CN117126832B - 一种重组人凝血因子ix融合蛋白及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种重组人凝血因子IX融合蛋白及其制备方法,属于基因工程技术领域。所述的重组人凝血因子IX融合蛋白中包括人凝血因子IX突变体,所述的人凝血因子IX的序列为SEQ ID NO.1,其第194位的A突变为T,且第384位的R发生突变。本发明的人凝血因子IX突变体相较于突变前序列,所制备的融合蛋白比活提升,且相应的细胞株产量高、筛选速度快、稳定性好,优于市售产品,有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种重组人凝血因子IX重组质粒的构建及其稳定细胞株的建立方法,和依照该方法建立的稳定细胞株;以及融合蛋白及其制备方法和用途,特别是治疗多种凝血相关疾病的用途。
背景技术
血友病B是一种X染色体连锁的隐性遗传性出血性疾病,患者因体内缺乏凝血因子IX(Factor IX,FIX)而易发生出血事件。病情严重程度与FIX的缺乏程度相关,重症血友病B患者体内的FIX含量小于正常人的1%,患者频繁发生自发性出血,如关节内出血、软组织血肿、腹腔出血和脑出血等,最终导致严重的关节病、慢性疼痛、残疾和死亡。
FIX替代治疗药物一直是血友病B药物的研发热点,主要分为人血浆天然提取的IX因子(pdFIX,plasma-derived FIX)和重组蛋白IX因子(rFIX,recombinant FIX)两大类。
pdFIX制品来源于人血液,存在传播血液感染病的风险(血液传播的病毒、支原体,如肝炎病毒和HIV病毒等)。且由于提取工艺对血浆质量要求高,且血浆来源有限,该类产品价格也较为昂贵。另一方面,天然IX因子在人体内半衰期很短,约18-24小时,患者需要反复输血液制品,这样不仅费用昂贵,还可能引起严重的输血反应,凝血酶原复合物中微量的激活因子还可能激活凝血级联反应,引起血栓形成和栓塞。
目前市售国产血源性IX因子的半衰期相对较短,只有18小时,这使得血友病人在发生出血后应急式按需治疗过程中抑或是出血发生前预防治疗应用中都需要接受频繁静脉注射给药。B型血友病人推荐每周接受2-3次,每次40-100IU/kg剂量注射IX因子以预防出血事件发生。因而迫切需要开发长效重组IX因子制剂,通过延长产品血浆半衰期来减少用药次数,从而减轻患者身心负担,大大提高患者依从性。
延长IX因子体内半衰期的方法包括聚乙二醇化和融合蛋白技术,目前并无国产长效IX因子上市或进入临床试验。国外Novo Nordisk公司的IX因子产品Refixia®通过聚乙二醇化延长了半衰期,CSL Behring公司的IX因子产品Idelvion®使用了白蛋白融合技术,Biogen Idec公司的AlprolIX®则是融合Fc蛋白的长效IX因子产品。Refixia®临床试验结果显示,累计给药3次可使FIX半衰期延长5倍(平均半衰期为110h)。然而试验观测到1例严重的超敏反应,3例产生了非抑制性抗体。Idelvion®临床试验结果显示其半衰期为89-96小时,且病人没有出现特殊免疫反应;但安全性还有待验证。Biogen Idec公司的AlprolIX®是一种重组长效IX因子药物,它是人IgG1的双链Fc片段N末端共价结合单个FIX分子形成的融合蛋白,由HEK-293H细胞重组表达。临床研究显示,AlprolIX®半衰期为57-86小时,预防性用药时用药频次可达7或10天给药一次。但是Fc融合后也不可避免地发生了比活性降低问题,体外活性检测证实AlprolIX®的摩尔比活性(IU/nmol)仅为天然IX因子的50%(Peters RT等,Blood,2010,115(10):2057-64)。
综上所述,目前国产血源性IX产品通常产量较低且半衰期短,而进口长效IX因子又价格昂贵而且也存在一些问题。因此开发一种表达量高、活性高、价格低廉的长效IX因子产品对血友病药物开发具有重大意义。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种人凝血因子IX突变体并构建了一种表达量高、活性高的长效重组人凝血因子IX融合蛋白,以期发现临床应用效果更好的药物。
本发明中,如无特别说明,氨基酸的简写与本领域所认知的具有相同的含义,示例如A表示丙氨酸,T表示苏氨酸,R表示精氨酸,L表示亮氨酸,Q表示谷氨酰胺。
一方面,本发明提供了一种人凝血因子IX突变体。
所述的人凝血因子IX突变体在人凝血因子IX基础上同时发生两处突变,所述的人凝血因子IX的序列为SEQ ID NO.1第1-461位;所述的两处突变分别为第194位的A突变为T和第384位的R发生突变。
优选地,所述的第384位的R突变为L或Q。即,所述的人凝血因子IX突变体序列选自SEQ ID NO.2-3第1-461位。
另一方面,本发明提供了包括上述人凝血因子IX突变体的融合蛋白。
所述的融合蛋白还可以包括人免疫球蛋白Fc段,所述的人免疫球蛋白包括但不限于:IgG(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4及其突变体)、IgM、IgA等。
所述的人免疫球蛋白Fc段上可以包括终止子。
优选地,所述的融合蛋白还可以包括人免疫球蛋白IgG1的Fc段,更优选为SEQ IDNO.4所示的Fc段。
优选地,所述的融合蛋白为异源二聚体复合物。
所述的融合蛋白上还可以包括连接子。
所述的连接子可以是(GGS)n,所述的n可以是≥1的整数。
所述的连接子优选为GGS。
再一方面,本发明提供了与前述人凝血因子IX突变体和融合蛋白相关的基因工程产物。
所述的基因工程产物可以是核酸、载体或细胞。
具体地,所述的核酸可以表达前述人凝血因子IX突变体或融合蛋白。基于密码子简并性,事实上在确定人凝血因子IX突变体或融合蛋白的氨基酸的情况下,本领域技术人员可以通过逆转录原理获得多种核酸,以实现人凝血因子IX突变体或融合蛋白的表达。
具体地,所述的载体为表达载体,所述的载体上包括前述的核酸。
所述的载体的类型可以由本领域技术人员进行常规选择,能够对前述的核酸进行表达即可,优选为哺乳动物表达载体,包括但不限于:pcDNA系列载体,pTT5载体,pCMV载体,pBK载体等以及腺病毒慢病毒表达载体。
所述的细胞可以理解为基因工程细胞,一般包括前述的表达载体,通过表达载体采用一般手段转化获得相应细胞,再通过常规培养方式使其表达前述的人凝血因子IX突变体或融合蛋白。
所述的细胞的类型可以由本领域技术人员进行常规选择,能够对前述的核酸进行表达即可,优选为哺乳动物细胞,包括但不限于:CHO细胞系,HEK293细胞系,COS细胞系,PER.C6细胞系,CAP/CAP-T细胞系等。
又一方面,本发明提供了前述的融合蛋白的制备方法。
所述的制备方法包括:
1)构建包括前述的人凝血因子IX突变体基因和人免疫球蛋白Fc段基因的表达载体1;
2)构建表达人免疫球蛋白Fc段基因的表达载体2;
3)表达载体1和表达载体2共转染细胞;
4)转染完成后培养细胞。
优选地,所述的表达载体1和表达载体2的载体骨架为pcDNA3.1;所述的人免疫球蛋白Fc段基因上含终止子。
优选地,所述的表达载体1上还包括连接子基因;进一步优选地,所述的连接子为GGS。
优选地,所述的连接子基因与人免疫球蛋白Fc段基因连接。
优选地,所述的表达载体1上外源基因的插入位点为BamH I和Hind III。
在一些实施例中,所述的步骤1)包括:获得人凝血因子IX突变体基因片段、获得连接子基因与人免疫球蛋白Fc段基因(含终止子)的组合片段;获得的两种片段利用同源重组连接至载体骨架。
优选地,所述的表达载体2上外源基因的插入位点为NheI和NotI。
优选地,所述的步骤3)中表达载体1和表达载体2的摩尔比为1:1-1:8。也即,人凝血因子IX突变体基因和人免疫球蛋白Fc段基因的组合片段与人免疫球蛋白Fc段基因的摩尔比为1:1-1:8;所述的细胞优选为293细胞,更优选为Expi293F细胞。
在一些实施例中,所述的步骤3)中还可以包括细胞筛选步骤对转染后细胞进行筛选,优选地,使用G418(200mg/L-400mg/L)筛选,获得稳定细胞株,建立细胞库。稳定细胞株冻于液氮中保藏。
所述的步骤4)中的培养条件可以由本领域技术人员进行常规调节,如细胞的接种浓度可以是3.0×106-4.0×106cells/mL,培养基中可以包括蔗糖、VPA、维生素K等。
优选地,所述的培养基中包括5-10mg/L蔗糖、1-5mM VPA、0.5mg/L-2mg/L维生素K;进一步优选地,所述的培养基中包括7g/L蔗糖、3mM VPA、1mg/L维生素K。
在一些实施例中,所述的制备方法还可以包括纯化步骤,所述的纯化包括但不限于亲和层析(示例如Protein A亲和纯化)、离子交换层析(示例如阴离子层析)、疏水层析、超滤换液中的任意一种或多种。
所述的纯化可以是对发酵的细胞上清液进行纯化。本发明的表述中,发酵也可以理解为培养,如细胞发酵上清液、细胞培养上清液、培养细胞得到的上清液、发酵细胞得到的上清液,在描述本发明的纯化步骤时,具有类似的含义。
又一方面,本发明提供了前述的人凝血因子IX突变体或融合蛋白或核酸或表达载体或细胞在制备药物中的应用。
所述的药物用于预防或治疗IX因子缺乏或功能缺陷导致的疾病。
优选地,所述的药物为凝血药物。
优选地,所述的疾病为出血性疾病。
进一步优选地,所述的疾病为血友病,更具体为B型血友病。
所述的药物的剂型包括但不限于:注射剂、输液剂、缓释剂等包含本发明蛋白的制剂。
所述的药物中还可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。
所述的药物中还可能包括本领域常用的其他佐剂,如:水,葡萄糖,盐水,缓冲液,甘油,甘露糖等。
本发明的有益效果:
(1)本发明通过在FIX蛋白序列上突变194,384位点获得了FIX蛋白突变体,相较于突变前,所制备的融合蛋白的活性大大提升。
(2)本发明在FIX的C端插入Fc序列,与单独的Fc蛋白组成异源二聚体复合物;使FIX具有长效性。
(3)本发明通过突变FIX蛋白构建的融合蛋白高于国外同类产品,比辉瑞的BeneFIX®(普通型商品蛋白)高12-18.5倍,比Biogen的AlprolIX®(长效型商品蛋白,未突变的FIX-Fc/Fc融合蛋白)高53-82倍。
(4)本发明分别将2种重组质粒转入Expi293F细胞中,用G418筛选得到稳定细胞株,大大提高rFIX的产量。且筛选速度快、稳定性好。相对于Biogen公司使用HEK-293H细胞表达rFIX蛋白,Expi293F细胞具有更快的细胞生长速度和更高的培养活性,有利于提高rFIX蛋白产量。
(5)本发明构建的基因工程细胞在3L摇瓶中培养5-7天,累积产量至少可达到25mg/L,可进行工艺放大,实现大规模工业化生产。体外活性可达2400-3700 IU/mg。蛋白纯度高于95%。
(6)根据本发明,制备所述重组长效IX因子可用于预防或治疗因IX因子缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,可填补国内长效血友病治疗药物的空白,替代进口产品。本发明所述的融合蛋白相对于Biogen公司开发的 rFIX-Fc/Fc融合蛋白AlprolIX®具有一定的技术优势和价格优势,其表达、纯化工艺都更简单、高效,生产成本也更低。Biogen公司构建了rFIXFc与Fc的双表达载体,其中Fc分子以Flag标记(欧洲专利,公开号:EP1624891B1)。其所表达的融合蛋白发酵液中预期应含有三种形式的产物,分别是FIX-Fc/FIX-Fc同源二聚体型 (Dimeric)融合蛋白、FIX-Fc/Flag-Fc单体-二聚体杂合体(Monomeric)融合蛋白以及FLAG-Fc/Flag-Fc二聚体三种产物。在纯化过程中还必须去除另外两种形式的杂质,这使其纯化过程也更为复杂、生产效率低下,其生产成本也大大增加。本发明的制备方法优化了rFIX-Fc与Fc的比例,使其表达产物主要是rFIX-Fc/Fc融合蛋白以及Fc/Fc二聚体两种产物,纯化步骤更简单。
本发明所述融合蛋白无论在发酵、纯化过程以及储存过程中均具有良好的稳定性,具有良好的市场前景。
附图说明
图1为本发明pcDNA3.1-rFIX(mutant)-Fc载体构建示意图,其中A图为构建流程;B图为rFIX(mutant)-Fc核酸片段琼脂糖凝胶电泳图,M表示Marker,F1大小为1383bp;F2大小为1383bp;F3大小为709bp。
图2为本发明pcDNA3.1-Fc载体构建示意图,其中A图为构建流程;B图为Fc核酸片段琼脂糖凝胶电泳图,M表示Marker,F4大小为709bp。
图3为纯化后rFIX(mutant)-Fc/Fc融合蛋白SDS-PAGE电泳图,图中所有marker由上到下表示:180kDa、135kDa、100kDa、75kDa、63kDa、48kDa、35kDa、25kDa;其中A为含A194T,R384L突变的融合蛋白SDS-PAGE电泳图,B为含A194T,R384Q突变的融合蛋白SDS-PAGE电泳图。
图4为纯化后rFIX(mutant)-Fc/Fc融合蛋白WestonBlot检测图。其中A为含A194T,R384L突变的融合蛋白WestonBlot检测图,B为含A194T,R384Q突变的融合蛋白WestonBlot检测图。
图5为纯化后rFIX(mutant)-Fc/Fc融合蛋白SEC-HPLC纯度检测图。其中A为A194T,R384L突变的融合蛋白的SEC-HPLC检测结果,B为A194T,R384Q突变的融合蛋白的检测结果。
图6为纯化后rFIX(A194T,R384L)-Fc/Fc融合蛋白SEC-MALS分子量测定图。其中A为原始数据图,包括dRI(示差折光检测信号曲线),UV(280nm紫外吸收峰图),LS11(经18角度激光光散射检测器检测的第11通道的激光散射信号图),其中峰1为可检测到的蛋白主峰(时间区段标记1-1),峰2为少量的蛋白聚体峰(时间区段标记2-2),溶剂峰的溶剂指水。B为经计算后在水溶液中的融合蛋白分子质量分布图,图中每个散点代表在X轴时间点处检测到分子经积分后计算的分子质量于Y轴的交叉点,B中对可检测到的蛋白主峰位置峰1以及少量聚体峰位置峰2分别进行了积分(分别保留了时间区段标记),表明了两种不同聚体状态的rFIX(A194T,R384L)-Fc/Fc融合蛋白的质量分布。
图7为纯化获得rFIX(mutant)-Fc/Fc融合蛋白比活性检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例,对本发明作进一步详细的阐述,下述实施例不用于限制本发明,仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中,rFIX(mutant)或rFIX(突变体)或FIX(mutant)或FIX(突变体)均指凝血因子IX的突变体相关序列,有时括号中的mutant以特定突变形式替代,在不限定具体突变形式时,所有突变形式可以用mutant指代,且本领域技术人员可以根据具体的操作步骤判断该处表述是指氨基酸序列或核苷酸序列,示例如,当涉及凝血因子IX的突变体本身时,本领域技术人员可以理解其指代的是氨基酸序列;当涉及相关表达载体时,其指代的可以是凝血因子IX的突变体的表达基因,即核苷酸序列。在一些情况下,本发明中还可以出现如FIX(1-461aa,A194T,R384L)的表达方式,其表示的序列含义为:FIX序列第1-461个氨基酸且包括A194T和R384L突变,该种表述方式一般可以理解为与rFIX(A194T,R384L)具有相同的含义;以上表述方式或理解方式不影响本发明技术方案的实施。
实施例1
1、重组人凝血因子IX真核表达载体的构建
(1)构建pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384L)和pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384Q)
取哺乳动物高效表达载体pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific Inc.V79020),使用BamH I和Hind III双酶切成线性载体,电泳回收。利用PCR扩增,分别获得人凝血因子IX基因序列F1(SEQ ID NO.5,编码FIX(1-461aa,A194T,R384L)),F2(SEQ ID NO.6,编码FIX(1-461aa,A194T,R384Q))和连接子-Fc基因序列F3(SEQ ID NO.7,编码连接子-IgG(216-447aa)),电泳回收。
再将F1+F3、F2+F3片段分别与pcDNA3.1线性化载体以1:1:2的摩尔比混合,在无缝克隆酶(2×MultiF Seamless Assembly Mix,爱博泰克生物,RK21020)的作用下(50℃,45min)进行体外连接。得到重组质粒pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384L)-Fc和pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384Q)-Fc,重组质粒经测序鉴定,序列正确。
pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384L)-Fc和pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384Q)-Fc的构建流程参见图1中的A,F1、F2、F3的电泳结果见图1中的B。
(2)构建pcDNA3.1-Fc
取哺乳动物高效表达载体pcDNA3.1使用NheI和NotI双酶切成线性载体,电泳回收。利用PCR扩增,获得Fc基因序列F4(SEQ ID NO.8,编码IgG(216-447aa)),电泳回收。
再将F4 片段与pcDNA3.1线性化载体以1:2的摩尔比混合,在无缝克隆酶(2×MultiF Seamless Assembly Mix)的作用下(50℃,45 min)进行体外连接。得到重组质粒pcDNA3.1-Fc,重组质粒经测序鉴定,序列正确。
pcDNA3.1-Fc的构建流程参见图2中的A,F4的电泳结果见图2中的B。
2、哺乳动物细胞Expi293F的培养,转染、筛选,蛋白表达
(1)细胞培养
Expi293F细胞(Thermo Fisher Scientific Inc.,A14527),复苏好培养于250mL细胞培养摇瓶中,培养条件37℃,7%CO2,125 rpm。培养液为无血清Expi293TM ExpressionMedium(四川维亚本苑生物科技有限公司,A14351-01),防止血液来源制剂传播感染性疾病;不添加任何抗生素。待细胞浓度达到3.0×106cells/mL时即可传代。
(2)转染、筛选
转染前一天,将Expi293F细胞按2×106cells/mL密度种于摇瓶中,过夜培养使得次日细胞活率大于98%。
转染第一天,将细胞稀释至浓度为2.7×106cells/mL,以转染体积1000mL为例:
A液:取1-3mg混合质粒加入50mL Opti-MEM medium(混合质粒组成为:pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384L/Q)-Fc,及pcDNA3.1-Fc按照摩尔比1:1-1:8),充分混匀。
B液:取5-7mg PEI加入50mL Opti-MEM medium,充分混匀。
室温孵育3分钟。
将A液、B液混合后,室温孵育15分钟得混合液。
将以上混合液加入Expi293F细胞培养液中,37℃,7%CO2,125 rpm震荡培养。
连续培养20小时后,加入G418(200mg/L-400mg/L)筛选。
每2-3天更换一次含有G418的筛选培养液,连续筛选6-8代后,细胞活率达到95%,获得2种Expi293F稳定细胞株,即稳定细胞株rFIX(A194T,R384Q)-Fc/Fc。建立细胞库。稳定细胞株冻于液氮中保藏。
稳定细胞株rFIX(A194T,R384L)-Fc/Fc的构建参照以上方法区别在于A液中的质粒替换为pcDNA3.1-rFIX(A194T,R384L)-Fc。
(3)蛋白表达
取稳定细胞株,以表达体积1000mL(基础培养基为Expi293TM ExpressionMedium,四川维亚本苑生物科技有限公司,A14351-01)为例,当细胞浓度达到3.0×106-4.0×106cells/mL,加入5-10mg/L蔗糖、3mM VPA、0.5mg/L-2mg/L维生素K。连续表达5-7天,当细胞活率低于80%时,收获培养上清。
3、蛋白纯化
本发明主要采用亲和层析法对rFIX(mutant)-Fc/Fc融合蛋白进行纯化(本实施例采用的蛋白纯化仪为美国GE公司的AKTA Explorer 100;本实施例中试剂均购自国药集团化学试剂有限公司,纯度均为分析级)。
(1)亲和层析
采用GE公司的Mabselect PrismA(本实施例)或其它市售的重组protein A亲和层析介质(例如GE的Mabselect、Mabselect Sure LX、天地人和的rProtein A Bead)进行样品捕获、浓缩以及部分污染物去除。此步骤后洗脱液中目的蛋白纯度大于等于80%。
(2)阴离子层析:使用GE公司的Q Sepharase FF(本实施例)或其它市售的阴离子层析介质(例如GE的DEAE Sepharose FF、Q Sepharose HP、天地人和的DEAE Beads 6F)进行纯化,用于去除Fc/Fc二聚体、HCP(Host Cell Protein,宿主蛋白)、残留DNA、脱落ProteinA等杂质。通常此步纯化后的rFIX(mutant)-Fc/Fc蛋白纯度将大于等于90%,如纯度未达到百分之95%可选择使用额外的疏水层析进行进一步纯化。
(3)疏水层析:使用GE公司的HiPrep Phenyl FF(High Sub)或其它市售的亲和层析介质(例如赛多利斯的Sartobind®)进行最后精纯,去除少量表达的rFIX(mutant)-Fc/rFIX(mutant)-Fc二聚体,进一步去除HCP、DNA等杂质。
4、蛋白检测
对纯化后蛋白进行SDS-PAGE电泳结果、WestonBlot检测结果和SEC-HPLC纯度检测。
WestonBlot检测:
(1)电泳。将胶板装好,放入电泳槽中,内槽加满电泳液,外槽电泳液加至相应黑线处。加入Marker、蛋白样品、及阳性对照。盖好电泳盖,开始电泳。低压80V 电泳至浓缩胶底部,然后高压120V至玻璃板底部(或根据目的蛋白大小及Marker确定电泳时间)。
(2)切胶。用绿色切胶板按蛋白分子量进行切胶,边缘留点空余以防切到目的条带,在转膜液中轻轻将胶与胶板分离。
(3)转膜。按照胶的大小裁剪出比膜稍大的PVDF膜(不可用手直接接触PVDF膜),用无水甲醇激活10s。在转膜液中按顺序操作:黑板在下(负极)—海绵—两层滤纸—凝胶胶—PVDF膜—两层滤纸—海绵—白夹板在上(正极)。将夹板夹紧,黑板对黑板,插入转膜仪,电极黑对黑红对红,放入冰袋,加入转膜液没过夹板。将转膜仪放在加满冰的冰盒中。100V转膜90min。
(4)封闭。将PVDF膜取出,用10mL 5%脱脂牛奶(Beyotime,P0216-1500g)室温下孵育1h(或4℃过夜孵育)。
(5)一抗孵育。用10mL 5%脱脂牛奶按1:10000加入一抗(beyotime,AF6849),室温孵育1h(或4℃过夜孵育)后用TBST洗三次,每次5min。
(6)二抗孵育。用10mL 5%脱脂牛奶按1:10000加入二抗(华安生物,HA1001),室温孵育40min后用TBST洗三次,每次5min。
(7)曝光。将ECL化学发光剂(Beyotime ,P0018AS)A液和B液1:1混合,轻轻滴至PVDF膜上,避光反应2min,在凝胶成像仪中显影曝光。
SEC-HPLC纯度检测:
(1)样品制备与处理
制样:将FIX-Fc蛋白稀释至1mg/mL,4℃离心充分离心,小心转移上清至样品管中。
进样:将样品管放入HPLC样品仓(Agilent 1260 Infinity)中,等待上样。
(2)仪器与色谱柱准备
仪器准备:打开仪器与对应操作软件,将泵放置在事先配置好的流动相中,排出管路和泵中的气泡。
色谱柱选择与安装:此检测选择SEC色谱柱。色谱柱内径为2.1~4.6mm,填充剂粒径为2~20μm。优选地使用Superdex® 200 5/150 GL(Cytiva 28-9065-61)。按色谱柱流速箭头方向安装。
仪器与色谱柱预平衡:设定于检测方法相同的流速与流动相比例冲洗仪器与色谱柱至少30分钟,准备进行样品检测。
(3)样品检测与数据处理
样品检测:将处理好的样品通过进样针注入样品口中,进样前应先排除气泡,确保进样的准确性和稳定性。按设定的程序进行样品检测,使用UV检测器收集样品信号,记录色谱图和数据。
数据分析和报告编写:对收集到的数据进行分析,提取有用的数据。编写结果报告,记录检验过程和结果。
样品SDS-PAGE电泳结果、WestonBlot检测结果和SEC-HPLC纯度检测结果分别见图3-图5。rFIX(mutant)-Fc和Fc的理论分子量分别为75kDa和26kDa。SDS-PAGE电泳结果及WB检测结果显示,这一异源二聚体在非还原(No-Reducing)电泳胶上为一条带,在还原型(Reducing)电泳胶上解离为两条带;由于存在糖基化修饰(FIX蛋白有8个糖基化位点,Fc有1个糖基化位点),rFIX(mutant)-Fc/Fc蛋白在还原和非还原的SDS-PAGE中均可以看到实际分子量大于理论分子量。SEC-HPLC检测结果显示,纯化后融合蛋白的主峰纯度大于90%。SEC-MALS检测结果显示(图6),rFIX(A194T,R384L)-Fc/Fc水溶状态下主要蛋白分子量大小为139.7kDa。
(4)发色底物法测定融合蛋白体外活性
rFIX-Fc融合蛋白的活性可采用发色底物法测定。本实施例采用BIOPHEN FactorIX试剂盒(HYPHEN BioMed,Ref. A221802)测定,其检测原理如下:试剂盒中提供的因子XIa会将测试样品中的因子IX活化为FIXa,活化的FIXa在凝血酶、磷脂(PLPs)和钙离子(Ca2+)的存在下,与凝血酶激活的FVII:C、PLPs和Ca2+形成凝血酶复合物,继而将测定系统中的因子X转变为激活形式的Xa。凝血酶复合物对因子X的激活活性与测试样品中因子IX的含量呈正相关关系。激活的因子Xa活性可通过其对发色底物(SXa-11)特异性裂解进行检测,即在405nm下检测其裂解产物pNA的吸光值,pNA吸光值与FIXa活性成正比。
检测结果见图7,以本方法测定纯化的重组FIX融合蛋白rFIX(A194T,R384L)-Fc/Fc的比活性可达3700 IU/mg以上,重组FIX融合蛋白rFIX(A194T,R384Q)-Fc/Fc的比活性可达2400 IU/mg以上,明显高于单突变蛋白rFIX(A194T)-Fc/Fc(200 IU/mg,BeneFIX,辉瑞)。Biogen Idec公司的AlprolIX为原始的rFIX-Fc/Fc,其比活性约为43.8IU/mg,摩尔比活性(IU/nmol)仅为天然IX因子的50%(Peters RT等,Blood,2010,115(10):2057-64)。现有技术“X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX(Factor IX Padua),PaoloSimioni,The new england journal of medicine”显示在体外试验中,单独R384L的活性约为野生型的5-10倍。因为FC标签会降低酶比活,预计rFIX(R384L)-Fc/Fc活性在野生型rFIX的2-5倍之间,即约100-200IU/mg。现有技术“Wenman Wu , Lin Xiao , Xi Wu,Xiaoling Xie, Ping Li , Changming Chen , Zhaoyue Zheng, Jiangang Ai ,Alexander Valencia , Birong Dong , Qiulan Ding , Biao Dong , Xuefeng Wang.Factor IX Alteration p.Arg338Gln (FIX Shanghai) Potentiates FIX ClottingActivity and Causes Thrombosis. Haematologica. 2020; haematol.2019.216713”中描述rFIX(R384Q)的体外活性对比rFIX(R384L)平均值低大约百分之20%,可以推算其活性约为80-160 IU/mg。本发明的方法提供的融合蛋白,同时存在两种突变,相较于现有技术公开的未突变或单突变蛋白,比活提高了至少一个数量级,优于现有技术效果之和,对本领域的发展具有重要意义。
实施例2
参照实施例1,制备融合蛋白,区别在于,替换Fc片段为人源IgG1的突变体,其中pcDNA3.1-rFIX-Fc质粒对应Fc序列为IgG(221-447,Y349C,T366S,L368A,Y407V),其核酸序列为SEQ ID NO.9。
pcDNA3.1-Fc对应的氨基酸序列为IgG(221-447,S354C,T366W),核酸序列为:SEQID NO.10。
本实施例构建获得的蛋白比活性与例一构建的蛋白接近,但在表达纯化过程中的异源二聚体数量更少,纯化难度更低,降低了纯化成本。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以上通过实施例形式体现的具体实施方式,对本发明的技术方案进行了进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明保护题的范围仅限于实施例的范围。凡基于本发明所实现的技术均属于本发明的保护范围。
Claims (8)
1.包括一种人凝血因子IX突变体的融合蛋白,其特征在于,所述的人凝血因子IX突变体为人凝血因子IX第194位的A突变为T,且第384位的R突变为L或Q,所述的人凝血因子IX的序列为SEQ ID NO.1第1-461位;所述的人凝血因子IX突变体的C端通过连接子与Fc段连接。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白,其特征在于,所述的Fc段包括人免疫球蛋白的Fc段。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白,其特征在于,所述的人免疫球蛋白的Fc段为人免疫球蛋白IgG1的Fc段,其序列如SEQ ID NO.4所示。
4.表达权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的核酸。
5.包括权利要求4所述的核酸的表达载体或细胞。
6.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法,其特征在于,包括:
1)构建包括权利要求1所述的人凝血因子IX突变体的基因和人免疫球蛋白的Fc段基因的表达载体1;
2)构建表达人免疫球蛋白的Fc段基因的表达载体2;
3)表达载体1和表达载体2共转染细胞;
4)转染完成后培养细胞。
7.权利要求1-3任一项所述的融合蛋白或权利要求4所述的核酸或权利要求5所述的表达载体或细胞在制备药物中的应用,其特征在于,所述的药物用于治疗B型血友病。
8.包括权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的药物。
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