CN110305224B - 一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法 - Google Patents

一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法，属于生物技术和基因工程技术领域。本发明利用大肠杆菌表达系统表达并纯化制备高产、高纯度N端带有His6标签的Aβ42蛋白。通过研究该多肽聚集特性和细胞毒性，证明本发明制备的N端有残基修饰的Aβ42相对于不含多余残基的Aβ42其聚集特性明显减弱，具有明显阻抗Aβ42聚集的作用。

Description

一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化 方法
技术领域：
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，特别涉及具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法。
背景技术：
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)，亦称老年痴呆症，是一种常见的神经退行性疾病。据国际阿尔茨海默病协会2016年公布的数据，2015年全球约有4680万AD患者，且其数量以20年翻一番的速度递增，预计到2050年将增至1.32亿，成为全球最大的公共卫生问题。美国阿尔茨海默症协会于2017年3月8日公布了包括2016年的统计数据及对2017年的预估，与前一年所公布的事实与数据相较，美国AD的罹病人数增加了10万人，2017年与失智症照护有关费用支出与2016年相较增加230亿美金。作为人口老龄化进展最迅速的国家之一，我国的形势更为严峻。2014年我国AD患者数量(约600万)已居世界第一，同时还是全球增速最快的国家之一，这将给家庭和社会带来沉重的负担。因此该疾病的病因和寻找抗AD药物成为世界范围内研究人员关注的焦点。
典型的AD病理特征是患者大脑中会发现大量的淀粉样斑块和细胞内神经元纤维缠结，这些物质会引起大脑和海马体中神经细胞的死亡，逐步引起患者的智力和认知功能损害，最终导致AD病人完全丧失其自主能力，进而引发一些并发症而死亡。淀粉样斑块的主要成分是各种形态的β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集体。Aβ是由β-和γ-淀粉样水解酶水解淀粉样前体蛋白APP产生的多肽，含有39-43个氨基酸。APP是一种跨膜蛋白，共含有770个氨基酸，其中Aβ区域部分残基处于跨膜区域(12-14个氨基酸)，28个氨基酸处于细胞膜外。当APP正常水解时，经α-水解酶途径，在Aβ区域内对APP进行切割，破坏了Aβ序列，因此不会产生完整的Aβ。当APP经β-水解酶途径水解时，会产生含有完整Aβ序列的多肽链，这些多肽链上会存在多个γ-水解酶切割位点，经γ-水解酶水解后会产生大量的Aβ片段。其中Aβ的N-末端起源于Aβ肽段的Asp1位点也是APP蛋白的Asp672位点的典型β-淀粉样水解酶-1(BACE1)裂解位点的之前或之后。有研究显示，APP可能在非标准BACE1位点处发生蛋白水解，即有可能在Asp672位点之前就发生水解，这样就会产生一系列在N端有残基延伸的Aβ变体。
以上一系列机理决定了在人体内存在多个不同长度的Aβ变异体，这些变异体在N-端或C-端都有延伸和截断，并且具有不同的聚集倾向，产生的Aβ片段中，受到的关注最为广泛的是Aβ40和Aβ42。大量的证据表明Aβ42的聚集性更强，神经毒性也更强，在AD的发病过程中扮演着更关键的角色。造成这种现象的原因可能是在Aβ42的C-端含有疏水性氨基酸(Ile-Ala)，这表明了Aβ在C-端有残基延伸特性的重要性。并且一系列Aβ变异体无论是C端还是N端延伸的残基均是来源于APP蛋白，是同源性的残基延伸，而对于N端有非同源性残基延伸的Aβ42变异体的聚集特性和毒性等方面尚未进行系统的研究。
发明内容：
为了实现上述目的，本发明提供一种具有阻抗蛋白自身聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法。
本发明的目的是提供一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白所述Aβ42修饰蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述Aβ42修饰蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白，具体为His6-Aβ42蛋白，是在Aβ42的N端添加His6标签，即添加6个His后形成。所述His6-Aβ42蛋白可以阻抗Aβ42蛋白自身的聚集，具有相对于不含多余残基的Aβ42蛋白明显减弱的聚集特性。
包含所述Aβ42修饰蛋白的表达载体或宿主细胞。
所述表达载体为pET22b，所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明的另一目的是提供上述Aβ42修饰蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化方法，包括重组表达载体构建、转化与筛选、诱导表达及纯化，步骤如下：
(1)在所述Aβ42的基因序列的上游添加6个His，得到His6-Aβ42基因；
(2)将所述His6-Aβ42基因插入到经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的表达载体pET22b上，构建重组表达载体质粒pET22b-His6-Aβ42；
所述Aβ42基因氨基酸序列和核苷酸编码序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；
(3)将所述步骤(2)中构建的重组表达载体质粒转入宿主菌大肠杆菌E coli.BL21(DE3)，得到重组菌株；
(4)对所述重组菌株进行诱导，表达His6-Aβ42蛋白，并收集菌体经破碎后，利用变性溶液使包涵体变性；
(5)变性后过Ni-NTA树脂，利用纯化洗脱液进行亲和层析纯化得His6-Aβ42蛋白；
(6)透析去除所述步骤(5)得到的His6-Aβ42蛋白中的杂质，促进His6-Aβ42蛋白聚集形成淀粉样纤维；
(7)透析完成后经离心得到沉淀，利用六氟异丙醇溶液溶解所述沉淀，经溶解、离心，取上清经冻干，即得His6-Aβ42蛋白。
所述His6-Aβ42蛋白在六氟异丙醇中的溶解性较好，而其他杂蛋白不溶于该有机溶液。
优选地，所述步骤(4)中，变性溶液组成为：20mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，1mMDTT，pH 7.4。
优选地，所述步骤(5)中，纯化洗脱液组成为：20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，5M尿素，1mM DTT，pH 7.4。
进一步地，本发明实现上述目的的过程具体如下：表达载体及重组His6-Aβ42基因的大肠杆菌工程菌的构建
(1)根据Aβ42的氨基酸序列(原始序列如SEQ ID No.3)以及大肠杆菌密码子偏好性对Aβ42基因序列进行密码子优化，并由基因公司合成，得到的Aβ42蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID No.3)
GATGCCGAGTTTCGCCATGATAGCGGCTATGAGGTGCACCACCAGAAACTGGTGTTCTTTGCCGAGGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCCATTATTGGCCTGATGGTGGGTGGCGTGGTGATTGCC(SEQ ID No.4)；
(2)利用引物NdeⅠ-His6-Aβ42-F和XhoⅠ-His6-Aβ42-R，其中上游引物NdeⅠ-His6-Aβ42-F含有His6标签的基因序列，通过PCR在Aβ42基因序列上游添加His6标签，得到His6-Aβ42目的基因片段，His6-Aβ42蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1，His6-Aβ42蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2，引物序列如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6；
HHHHHHDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID No.1)
CACCACCATCATCACCATGATGCCGAGTTTCGCCATGATAGCGGCTATGAGGTGCACCACCAGAAACTGGTGTTCTTTGCCGAGGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCCATTATTGGCCTGATGGTGGGTGGCGTGGTGATTGCC(SEQ ID No.2)；
NdeⅠ-His6-Aβ42-F:GGAATTCCATATGCACCACCATCATCACCATGATGCCGAGT(SEQ IDNo.5)
XhoⅠ-His6-Aβ42-R:CCGCTCGAGTTAGGCAATCACCACGCCACCCA(SEQ ID No.6)
(3)将所述His6-Aβ42基因插入到表达载体pET22b的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达载体质粒pET22b-His6-Aβ42；
优选地，操作条件如下：
利用设计好的引物NdeⅠ-His6-Aβ42-F和XhoⅠ-His6-Aβ42-R，通过PCR在Aβ42的DNA序列前方添加His6标签的DNA序列，得到His6-Aβ42目的基因；将His6-Aβ42基因片段与pET22b表达载体连接，16℃反应4h后，连接产物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰浴30min，42℃反应1min 30s，冰浴2min，加入1mL LB液体培养基复苏液，250rpm，37℃孵育1h；
4000rpm离心5min收集菌体，去除后重悬菌体，涂布氨苄霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养过夜。挑取单菌落至液体培养基中，250rpm，37℃过夜培养。
菌落PCR鉴定阳性克隆后进行测序分析，提取测序正确的阳性转化子质粒备用，菌落PCR验证正向引物和反向引物见SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；
(4)重组大肠杆菌表达菌株的构建：
将测序正确的pET22b-His6-Aβ42表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，最终获得重组Aβ42基因的大肠杆菌工程菌BL21-His6-Aβ42。
His6-Aβ42蛋白的表达及纯化：
(1)His6-Aβ42蛋白的表达：采用1mM IPTG对工程菌BL21-His6-Aβ42诱导蛋白表达，于30℃诱导20h，诱导结束后，将菌液离心收集菌体，获得含有His6-Aβ42融合蛋白的大肠杆菌菌体；
(2)His6-Aβ42蛋白的纯化：用缓冲液将上述所得菌体重悬，加入浓度为1％的苯甲基磺酰氟，冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心30min，收集上清和沉淀，SDS-PAGE凝胶电泳发现目标蛋白存在于沉淀中，即His6-Aβ42蛋白主要以包涵体形式表达；将沉淀用变性溶液(buffer A)溶液完全溶解后，高速离心去除沉淀，将上清经Ni-NTA树脂亲和层析柱，用清洗液(buffer B)清洗后，用适量纯化洗脱液(buffer C)洗脱His6-Aβ42蛋白，最终得到His6-Aβ42蛋白溶液；
(3)透析并纯化His6-Aβ42纤维：将上述His6-Aβ42蛋白溶液用超纯水透析，将洗脱液中的咪唑氯化钠和Tris等杂质去除，同时利用蛋白的强疏水性加速其聚集形成纤维。高速离心，收集沉淀即为His6-Aβ42纤维；
(4)获得高纯度His6-Aβ42单体：将上述His6-Aβ42纤维用六氟异丙醇溶解，超声处理使得纤维充分打散，高速离心去除不溶性杂质后，吸取80％上清进行冻干处理，即得His6-Aβ42蛋白单体。
所述变性溶液(buffer A)组成为：20mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，1mM DTT，pH7.4。
所述清洗液(buffer B)组成为：20mM Tris，150mM NaCl，30mM咪唑，5M尿素，1mMDTT，pH 7.4；
纯化洗脱液(buffer C)组成为：20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，5M尿素，1mMDTT，pH 7.4。
本发明的另一目的是提供所述Aβ42修饰蛋白在阻抗蛋白聚集中的用途。
所述His6-Aβ42蛋白的鉴定：
(1)电泳鉴定：His6-Aβ42蛋白的表达及纯化包涵体蛋白过程中每一步都取样进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示在5.47kDa附近有一条明显的条带；
(2)质谱鉴定：将纯化所得His6-Aβ42蛋白进行MALDI TOF质谱鉴定分子量，结果表明所得产物确为目标His6-Aβ42蛋白；
所述His6-Aβ42蛋白与化学合成的不含多余残基的Aβ42蛋白特性比较：
(1)ThT荧光染色分析聚集特性：将上述纯化所得His6-Aβ42蛋白和ThT一起培养，通过检测荧光值变化来分析聚集特性，发现本发明所得His6-Aβ42比不含多余残基的Aβ42具有明显降低的聚集动力学；
(2)原子力显微镜检测聚集物的形态：上述His6-Aβ42蛋白与化学合成的不含多余残基的Aβ42蛋白分别进行培养，然后用原子力显微镜观察其纤维形态，发现His6-Aβ42形成的聚集物区别于Aβ42蛋白聚集形成的正常纤维。
(3)MTT实验分析其对PC12细胞的毒性：将上述纯化所得His6-Aβ42蛋白以及不含多余残基的Aβ42蛋白分别在适宜条件下进行培养，然后用MTT方法检测其对PC12细胞的毒性，发现该蛋白相对于不含多余残基的Aβ42具有更强的细胞毒性。
需要说明的是，相对于N端，一般更常在C端添加His6标签用于蛋白纯化，在C端添加His6标签的好处是显而易见的，这样可以利用基因本身的ATG作为起始密码子，保证了蛋白天然的N末端，这对于一些医药用的重组蛋白是相当重要的。同时可以纯化出那些完整表达的蛋白，一些在翻译过程中容易中止的蛋白就避免了纯化的产物里含有不完整蛋白的现象。像pET22b表达载体的多克隆位点后面自带His6标签，能使表达出的蛋白C端带上His6标签，以方便后续的纯化。
而本发明则是在N-端添加His6标签，目的则是阻抗Aβ42的聚集，减弱其聚集形成正常纤维的能力，同时还极大地方便了后期蛋白的纯化。
有益效果：
1、本发明提供了一种阻抗蛋白聚集的Aβ42修饰蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化方法，以获得高产、高纯度的N端有His6修饰的Aβ42蛋白，并通过研究该多肽聚集特性和细胞毒性，证明N端有残基修饰的Aβ42相对于不含多余残基的Aβ42其聚集特性明显减弱。本发明所得N端有His6标签修饰的Aβ42中，发明所采用的His6标签是异源性的残基修饰，并且His6标签极大的方便了蛋白的纯化。本发明所得His6-Aβ42蛋白相对于Aβ42其聚集能力整体减弱而非体现在延滞期的延长上，甚至其相对于Aβ42具有更短的延滞期，能更快更高效地达到聚集的稳定期。最终His6-Aβ42达到聚集稳定期时的荧光值相对于Aβ42降低了60％～80％，并且原子力显微镜(AFM)实验显示其聚集形成的纤维形态明显区别于Aβ42。说明本发明所得N端有His6修饰的Aβ42蛋白具有明显阻抗Aβ42聚集的作用。
本发明在Aβ42的N-端添加His6标签，不但方便了后期蛋白的纯化，还由此探究了N端有残基修饰对Aβ42聚集的影响。此特性的发现可以为Aβ42的聚集提供结构上的启发，可以对此进行基于结构的Aβ42聚集抑制剂的设计。还可以为其他淀粉样蛋白如AD致病蛋白tau和帕金森综合征致病蛋白α-突触核蛋白等的基于结构的聚集抑制剂的设计提供思路。
2、本发明构建的表达体系提供了原核生物重组表达His6-Aβ42蛋白的表达载体的构建方法，并将表达载体导入至大肠杆菌表达宿主中，经诱导表达、两步纯化及鉴定后获得具有高纯度生物活性的His6-Aβ42蛋白。本方法所采用的大肠杆菌表达系统、表达载体及纯化过程，具有表达效率高、表达量大、成本低、容易操作等特点，所表达的His6-Aβ42蛋白纯度高、产率高等优点，利用pET22b表达载体，经诱导后几乎能启动转录细胞内所有类型的基因，且能够极大提高插入基因片段的表达量。利用其多克隆位点N端T7强启动子，该启动子为强诱导型启动子，具有较好的选择特异性和活性，可有效提高表达量，精简了纯化过程；为其他疏水性、毒性蛋白或多肽的研究提供了思路。
3、本发明利用Aβ42蛋白的强疏水性，采用简易的纯水透析方法，加速其形成纤维，再利用该蛋白在六氟异丙醇中的较好溶解性，溶解打散纤维，同时排除其他杂蛋白，最终获得高纯度His6-Aβ42单体。该方法解决了表达纯化过程中蛋白形成聚集体和纤维的问题。
4、本发明将纯化所得的His6-Aβ42蛋白以及化学合成的Aβ42进行ThT荧光实验、原子力显微镜实验和细胞毒性实验。将两种蛋白和ThT按一定浓度比例一起培养，通过检测ThT在不同培养时间的荧光值变化来分析其聚集特性，发现所得His6-Aβ42比化学合成的不含多余残基的Aβ42具有明显减弱的聚集特性，原子力显微镜实验显示其形成的纤维形态区别于Aβ42。证明了N端有His6标签修饰对Aβ42聚集特性的影响。
5、本发明将纯化所得的His6-Aβ42蛋白以及化学合成的Aβ42两种蛋白进行培养，然后用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)方法检测其对PC12细胞的毒性，发现该蛋白比化学合成的Aβ42具有更强的细胞毒性，说明His6-Aβ42蛋白更难以聚集形成纤维而体系中含有更多的毒性较强的寡聚体。据此特性，可以利用His6-Aβ42蛋白来研究寡聚体对于细胞的毒性以及相关动物实验研究。
需要说明的是，相对于N端，一般将His6添加在C端来实现蛋白的纯化，并且对于将His6添加至N端对于Aβ42蛋白的性质等的影响方面的研究未见报道。
附图说明：
图1为His6-Aβ42表达和纯化流程图；
图2为表达载体pET22b-His6-Aβ42构建示意图；
其中lacl为乳糖操纵子；ori为转录起始位点；Amp为氨苄青霉素抗性；f1origin为f1噬菌体基因组DNA的复制区序列；
图3为His6-Aβ42蛋白纯化电泳图；
其中，M：蛋白Marker；泳道1：细胞破碎液上清；泳道2：细胞破碎后沉淀(包涵体IBs)；泳道3：buffer A溶解IBs离心后上清；泳道4：buffer A溶解IBs离心后沉淀；泳道5：buffer A溶解IBS上清过Ni-NTA柱的流出液；泳道6：Ni-NTA柱buffer B清洗液；泳道7：buffer C洗脱液，即洗脱His-Aβ42蛋白的溶液；
图4为His6-Aβ42蛋白的基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI TOF)质谱检测分析图；
图5为ThT荧光染色分析聚集特性；
图6为AFM呈像图和纤维高度分析图；
其中A：Aβ42的AFM呈像图和纤维高度分析图B：His6-Aβ42的AFM呈像图和纤维高度分析图；
图7为MTT实验分析细胞毒性。标准差±SD(n＝6)***p<0.001,实验组和对照组相比较,###p<0.001,实验组Aβ42和His6-Aβ42相比较。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明使用限制性内切酶及DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司，小量质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自Omega bio-tech，Ni+树脂购自Sigma公司，其他试剂未特别注明来源的，均购自上海生工生物工程股份有限公司。基因及引物合成来自于苏州金唯智生物科技有限公司。ThT和MTT购自Sigma公司，RPMI 1640培养基(1X)购自Gibco公司。PC12细胞系来源于国家细胞系资源基础设施。除非另有说明，否则所有其他试剂和化学品的纯度均为当地最高。实验操作未详述的，均根据实验室手册——如《分子克隆》进行操作。
实施例1：pET22b-His6-Aβ42表达载体质粒及重组His6-Aβ42大肠杆菌表达菌株的构建
His6-Aβ42表达和纯化流程图如图1所示；
表达载体pET22b-His6-Aβ42构建示意图如图2所示；
(1)根据Aβ42的氨基酸序列以及大肠杆菌密码子偏好性对Aβ42基因序列进行密码子优化，获得Aβ42氨基酸序列如SEQ ID No.3，核苷酸序列如SEQ ID No.4；
(2)利用引物NdeⅠ-His6-Aβ42-F和XhoⅠ-His6-Aβ42-R，引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。其中上游引物NdeⅠ-His6-Aβ42-F含有His6标签的基因序列，通过PCR在Aβ42基因序列上游添加His6标签，得到His6-Aβ42目的基因序列如SEQ ID No.2所示，His6-Aβ42的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.2是通过PCR的方式将His6标签的基因序列添加至Aβ42基因序列的上游，所用的上游引物(如SEQ ID No.5所示)含有经密码子优化后的His6标签基因序列。
HHHHHHDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID No.1)
CACCACCATCATCACCATGATGCCGAGTTTCGCCATGATAGCGGCTATGAGGTGCACCACCAGAAACTGGTGTTCTTTGCCGAGGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCCATTATTGGCCTGATGGTGGGTGGCGTGGTGATTGCC(SEQ ID No.2)；
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID No.3)
GATGCCGAGTTTCGCCATGATAGCGGCTATGAGGTGCACCACCAGAAACTGGTGTTCTTTGCCGAGGATGTGGGCAGCAACAAAGGCGCCATTATTGGCCTGATGGTGGGTGGCGTGGTGATTGCC(SEQ ID No.4)；
NdeⅠ-His6-Aβ42-F:GGAATTCCATATGCACCACCATCATCACCATGATGCCGAGT(SEQ IDNo.5)
XhoⅠ-His6-Aβ42-R:CCGCTCGAGTTAGGCAATCACCACGCCACCCA(SEQ ID No.6)
(3)将所述His6-Aβ42基因插入到表达载体pET22b的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建重组表达载体质粒pET22b-His6-Aβ42；
优选地，操作条件如下：
利用设计好的引物NdeⅠ-His6-Aβ42-F和XhoⅠ-His6-Aβ42-R，通过PCR在Aβ42的DNA序列前方添加His6标签的DNA序列，得到His6-Aβ42目的基因，并进行验证；将验证正确的His6-Aβ42基因片段与pET22b表达载体连接，16℃反应4-6h后，连接产物加入到大肠杆菌JM109感受态细胞中，冰浴30min，42℃反应1min 30s，冰浴2min，加入1mL LB液体培养基复苏液，250rpm，37℃孵育1h；
4000rpm离心5min收集菌体，去除后重悬菌体，涂布氨苄霉素抗性的LB培养基平板，37℃培养过夜。挑取单菌落至液体培养基中，250rpm，37℃过夜培养。
菌落PCR鉴定阳性克隆后进行测序分析，提取测序正确的阳性转化子质粒备用，菌落PCR验证正向引物和反向引物见SEQ ID No.5和SEQ ID No.6；
(4)重组His6-Aβ42大肠杆菌表达菌株的构建：
将测序正确的pET22b-His6-Aβ42表达载体质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中，菌落PCR验证转化子，最终获得重组Aβ42基因的大肠杆菌工程菌BL21-His6-Aβ42.
实施例2：His6-Aβ42蛋白的表达及纯化
His6-Aβ42表达和纯化流程图如图1所示。
(1)His6-Aβ42蛋白的表达：采用1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白表达，将实施例1得到的工程菌BL21-His6-Aβ42于30℃诱导20h，诱导结束后，将菌液离心收集菌体，获得含有His6-Aβ42融合蛋白的大肠杆菌菌体；
(2)His6-Aβ42蛋白的纯化：用缓冲液将上述所得菌体重悬，加入1％的苯甲基磺酰氟，冰浴30min后超声破碎，12000rpm离心30min，由于His6-Aβ42蛋白主要以包涵体形式表达，使用含尿素的buffer A溶液使包涵体变性溶解。
所述变性溶液(buffer A)组成为：20mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，1mM DTT，pH7.4。
高速离心去除沉淀，将上清经Ni-树脂亲和层析柱，清洗液(buffer B)清洗后，用适量纯化洗脱液(buffer C)洗脱蛋白。
所述清洗液(buffer B)组成为：20mM Tris，150mM NaCl，30mM咪唑，5M尿素，1mMDTT，pH 7.4；
纯化洗脱液(buffer C)组成为：20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，5M尿素，1mMDTT，pH 7.4。
(3)透析并纯化His6-Aβ42纤维：将上述His6-Aβ42蛋白溶液用超纯水透析，将洗脱液中的咪唑、氯化钠和Tris等盐成分去除，同时利用蛋白的强疏水性加速其聚集形成纤维。高速离心，收集沉淀即为His6-Aβ42纤维；
(4)获得高纯度His6-Aβ42单体：将上述His6-Aβ42纤维用六氟异丙醇溶解，超声处理使得纤维充分打散，高速离心去除不溶性杂质后，吸取80％上清进行冻干处理，即得His6-Aβ42蛋白单体。
实施例3：His6-Aβ42多肽鉴定
(1)电泳鉴定：将本发明实施例2制备得到的His6-Aβ42蛋白经SDS-PAGE电泳确定纯度及分子量，如图3所示，在5.47kDa附近有一条明显的条带。经NanoDrop 2000蛋白核酸定量仪检测蛋白浓度，最终计算1L菌液可得约22mg His6-Aβ42多肽。
(2)质谱鉴定：将纯化所得His6-Aβ42多肽进行MALDI TOF质谱鉴定，如图4所示，荷质比为5470的峰即为His6-Aβ42多肽，因此可证明该蛋白即为目标蛋白His6-Aβ42。
实施例4：硫黄素(ThT)荧光染色分析His6-Aβ42蛋白和Aβ42蛋白的聚集动力学
(1)已知荧光化合物硫黄素(ThT)具有与淀粉样蛋白的β-sheet结构特异性结合而显著增强荧光强度的性质。将本发明实施例2制备得到的His6-Aβ42蛋白脱盐并冻干处理后，取少量His6-Aβ42蛋白和化学合成的Aβ42蛋白粉末，分别用适量20mM NaOH溶液溶解，冰水浴超声处理10min后16000rpm离心25min，取80％上清检测蛋白浓度。并分别用PBS缓冲液(pH 7.4)稀释至25μM和50μM，浓度按His6-Aβ42：ThT＝1:3比例配置，于37℃下震荡培养，转速200rpm。在激发波长440nm，发射波长480nm条件下检测不同培养时间下的荧光强度变化来分析其聚集特性。
如图5结果显示：Aβ42和His6-Aβ42的ThT荧光值都随时间迅速增大，均没有明显的延滞期，其中His6-Aβ42培养大约8小时后逐渐进入稳定期，而多次实验显示Aβ42培养大约12小时后才逐渐进入稳定期，说明His6-Aβ42相对于Aβ42能更快的达到聚集稳定期。而对比两种蛋白达到聚集的稳定期时的ThT荧光强度，重组His6-Aβ42蛋白则明显低于Aβ42的ThT荧光强度。证明本发明所得His6-Aβ42蛋白相对于不含多余残基的Aβ42其聚集动力学处于整体降低的趋势，其聚集稳定期时的荧光值相对于Aβ42降低了60％～80％。初步证明了His6-Aβ42相对于不含多余残基的Aβ42具有明显减弱的聚集性，且本发明通过在Aβ42的N端添加His6标签，使得其阻抗蛋白聚集的性能更具有高效性，可以在更短的时间达到蛋白聚集过程的稳定状态。
实施例5：AFM检测His6-Aβ42蛋白和Aβ42蛋白聚集物的形态
将培养至稳定期的本发明制备的His6-Aβ42蛋白和化学合成的Aβ42蛋白溶液取10μl置于新鲜的云母片上，在室温下孵育10分钟，用去离子水洗涤三次以去除盐和松散结合的蛋白，然后在空气中自然晾干。在空气中使用AFM(Bruker，美国)进行智能模式成像，标准扫描式空气硅探头尖端(悬臂115μm，弹簧常数0.4N/m，共振频率约70kHz，尖端半径2nm)。扫描参数设置如下：峰值力设定值，0.3-1.0V；扫描速率，0.8-2.0Hz；扫描尺寸，5μm×5μm；分辨率，512行。所有AFM图像均使用Nanoscope Analysis 1.8软件(美国布鲁克)进行分析。
如图6A所示，Aβ42呈现典型的形态较清晰的较长纤维，长度在600-1500nm之间，如图6B所示His6-Aβ42仅观察到长度在200-500nm之间的形态短而细的纤维和更多的无定形聚集物。尽管其个别纤维高度和Aβ42形成的纤维类似，约为8nm(如图中绿色短线所示)。
实施例6：用MTT方法检测His6-Aβ42蛋白和Aβ42蛋白培养物对PC12的细胞毒性
(1)细胞毒性实验中使用的细胞为鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株(PC12)。首先，取低分化细胞，用含有10％胎牛血清和1％青霉素一链霉素的培养基进行培养，并向培养基中加入神经细胞生长因子(nerve growth ractor，NGF)，使其终浓度为50ng/mL，5％CO2，37℃培养3天。观察到PC12细胞在NGF诱导下长出较长的突起，成为高分化细胞后向培养瓶中加入含有0.25％胰酶的溶液对高分化细胞进行消化，再用含有10％胎牛血清和1％青霉素一链霉素的RPMI 1640培养基以适当浓度稀释细胞，以5×104cell/孔的细胞浓度加入到96孔板，每孔90μL。5％CO2，37℃培养24h。
(2)配制His6-Aβ42蛋白和化学合成的Aβ42蛋白溶液，均采用30μM的培养浓度，其中蛋白的处理方法与实施例4相同，37℃培养24h。
(3)将上述老化好的两种蛋白溶液加入到已经培养24h的含有PC12的96孔板中，10μL/孔。空白对照孔中加入PBS缓冲液10μL/孔。最终使加蛋白组每孔中蛋白终浓度为3μM。细胞在培养箱中以5％CO2，37℃培养48h后，加入10μL/孔的MTT溶液,使得培养基中的MTT终浓度为0.5mg/mL。5％CO2，37℃条件继续培养4h。
(4)移除96孔板中溶液，每孔加入100μL的DMSO摇床震荡10min，检测570nm处吸光值。将培养基中不含蛋白的孔作为空白对照组，记为细胞活性为100％，然后将其作为对照计算加蛋白组的细胞存活率。实验中每个蛋白设置6个复孔。
由图7可知和Aβ42蛋白一起培养的细胞存活率为50％，而和His6-Aβ42蛋白一起培养的细胞存活率降为25％，说明His6-Aβ42蛋白对于细胞的毒性明显高于Aβ42蛋白。这是因为Aβ42聚集过程中会经历寡聚体这一阶段，并且研究显示寡聚体相对于纤维具有更高的细胞毒性，相关动物实验也证明了这一结论，而不含多余残基的Aβ42相对于重组His6-Aβ42具有明显强的聚集能力，更容易聚集成纤维，其体系中含有更少的寡聚体。相比之下，His6-Aβ42则更难聚集形成纤维，其体系中含有更多的寡聚体，其细胞毒性相对于Aβ42也更大。同样的，蛋白培养浓度越大其聚集形成纤维的能力也越强，相对于更小的培养浓度其体系中寡聚体含量也越少，细胞毒性也越小。
His作为残基链的特殊性，以及其对降低荧光强度，降低蛋白聚集性的原理解释：
His6标签是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸，其特点是分子量小，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，六组氨酸(His6)标记是蛋白质表达和纯化中最常用的融合标记之一。与其他融合标签相比，His6标记对许多蛋白质的结构和功能特性的影响可以忽略不计。例如，His标记的α-突触核蛋白被用来研究多酚表没食子酸儿茶素酯(EGCG)的聚集抑制机制。将His6标签添加在N端的初衷是为了研究其和His6标签添加在C端的区别，并方便蛋白的纯化。
最终发现其聚集动力学明显区别于Aβ42，并且形成的聚集物形态也和Aβ42有所不同。对于ThT实验降低荧光强度的原理简单来说就是His6-Aβ42相对于Aβ42其组装形成纤维的能力降低，这样就会形成更少的β-sheet结构，而ThT分子只有和β-sheet结构结合才会发光，所以His6-Aβ42的荧光强度明显低于不含多余残基的Aβ42。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种具有阻抗蛋白聚集功能的Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法
<130> 1
<141> 2019-06-28
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
His His His His His His Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser
20 25 30
Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40 45
<210> 2
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
caccaccatc atcaccatga tgccgagttt cgccatgata gcggctatga ggtgcaccac 60
cagaaactgg tgttctttgc cgaggatgtg ggcagcaaca aaggcgccat tattggcctg 120
atggtgggtg gcgtggtgat tgcc 144
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 4
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gatgccgagt ttcgccatga tagcggctat gaggtgcacc accagaaact ggtgttcttt 60
gccgaggatg tgggcagcaa caaaggcgcc attattggcc tgatggtggg tggcgtggtg 120
attgcc 126
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
ggaattccat atgcaccacc atcatcacca tgatgccgag t 41
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ccgctcgagt taggcaatca ccacgccacc ca 32

Claims (8)

1.一种Aβ42修饰蛋白，其特征在于：所述Aβ42修饰蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述Aβ42修饰蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述Aβ42修饰蛋白在阻抗Aβ42蛋白自身的聚集中的用途。
4.包含权利要求1所述Aβ42修饰蛋白编码基因的表达载体或宿主细胞。
5.如权利要求4所述的表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述表达载体为pET22b，所述宿主细胞为大肠杆菌。
6.权利要求1所述Aβ42修饰蛋白的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)在所述Aβ42的基因序列的上游添加6个His，得到His6-Aβ42基因；
(2)将所述His6-Aβ42基因插入到经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的表达载体pET22b上，构建重组表达载体质粒pET22b-His6-Aβ42；
(3)将所述步骤(2)中构建的重组表达载体质粒转入宿主菌大肠杆菌E coli.BL21(DE3)，得到重组菌株；
(4)对所述重组菌株进行诱导，表达His6-Aβ42蛋白，并收集菌体经破碎后，利用变性溶液使包涵体变性；
(5)变性后过Ni-NTA树脂，利用纯化洗脱液进行亲和层析纯化得His6-Aβ42蛋白；
(6)透析去除所述步骤(5)得到的His6-Aβ42蛋白中的杂质，促进His6-Aβ42蛋白聚集形成淀粉样纤维；
(7)透析完成后经离心得到沉淀，利用六氟异丙醇溶液溶解所述沉淀，经溶解、离心，取上清经冻干，即得His6-Aβ42蛋白。
7.如权利要求6所述Aβ42修饰蛋白的制备方法，其特征在于：所述变性溶液组成为：20mM Tris，150mM NaCl，8M尿素，1mM DTT，pH 7.4。
8.如权利要求6所述Aβ42修饰蛋白的制备方法，其特征在于：所述纯化洗脱液组成为：20mM Tris，150mM NaCl，500mM咪唑，5M尿素，1mM DTT，pH 7.4。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111620941B (zh) * 2020-05-28 2023-03-17 西安医学院 DAβ42及其表达载体、DAβ42的制备方法和应用
CN113025675B (zh) * 2021-05-21 2021-08-20 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 多肽的制备方法
CN117700525B (zh) * 2024-02-05 2024-06-18 上海良润生物医药科技有限公司 一种多肽改造体及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020054870A1 (en) * 1996-03-22 2002-05-09 Synaptica Limited Peptide from soluble form of acetylcholinesterase, active as a calcium channel modulator
CN101832919A (zh) * 2010-05-12 2010-09-15 中国科学院长春应用化学研究所 一种抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选方法
CN101948523A (zh) * 2010-08-26 2011-01-19 北京交通大学 一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法和用途
WO2016033774A1 (zh) * 2014-09-04 2016-03-10 天津医科大学 用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽
CN107746432A (zh) * 2017-10-27 2018-03-02 天津科技大学 一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020054870A1 (en) * 1996-03-22 2002-05-09 Synaptica Limited Peptide from soluble form of acetylcholinesterase, active as a calcium channel modulator
CN101832919A (zh) * 2010-05-12 2010-09-15 中国科学院长春应用化学研究所 一种抑制β淀粉样蛋白沉积的药物的筛选方法
CN101948523A (zh) * 2010-08-26 2011-01-19 北京交通大学 一种低分子量淀粉样肽寡聚体的人工体外制备方法和用途
WO2016033774A1 (zh) * 2014-09-04 2016-03-10 天津医科大学 用于预防和/或治疗阿尔茨海默病的β片层阻断肽
CN107746432A (zh) * 2017-10-27 2018-03-02 天津科技大学 一种Aβ42修饰蛋白及其表达与纯化方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A novel method for expression and purification of authentic amyloid-β with and without 15N labels;Yi-Hung Liao;《Protein Expression and Purification》;20150509;第113卷;第63-71页 *
淀粉样β蛋白质构象转换及其抑制的分子动力学模拟;李丽;《生物加工过程》;20190115;第17卷(第1期);第44-52页 *

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