供了一种启动子突变体文库，其中具有不同表达强度的启动子，可根据基因表达需求，从突变体库中选择合适的启动子用以更精准地调控基因的表达量。且本发明启动子库中具有多条比目前已报道的天然或者人工启动子更高表达强度的启动子。

附图说明

图1为本发明菌落文库S9114-mcherry-mut启动子强度测定结果。

图2为本发明启动子突变体与常见谷氨酸棒杆菌启动子的强度比较结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。

实施例1构建启动子H36的双顺反子表达系统，引入启动子突变

本实施例根据谷氨酸棒杆菌启动子-35区和-10区的碱基分布情况(JBiotechnol.2011Jul 10；154(2-3):101-13)，选取保守型较弱的4个位点，以长引物H36-F(acacaggaaacagctatgacatgattacgcaaaagctgggtacctctatctggtgccctaaacgggggaatattaacgggccc，SEQ ID NO.13)，和含有多义碱基突变的H36-R(ggcgcaaaacaatttagaagtagtctcatggatcccatgntactcctaccaaccaaggtgnnnccaccctgggcccgttaatattcc，SEQ ID NO.14，其中n为a,t,c,g中的任一种)互为模版进行PCR扩增和产物纯化，获得长度为154bp的H36启动子序列库。以长引物fc-F(catgagactacttctaaattgttttgcgccattgttcatacaatttctaagctatttgc，SEQ ID NO.15)和fc-R(ctcctcgcccttgctcaccattagttgtcctcctttaattgcaaatagcttagaaattgtatgaacaatggcg，SEQ ID NO.16)互为模版进行PCR扩增和产物纯化，获得长度为77bp的顺反子序列(SEQ ID NO.12)。

以J23101-RBS34-mCherry质粒(ACS Synthetic Biology,2015,4(7):781-787)为模板，以引物mcherry-F(gaggacaactaatggtgagcaagggcgaggagg，SEQ ID NO.17)和mcherry-R(agcttgcatgcctgcaggtcgactctagagagagtttgtagaaacgcaaaaaggcc，SEQ IDNO.18)进行PCR扩增和产物纯化，获得长度为1192bp的荧光蛋白mcherry序列。

将穿梭质粒pEC-K18mob2(Curr Microbiol.2002Nov；45(5):362-7)用EcoRI/BamHI进行双酶切，利用Gibson Assembly试剂盒(NEB)将H36启动子序列片段、顺反子片段和mcherry片段一步连接到pEC-K18mob2上，转化大肠杆菌后，将菌落平板用涂布棒刮下，提取质粒文库pEC-K18-H36mut-fc-mcherry，获得启动子库。启动子库中的启动子的序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

caaaagctgggtacctctatctggtgccctaaacgggggaatattaacgggcccagggtggnnncaccttggttggtaggagtancatgggatccatgagactacttctaaattgttttgcgccattgttcatacaatttctaagctatttgcaattaaaggaggacaacta(n代表a、t、c、g中任意一种)。

实施例2启动子文库梯度筛选

利用电穿孔仪(伯乐)将pEC-K18-H36mut-fc-mcherry通过电转化转入到谷氨酸棒杆菌S9114中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。涂布平板，获得含有不同强度荧光蛋白mcherry的表达质粒的菌落文库。从该平板上随机挑选单菌落接种于含有2mL LBB培养基的48孔深孔板中，30℃，200rpm培养12小时。而后以10％的量接种于新的2mL LBB培养基的48孔深孔板中，30℃，200rpm培养24小时。

LBB培养基配方包括：10g/L NaCl，10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L脑心浸液。

收集培养液，将菌液稀释5倍(OD₆₀₀约为1)，各取200uL加入到96孔透明微孔板和96孔黑色微孔板中，用酶标仪分别测定OD₆₀₀和mcherry的荧光强度(激发波长为535nm，吸收波长为620nm)，每个启动子进行2次重复检测。以含有空载质粒pEC-K18mob2的S9114菌株作为参照，扣除菌体本底的荧光值，最终的荧光强度以RFU/OD₆₀₀来表示，并从低到高排序，具体部分检测结果见图1，图中每个柱状结果代表一个启动子突变体的检测结果，横坐标中的数字代表本发明筛选出的代表性目标启动子的编号。

本发明突变库对启动子序列中的共4个碱基进行突变，理论可获得256个序列，可通过增加突变碱基的数量更进一步扩增突变库的容量，扩大筛选的范围。

本实施例共选取了99个含启动子突变序列的菌株进行荧光强度测定，剔除重复测定误差值较大的启动子结果，最终荧光强度范围为369-20862，其中8条荧光强度超过15000(不含15000)，33条荧光强度超过10000(不含10000)但小于15000(含15000)，12条荧光强度在5000(不含5000)-10000(含10000)的范围内，其余23条强度在5000以下。在各强度条件下基本都能找到对应的启动子序列。图1中共展示有68个启动子强度。

实施例3筛选更高强度的启动子序列

用谷氨酸棒杆菌常见的天然启动子tuf(SEQ ID NO.20)，gapA(SEQ ID NO.21)和sodA(SEQ ID NO.22)和人工启动子H36(SEQ ID NO.23)保持与上述质粒文库一致的RBS序列(AAAGGAGGACAACTA，SEQ ID NO.19)构建mcherry荧光蛋白表达质粒，并分别电转谷氨酸棒杆菌S9114，将得到的菌株用上述方法同样进行荧光蛋白表达强度测试，与实施例2中启动子突变体中筛选得到的强启动子进行比较(从高到低排列)，每个启动子进行3次重复检测。结果见表1和图2，从中可知，筛选得到的代表性启动子99号，98号，96号，97号，92号，5号，18号，24号，39号，90号，能显著提升荧光蛋白mcherry的转录表达，高于目前常用的强启动子H36，sodA，gapA等，具有重要的应用前景。

表1

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种启动子库，其特征在于，所述启动子库包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的启动子，其中，n代表a、t、c、g中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的启动子库，其特征在于，所述启动子库包含核苷酸序列如SEQID NO.2-11所示的启动子。

3.一种启动子，其特征在于，所述启动子为权利要求1或2所述的启动子库中的启动子。

4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1或2所述的启动子库中的启动子。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1或2所述的启动子库中的启动子，或包含权利要求4所述的表达盒。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1或2所述的启动子库中的启动子，或包含权利要求4所述的表达盒，或包含权利要求5所述的载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为棒杆菌属的微生物细胞。

8.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包括权利要求1或2所述的启动子库中的启动子。

9.权利要求1或2所述的启动子库或权利要求3所述的启动子或权利要求4所述的表达盒或权利要求5所述的载体或权利要求6或7所述的宿主细胞的以下任意一种应用：

(1)在调控微生物中基因转录和/或表达中的应用；

(2)在微生物基因编辑中的应用；

(3)在通过基因工程改造微生物中的应用；

(4)在构建用于生产目标产物的微生物中的应用；

(5)在利用微生物发酵生产目标产物中的应用。

10.一种调控基因转录和/或表达的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述的启动子库中的启动子与目标基因可操作性地连接的步骤。