JP2003534384A

JP2003534384A - 神経保護性ペプチド

Info

Publication number: JP2003534384A
Application number: JP2001587795A
Authority: JP
Inventors: スミス−スウイントスキ，バージニア; レンジ，マイケル; プラタ−サラマン，カルロス; ジヨリフエ，リンダ; フアレル，フランシス; ジヨンソン，ダナ・エル
Original assignee: オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2003-11-18
Also published as: CN1318084C; EP1296702A4; CN1452492A; MXPA02011727A; IL153079A0; AU7490401A; NZ522924A; BR0111182A; HK1058484A1; WO2001091780A1; ZA200210304B; CA2410453A1; AU2001274904B2; EP1296702A1

Abstract

(57)【要約】ヒトのエリトロポエチンの神経治療的活性を有する組成物を投与することにより、神経系の疾患を処置する方法を開示する。これらの組成物は、ヒトのエリトロポエチンの生物活性の全範囲、またはエリトロポエチンの特定の生物活性のみを有するペプチド、ペプチド二量体、ポリペプチドおよびタンパク質のような治療薬を含む。造血を刺激するために必要とされる濃度未満でエリトロポエチンを投与する改善された治療的養生法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）関連出願との関係本出願は、2000年5月26日に出願された米国仮特許出願第60/207654号の利益を
主張する。発明の分野本発明は、ヒトのエリトロポエチンの治療的活性を有する組成物を投与するこ
とにより神経系が関与する疾患および状態の処置法を対象とする。これらの組成
物はヒトのエリトロポエチンの完全な範囲の生物活性またはエリトロポエチンの
特定の生物活性のみを有するペプチド、ペプチド二量体、ポリペプチドおよびタ
ンパク質のような治療薬を含む。また本発明は改善された治療的養生法も提供し
、ここで治療薬は造血を刺激するために必要な濃度未満の濃度で投与される。発明の背景エリトロポエチン（EPO）は、組織低酸素に応答して腎臓により生産される、
骨髄中の赤血球生産を刺激する糖タンパク質ホルモンである。エリトロポエチン
の遺伝子は米国特許第4,703 008号明細書に記載されているように、クローン化
され、そしてチャイニーズハムスター卵母（CHO）細胞中で発現された。組換え
ヒトエリトロポエチン（r-HuEPOまたはポエチンアルファ）はヒトの尿のエリト
ロポエチンと同一のアミノ酸配列を有し、そしてこの２つは化学的、物理的およ
び免疫学的試験で識別することができない。組換えヒトエリトロポエチンは成熟
赤血球に分化することができる多数の細胞を増加させ、それらの分化を誘発し、
そして赤芽球の発生においてヘモグロビンを増やすことにより作用する（Krantz
SB.Blood(1991) 77:419-434,Beckman BS,Mason-Garcia M.The Faseb Journal(1
991)5:2958-2964)。

【０００２】ポエチンアルファは今日までの研究において十分に寛大に扱われてきた。時々
高血圧性脳症および発作が、ポエチンアルファで処置した患者の透析でヘマトク
リットが上昇した時に特に治療の初期に記載された。（Eschbach JW,Egrie JC,D
owning MR,Browne JK,Adamson JW.New Engl.Med(1987)316:73-78,Winearls CG,O
liver DO,Pippard MJ,et al.,Lancet(1986)2(8517):1175-1177)。そのような報
告は開発された化合物の使用経験を積む毎により稀になった。時折、ポエチンア
ルファで処置した癌患者は、ヘマトクリットの有意な上昇に伴う血圧の上昇を経
験した。しかし慢性腎不全患者におけるよりも危険性は実質的に低いと思われる
。

【０００３】２年もの間、ポエチンアルファで処置された個体におけるポエチンアルファに
対する抗体力価を証明できず、そして確認することができなかったことは、ポエ
チンアルファに対する免疫学的感受性の不存在を示している。皮膚の発疹および
蕁麻疹が観察されることは稀で、そして報告される場合は軽度であり、そして一
過性の性質であるが、これらの出来事はポエチンアルファ製剤のある成分に対す
るアレルギー過敏症を示唆している。

【０００４】ポエチンアルファは、慢性腎不全（透析および前透析）における貧血、ジドブ
ジン処置したHIV陽性患者における貧血(米国)、白金に基づく化学療法を受けて
いる癌患者における貧血の処置に、自己血液プレ-ドネーション（pre-donation
）の促進剤として、および整形外科手術を受けている患者において同種輸血の必
要性の見込みを減らすための外科的周辺補助剤（peri-surgical adjuvant）とし
て多くの国で販売が認められている。

【０００５】 EPOは胚発生中および恐らく分化のインビトロ実験中のように神経幹細胞に影
響を及ぼす。（Juul et al Pediatr Dev Pathol(1999)2(2)148-158.Juul et al Pediatr Res (1998)43(1)40-49.)。さらに低酸素症、髄膜炎および脳室内出血を
介してCNS損傷に罹っている新生児および胎児は、EPOが誘導する神経保護効果を
示す（Juul et al Ped Res(1999)46(5)543-547） EPOは低酸素症を生じる損傷の場合に、神経組織のアポトーシスを防止するの
に役立つ。これは星状細胞により局所的に生産されるEPOの結果であり得る（Mor
ishita et al Neuroscience (1996)76(1)105-116）。神経保護はアレチネズミの
海馬およびラットの大脳皮質組織で示された（Sakanaka et al PNAS (1998)95(8
)4635-4640、Sadamoto et al Biochem Biophys Res Commun(1998)253(1)26-32）
。

【０００６】 EPOは、Ca2⁺の変化、膜電位の変化および神経生存の促進を含むPC12細胞の生
物学的効果を誘導する。これはEPOが神経機能および生存能を刺激できると解釈
された（Koshimura et al J.Neurochem(1999)72(6)2565-2572,Tabria et al Int J Dev Neurosci (1995)13(3/4)241-252）。

【０００７】 O'Brien et alは、EPOの17アミノ酸ペプチド配列がEPO-R（エリトロポエチン
レセプター）を介して作用して、NS20Y、SK-N-MCおよびPC12細胞に生物学的活性
を誘導できると提案し、これには出芽、分化および神経保護を含む。奇妙にもこ
のペプチドは血液細胞の増殖を促進せず、すなわちこのペプチドはEPO活性に対
してその感度が十分に理解されている細胞系では不活性であるらしい。（Campan
s et al Int J Mol Med (1998)1(1)235-241およびすべてO'Brienへの12/23/1999
に発効された米国特許第5,700,909号明細書、11/5/1996に発効された同第5,571,
787号明細書、2/3/1998に発効された5,714,459号明細書および12/9/1997に発効
された同第5,696,080号明細書。） EPOは星状細胞または希突起膠細胞とは反対に、ニューロンの分化を駆動する
とされている神経幹細胞に影響を及ぼすかもしれない。これはEPOが造血幹細胞
に赤血球（RBC）を生産させるように機能するEPOの類似活性に匹敵する。CNSの
低酸素性損傷との間には明らかな関連性があり、神経幹細胞をニューロンに分化
させる星状細胞からEPOの生産をもたらすと同時に、既存のニューロンには神経
保護的機能として作用する。（国際公開第99/21996、5/6/1999公開、Weiss et a
l.) 発明の要約本発明は、ヒトのエリトロポエチンの神経治療的活性を有する組成物を投与す
ることにより、神経系が関与する疾患および状態を処置する方法を対象とする。

【０００８】第１の態様では、本発明は神経毒性、神経変性または神経的傷害を特徴とする
障害を有する患者の処置法を対象とし、この方法はEPOレセプターに結合する８
〜約40アミノ酸長の１以上の単量体ペプチドを含んで成る治療に効果的な量のペ
プチドを該患者に投与することを含んで成り、各単量体ペプチドはアミノ酸Ｘ₄
Ｘ₅Ｘ_aＸ_bＸ₆Ｘ_cＸ_dＸ₇（配列番号４７）、ここでＸ_aは、ＧまたはＡであり；Ｘ_bは、ＰまたはＡであり；Ｘ_cは、ＴまたはＡであり；Ｘ_dは、Ｗ、ＡおよびＦから選択され；Ｘ₄は、Ｒ、Ｈ、Ｙ、ＬおよびＷから選択されるか、またはＸ₄は存在せず；Ｘ₅は、Ｆ、ＭおよびＩから選択され；Ｘ₆は、20個の遺伝子的にコードされたＬ-アミノ酸または立体異性的Ｄ-アミ
ノ酸から独立して選択され；そしてＸ₇は、Ｄ、Ｖ、Ｅ、ＩおよびＬから選択される、の配列を含んで成る。

【０００９】特に、上記配列はＸ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号１）であり、ここでＸ₃は、Ｃ、Ｅ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸およびホモシステイン（Hoc）
から選択され；そしてＸ₈は、Ｃ、Ｋ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸およびホモシステイン（Hoc）
から選択される。

【００１０】第２の態様では、本発明は細胞表面レセプターアゴニストおよびアンタゴニス
トとして挙動するペプチド、ならびに増殖因子−型レセプターの結合およびシグ
ナル開始を表すそのようなペプチドの二量体および多量体を対象とする。１つの
態様では、本発明はEPOアゴニストとして挙動するペプチドを提供する。これら
のペプチドはそのようなペプチドの二量体または多量体であり、好ましくはＸ₃
Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号１）のコアアミノ酸配列を含んで成る14〜
約20残基長であり、ここで各アミノ酸は標準的な１文字略号により表され；Ｘ₃
はＣ、Ｅ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはHocから選択されることができ、
ここでHocはホモシステインであり；Ｘ₄は、Ｒ、Ｈ、Ｙ、ＬまたはＷであること
ができ、またはＸ₄は存在せず；Ｘ₅は、Ｆ、ＭまたはＩであることができ；Ｘ₆
は独立して、20個の遺伝子的にコードされた任意のＬ-アミノ酸または立体異性
的Ｄ-アミノ酸であり；Ｘ₇は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そし
てＸ₈はＣ、Ｋ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはHocであることができ、こ
こでHocはホモシステインである。

【００１１】好ましくは二量体または多量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄ Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号２）のコア配列を含んで成り、ここで各Ｘ₂お
よびＸ₆は独立して、20個の遺伝的にコードされた任意のＬ-アミノ酸であり；Ｘ₃ はＣであり；そしてＸ₈はＣである。

【００１２】好ましくは二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰ
Ｘ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号３）のコア配列を含んで成り、ここで各Ｘ₁ 、Ｘ₂、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀およびＸ₁₁は20個の遺伝的にコードされたＬ-アミノ酸
から独立して選択される。特にＸ₃は、Ｃ、Ｅ、Ａであることができ；Ｘ₄はＲ、
ＨまたはＹであることができるか、またはＸ₄は存在せず；Ｘ₅はＭ、ＦまたはＩ
であることができ；Ｘ₇はＤまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ｋまた
はＡであることができる。

【００１３】より好適な態様では、Ｘ₃およびＸ₄の両方がＣであり、そしてこのように二量
体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁ ₀ Ｘ₁₁（配列番号４）のコア配列を含んで成る。特に単量体ペプチド単位は、ア
ミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号５）のコア配
列を含んで成り、ここでＸ₄は、ＲまたはＨであることができ；Ｘ₅はＦまたはＭ
であることができ；Ｘ₆はＩ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶであることができ；Ｘ₇はＤま
たはＶであり；Ｘ₉はＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであることができ；そし
てＸ₁₀はＡ、Ｇ、Ｐ、ＲまたはＹであることができる。特により好ましくは二量
体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁ ₀ Ｘ₁₁（配列番号６）のコア配列を含んで成り、ここでＸ₁はＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ
、ＴまたはＶであることができ；Ｘ₂はＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＳまたはＴである
ことができ；Ｘ₄はＲまたはＨであることができ；Ｘ₉はＫ、Ｒ、ＳまたはＴであ
ることができ；そしてＸ₁₀はＰである。

【００１４】好ましくは二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号６）のコア配列を含んで成り、ここでＸ₁はＤ
、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであることができ；Ｘ₂はＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
ＳまたはＴであることができ；Ｘ₄はＲまたはＨであることができ；Ｘ₉はＫ、Ｒ
、ＳまたはＴであることができ；そしてＸ₁₀はＰである。

【００１５】特に好ましくは、二量体の単量体ペプチド単位には：

【００１６】

【表６】

【００１７】

【表７】

【００１８】を含む。

【００１９】特に二量体の単量体ペプチド単位には：

【００２０】

【表８】

【００２１】を含む。

【００２２】本発明によれば二量体の単量体単位は、同じまたは異なることができる。

【００２３】好適な態様では、リンカーとしてポリエチレングリコール（PEG）を使用して
共有結合を通して本発明の二量体ペプチドを形成してもよい。

【００２４】別の態様では、本発明は神経毒性を処置または防ぐための方法に使用する本発
明の少なくとも１つのペプチドおよび医薬キャリアーを含んで成る医薬組成物を
対象とする。

【００２５】さらなる態様では本発明は、本発明の少なくとも１つのペプチドを投与するこ
とにより神経毒性的または神経変性的または神経傷害的な出来事から生じる疾患
または状態を有する哺乳動物の治療的処置法を提供する。

【００２６】さらに別の態様では、本発明の少なくとも１つのペプチドを使用することによ
り、EPOにより調節され得る神経毒性的、神経傷害的または神経変性的状態を有
する哺乳動物の治療的処置法を提供する。

【００２７】詳細な説明本明細書で使用する「エリトロポエチン」（EPO）は、ヒトのエリトロポエチ
ンの完全な範囲の生物活性（例えば造血および神経学的活性）、またはエリトロ
ポエチンの特定の生物活性のみ（例えば造血または神経学的活性）を有するペプ
チド、ペプチド二量体、ポリペプチドおよびタンパク質、ならびにその生物学的
活性にかかわらず、さらに限定するわけではないがcDNAまたはゲノムDNAのいず
れかから生成された組換え体、合成、トランスジェニックおよび遺伝子活性化法
を含むそれらの合成または製造法にかかわらず、エリトロポエチン同族体、エリ
トロポエチンアイソフォーム、エリトロポエチン模造物、エリトロポエチンフラ
グメント、ハイブリッドエリトロポエチンタンパク質、融合タンパク質、上記の
オリゴマーおよび多量体、上記の相同体、上記のグリコシル化パターンの変異体
および上記の突然変異タンパク質を含む。エリトロポエチンの具体的な例には、
ポエチンアルファ（EPREX(商標)、ERYPO(商標)、PROCRIT(商標))、NEORECORMON
、新規な赤血球生成刺激タンパク質（NESPまたはARANESP、欧州特許出願公開第6
40619号明細書に記載された組換えヒトエリトロポエチン（Epoetin）の過グリコ
シル化同族体)、ヒトのエリトロポエチン同族体−国際公開第99/66054号明細書
に記載されたもののようなヒト血清アルブミン融合タンパク質、国際公開第99/3
38890号明細書に記載されたもののようなエリトロポエチン突然変異体、米国特
許第5,688,679号明細書に記載されたヒトのエリトロポエチン遺伝子のApaI制限
フラグメントから生成され得るエリトロポエチンオメガ、国際公開第99/11781号
明細書に記載されているもののような改変されたグリコシル化ヒトエリトロポエ
チン、国際公開第98/05363号明細書または米国特許第5,643,575号明細書に記載
されているもののようなPEG結合エリトロポエチン同族体を含む。内因性のヒト
エリトロポエチンの発現に関して修飾された細胞系の具体的例は、国際公開第99
/05268号および同第94/12650号明細書に記載されている。一般的に好適なEPO形
は現在、EPREX(商標)、ERYPO(商標)またはPROCRIT(商標)の登録商標で製剤およ
び頒布されている精製された組換えヒトEPO（rhEOP）である。

【００２８】本明細書で使用する略号“EMP”は、EPOのペプチド模造物、特に米国特許第5,
767,078号および同第5,773,569号明細書に記載された特定のペプチドを称する。

【００２９】以下は、種々のペプチドに関して本明細書で使用する以下のアミノ酸略号の一
覧表である。個々のアミノ酸残基は当業者により容易に知られ、そして使用され
ている１文字および３文字暗号に従い関連付ける。

【００３０】

【表９】

【００３１】第１の態様では、本発明は細胞−表面レセプターアゴニストとして挙動する治
療的に活性なペプチド、ならびに増殖因子−型レセプターの結合およびシグナル
開始を表すそのようなペプチドの二量体および多量体を含んで成る医薬組成物で
神経細胞を処置する方法を対象とする。１つの態様では、本発明はEPOアゴニス
トとして挙動するペプチドを提供する。特にこれらのペプチドは、コアアミノ酸
配列Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号１）を含んで成る８〜40またはそれ
以上のアミノ酸、好ましくは14〜約20残基長の２つの「単量体」ペプチド単位を
有する二量体または多量体であることができ、ここで各アミノ酸は標準的な１文
字略号により示される；Ｘ₃はＣ、Ｅ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはHoc
から選択することができ、ここでHocはホモシステインであり；Ｘ₄は、Ｒ、Ｈ、
Ｙ、ＬまたはＷであることができ、またはＸ₄は存在せず；Ｘ₅は、Ｍ、Ｆまたは
Ｉであることができ；Ｘ₆は独立して、20個の遺伝子的にコードされた任意のＬ-
アミノ酸または立体異性的Ｄ-アミノ酸であり；Ｘ₇は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶ
であることができ；そしてＸ₈はＣ、Ｋ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはHo
cであることができ、ここでHocはホモシステインであるが、ただしＸ₃またはＸ₈ のいずれかがＣまたはHocである。好ましくは二量体または多量体の単量体ペプ
チド単位は、コア配列ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号２）を含ん
で成り、ここで各アミノ酸残基は標準的な１文字略号により示され：各Ｘ₁、Ｘ₂ 、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀およびＸ₁₁は、20個の遺伝的にコードされたＬ-アミノ酸から
独立して選択され；Ｘ₃はＣ、Ｅ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸またはHocであ
り、ここでHocはホモシステインであり；Ｘ₄はＲ、Ｈ、Ｙ、ＬまたはＷであるこ
とができ、またはＸ₄は存在せず；Ｘ₅は、Ｍ、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₇ は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであることができ；そしてＸ₈はＣ、Ｋ、Ａ、α-
アミノ-γ-ブロモ酪酸またはHocであることができ、ここでHocはホモシステイン
である。より好ましくはＸ₃またはＸ₈のいずれかがＣまたはHocである。

【００３２】好ましくは二量体または多量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄ Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号２）のコア配列を含んで成り、ここで各Ｘ₂お
よびＸ₆は独立して、20個の遺伝的にコードされた任意のＬ-アミノ酸であり；Ｘ₃ はＣであり；そしてＸ₈はＣである。

【００３３】好ましくは二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰ
Ｘ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号３）のコア配列を含んで成り、ここで各Ｘ₁ 、Ｘ₂、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀およびＸ₁₁は20個の遺伝的にコードされたＬ-アミノ酸
から独立して選択される。好ましくはＸ₃は、Ｃ、Ｅ、Ａであることができ；Ｘ₄ はＲ、ＨまたはＹであることができるか、またはまたはＸ₄が存在せず；Ｘ₅はＭ
、ＦまたはＩであることができ；Ｘ₇はＤまたはＶであることができ；そしてＸ₈ はＣ、ＫまたはＡであることができる。

【００３４】より好適な態様では、Ｘ₃およびＸ₈の両方がＣであり、そしてこのように二量
体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁ ₀ Ｘ₁₁（配列番号４）のコア配列を含んで成る。特に単量体ペプチド単位は、ア
ミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号５）のコア配
列を含んで成り、ここでＸ₄は、ＲまたはＨであることができ；Ｘ₅はＦまたはＭ
であることができ；Ｘ₆はＩ、Ｌ、Ｔ、ＭまたはＶであることができ；Ｘ₇はＤま
たはＶであり；Ｘ₉はＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであることができ；そし
てＸ₁₀はＡ、Ｇ、Ｐ、ＲまたはＹであることができる。より好ましくは二量体の
単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁ ₁ （配列番号６）のコア配列を含んで成り、ここでＸ₁はＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ
またはＶであることができ；Ｘ₂はＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＳまたはＴであること
ができ；Ｘ₄はＲまたはＨであり；Ｘ₉はＫ、Ｒ、ＳまたはＴであることができ；
そしてＸ₁₀はＰである。

【００３５】好ましくは二量体の単量体ペプチド単位は、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂ＣＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ ＴＷＸ₇ＣＸ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号６）のコア配列を含んで成り、ここでＸ₁はＤ
、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであることができ；Ｘ₂はＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
ＳまたはＴであることができ；Ｘ₄はＲまたはＨであり；Ｘ₉はＫ、Ｒ、Ｓまたは
Ｔであることができ；そしてＸ₁₀はＰである。

【００３６】特に好ましくは、二量体の単量体ペプチド単位には：

【００３７】

【表１０】

【００３８】

【表１１】

【００３９】

【表１２】

【００４０】を含む。

【００４１】最も好ましくは、二量体の単量体ペプチド単位には

【００４２】

【表１３】

【００４３】を含む。

【００４４】 EPOは当業者には明白であるように、処置する特定の患者に適切な適当な手段
により投与する。本明細書で使用する「治療に効果的」という句は、患者毎に変
動し、そして投与するEPO分子が保有する特定の生物学的活性の範囲に依存する
だろう。典型的には、造血活性を有するEPOについて、治療に効果的な量は約１
〜500I.U./kg体重であり、より好ましくは特にエリトロポエチンが皮下に投与さ
れる時は、50〜300I.U./kg体重である。造血活性を持たないEPO分子については
、治療に効果的な量は、造血活性を有するEPO分子より多くても少なくともよい
。好適な投与方法は、静脈内（iv）および皮下（sc）であり、皮下が一般には好
適である。造血的に活性なEPOは用量あたり約50〜1000U/kgの範囲内で、１週間
に１〜５回投与される。別の態様ではEPO組成物は、神経系に直接投与される。
この投与経路には限定するわけではないが大脳内、心室内、脳室内、鞘内、槽内
、脊椎内および／または脊椎周辺の投与経路を含み、これらは頭蓋内および推骨
内針、およびポンプを含むかまたは含まないカテーテルを使用することができる
。注入用量は数分から数日の範囲の期間にわたり実例えば約1.0〜50,000U/kg/分
のEPO組成物の範囲であることができる。造血的に活性なEPOの投与は、患者（男
性または女性）が約15g/dLを越えるヘモグロビレベルを表す場合、遅らせるかま
たは抑える。

【００４５】１つの態様では本発明は、EPOまたはそれらの同族体を投与することを含んで
成る急性および慢性の神経変性障害を処置する方法を提供する。急性神経変性障
害には限定するわけではないが、神経細胞死または脳血管不全、局所的またはび
まん性外傷、びまん性脳障害、および脊椎損傷を含む障害（compromise）に付随
する種々の型の急性神経変性障害を含む。急性神経変性障害の例は：塞栓閉塞お
よび血栓閉塞を含む大脳虚血または血栓梗塞、急性虚血後の再潅流、周産期の低
酸素−虚血損傷、心停止、ならびに任意の種類の頭蓋内出血（硬膜外、硬膜下、
クモ膜下および大脳内のような）、および頭蓋内および推骨内損傷（挫傷、穿通
、ずれ、圧傷および裂傷のような）、および乳幼児ムチ打ち揺さぶり症候群（wh
iplash shaken infant syndrome）である。本発明の１以上の方法を用いて処置
することができる慢性の神経変性障害には、限定するわけでないが、アルツハイ
マー病、ピック病、びまん性レーヴィ体病、進行性核上性麻痺（マーチス-リチ
ャードソン症候群）、多系統変性（シャイ-ドレーガー症候群）、神経変性に伴
う慢性癲癇性状態、筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患、変性運動失
調、皮質底部変性、GuamのALS-パーキンソン-痴呆合併症、亜急性硬化性汎脳炎
、ハンチントン病、パーキンソン病、シヌクレイノパチー（synucleinopathy）
（多系統萎縮症を含む）、特発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マチャド−
ジョセフ病／脊髄小脳変性症３型およびオリーブ橋小脳変性、ジルドラトウ
レット病、球および偽球性麻痺、脊髄および脊髄延髄筋萎縮症（ケネディ病）、
原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ヴェルドニッヒ-ホフマン病、クーゲル
ベルグ-ヴェランデル病、テイ-サックス病、サンドホフ病、家族性痙性病、ヴォ
ールファルト-クーゲルベルグ-ヴェランデル病、痙性不全対麻痺、進行性多病巣
性白質脳障害、家族性自律神経障害（Riley-Day 症候群）、およびプリオン病（
限定するわけではないがクロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイ
ラー-シャインカー病、クールおよび致命的な家族性不眠症）を含む。

【００４６】 rhEPOにより誘導される神経保護および神経突起の異常成長(outgrowth)の組み
合わせから、本発明の１以上の方法を用いて処置できる他の臨床的状態は、限定
するわけではないがEPO不全症（例えば腎不全）、任意の種類の血液損失（限定
するわけではないが血液透析、腹膜透析、診断用サンプリング、不顕性胃腸管出
血）、腎不全および末期腎不全、腎臓移植を含む末梢疾患に伴う神経的（限定す
るわけではないが認知的）および精神医学的（限定するわけではないが精神病理
学、鬱または不安）発現（manifestation）、および限定するわけではないが血
液的および非血液的悪性／癌を含む貧血および神経および神経精神的発現に伴う
他の状態、化学療法（限定するわけではないがシスプラチンを含む）および他の
薬剤（限定するわけではないがジドブジンを含む）を受けた患者の症状および合
併症、他の血液的障害（限定するわけではないが、鎌状赤血球性貧血およびサラ
セミアを含む）、炎症および感染性疾患（限定するわけではないが、ヒト免疫不
全ウイルス感染を含む）、慢性全身性自己免疫疾患（限定するわけではないが、
全身性紅斑性狼瘡）、ヘーノホフシェーンライン紫斑病および溶血性尿毒症症
候群を処置および／または防止することを含む。また本発明に含まれるのは、神
経系の化学的、毒性的、感染性および照射損傷から、および未成熟の結果として
生じる神経および神経精神的発現の処置および／または防止、ならびに限定する
わけではないが無酸素虚血、肝臓、血糖、尿、電解質および内分泌起源を含む脳
障害の神経および神経精神的結果の処置および／または防止である。

【００４７】 rhEPOにより誘導される神経保護および神経突起成長の組み合わせから、この
分子は神経叢病（神経叢麻痺を含む）、多病巣性ニューロパチー、感覚性ニュー
ロパチー、運動性ニューロパチー、感覚−運動性ニューロパチー、感染ニューロ
パチー、自律神経ニューロパチー、感覚−自律神経ニューロパチー、脱髄性ニュ
ーロパチー（限定するわけではないがギラン-バレー症候群および慢性炎症性脱
髄性多発根神経炎を含む）、他の炎症および免疫ニューロパチー、薬剤により誘
導されるニューロパチー、薬理学的処置により誘導されるニューロパチー、トキ
シンに誘導されるニューロパチー、外傷性ニューロパチー（限定するわけではな
いが、圧傷、挫傷、裂傷および分断ニューロパチーを含む）、代謝性ニューロパ
チー、内分泌および腫瘍随伴性ニューロパチー、およびシャルコ-マリー-ツース
病（1a、1b、２、4a-1-X型に関連した）、フリードリッヒ運動失調、黒染性白質
萎縮症、レフスム病（Refsum's disease)、アドレノミエロニューロパチー（adr
enomyeloneuropathy）、毛細血管拡張性失調症、デシェリーヌ-ソッタニューロ
パチー（ＡおよびＢ型）、ランバート-イートン症候群および脳神経障害のよう
な他のニューロパチーの処置および／または防止にも応用することができる。

【００４８】以下の実施例は本発明を具体的に説明するが、それを限定することはない。

【００４９】

【実施例】

実施例１ rhEPOは初代ラット神経培養および神経細胞系で発現する初代神経細胞培養解離した海馬および皮質細胞培養は、18日のラットの胎児胚からすでに記載さ
れているように樹立した（Mattson et al.,1994)。簡単に説明すると、組織は安
楽死に基づくAVMAパネルに従い、ハロタンで麻酔をかけた妊娠している母親（Sp
rague-Dawley）から帝王切開を介して取り出した。子供を断頭し、そして脳を摘
出し、そしてHEPES-緩衝化ハンクスバランス塩溶液(HBSS:ギブコ(Gibco)）に置
いた。海馬および皮質を切開し、そして組織型に従いプールした。組織は15分間
トリプシン処理し（１mg/ml トリプシン-HBSS;ワーシントン(Worthington)）、
新たなHBSSで洗浄し、トリプシンインヒビター（１mg/ml；シグマ(Sigma))中で
５分間インキューベーションし、新たなHBSSで再度すすぎ、そして次に１mlの新
たなHBSS中で火炎−処理ガラスピペットを用いてトリチュレートした。解離した
細胞を30,000細胞／ウェルでポリ-D-リシンをコートした96-ウェルプレート(コ
ラボラティイブバイオサイエンス:Collaborative BioScience）上にまいた。各
ウェルは、26mM NaHCO₃（シグマ）、56mM グルコース(シグマ）、15mM KCl(シグ
マ）、1mM ピルビン酸ナトリウム(シグマ）、1.1mM L-グルタミン（シグマ）、1
0（容量／容量）％熱−不活性化ウシ胎児血清（ハイクローン：Hyclone）および
0.001％硫酸ゲンタマイシン（シグマ）(pH7.4）を補充した100μlのイーグル最
少必須培地（MEM;ギブコ）を含んだ。細胞は実験処理前に24時間、湿潤化された
37℃の５％CO₂インキュベーター中で接着させた。培養基は３日毎に吸引し、そ
して新しい培地と交換した。免疫細胞化学平行して、海馬および皮質培養を上記のように処理し、そしてすでに記載され
たように免疫細胞化学（ICC）用に処理した（Smith-Swintosky et al。、1997)。
簡単に説明すると、細胞を４つのチャンバーのポリ-D-リシンコートガラススラ
イド（ラボテック(LabTek)、ナパースヴィル、イリノイ州）に置いた。培養の７
日目に、培養基を取り出し、そして細胞をダルベッコのリン酸緩衝化塩（DPBS;
シグマ）で１回洗浄し、そして次に10％リン酸緩衝化ホルマリンで15分間、室温
で固定した。固定後、培養物をDPBSですすぎ、そして10分間、ブロッキング血清
中（正常ウマ血清；DPBS中に１：50希釈；ベクターラボズ(Vector Labs)、バー
リンガム、カリフォルニア州）に置いた。培養物を再度すすぎ、そして次いで30
分間、EPOレセプター（EBP-7）に特異的な抗-マウスモノクローナル抗体中でイ
ンキューベーションした；1:75の抗体希釈物中（ザイメッド（Zymed）、サウス
サンフランシスコ、カリフォルニア州）。培養物を数回、DPBSですすぎ、次いで
ビオチン化２次抗体（ベクターラボズ）に30分間暴露した。培養物に最後のすす
ぎを行い、そして30分間、アビジン-ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ複
合体中（マウスIgG ABC キット、ベクターラボズ）でインキューベーションした
。１次抗体の存在は、3'3-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（DAB、
バイオメダ（Biomeda）、フォスター市、カリフォルニア州）を使用して検出し
た−それぞれ５分間、２回の暴露。次いで細胞をヘマトキシリンでカウンター染
色し、脱水し、清浄化し、カバーガラスを置き、そしてオリンパス（Olimpus）
BX-2光学顕微鏡下で写真撮影をした。結果 EPOレセプターに関する強い染色が海馬および皮質培養物中のニューロンおよ
びグリアで観察された（図１ａおよび図１ｂ）。EPOレセプターの発現レベルは
培養中、時間と共に増加するようである。考察これらの結果は、EPOが神経系、特に海馬および大脳皮質での初期発生に役割
を果たしていることを示す。神経細胞系の免疫組織化学ラット副腎のクロム親和性細胞腫に由来する神経細胞系PC-12（Greene and Ti
schler,1976)、およびヒト起源の脳の神経上皮腫から得たSK-N-MC（Spengler et
al.,1973）を使用した。PC-12細胞は神経成長因子(NGF)の存在下で神経表現型
を可逆的に誘導することができる。PC-12細胞はポリ-D-リシンをコートした組織
培養皿のDMEM中（10％ウマ血清および５％FBSを含有する）で、0.1μg/ml NGFの
存在下で７日間成長させて神経表現型を誘導した。SK-N-MC細胞は、1.0mM ピル
ビン酸ナトリウム、1.5mM 重炭酸ナトリウム、２mM グルタミンおよび10％FBSを
補充した最少培地中で４日間培養した。PC-12およびSK-N-MC細胞は、顕微鏡に伝
導性のGreinerからの96ウェルプレートで培養した。実験日に細胞は10％シュク
ロースを含有する10％ホルマリン中で固定し、そしてブロッキングバッファー（
40mM Tris HCL、Ph 8.0、27mM NaClおよび0.2％ Tween 20）でインキューベーシ
ョンした。エリトロポエチンのレセプターは、細胞をウサギポリクローナルの抗
-エリトロポエチンレセプター抗体（サンタクルズ（Santa Cruz）からのC-20）
およびFITC結合２次抗体とインキューベーションすることにより検出した。標識
した細胞は、蛍光顕微鏡（ATTO）を使用して視覚化した。結果エリトロポエチンレセプターに対するポリクローナル抗体は、図２（右パネル
）で見られるようにSK-N-MCおよびPC-12細胞の両方を標識した。低い倍率で見え
るすべてのSK-N-MC細胞は、抗体で標識されたようだった。検出可能なPC-12細胞
のほとんどが、抗-エリトロポエチンレセプター抗体で標識された。この調製で
特徴的な神経表現型を保持した数個の完全なPC-12細胞は、軸索プロセス（axona
l process）を通して、ならびに細胞体での染色を示した。２次抗体単独ではい
ずれの型の細胞も標識しなかった（図２、左パネル）。

【００５０】したがって、これらの結果はこれらの細胞系、ヒトの神経上皮腫に由来するSK
-N-MC細胞およびラットのクロム親和性細胞腫に由来するPC-12細胞がエリトロポ
エチンレセプターを発現することを示す。したがってこれらの細胞系はエリトロ
ポエチンに反応性であり、そしてニューロンに及ぼすエリトロポエチンの効果を
研究する良い系を提供することができる。

【００５１】実施例２ EPOはPC12細胞で遺伝子発現を誘導した細胞培養 PC12細胞（ラットのクロム親和性細胞腫に由来する）は、10％FBSおよび５％
ウマ血清を含有するDMEM中でポリ-D-リシンをコートした組織培養プラスチック
上で培養した。PC-12細胞で神経表現型を誘導するために、血清を除去し、そし
て細胞をNGF（50ng/ml）で処理した。細胞はNGFの存在下で７日間成長させ、次
いで実験に使用した。EPO処理およびRNA単離 PC-12細胞は、10cmのポリ-D-リシンをコートした組織培養皿で実施例１に記載
したように培養した。細胞は１U/mlのEPOの存在下で24時間インキューベーショ
ンした。次いで全RNAはQiagen RNAイージイミニプレップキット(easy mini prep
kit)を使用して単離し、そしてRT-PCRに使用した。定量的RT-PCR リアルタイム逆転写およびPCRは、光循環器およびロッシュモレキュラーバ
イオケミカルズ(Roche Molecular Biochemicals）からのRNA増幅キットを使用し
て１回の反応で行った。RNAを定量し、そしてdsDNA特異的色素SYBRグリーンIを
含む反応混合物に等量で加えた。特異的PCR反応は、各PCRサイクルで反応物中の
蛍光量を検出することにより定量する。最終分析は光循環装置に含まれる分析ソ
フトウェアを使用して行った。まとめ EPO（１U/ml）を用いたPC-12細胞の24時間の前処理により、図３に見られるよ
うにbcl-2ファミリーの員であるbcl_xL およびbakの遺伝子発現に有意な変化が生
じた。EPOで処理した細胞は、抗-アポトーシス遺伝子であるbcl_xL の発現に６倍
の上昇を、そしてプロ-アポトーシス遺伝子であるbakの発現に５倍の減少を示し
た。EPOはbcl_xL 発現を上昇させることにより赤血球前駆体細胞の生存を上昇され
ることが以前に示された（Silva et al.,1996)。これらの結果はEPOが、損傷に
反応してアポトーシスを受けることからニューロンを保護するために類似のメカ
ニズムを使用することを示す。bakの調節は、EPOがさらなる遺伝子の発現を行っ
てこの効果を誘導できることを示す。

【００５２】実施例３ラット海馬および皮質細胞およびPC12細胞に及ぼす rhEPOの神経保護および神経突起異常成長効果初代神経細胞培養解離した海馬および皮質細胞培養は、18日のラットの胎児胚からすでに記載さ
れているように樹立した（Mattson et al.,1994)。簡単に説明すると、胎児は安
楽死に基づくAVMAパネルに従い、ハロタンで麻酔をかけた妊娠している母親（Sp
rague-Dawley）から帝王切開を介して取り出した。子供を断頭し、そして脳を摘
出し、そしてHEPES-緩衝化ハンクスバランス塩溶液(HBSS:ギブコ）に置いた。海
馬および皮質を切開し、そして組織型に従いプールした。組織は15分間トリプシ
ン処理し（１mg/ml トリプシン-HBSS;ワーシントン）、新たなHBSSですすぎ、ト
リプシンインヒビター（１mg/ml；シグマ）中で５分間インキューベーションし
、新たなHBSSで再度すすぎ、そして次に１mlの新たなHBSS中で火炎−処理ガラス
ピペットを用いてトリチュレートした。解離した細胞を30,000細胞／ウェルでポ
リ-D-リシンをコートした96-ウェルプレート(コラボラティイブバイオサイエン
ス）上にまいた。各ウェルは、26mM NaHCO₃（シグマ）、56mM グルコース(シグ
マ）、15mM KCl(シグマ）、1mM ピルビン酸ナトリウム(シグマ）、1.1mM L-グル
タミン（シグマ）、10（容量／容量）％熱−不活性化ウシ胎児血清（ハイクロー
ン）および0.001％硫酸ゲンタマイシン（シグマ）(pH7.4）を補充した100μlの
イーグル最少必須培地（MEM;ギブコ）を含んだ。細胞は実験処理前に24時間、湿
潤化された37℃の５％CO₂インキュベーター中で接着させた。培養基は３日毎に
吸引し、そして新しい培地と交換した。グルタメート毒性アッセイ皮質細胞は、200,000細胞／皿でポリエチレンイミンをコートした35mmの培養
基上にまいた。各皿は上記のように補充した1.5mlのMEMを含んだ。培養の７日目
に、前以て印をつけた４つの場を、ニコン（Nikon）Diaphot倒立顕微鏡（10×倍
）で視覚化し、そして実験処置前に写真を取った。直後に、培養物を賦形剤また
は組換えヒトエリトロポエチン（rEPO;ロット#41C514;ダッベッコのリン酸緩衝
化塩（DPBS;シグマ）中に適当濃度に希釈した0.2M クエン酸、0.585g.L NaCl中
の50μM ストック＋0.1％ウシ血清アルブミン（BSA;シグマ））で処理した。24
時間後、培養物を100μMのグルタメート（シグマ）で処理した。グルタメートか
ら24時間後、各皿の４つの場を再度写真撮影した。細胞の生存は実験処理前およ
び後に各場の生存細胞を数えることにより測定した。ニューロンは、直径が均一
で、しかも外観が滑らかなそれらの神経突起を有する場合、そしてソーマは滑ら
かで丸から楕円形である場合、生存すると考えた。データは対照のパーセントと
して表した（賦形剤；平均±SD）。PC-12細胞培養 PC-12細胞（ラットのクロム親和性細胞腫に由来する）は、ポリ-D-リシンをコ
ートした組織培養皿上で10％FBSおよび５％ウマ血清を含有するDMEM中で培養し
た。PC-12細胞の神経表現型を誘導するために、血清を除去し、そして細胞をNGF
(50ng/ml)で処理した。細胞はNGFの存在下で７日間成長させ、次いで実験に使用
した。グルタメート毒性 PC-12細胞は上記のように培養した。インサルトの攻撃の24時間前、細胞を１p
m〜１nmの範囲の濃度でrhEPOを用いて処理した。実験日に、細胞を200μMのグル
タメートに30分間暴露した。次いで細胞を２回、新しい培地で洗浄してグルタメ
ートを除去し、そしてNGFを含むがEPOは含まない新しい培地で培養した。24時間
後、細胞はトリパンブルー排除アッセイを使用して生存能についてアッセイした
。簡単に説明すると、培地を除去し、そして細胞を５分間、0.4％トリパンブル
ーとインキューベーションした。次いで細胞をPBSで穏やかに洗浄し、次いで10
％ホルマリンで固定した。細胞の生存能は細胞の総数対トリパンブルー陽性（
死亡）細胞数を計数することにより決定した。NGF離脱 PC-12細胞は上記のように96ウェルのポリ-d-リシンをコートした多-ウェルプ
レート中で培養し、そしてNGF離脱24時間前にrhEPO（１pm〜10nm）で処理した。
実験日に細胞を３回、バッファーで洗浄してNGFを除去し、そして次いでNGFを含
まない新たな培地で培養した。NGFの洗いだし直後に細胞を計数し（ｔ＝０）、
生存細胞数を決定した。細胞の生存能は相の明るさ、軸索の存在および泡状突起
（blebbing）の不存在を含む形態学的特徴に基づいた。細胞計数は12時間、24時
間、48時間および72時間に行い、そして生存細胞数を数えた。神経突起異常成長アッセイプレートにまいてから24時間後、培養物を賦形剤（PBS+0.1％BSA）、100ngの
種々の増殖因子（脳由来神経栄養因子（BDNF:プロメガ(Promega)、グリア由来神
経栄養因子（GDNF:プロメガ）、神経成長因子（NGF;ベーリンガーマンハイム(B
oehringer Mannheim）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF;ベーリンガーマンハ
イム）、インスリン−様増殖因子-1（IGF-1;ベーリンガーマンハイム）、ニュ
ーロトロフィン-3（NT3;カルビオケム(Calbiochem))、ニューロトロフィン-4（N
T4;カルビオケム)、毛様体神経栄養因子(CNTF:カルビオケム）、上皮増殖因子（
EGF;カルビオケム）、血管内皮増殖因子（VEGF;カルビオケム)）、またはrhEPO
（上記と同じように調製した;10fM〜10nM）で処理した。各処理条件は４連また
は８連で行った。培養の３日目に培地を吸引し、そして新たな培地および試験化
合物に置き換えた。培養の１週間目に、細胞を10％リン酸緩衝化ホルマリンで15
分間固定し、次いでDPBS（シグマ)ですすぎ、そしてブロッキング血清中（ウマ
血清：DPBS中で1:50希釈;ベクターラボズ）に30分間置いた。培養物を再度DPBS
ですすぎ、そして１次抗体中で２時間インキューベーションした（微小管関連タ
ンパク質-2（MAP-2）が樹状プロセスの選択的マーカーである；抗-マウスモノク
ローナル（カルビオケム）；抗体希釈物中（ザイメッド）のMAP-2の1:1000希釈
）。陰性対照ウェルは抗体希釈物のみとインキューベーションした。バックグラ
ウンドシグナルは、抗体と共に、または無しでインキューベーションしたブラン
クウェル（無細胞）により測定した。培養物を再度DPBSですすぎ、そして次いで
フルオロセイン中に１時間置いた（FITC:抗-マウスIgG;ラット吸着;DPBS中1:50
希釈;ベクターラボズ）。培養物を最後にDPBSですすぎ、そして次いでプレート
をCytofluor 4000蛍光プレートリーダーで読んだ。神経突起の異常成長は対照か
らの変化のパーセントとして表した（賦形剤；平均蛍光±SD）。結果初代神経培養を用いた神経保護実験：グルタメート投与24時間前にrhEPOを用い
た培養物の前処理により、神経生存に有意な上昇がもたらされた（図４）。細胞
の生存は、グルタメートのみで処理した平行する培養物よりも最大で約200％上
昇した。rhEPOの神経保護的効果は濃度依存的であり、最大の効果はpM濃度で観
察され、ここで細胞の生存は賦形剤（グルタメート無し）処理培養物以上であっ
た。PC12細胞を用いた神経保護実験：EPOを用いた前処理は、PC-12細胞においてグル
タメート毒性および増殖因子離脱の両方により誘導される細胞死に有意な低下を
もたらした。両実験における神経保護効果に関するピーク濃度は10pmであった。
EPOの神経保護効果に関する用量応答曲線は２相的であり、EPOが細胞傷害性に対
して細胞を保護する能力は10pmより高い濃度ては減少し、そして1nmでは有意な
効果が無かった。これらの結果は、EPOが種々の細胞傷害性インサルトに暴露さ
れたニューロンにおけるアポトーシス応答を防ぐことができることを示唆する。初代神経培養を用いた神経突起の異常成長実験：rhEPOを用いて処理した培養物
は、MAP2-FITC免疫蛍光により測定されるように、神経突起の異常成長に有意な
上昇をもたらした。この神経突起の異常成長促進効果は濃度依存的であり、pMレ
ベルで最大活性が観察された（図７および８）。この結果はrhEPO処理が海馬培
養物（対照に対して12〜44％）で皮質培養物（対照に対して15〜29％）よりも大
きな異常成長応答を誘導したことを示す。rhEPOと既知の増殖因子との間の比較
は、それらの神経突起の異常成長促進能力において場所的な差異を表すことを示
す。皮質培養物中での神経突起の異常成長を増すrhEPOの能力は、既知の増殖因
子以上である。幾つかの因子が皮質細胞にそのような効果を有することから、こ
の観察は強い影響力を持ち、しかも重要である。一方、多くの増殖因子が海馬で
強い異常成長応答を発揮する（対照に対して38〜86％）。そのような増殖因子と
比較して、rhEPOは中程度から強い異常成長促進活性を示したが；その活性はBDN
F、NGFおよびVEGFを含む幾つかの増殖因子より優れていた。考察神経保護実験では、rhEPOがグルタメート毒性およびインビボでの血清離脱に
対して、pM濃度で保護的であるという前の証拠が確認された。

【００５３】驚くべきことには、我々はrhEPOが初代哺乳動物神経細胞において神経突起の
異常成長を促進することを見いだした。効果は海馬および皮質細胞で強力であっ
た。この効果は有力であり、ピコモル以下の濃度で観察された効力はこれまでの
EPOに関連する考察よりもはるかにより強力であった。さらに幾つかの増殖因子
に応答する大脳皮質ニューロンでは、rhEPOはほとんどの既知の増殖因子に比べ
て神経突起の異常成長の誘導に優れていた。

【００５４】治療的観点から、rhEPOが大脳皮質ニューロンの神経保護および神経突起の異
常成長を促進するという考察は大変重要である。神経変性中、神経細胞は異なる
段階のプロセスに存在し得る。幾つかはストレスを受け、他は有意な神経突起の
収縮、およびシナプス入力の損失を経験し、そして最終的には影響を受けたすべ
ての細胞が死ぬだろう。多くのレベルでこのプロセスに介入できる治療薬は神経
細胞および最終的には神経機能の回復に大変有益であり得る。本データはrhEPO
がこの目的を、細胞を保護することにより、それらの生存を強化することにより
、シナプス接触および連結の再樹立を促進することにより、そしてニューロンお
よび神経の循環性を安定化することにより達成する。

【００５５】大変わずかな増殖因子が大脳皮質ニューロンには効果的であり、そしてまた大
変わずかな増殖因子が皮質ニューロンにおける神経保護物質および神経突起の異
常成長の促進物質として二重の活性を示すことを考えると、このデータは特に重
要であると言うべきである。このrhEPOの二重活性がピコモル下／ピコモル濃度
で観察されたことには特に意味がある。

【００５６】実施例４ EPO模擬ペプチドは神経突起の異常成長を刺激する細胞培養解離した海馬および皮質細胞培養は、18日のラットの胎児胚からすでに記載さ
れているように樹立した（Mattson et al.,1994)。簡単に説明すると、胎児は安
楽死に基づくAVMAパネルに従い、ハロタンで麻酔をかけた妊娠している母親（Sp
rague-Dawley）から帝王切開を介して取り出した。子供を断頭し、そして脳を摘
出し、そしてHEPES-緩衝化ハンクスバランス塩溶液(HBSS:ギブコ）に置いた。海
馬および皮質を切開し、そして組織型に従いプールした。組織は15分間トリプシ
ン処理し（１mg/ml トリプシン-HBSS;ワーシントン）、新たなHBSSですすぎ、５
分間トリプシンインヒビター（１mg/ml；シグマ）中でインキューベーションし
、新たなHBSSで再度すすぎ、そして次に１mlの新たなHBSS中で火炎−処理ガラス
ピペットを用いてトリチュレートした。解離した細胞を30,000細胞／ウェルでポ
リ-D-リシンをコートした96-ウェルプレート(コラボラティイブバイオサイエン
ス）上にまいた。各ウェルは、26mM NaHCO₃（シグマ）、56mM グルコース(シグ
マ）、15mM KCl(シグマ）、1mM ピルビン酸ナトリウム(シグマ）、1.1mM L-グル
タミン（シグマ）、10（容量／容量）％熱−不活性化ウシ胎児血清（ハイクロー
ン：Hyclone）および0.001％硫酸ゲンタマイシン（シグマ）(pH7.4）を補充した
100μlのイーグル最少必須培地（MEM;ギブコ）を含んだ。細胞は実験処理前に24
時間、湿潤化された37℃の５％CO₂インキュベーター中で接着させた。培養基は
３日毎に吸引し、そして新しい培地と交換した。神経突起異常成長アッセイプレートにまいてから24時間後、培養物を賦形剤（PBS+0.1％BSA）、100ngの
種々の増殖因子（脳由来神経栄養因子（BDNF:プロメガ)、グリア由来神経栄養因
子（GDNF:プロメガ）、神経成長因子（NGF;ベーリンガーマンハイム）、塩基性
繊維芽細胞増殖因子（bFGF;ベーリンガーマンハイム）、インスリン−様増殖因
子-1（IGF-1;ベーリンガーマンハイム）、ニューロトロフィン-3（NT3;カルビ
オケム）、ニューロトロフィン-4（NT4;カルビオケム)、毛様体神経栄養因子（C
NTF:カルビオケム）、上皮増殖因子（EGF;カルビオケム）、血管内皮増殖因子（
VEGF;カルビオケム））、またはEPO模擬ペプチド（EMP1、EMP6、EMP9、EMP23お
よびEMP27;DPBS+0.1％ BSA中で希釈；10fM〜10nM;表１）で処理した。各処理条
件は４連で行った。培養の３日目に培地を吸引し、そして新たな培地および試験
化合物に置き換えた。培養の１週間目に、細胞を10％リン酸緩衝化ホルマリンで
15分間固定し、次いでDPBS（シグマ）ですすぎ、そしてブロッキング血清中（ウ
マ血清：DPBS中で1:50希釈;ベクターラボズ）に30分間置いた。培養物を再度DP
BSで再度すすぎ、そして１次抗体中で２時間インキューベーションした（微小管
関連タンパク質-2（MAP-2）は樹状プロセスの選択的マーカーである；抗-マウス
モノクローナル（カルビオケム）；抗体希釈物中（ザイメッド）のMAP-2の1:100
0希釈）。陰性対照ウェルは抗体希釈物のみとインキューベーションした。バッ
クグラウンドシグナルは、抗体と共に、または無しでインキューベーションした
ブランクウェル（無細胞）により測定した。培養物を再度DPBSですすぎ、そして
次いでフルオロセイン中に１時間置いた（FITC:抗-マウスIgG;ラット吸着;DPBS
中1:50希釈;ベクターラボズ）。培養物を最後にDPBSですすぎ、そして次いでプ
レートをCytofluor 4000蛍光プレートリーダーで読んだ。神経突起の異常成長は
対照からの変化のパーセントとして表した（賦形剤；平均蛍光±SEM）。

【００５７】

【表１４】

【００５８】結果神経突起異常成長実験：EMPで処理した培養物は、MAP2-FITCにより測定した時に
神経突起の異常成長に有意な上昇をもたらした。神経突起の異常成長を促進する
効果は濃度依存的であり、最大活性はpMレベルで観察された（図９〜１８）。こ
の結果はEMPが異なる活性プロフィールを表すことを示した。試験した濃度で、E
MP-1および6は海馬培養物において典型的なベル型の用量応答プロフィールを示
し、ピーク活性は30〜300pMで観察された（賦形剤に対して83〜117％の上昇）。
EMP-9および27は海馬培養物において平らな応答プロフィールを表し、ピーク活
性はEMP-1および6と同じ濃度で観察されたが、応答の規模は大きく低下した（賦
形剤に対して29〜32％の上昇）。EMP-23は海馬培養物において中程度の応答を有
し、賦形剤応答に対して43〜46％の上昇を導く30pM〜１nMの間にピーク活性が観
察された。皮質培養物では、EMP-1、9および27が最も知られている増殖因子に類
似する応答プロフィールを表し−全体的には平らな応答であり、最大活性は30〜
300pM間で起こり、賦形剤応答より32〜40％高く到達した。EMP-6および23は、典
型的なベル型の用量応答プロフィールを示し、ピーク活性が30〜300pM間で観察
され、賦形剤応答レベルに対する成長では68〜87％の上昇をもたらした。全体的
にEMP-6は海馬および皮質培養物の両方において強力な神経突起の成長活性を促
進し；一方EMP-1は皮質培養物よりも海馬培養物で選択的な効果を表し、そしてE
MP-23効果は海馬細胞よりも皮質培養物で大きかった。EMP-9および27の神経突起
異常成長応答は、全体的に印象が薄かった。

【００５９】 EMPと既知の増殖因子との間の比較では、それらが神経突起異常成長能におい
て場所的な差異を表すことを示した。EMP27が皮質培養物で神経突起の異常成長
を増す能力は、既知の増殖因子より大きいか、または等しかった（図９〜１８）
。幾つかの因子がそのような効果を皮質細胞に持つので、この観察は強い影響力
を持ち、そして重要である。一方で、多くの増殖因子は強力な異常成長応答を海
馬で発揮した（対照に対して38〜86％）。そのような成長因子と比較して、EMP
は中程度から強い異常成長促進活性を示した；しかしそれらはBDNF、NGFおよびV
EGFよりは優れた活性を示した。考察 EMPは哺乳動物細胞中の神経突起の異常成長を促進する。この効果は海馬およ
び皮質細胞で強力であった。神経突起異常成長促進効果は、種々の増殖因子より
も優れていた。この効果は強力でピコモル濃度で効力が観察された。

【００６０】大変わずかな増殖因子または模造物が神経突起の異常成長において大脳皮質ニ
ューロンでは効果的であることを考えると、このデータも特に重要である言うべ
きである。このEMPの活性がピコモル下／ピコモル濃度で観察されることには特
に意味がある。

【００６１】実施例５ EPOは虚血性損傷に対して保護する個体 250〜300gの体重のオスの自然発生高血圧ラット(Charles River）を体重測定
し、そしてケタミンで麻酔をかけた（100mg/mlキシラジン(20mg/ml)カクテル(1.
2ml/kg;i.p.）。麻酔レベルは角膜反射（目に対して空気を一吹き)、および尾ま
たは足のピンチに反応する脚の反射により評価した。いったんラットに麻酔をか
けたら、ラットを小さい手術台に置き、そして手術中に拘束した。ラットの体温
は直腸プローブで連続的に監視し、そして恒常的熱パッドを用いて37℃に維持し
た。大脳虚血の実験モデルラットはBritおよび共同研究者により記載された技法（J.Cereb Blood Flow M etab. 8:474-485,1988）を変更して使用して、左総頸動脈および左中大脳動脈を
並べて２時間閉鎖して虚血とし、続いて22時間再潅流した。具体的には左CCAを
首の腹側表面の切開を通して分離した。同側のMCAを分離するために、左外眼角
と下の頭蓋を噛むために応する外耳道との間に第２切開を作成した。MCAは５mm
のブルホールドリルで２〜３mmの穴を開けた吻を通して頬骨弓および側頭鱗にの
融合部に、Zeiss操作顕微鏡下で直接見ながら露出した。硬膜を滅菌した26gの針
を用いて開き、そして白金合金ワイヤ（直径0.1mm）を下皮質静脈のちょうど上
のMCA下に挿入した。Aronowskiおよび共同研究者（Stroke,25:2235-2240,1994)
に記載されているようにMCAを持ち上げ、そして合金ワイヤを渡る血管を圧縮す
ることにより一時的に閉塞した。同時にCCAを動脈瘤クリップで閉塞した。CCAお
よびMCAの閉塞時間は２時間であった。この時間の終わりに、ワイヤおよびクリ
ップを慎重に取り出して血管の再潅流を可能とし、そして切開領域は縫合により
閉じた。ラットは隔離ケージに置いた後、それらのホームケージに戻した。実験計画実験Ｉ：浸透圧ミニポンプにより送達されるEPOおよび賦形剤虚血の発生24時間前に、賦形剤またはEPOを充填した浸透圧ミニポンプ（モデ
ル1003D:アルザ(Alza)）を、ラットの肩甲骨間に配置した。ポンプに付けたカテ
ーテルは、１μl／時間の速度で薬剤を連続的に注入するために右頸動脈内に挿
入し、そして繋いだ。ラットは５群に分割した：（１）偽操作の賦形剤−処理、
（２）虚血性の賦形剤処置、（３）虚血性の1.32U/日 EPO処理、（４）虚血性の
32U/日 EPO処理、および（５）虚血性の1321U/日 EPO処理。２日目に、ラットは
上記のように虚血とした。22時間後、ラットの行動的能力について評価し、血液
サンプルをEPOの最終血漿レベルのために集め、そして次いでラットを屠殺し、
脳を摘出し、切片とし、そして組織学的分析のために染色した。実験II：単回の静脈ボーラス注射として送達されるEPOおよび賦形剤１日目に、ラットを上記のように虚血とした。ラットを４群に分けた：（１）
虚血性の賦形剤処置、（２）虚血性の1000U/kg EPO処置、（３）虚血性の2500U/
kg EPO処置、および（４）5000U/kg EPO処置。閉塞から15分後、ラットは賦形剤
またはEPOを静脈内ボーラス注射として受容した。22時間後、ラットは行動的能
力について評価し、血液サンプルをEPOの最終血漿レベルのために集め、そして
次いでラットを屠殺し、脳を摘出し、切片とし、そして組織学的分析のために染
色した。実験III：反復静脈内ボーラス注射として送達されるEPOおよび賦形剤１日目に、ラットは上記のように虚血とした。ラットを２群に分けた：（１）
虚血性の賦形剤処置、および（２）虚血性の2500U/kg EPO処置。薬剤は全部で10
,00U/kgの用量について、閉塞後、15分、２時間、４時間および６時間に静脈内
ボーラスとして投与した。22時間後、ラットを行動的能力について評価し、血液
サンプルをEPOの最終血漿レベルのために集め、そして次いでラットを屠殺し、
脳を摘出し、切片とし、そして組織学的分析のために染色した。結果の測定血漿測定：血液サンプルは各ラットから屠殺時に眼窩洞を通して集めた。血漿は
分離し、凍結し、そしてEPO ELISAにより血漿濃度測定のために分析した（U/ml)
。梗塞容量：脳を摘出し、1mmのスラブ中にブロックし、そして2,3,5-トリフェニ
ルテトラゾリウムクロライド染料（TTC;シグマ)で室温にて15分間染色した。染
色した切片を10％緩衝化ホルマリン中で４℃にて保存した。切片はニコン SMZ-U
顕微解剖鏡により視覚化した。各脳切片の画像はCCDカメラにより捕らえ、そし
て梗塞容量を計算するためにImage Pro Phase IIIソフトウェアを使用して処理
した。結果実験I ：浸透圧ミニポンプを介して連続的注入として132または1321U/日で与えた
EPOは、梗塞容量を有意に下げた（図１９）。血漿濃度は保護効果と相関した（
図２０）。実験II ：閉塞から15分後に単回のivボーラスとして与えたEPOは、このモデルに
おいて1000、2500または5000U/kgで虚血性傷害に対して保護しなかった（図２１
）。血漿濃度は各群で低かった（図２２）。実験III ：閉塞から15分、２時間、４時間および６時間後に反復ivボーラスとし
て与えたEPOは、有意に梗塞容量の低下を導いた（図２３）。血漿濃度は現在測
定中である（図２４）。考察データは低から中程度の濃度のEPOを連続的または繰り返し投与することが、C
CAおよびMCAの一過性の並列閉塞を介して虚血にされた自然発生高血圧ラットに
おいて、梗塞容量を有意に下げることができるということを支持する。また結果
は、保護的効果が起こるためにはEPO投与の量と時期との間に重要な関係がある
ことも支持する。長期にわたり与えた低容量のEPOは、同様に与えた、または単
回のボーラス注射として与えた高用量よりもより有益となり得る。これはEPOの
最大保護効果が低用量（pM）で観察され、そして実際には高用量（μM）で効果
を失うというインビトロデータと一致する。

【００６２】

【表１５】

【００６３】

【表１６】

【００６４】

【表１７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 EPOレセプターがラットの海馬および皮質培養で発現することを示す。

【図２】 EPOレセプターが神経細胞系：PC12およびSK-N-MC細胞で発現することを示す。

【図３】 EPOがPC12細胞で遺伝子発現を誘導したことを示す（上）。１nmのEPOで24時間
処理したPC12細胞から単離した全RNAを、RT-PCRにかけて特異的BCLファミリー員
の遺伝子発現における変化を定量した。EPOの前処理で、抗-アポトーシス遺伝子
BCL_XLの発現に６倍の上昇が、そしてプロ-アポトーシスBakの発現に５倍以上の
低下が生じた。これらの結果は遺伝子チップを用いた結果と一致し、EPOの保護
的効果に関する可能なメカニズムを示唆している。（下）RT-PCR産物を示すアガ
ロースゲルは、Bcl_XLおよびBckの調節を示す。ｍ−マーカー、１−RT-PCR陰性対
照、レーン２−処理無し、レーン３−50ng/ml NGF、レーン４−EPO １nm。

【図４】 rhEPOはグルタメート毒性に対してラットの大脳皮質ニューロンを保護するこ
とを示す。

【図５】 rhEPOはグルタメートが誘導する細胞死に対してラットPC12細胞を保護するこ
とを示す。PC-12細胞の７日の培養物をエリトロポエチンで24時間処理した後、
毒性濃度のグルタメート（200um）に暴露した。培養物は24時間で回収し、そし
て細胞の生存はトリパンブルー排除アッセイを使用して測定した。グルタメート
に15分間暴露する24時間前に与えた１〜10pmのエリトロポエチンは、細胞の生存
を有意に増加させた（ｐ＜0.01、スチューデントｔ検定。EPOの保護活性はより
高い用量で低下した。

【図６】 rhEPOはNGF-離脱が誘導する細胞死に対してラットPC12細胞を保護することを
示す。PC-12細胞の培養物はNGFの存在下で７日間成長させ、そして次いでEPOで2
4時間処理した後、NGFを含まない培地に切り替えた。細胞の生存は、NGFの除去
直後に生きている細胞の数を計数し、そして増殖因子の離脱後12時間、24時間、
48時間および72時間の生存細胞数と比較することにより決定した。細胞の生存性
は相の明るさ、軸索の存在および膜の泡状突起の不存在を含む形態学的特徴に基
づき測定した。10pmの最適濃度のEPOを用いた処理は、増殖因子の離脱後の各時
点で生存細胞数を上昇させた。

【図７】 rhEPOがラットの大脳培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図８】 rhEPOがラットの海馬培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図９】 EMP-1がラットの大脳皮質培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１０】 EMP-1がラットの海馬培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１１】 EMP-6がラットの大脳皮質培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１２】 EMP-6がラットの海馬培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１３】 EMP-9がラットの大脳皮質培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１４】 EMP-9がラットの海馬培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１５】 EMP-23がラットの大脳皮質培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１６】 EMP-23がラットの海馬培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１７】 EMP-27がラットの大脳皮質培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１８】 EMP-27がラットの海馬培養で神経突起の成長を促進することを示す。

【図１９】 EPOが虚血性損傷に対して保護することを示す：実験I浸透圧ミニポンプを介し
た連続iv注入。

【図２０】実験Iに関する血漿測定を示す。

【図２１】 EPOは虚血性損傷に対して保護しないことを示す；実験II単回ivボーラス投与
。

【図２２】実験IIに関する血漿測定を示す。

【図２３】 EPOは虚血性損傷に対して保護することを示す；実験III反復ivボーラス投与。

【図２４】血漿測定を示す：実験III。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 13/02 13/02 13/12 13/12 17/00 17/00 21/04 21/04 25/00 25/00 25/02 25/02 １０１１０１１０３１０３ 25/08 25/08 25/14 25/14 25/16 25/16 25/22 25/22 25/24 25/24 25/28 25/28 29/00 29/00 31/18 31/18 35/00 35/00 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡＣ０７Ｋ 7/08 ＺＮＡ 14/505 // Ｃ０７Ｋ 14/505 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者プラタ−サラマン，カルロスアメリカ合衆国ペンシルベニア州19002アンブラー・スクワイアドライブ1313 (72)発明者ジヨリフエ，リンダアメリカ合衆国ニユージヤージイ州08501 ベルミード・ダベンポートウエイ16 (72)発明者フアレル，フランシスアメリカ合衆国ペンシルベニア州18890ドイルズタウン・ジユリーコート4934 (72)発明者ジヨンソン，ダナ・エルアメリカ合衆国ペンシルベニア州19872アツパーブラツクエデイ・ロンリーコテイジロード1343 Ｆターム(参考） 4C076 AA11 AA16 BB13 BB16 BB21 CC01 CC04 CC07 CC11 CC17 CC18 CC27 EE59 4C084 AA02 AA03 BA01 BA08 BA09 BA10 BA18 BA23 BA32 BA37 MA17 MA21 MA65 MA66 NA14 ZA022 ZA062 ZA122 ZA152 ZA162 ZA182 ZA202 ZA212 ZA222 ZA242 ZA362 ZA532 ZA542 ZA552 ZA812 ZA942 ZB262 ZB322 ZC412 ZC422 ZC552 4H045 AA10 AA30 BA17 BA57 DA13 EA21 FA10 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】神経毒性、神経変性または神経的傷害により媒介される状態
を有する患者の処置法であって、EPOレセプターに結合する８〜約40アミノ酸長
の１以上の単量体ペプチドを含んで成る治療に効果的な量のペプチドを該患者に
投与することを含んで成り、各単量体ペプチドはアミノ酸Ｘ₄Ｘ₅Ｘ_aＸ_bＸ₆Ｘ_cＸ_d Ｘ₇（配列番号４７）、ここでＸ_aは、ＧまたはＡであり；Ｘ_bは、ＰまたはＡであり；Ｘ_cは、ＴまたはＡであり；Ｘ_dは、Ｗ、ＡおよびＦから選択され；Ｘ₄は、Ｒ、Ｈ、Ｙ、ＬおよびＷから選択されるか、またはＸ₄は存在せず；Ｘ₅は、Ｆ、ＭおよびＩから選択され；Ｘ₆は、20個の遺伝子的にコードされたＬ-アミノ酸または立体異性的Ｄ-アミ
ノ酸から独立して選択され；Ｘ₇は、Ｄ、Ｖ、Ｅ、ＩおよびＬから選択される、の配列を含んで成る上記方法。
【請求項２】上記配列がＸ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇（配列番号４８）である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】上記配列がＸ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号１）、ここでＸ₃が、Ｃ、Ｅ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸およびホモシステイン（Hoc）
から選択され；そしてＸ₈が、Ｃ、Ｋ、Ａ、α-アミノ-γ-ブロモ酪酸およびホモシステイン（Hoc）
から選択される、である請求項２に記載の方法。
【請求項４】Ｘ₃またはＸ₈のいずれかが、Ｃまたはホモシステイン（Hoc
）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】Ｘ₃またはＸ₈がＣである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】Ｘ₃が、Ｃ、ＥおよびＡから選択され；Ｘ₄が、Ｒ、ＨおよびＹから選択されるか、またはＸ₄が存在せず、Ｘ₆が、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＥおよびＡから選択され；そしてＸ₇が、ＤまたはＶであり；そしてＸ₈が、Ｃ、ＫおよびＡから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】上記ペプチドがアミノ酸ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈
（配列番号２）、ここで、Ｘ₂およびＸ₆は、各々が20個の遺伝的にコードされたＬ-アミノ酸から独立し
て選択され；Ｘ₃がＣであり；そしてＸ₈がＣである、の配列を含んで成る上記の各単量体ペプチドの二量体である、請求項３に記載の
方法。
【請求項８】Ｘ₂が、ＬＳＨＭＡおよびＩから選択されるか、またはＸ₂が
存在せず；そしてＸ₆が、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＥおよびＡから選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】上記の各単量体ペプチドが、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｇ
ＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号３）の配列を含んで成り、ここで各Ｘ₁
、Ｘ₂、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀およびＸ₁₁は20個の遺伝的にコードされたＬ-アミノ酸か
ら独立して選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】Ｘ₃が、Ｃ、ＥおよびＡから選択され；Ｘ₄が、Ｒ、ＨおよびＹから選択されるか、またはＸ₄が存在せず、Ｘ₇が、ＤまたはＶであり；Ｘ₈が、ＣまたはＫであり、Ｘ₉が、Ｋ、Ｇ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴであり；そしてＸ₁₀が、Ａ、Ｇ、Ｐ、ＲまたはＹである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】Ｘ₁が、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶであり；Ｘ₂が、Ｌ、Ｓ、Ｈ、Ｍ、ＡおよびＩから選択されるか、またはＸ₂が存在せず
；Ｘ₉が、Ｋ、Ｑ、Ｒ、ＳおよびＧから選択され；そしてＸ₁₀が、Ｐ、ＹおよびＡから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】上記ペプチドがアミノ酸Ｘ'Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷＸ₇
Ｘ₈（配列番号４９）ここで、Ｘ'は、D-Tyr、p-NO₂-Phe、p-NH₂-Phe、p-F-Phe、p-I-Pheおよび3,5-
ジブロモ-Tyrから選択される、の配列を含んで成る上記の各単量体ペプチドの二量体である、請求項３に記載の
方法。
【請求項１３】上記配列がＸ'ＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣである、請求項１２
に記載の方法。
【請求項１４】上記の各単量体ペプチドが【表１】【表２】から独立して選択される配列を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】上記の各単量体ペプチドが【表３】から独立して選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】上記ペプチドが、共有結合を介してポリエチレングリコー
ルリンカーにより形成された二量体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】上記二量体の各単量体ペプチドがＮ-末端をＮ-末端に共有
結合されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】上記二量体の各単体ペプチドがＮ-末端をＣ-末端に共有結
合されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】上記単量体ペプチドが、活性化ベノジアゼピン、オキサザ
ロン、アザラクトン、アミンイミドまたはジケトピペラジン上で二量体化されて
いる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】上記単量体ペプチドがＮ-末端をＮ-末端に共有結合されて
いる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】上記単量体ペプチドがＮ-末端をＣ-末端に共有結合されて
いる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】少なくとも１つのペプチド二量体を含んで成る請求項２に
記載のペプチド。
【請求項２３】細胞表面レセプターを活性化して神経保護的生物活性を誘
導する方法であって、請求項２に記載のペプチドの二量体を該レセプターと接触
させることにより該神経保護的生物活性を誘導する上記方法。
【請求項２４】上記の細胞表面レセプターが、上記二量体とインビトロま
たはインビボで接触する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】上記の細胞表面レセプターがEPOレセプターである、請求
項２３に記載の方法。
【請求項２６】上記のペプチド二量体が、GHアゴニスト、PDGFアゴニスト
、EGFアゴニスト、G-CSFアゴニスト、TPO（トロンボポエチン）アゴニスト、VEG
Fアゴニスト、FGFアゴニスト、インスリンアゴニスト、IL-3アゴニスト、IL-5ア
ゴニスト、IL-6アゴニストおよびIL-2アゴニストから成る群から選択される細胞
表面レセプターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】上記アゴニストが、アミノ酸ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆ＴＷ
Ｘ₇Ｘ₈（配列番号２）（ここで、各Ｘ₂およびＸ₆が20個の遺伝的にコードされた
Ｌ-アミノ酸から独立して選択され；Ｘ₃がＣであり；Ｘ₄がＲ、Ｈ、ＬまたはＷ
であり；Ｘ₅がＭ、ＦまたはＩであり；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；そ
してＸ₈がＣである）の配列を含んで成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】上記アゴニストが、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆Ｔ
ＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号３）（ここで、各Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₆、Ｘ₉、Ｘ₁₀お
よびＸ₁₁が20個の遺伝的にコードされた任意のＬ-アミノ酸から独立して選択さ
れ；Ｘ₃がＣであり；Ｘ₄がＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり；Ｘ₅がＭ、ＦまたはＩで
あり；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；そしてＸ₈がＣである）の配列を含
んで成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】上記アゴニストが、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆Ｔ
ＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号３）（ここで、各Ｘ₁、Ｘ₂およびＸ₁₁が20個の
遺伝的にコードされた任意のＬ-アミノ酸から独立して選択され；Ｘ₃がＣであり
；Ｘ₄がＲまたはＨであり；Ｘ₅がＦまたはＭであり；Ｘ₆がＩ、Ｌ、Ｔ、Ｍまた
はＶであり；Ｘ₇がＤまたはＶであり；Ｘ₉がＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴで
あり；そしてＸ₁₀がＡ、Ｇ、Ｐ、ＲまたはＹである）の配列を含んで成る、請求
項２３に記載の方法。
【請求項３０】上記アゴニストが、アミノ酸Ｘ₁ＹＸ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅ＧＰＸ₆Ｔ
ＷＸ₇Ｘ₈Ｘ₉Ｘ₁₀Ｘ₁₁（配列番号３）（ここで、Ｘ₁が、Ｄ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ
またはＶであり；Ｘ₂がＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＳまたはＴであり；Ｘ₃がＣであり
；Ｘ₄がＲまたはＨであり；Ｘ₅がＭ、ＦまたはＩであり；Ｘ₆およびＸ₁₁が独立
して20個の遺伝的にコードされた任意のＬ-アミノ酸でよく；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、
ＬまたはＶであり；Ｘ₈がＣであり；Ｘ₉がＫ、Ｒ、ＳまたはＴであり；そしてＸ₁₀ がＰである）の配列を含んで成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】上記アゴニストが：【表４】【表５】から成る群か選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】上記ペプチド二量体が共有結合を介したポリエチレングリ
コールリンカーを用いて形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】細胞表面アンタゴニストを二量体化することを含んで成る
、細胞表面レセプターアゴニストの調製法。
【請求項３４】上記の細胞表面アンタゴニストレセプターが、GHアンタゴ
ニスト、PDGFアンタゴニスト、EGFアンタゴニスト、G-CSFアンタゴニスト、EGF
アゴニスト、GM-CSFアンタゴニスト、TPOアンタゴニスト、VEGFアンタゴニスト
、FGFアンタゴニスト、インスリンアンタゴニスト、IL-3アンタゴニスト、IL-5
アンタゴニスト、IL-6アンタゴニストまたはIL-2アンタゴニストである、請求項
３３に記載の方法。
【請求項３５】上記の細胞表面レセプターアンタゴニストがEPO-Rアンタ
ゴニストである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】上記アンタゴニストが、アミノ酸（Ｘ？Ｘ₂)_nＸ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｇ
ＰＸ₆ＴＷＸ₇Ｘ₈（配列番号１９）（ここで、Ｘ₆が20個の遺伝的にコードされた
Ｌ-アミノ酸から選択され；Ｘ₃がＣであり；Ｘ₄がＲ、Ｈ、ＬまたはＷであり；
Ｘ₅がＭ、ＦまたはＩであり；Ｘ₇がＤ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；Ｘ₈がＣで
あり；そしてＸ₂が20個の遺伝的にコードされたＬ-アミノ酸から選択され、ｎが
０または１であり、そしてＸ？がＹ（チロシン）を除く20個の遺伝的にコードさ
れた任意のＬ-アミノ酸から選択される）の配列を含んで成る、請求項３５に記
載の方法。
【請求項３７】上記アンタゴニストがＳＣＨＦＧＰＬＴＷＶＣＫ（配列番
号１８）である、請求項３３に記載の方法。