KR20030009450A - 트롬보포이에틴 수용체 조절성 펩티드 - Google Patents

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KR20030009450A
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타트야나 나란다
레나르트 올손
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플리바 파마세우츠카 인두스트리야, 디오닉코, 드러스트보
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Abstract

본 발명은 혈소판감소증의 치료를 위한 신규 진단 및 제약 조성물에 관한 것이다.

Description

트롬보포이에틴 수용체 조절성 펩티드 {Thrombopoietin Receptor Modulating Peptide}
본 발명은 트롬보포이에틴 (TPO) 수용체 조절성 화합물의 생물학적 활성을 갖는 올리고펩티드, 이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이 서열을 포함하는 벡터, 벡터를 포함하는 숙주 세포, 상기 올리고펩티드와 반응성인 항체, 및 상기 올리고펩티드, 뉴클레오티드 서열, 항체 및(또는) 숙주 세포를 포함하는 제약 및 진단 조성물뿐만 아니라 세포를 유전적으로 변형하는 방법, TPO 수용체 (TPO-R)의 활성을 조절하는 방법, 및 다른 TPO 수용체 조절성 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
혈소판감소증은 원발성 혈액성 질환 및 유도된 질환 둘 다로서 발생하는, 널리 퍼져 있는 중증의 치명적인 질병이다. 중증 혈소판감소증을 앓는 환자는 자발성 출혈에 대한 큰 위험이 있다. 유도성 혈소판감소증은 예를 들어 골수 이식, 암 화학요법, 방사선조사 또는 알러지 반응에 의해 발생할 수 있다. 진단되는 모든 새로운 암 환자의 약 50%는 어떤 형태의 화학요법이 실시되며, 혈소판 수혈을 받게 된다. 혈소판감소증은 화학요법을 실시받는 모든 환자의 25% 이상에게서 나타난다. 투여-강화 화학요법의 주기적 반복은 출혈을 예방하고 손상된 혈관의 수복을 보조하는 혈소판을 고갈시키기 때문에, 암 치료를 매우 자주 중단해야만 혈소판수가 회복될 수 있다. 혈소판수가 회복되지 않으면 이후의 화학요법 주기의 지연을 유발하고(하거나) 이 주기의 이용을 제한하여, 성공적인 치료 기회를 감소시킨다.
혈소판감소증의 치료는 주로 새 혈소판 제제의 주입에 의해 수행되는데, 이는 매우 고가이며, 주사 또는 경구 투여에 의해 혈소판의 수를 정상 수준으로 증가시킬 수 있는 약물로서 쉽게 이용할 수 없다. 미국에서만도 매년 800만 유닛의 혈소판이 심한 출혈 위험의 감소를 위해 환자에게 주입된다. 주입의 30% 이상은 합병증, 일반적으로는 발열 반응, 때로는 균혈증, 이식편-대-숙주 질환 또는 급성 폐 손상을 일으킨다. 반복적인 혈소판 주입을 필요로 하는 환자의 15 내지 25%에서, 증가하는 혈소판 반응은 HLA 동종면역화의 결과로서 부적합하다. 또한, 혈소판 주입 비용은 고가이다. 특히, 화학요법으로 인해 유도된 혈소판감소증은 현재로서는 혈소판의 수가 증가할 때까지 혈소판을 주입하고(하거나) 화학요법을 축소 또는 지연시켜 관리한다. 그러나, 이러한 주입은 환자를 혈액성 감염, 예를 들어 B형 간염, C형 간염, HIV 감염 및 인간 T-림프영양성 바이러스, 또는 면역 반응, 예를 들어 발열의 위험에 노출시킬 수 있다. 화학요법 투여량을 감소시키는 행위 및 치료를 지연 또는 중단하는 행위는 이론상 암세포의 증식 또는 확산을 허용한다. 따라서, 혈소판감소증의 치료를 위한 효과적인 약물을 설계하는 것이 긴급하게 요구되고 있는 실정이지만, 여기에는 혈소판감소증의 분자적 및 생화학적 원인에 대한 상세한 이해가 필요하다.
거대핵세포는 순환하는 혈소판을 생산하는 역할을 하는 골수 유래의 세포이다. 거대핵세포는 대부분의 종들에서 적은 비율의 골수 세포만을 포함하지만, 이들은 전형적인 골수 세포 부피의 10배를 넘는다. 거대핵세포는 핵내분열 (endomitosis)을 수행하여 그의 핵을 복제하지만 세포 분열을 수행하지는 않음으로써 다배수체 (polyploid) 세포를 형성한다. 감소된 혈소판 수에 반응하여, 핵내분열 속도는 증가하고, 높은 배수체의 거대핵세포가 형성되며, 거대핵세포의 수는 3배까지 증가한다. 대조적으로, 증가된 혈소판 수에 반응하여, 핵내분열 속도는 감소하고, 낮은 배수체의 거대핵세포가 형성되며, 거대핵세포의 수는 상당히 감소할 수 있다.
순환하는 혈소판 집단이 핵내분열 속도 및 골수 거대핵세포의 수를 조절하는 정확한 생리학적 피드백 메카니즘은 알려져 있지 않다. 현재 이러한 피드백 루프를 조정하는 데 관여하는 순환하는 트롬보포이에틴 인자는, 공통의 N-말단을 갖는 분자량 25 및 31 kDa의 2가지 이상의 형태로 발생하며 적혈구 세포 생산을 조절하는 당단백질인 TPO인 것으로 생각된다. TPO는 생체내 및 시험관내 모두에서 거대핵세포형성의 주요 조절자인 것으로 알려져 있다. TPO는 조혈소 수용체 거대족의 구성원인 c-mpl (하기에서, TPO-R이라고도 함)에 결합함으로써 그의 생물학적 효과를 개시한다. 보다 구체적으로, TPO는 혈소판감소증을 포함하는 상황에서 주요 체액성 조절자인 것으로 알려져 있다. 여러 연구에서, TPO는 혈소판 수를 증가시키고, 혈소판 크기를 증가시키며, 방사성동위원소의 수용체 동물 혈소판으로의 혼입을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, TPO는 다음과 같은 여러 방식으로 거대핵세포형성에 영향을 주는 것으로 생각된다: TPO는 (1) 거대핵세포의 크기 및 수를 증가시키고; (2) 거대핵세포에서 다배수체 형태로 DNA 함량을 증가시키고;(3) 거대핵세포 핵내분열을 증가시키고; (4) 거대핵세포의 성숙을 증가시키며; (5) 작은 형태의 아세틸콜린에스테라제-양성 세포 및 골수에서 전구체 세포의 비율을 증가시킨다.
혈소판 (thrombocyte)은 혈액 응고 작용에 필요하며, 그의 수가 매우 적은 경우에 환자는 갑작스러운 출혈로 인해 사망할 위험이 크기 때문에, TPO는 다양한 혈액성 질환, 예를 들어 주로 혈소판 부족으로 인한 질병의 진단 및 치료 모두에 있어서 잠재적으로 유용한 용도를 갖는다. 또한, 최근의 연구는 혈소판감소증, 특히 화학요법, 방사선요법으로 인한 혈소판감소증의 치료, 또는 암 또는 림프종의 치료로서 골수 이식에 있어서 TPO 요법의 효능에 대하여 고려하는 계기를 제공하였다 (McDonald (1992) Am. J. Ped. Hematology/Oncology 14:8-21).
TPO를 코딩하는 유전자가 클로닝되고 특징이 규명되었다 (Kuter et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11104-11108; Barley et al. (1994) Cell 77:1117-1124; Kaushansky et al. (1994) Nature 369:568-571; Wendling et al. (1994) Nature 369:571-574; and Savage et al. (1994) Nature 369:533-538).
재조합 트롬보포이에틴 (하기에서 rTPO라고도 함)은 혈소판감소증의 치료에 효과적일 수 있는 특별히 설계된 유일한 화합물로서 최근에 얻어졌다. 그는 혈소판감소증에 있어서 혈소판-유도 약물로서 작용한다. rTPO의 외부 단일 투여량의 투여는 일반적으로 혈소판 수의 증가와 관련된 것으로 알려져 있다. 어떤 경우, rTPO는 거대핵세포 반응을 증가시켜 혈전성 합병증을 유발시킬 수 있다. 혈소판감소증이 잘 알려진 아고니스트 (트롬빈, 콜라겐)의 부재하에 혈소판 응집을 유발하지 않더라도, 혈소판감소증은 혈소판을 감응화시켜 이러한 물질의 응집 효과를 나타낸다. 이러한 "프라이밍 (priming)"은 또한 생체내에서 입증되었다. 혈소판감소증-치료된 동물로부터 유래하는 혈소판은 혈소판 응집을 자극하는 물질에 대해 증가된 감응성을 갖는다. 따라서, TPO는 혈전유발성 증상을 악화시킬 수 있으며, 이러한 위험은 TPO를 환자에게 투여하기 전에 주의하여 평가해야 한다. 또한, 성숙한 혈소판은 용액으로부터 트롬보포이에틴을 제거하며, 혈소판감소증 동물에서는 혈장 트롬보포이에틴 농도가 혈소판 수혈 직후에 낮아지고, 혈소판 수가 다시 줄어든 후에는 상승한다. 혈소판이 순환계로부터 TPO를 제거할 수 있다는 이러한 발견은 2가지 이상의 임상적 결론을 갖는다: i) 혈소판 수혈은 거대핵세포의 회복을 약화시킬 수 있고; ii) TPO의 존재하는 혈소판으로의 결합은 골수억제요법에 대한 내생 TPO의 반응을 약화시킬 수 있다. 그러나, 존재하는 혈소판은 계속하여 TPO와 결합하기 때문에, 혈장 TPO 농도의 증가는 수일 후에 혈소판감소증이 개입될 때까지 지연된다. 또한, 말단절단된 형태의 rTPO가 단일 PEG-결합 잔기로 제공되었을 때, 이 요법은 몇몇 경우 혈소판감소증 및 중화 항체의 발생과 관련이 있었다.
rTPO 이외에, 여러 다른 재조합 사이토카인 (IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF, 스틸 (Steel) 인자 및 프로메가포이에틴-IL-3-트롬보포이에틴 융합 단백질)은 거대핵세포 계열의 생체내 및 시험관내 세포에서 직접적 및 간접적인 자극 효과를 갖는다. 그러나, 이러한 물질의 대부분은 골수억제요법 이후의 혈소판 회복에 대하여 이로운 효과를 갖지 않거나, 허용되지 않는 독성 효과를 나타낸다. 이와 대조적으로, IL-11은 효과적이며 비교적 안전한 것으로 입증되었다. IL-11을 사용하여 화학요법을 받은 암환자에서 혈소판 수혈 요구를 감소시킨다. 매일 피하 투여하는 경우, IL-11은 암 환자에서 혈소판 수의 증가를 유도한다. 그러나, 이 약물은 주로 혈소판 부피 팽창으로 인한 역효과 (동맥성 부정맥, 심계항진, 말초성 부종, 두통, 호흡곤란, 빈혈, 근육통, 체중 증가, 거식증, 오심)를 가지며, 몇몇 암 환자에서는 항체 (하기에서 중화 항체로 고려되는 것들) 형성이 관찰되었다. IL-11은 치료에는 한계를 나타낸 중증의 혈소판감소증을 앓는 환자 또는 미리 혈소판 수혈을 필요로 하는 환자에만 적합한 것으로 보인다. IL-11은 약화된 혈소판감소증에 대한 통상적인 사용에는 추천되지 않는다.
인간 TPO-R에 대한 DNA 서열 및 그가 코딩하는 펩티드 서열이 또한 문헌 (Vigon et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644)에 기재되어 있다. TPO-R은 N-말단 부위에서 4개의 보존된 시스테인 잔기를 포함하는, 세포외 도메인의 통상적인 구조 설계를 특징으로 하는 조혈 성장 인자 수용체 족의 한 구성원이다.
TPO-R에 대한 클로닝된 유전자의 이용가능성은 이러한 중요한 수용체의 아고니스트에 대한 조사를 용이하게 한다. 재조합 수용체 단백질의 이용가능성은 다양한 랜덤 및 세미-랜덤 펩티드 다양성 발생계에서 수용체-리간드 상호작용의 연구를 가능케 한다.
WO 99/42127은 인간 TPO-Rp의 아미노산 444 내지 466에 상응하는 23개의 아미노산으로 이루어진 TPO-수용체 펩티드 (하기에서, TPO-Rp 야생형이라고 함)를 개시한다. 문헌의 방법은 TPO-Rp을 수용체에 적용하여 TPO-R의 활성을 조절하는 것을 개시한다. 그러나, 혈소판감소증의 구체적인 치료에 대하여는 개시하고 있지 않다.
여러 저자들이 구조-기능 관계의 분석을 가능하게 하는 TPO-R의 결실 돌연변이체에 대하여 보고하였다 (Dorsch et al. J. Exp. Med. (1997) 186, 1947-1955, Drachman and Kaushansky, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94, 2350-2355, Porteu et al., Mol. Cell. Biol. (1996), 2473-2482 and Takatoku et al., J. Biol. Chem. (1997) 272, 7259-7263).
다른 트롬보포이에틴 수용체 아고니스트 펩티드가 알려져 있는데, 예를 들어 문헌 (Kimura et al. (J. Biochem. (1997) 122, 1046-1051, Biochem. Mol. Biol. Int. (1998) 44, 1203-1209))은 트롬보포이에틴 의존성 세포의 증식 및 마우스 골수 세포의 거대핵세포로의 분화를 자극하는, 랜덤 파아지 펩티드 라이브러리 유래의 아미노산 15개의 펩티드를 개시한다. 문헌 (Cwirla et al.)은 인간 골수 세포 유래의 거대핵세포의 시험관내 증식 및 성숙을 자극하는 아미노산 14개의 트롬보포이에틴 수용체 아고니스트 펩티드를 개시한다 (Science (1997) 276, 1696-1699).
TPO-R 또는 아고니스트 펩티드의 결실 돌연변이체가 안정하고 제약상 효과적인 약물로 개발될 가능성을 갖는 트롬보포이에틴의 모방체로서 유용한지에 대하여는 입증된 바 없다.
따라서, 본 발명의 기초를 이루는 기술적인 문제는 혈액 질환성, 예를 들어 특발성 및 유도성 혈소판감소증, 구체적으로 화학요법, 알러지 및 방사선요법에 의해 유도된 혈소판감소증의 진단 및 치료에 유용하고 동시에 비독성이며 안정한, 효과적인 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명은 특히 바람직하게는 본질적으로 하기 구조식으로 표시되는 15 또는 18개의 아미노산으로 이루어지는, TPO-R 조절자의 생물학적 활성을 보유하는 단리 및 정제된 올리고펩티드를 제공하여 상기의 문제를 해결하기에 이르렀다.
X1G T L E L X2P X3S R Y R L Q L X4
상기 식에서,
X1은 A R G이거나 존재하지 않고,
X2는 R 또는 A이고,
X3는 R 또는 A이며,
X4는 R A R이거나 존재하지 않는다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 올리고펩티드는 특히 바람직하게는 본질적으로 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 또는 서열 6 (이들 모두는 본원에 포함되어 있음) 중 어느 하나에 정의된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 특히 상기 올리고펩티드가 TPO-R의 활성을 조절한다는 것, 구체적으로 TPO-R과 강하게 결합하여 그를 활성화시키고 또한 내생 TPO의 이용성을 향상시킨다는 사실을 기초로 한다. 따라서, 본 발명의 올리고펩티드는 2가지 이상의 다른 활성, 즉 (i) TPO-R 활성의 조절 효과, 예컨대 TPO-모방 효과와 같은 아고니스트 효과 또는 길항제 효과, 및 (ii) TPO와 함께, 특히 상기 두 화합물이 최대하의 농도로 존재하는 경우 시너지 효과를 나타낸다. 시너지 효과가 특히 중요한 것은 TPO를 단독으로 사용한 것에 비해 임상적으로 유리하기 때문이다.
또한, 본 발명의 올리고펩티드는 매우 높은 효과 및 효능을 나타내는데, 즉 nM 내지 μM 범위에서 활성이 있다. 본 발명의 올리고펩티드는 단독으로 또는 TPO와 함께 이용될 수 있다. TPO와 대조적으로, 본 발명의 올리고펩티드는 TPO 수용체의 하향조절을 나타내지 않으며, 따라서 TPO에 대하여 감소된 감응성을 나타내지 않는다. 대조적으로, TPO의 외부 투여는 이러한 수용체 하향조절을 일으킴에 따라 감응성 또는 내성 유도를 감소시킬 수 있다. 본 발명의 올리고펩티드는 또한 TPO-R에 대하여 매우 선택적이며, 예를 들어 밀접하게 관련된 에리쓰로포이에틴 수용체와 교차 반응성을 나타내지 않는다.
본 발명의 올리고펩티드는 TPO와는 완전히 다른 부위에서 TPO-R에 결합한다. 이 올리고펩티드는 TPO 결합을 방해하지 않으며, 오히려 이들 두 성분은 동일한 수용체 분자에 결합할 수 있다. 활성 측면에서, 이러한 결합 특성은 TPO와 본 발명의 올리고펩티드 사이에서 세포 신호화 분석에서 관찰된 시너지 작용을 일으키며, 이 때 본 발명의 올리고펩티드 및 TPO는 최대하의 농도로 단독으로 제공되는 경우 기질 인산화에 의해 측정된 최대 신호의 약 20%를 나타내지만, 동일한 농도로 함께 제공되는 경우 최대 신호를 나타낸다. 본 발명의 올리고펩티드는 TPO가 매우 높은 투여량으로 제공되는 경우 TPO-R의 하향 조절을 반전시킨다. 이 올리고펩티드를 고농도의 TPO에 가하면 TPO-R의 신호 전달을 초래한다. TPO-R에 대한 특이적인 결합을 통해, 본 발명의 올리고펩티드는 신호전달 경로에서 기질과 결합하여 그를 활성화하는데 유리한 수용체 형태를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고펩티드는 TPO-R의 신호전달 경로에 대한 그 자신의 아고니스트 효과 이외에도 천연 호르몬 TPO와 함께 제공되는 경우 TPO 활성 범위를 확장시키고, 최대하의 화합물 농도에서 TPO와 함께 상승 작용을 하며, 높은 호르몬 농도에서 "벨-모양"의 곡선 효과를 반전시킨다.
또한, 본 발명은 야생형 TPO-Rp가 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증을 특이적으로 치료하는데 유용한 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 올리고펩티드뿐 아니라 야생형 TPO-Rp는 단독으로 또는 TPO 또는 혈소판과 함께 혈액성 질환, 예를 들어 혈소판 질환으로 인한 질병 및 각종 모든 유형의 혈소판감소증을 진단, 특히 치료하는데 특히 유용한 것으로 보인다. 본 발명의 올리고펩티드는 작은 크기 및 제약 조성물에서의 높은 안정성으로 인해 그가 특히 경구적으로 사용될 수 있다면 또한 이롭다. 본 발명의 올리고펩티드는 또한 생체내에서 높은 안정성을 나타낸다.
이론에 얽메이지 않는다면, 본 발명의 올리고펩티드는 특히 TPO-R 활성을 조절하는 것처럼 보인다. 즉, TPO의 결합은 수용체 이량체화 및 세포내 신호전달 경로의 활성화를 일으킨다. 이러한 과정에서, JAK 키나제 족 (JAK2 및 Tyk2)의 수용체 결합 키나제의 특이적 인산화에 이어서 전사 인자 STAT5의 인산화 및 이량체화가 일어난다. 활성화된 STAT5 단백질은 핵으로 진입하여 표적 유전자의 프로모터 영역에 결합함으로써 세포 증식 및 혈소판 수의 증가를 자극한다. 그러나, 상기 야생형 작용 메카니즘이 본 발명의 올리고펩티드에 대해서도 유효할 수 있지만, 본발명의 올리고펩티드가 다른 작용, 예를 들어 수용체 단량체에 결합하여 수용체의 제2의 쇄를 모방하거나, 천연 TPO가 결합하지 않는 수용체의 부위에 결합하는 작용을 한다는 것을 배제할 수 없다. 실제로, 본 발명의 올리고펩티드는 천연 TPO와 같이 다른 부위에 작용하는 것으로 보인다.
본 발명은 또한 야생형 TPO-Rp의 Y14F 치환 돌연변이 유도체, 즉 야생형 TPO-Rp의 14번 위치의 티로신이 페닐알라닌으로 치환된 TPO-Rp에 관한 것이다. 이러한 변형된 펩티드는 예컨대 이 펩티드가 그의 N- 또는 C-말단에서 특이적으로 요오드화될 수 있기 때문에 예를 들어 펩티드 분해 연구를 수행하는데 있어서 특히 가치가 있는 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 올리고펩티드 및 야생형 TPO-Rp는 TPO에 의해 매개되는 질병의 예방 및 치료, 특히 알러지 반응, 화학요법, 방사선요법 또는 골수 이식으로부터 발생하는 혈소판 질환 및 혈소판감소증 또는 특발성 혈소판감소증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 혈액성 질환의 치료에 있어서 유용하다. 따라서, 본 발명은 상기 질환의 치료 방법을 제공하는데, 여기서 TPO-R 조절 화합물, 특히 TPO 아고니스트를 사용하는 치료에 민감한 질환을 앓는 환자는 치료 유효량 또는 투여량의 본 발명의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp를 수용하거나 투여받는다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp, 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 제약 조성물은 경구 투여 형태뿐만 아니라 흡입가능한 분말, 용액, 및 주사 및 주입가능한 용액을 비롯한 다양한 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물 및 방법은 TPO를 야생형 TPO-Rp 및(또는) 본 발명의 올리고펩티드와 함께 사용하는 것을 포함한다.
하기 정의는 본 발명을 설명하기 위해 사용된 여러 용어의 의미 및 범위를 설명하고 정의하기 위한 것이다.
"형질전환" 또는 "형질감염"이라는 용어는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 숙주 세포가 본래 세포의 일부가 아니거나, 본래 위치, 카피수 또는 배향으로 존재하지 않는 천연 TPO-Rp 뉴클레오티드 서열 또는 본 발명의 올리고펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 비롯한 목적하는 핵산 분자를 포함하도록 하는 작용을 의미한다.
"작동가능하게 연결된"이라는 용어는 유전자 및 하나 이상의 조절 서열이 센스 또는 안티센스 발현으로 연결되어 적절한 분자 (예를 들어, 전사 활성자 단백질)가 조절 서열에 결합하는 경우 유전자 발현을 허용하는 것을 의미한다.
"벡터"라는 용어는 임의의 공급원으로부터 유래하는 선형 또는 원형의 단일 가닥 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA인 플라스미드, 바이러스 또는 자가 복제 서열, 파아지 또는 뉴클레오티드 서열을 의미하며, 이들에서 많은 뉴클레오티드 서열은 프로모터 단편 및 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열을 적절한 3' 비번역 서열과 함께 센스 또는 안티센스 방향으로 세포내에 도입할 수 있는 특이적 구조물내에 연결 또는 결합되어 있다.
"플라스미드"는 그의 숙주 세포의 염색체의 일부가 아니며 안정하게 유전되는 유전적 요소이다. 플라스미드는 DNA 또는 RNA로 이루어질 수 있으며, 선형 또는 원형일 수 있다. 플라스미드는 세포 복제 동안 그의 복제 및 안정한 유전을 보장하는 분자를 코딩하며, 상당한 의학적, 농업적 및 환경적 중요성을 갖는 생성물을 코딩할 수 있다. 플라스미드는 또한 항생제에 대한 내성을 부여하는 유전자를 코딩할 수도 있다. 플라스미드는 분자 생물학에서 재조합 유전자를 클로닝하고 발현하는 벡터로서 널리 사용된다. 본원에 개시된 출발 플라스미드는 시판되거나, 공개적으로 이용가능하거나, 또는 잘 알려진 공개된 방법을 통상적으로 이용하여 이용가능한 플라스미드로부터 제작할 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 많은 플라스미드 및 다른 클로닝 및 발현 벡터는 잘 알려져 있으며, 당업자가 쉽게 이용할 수 있다. 또한, 당업자는 본 발명에 사용하기에 적합한 임의의 많은 다른 플라스미드를 쉽게 제작할 수 있다. 본 발명에서 상기 플라스미드뿐만 아니라 다른 벡터의 특성, 제작 및 사용은 본 발명의 개시로부터 당업자에게는 자명한 것이다.
"숙주 세포"라는 용어는 키메라, 이종 또는 자가 핵산 서열의 전달에 의해 유전적으로 변형된 세포 또는 이러한 서열을 포함하는 자손 세포를 의미한다. 이들 세포는 "유전자변형 (transgenic) 세포"라고도 불리운다. 자가 핵산 서열이 전달되는 경우, 서열은 자연 발생적인 것과는 달리 숙주 세포에서 높은 카피수, 다른 유전적 환경 또는 다른 배향으로 존재할 것이다.
"고상 지지체" 불용성 매트릭스라는 용어는 가용성 분자가 연결 또는 결합할 수 있는 천연의 세포 또는 박테리아 파아지 입자, 또는 합성의 아크릴아미드 유도체, 셀룰로스, 나일론, 실리카 및 자성 입자 등을 의미하지만 이에 한정되지는 않는다.
"항체"라는 용어는 실질적으로 이뮤노글로불린 유전자 또는 이뮤노글로불린 유전자들에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 또는 분석물 (항원)을 특이적으로 결합 및 인식하는 그의 단편을 의미한다. 인식되는 이뮤노글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 상수 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 항체는 예를 들어 온전한 이뮤노글로불린 또는 각종 펩티다제로의 절단에 의해 생성되는 잘 특성화된 다수의 단편으로 존재한다. "항체"는 또한 변형된 항체 (예를 들어, 올리고머 항체, 환원된 항체, 산화된 항체 및 표지된 항체)를 의미한다. 본원에 사용된 "항체"라는 용어에는 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편 또는 재조합 DNA 방법을 이용하여 드 노보 (de novo)로 합성된 것들이 포함된다. "항체"라는 용어는 온전한 분자뿐만 아니라 에피토프 결정자와 결합할 수 있는 그의 단편, 예를 들어 Fab, F(ab')2, 및 Fv가 포함된다. 이들 항체 단편은 그의 항원 또는 수용체와 선택적으로 결합하는 어떤 능력을 보유하며, 하기와 같이 정의된다:
1) Fab; 항체 분자의 1가 항원-결합 단편을 포함하는 단편은 전체 항체를 파파인 효소로 절단하여 온전한 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 생성함으로써 제조할 수 있다.
(2) Fab'; 항체 분자의 단편은 전체 항체를 펩신으로 처리한 다음 환원시켜 온전한 경쇄, 및 중쇄의 일부를 생성함으로써 얻을 수 있다; 항체 분자 당 2개의Fab' 단편이 얻어진다.
(3) (Fab')2; 항체의 단편은 전체 항체를 펩신 효소로 처리하고 이후에 환원시키지 않음으로써 얻을 수 있다; F(ab')2는 2개의 디술피드 결합에 의해 함께 연결되는 2개의 Fab' 단편의 이량체이다.
(4) Fv; 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 2개의 쇄로서 포함하는 유전적으로 조작된 단편으로 정의된다.
(5) 단쇄 항체 ("SCA"); 경쇄의 가변 영역 및 적합한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄의 가변 영역을 유전적으로 융합된 단쇄 분자로서 포함하는 유전적으로 조작된 분자로서 정의된다.
이러한 단편을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)) 참조).
본 발명에 사용된 바와 같이, "에피토프"라는 용어는 항체의 파라토프 (paratope)가 결합하는 항원상의 임의의 항원 결정자를 의미한다. 에피토프 결정자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹들로 이루어지고, 통상적으로 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 갖는다.
본 발명의 단백질 및 그의 단편에 대한 모노클로날 항체는 또한 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 하이브리도마 기술을 이용하여 모노클로날 항체를제조하는 일반적인 방법은 잘 알려져 있다. 불멸의 항체-생산 세포주는 세포 융합 및 다른 기술, 예를 들어 종양유전자 DNA를 사용한 B 림프구의 직접적인 형질전환 또는 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스를 사용한 형질감염에 의해 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 (M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980); Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980)) 참조; 또한, 미국 특허 제4,341,761호; 동 제4,399,121호; 동 제4,427,783호; 동 제4,444,887호; 동 제4,452,570호; 동 제4,466,917호; 동 제4,472,500호; 동 제4,491,632호; 및 동 제4,493,890호 참조). 대상 단백질, 특히 TPO-Rp 또는 본 발명의 올리고펩티드 또는 그의 단편에 대하여 제조되는 모노클로날 항체의 패널을 다양한 특성, 즉 이소타입, 에피토프, 친화성 등에 대하여 스크리닝할 수 있다. 또는, 대상 모노클로날을 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 PCR 기술에 의해 하이브리도마로부터 단리되어 적절한 벡터내에 클로닝되고 발현될 수 있다. 모노클로날 항체는 면역친화성 기술을 이용하여 이들이 지시되는 각 단백질을 정제하는데 있어서 유용하다. 폴리클로날이든지 모노클로날이든지 간에 본 발명의 항체는 그가 면역분석, RIA 및 ELISA 등에서 시약으로 이용될 수 있다는 점에서 추가의 유용성을 갖는다. 또한, 본 발명의 항체를 사용하여 세포 추출물 또는 세포로부터 본 발명의 올리고펩티드를 검출하고(하거나) 단리할 수 있다. 본 발명의 항체는 예를 들어 TPO-R 활성을 조절, 예를 들어 TPO 활성을 모방한 신규 화합물의 발견 또는 변형을 위한 조직 배양계 분석을 확립하는데 사용될 수 있다.
인간화 또는 키메라 항체는 2가지 다른 종들로부터 유래하는 부위 (예를 들어, 인간 불변 영역 및 쥐과동물 결합 영역)를 포함할 수 있다. 2가지 다른 종들로부터 유래하는 부위들을 통상의 기술에 의해 화학적으로 함께 연결시키거나, 유전자 조작 기술을 이용하여 단일 융합 단백질로서 제조할 수 있다. 키메라 항체의 두 부위의 단백질을 코딩하는 DNA는 단일 융합 단백질로 발현시킬 수 있다.
항체가 단백질 및 다른 생물제제의 이종 집단의 존재하에 단백질의 존재를 결정하는 결합 반응에서 작용하는 경우, 항체는 단백질 "에 특이적으로 결합하거나" 또는 단백질과 "특이적으로 면역반응한다." 따라서, 지시된 면역분석 조건하에, 특정 항체는 주로 특정 단백질에 결합하며, 샘플 중에 존재하는 상당량의 다른 단백질에는 결합하지 않는다. 이러한 조건하에 단백질에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대하여 선택되는 항체를 필요로 한다. 다양한 면역분석 포맷을 이용하여 특정 단백질과 특이적으로 면역반응하는 항체를 선별할 수 있다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역분석을 통상적으로 이용하여 단백질에 특이적으로 면역반응하는 모노클로날 항체를 선택한다. 특이적 면역반응성을 결정하는데 사용될 수 있는 면역분석 포맷 및 조건에 대한 기술에 대하여는 문헌 (Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York)을 참조한다.
"면역분석"이라는 용어는 항체 또는 항원일 수도 있는 분석대상물에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원을 이용하는 분석을 의미한다. 이러한 면역분석은 분석대상물을 검출, 단리, 표적화 및(또는) 정량하기 위해 특정 항체의 특이적 결합 특성을 이용하는 것을 특징으로 한다. 항체 또는 항원은 검출을 가능하게 위해 표지될 수 있다.
본 발명에 있어서, "치료"라는 용어는 제약 또는 진단 유효량의 화합물을 하나 이상의 첨가제, 예를 들어 담체와 함께 포함하는 조성물로 정의되는 약물 또는 약제의 예방 및(또는) 치료 효과를 의미한다.
"아고니스트"는 그와 상보적인 생물학적으로 활성인 수용체에 결합하여 수용체를 활성화시킴으로써 수용체에서 생물학적 반응을 일으키거나 수용체의 기존의 생물 활성을 증가시키는 생물학적으로 활성인 리간드를 의미한다. TPO 아고니스트는 TPO 수용체 (TPO-R)에 결합한다. TPO 아고니스트는 TPO 모방체로 작용할 수 있다. 그러나, TPO 아고니스트는 또한 TPO와는 상이한 결합 부위 또는 메카니즘을 이용하여 TPO-R을 활성화시키거나 그의 활성화에 기여할 수도 있다.
"길항제"는 예를 들어 TPO와 다르거나 유사한 결합 부위 또는 메카니즘을 이용하여 그와 상보적인 생물학적으로 활성인 수용체에 결합하여 TPO-R의 활성을 억제, 감소 또는 제거하는 생물학적으로 활성인 리간드를 의미한다.
"제약상 허용되는 염"이라는 용어는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조되는 것으로 암모늄, 바륨, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 칼륨, 칼륨 아연 염 및 나트륨을 비롯하여 통상적으로 사용되는 비독성 알칼리 금속, 알칼리 토금속 및 암모늄 염을 의미한다. 또한, 이 용어는 일반적으로 본 발명의 올리고펩티드를 적합한 유기 또는 무기 산, 예를 들어 아세테이트, 벤조에이트, 비술페이트, 보레이트, 시트레이트, 푸마레이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 락테이트, 라우레이트,말레에이트, 냅실레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 포스페이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 토실레이트, 발러레이트 등과 반응시켜 제조되는 비독성, 즉 제약상 허용되는 산 부가 염을 포함한다.
"제약상 허용되는 산 부가 염"이라는 용어는 무기산, 예를 들어 하이드로브롬산, 염산, 질산 인산, 황산, 및 유기산, 예를 들어 아세트산, 벤조산, 신남산, 시트르산, 에탄술폰산, 푸마르산, 글리콜산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄술폰산, 옥살산, 프로피온산, p-톨루엔술폰산, 피루브산, 살리실산, 숙신산, 타르타르산 등과 함께 형성되는 염으로서, 유리 염기의 생물학적 효과 및 특성을 보유하며 생물학적으로나 그 외에 있어서 바람직한 염을 의미한다.
"제약상 허용되는 에스테르"라는 용어는 에스테르 결합의 가수분해시에 그의 성분, 즉 카르복실산 또는 알콜의 생물학적 효과 및 특성을 보유하며, 생물학적으로나 그 외에 있어서 바람직한 에스테르를 의미한다. 본 발명은 또한 상기 에스테르이면서 동시에 그의 제약상 허용되는 산 부가 염이기도 한 그러한 조성물의 용도를 포함한다.
본 발명의 염은 자유 올리고펩티드를 적절한 염기와 함께 수성 또는 비수성/알콜성 용매 또는 다른 적합한 용매중에 용해시킨 다음, 용액을 증발, 동결 및 동결건조시켜 얻거나, 다른 용매, 예를 들어 디에틸에테르를 불용성 조 염의 분리를 포함하여 올리고펩티드 염의 수성 및(또는) 알콜성 용액에 가함으로써 얻어진 본 발명의 염을 단리하여 얻을 수 있다. 염 형성의 경우, 일반적으로 1몰 또는 최대로는 2몰의 염기, 즉 양이온 및 1몰의 자유 올리고펩티드를 사용한다. 알칼리 올리고펩티드 염을 제조하는 경우, 알칼리 금속 탄산염 또는 탄산수소염이 바람직하게 사용된다. 제조된 펩티드 염은 물에 잘 용해된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고펩티드 염의 제조 방법에 관한 것이기도 한다.
본 발명에 있어서, 염기는 용액, 특히 수용액 및 수성/알콜성 용액 중에서 양이온을 형성할 수 있는 물질로서 고려된다.
"제약상 허용되는 아미드"라는 용어는 아미드 결합의 가수분해시에 카르복실산 또는 아민의 생물학적 효과 및 특성을 보유하며 생물학적으로나 그 외에 있어서 바람직한 아미드를 의미한다. 이러한 아미드는 전형적으로 상응하는 카르복실산 및 아민으로부터 제조된다. 본 발명은 또한 상기 아미드인 동시에 그의 제약상 허용되는 산 부가 염이기도 한 상기 조성물의 용도를 포함한다.
제약상 허용되는 에스테르 및 아미드의 제조 기술은 예를 들어 문헌 (March Advanced Organic Chemistry, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York (1985) p. 1152)에 개시되어 있다. 전구약물로서 유용한 제약상 허용되는 에스테르 및 아미드는 문헌 (Bundgaard, H., ed., (1985) Design of Prodrugs, Elsevier Science Publishers, Amsterdam)에 개시되어 있다.
"제약상 또는 치료적으로 허용되는 담체"라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않으면서 숙주 또는 환자에 대하여 독성을 띠지 않는 담체 물질을 의미한다.
본 발명의 올리고펩티드 및 조성물에 적용되는 것으로 "치료 또는 제약 유효량"이란 용어는 목적하는 생물학적 결과를 유도하는데 충분한 올리고펩티드 또는조성물의 양을 의미한다. 그러한 결과로서 질병의 징후, 증상 또는 원인을 줄이거나, 생물계의 임의의 다른 바람직한 변화를 초래할 수 있다. 본 발명에 있어서, 그 결과는 예를 들어 특히 바람직한 실시양태에서 TPO 모방 활성, 즉 혈소판감소증 증상을 선택적으로 예방, 제거 및(또는) 감소시키는 것, 예를 들어 혈소판 수를 증가시키고(시키거나) 혈소판 수의 감소를 예방하는 것을 포함한다.
본 발명의 올리고펩티드의 아미노산 잔기는 다음과 같이 통상적으로 줄여쓴다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 루이신은 Leu 또는 L이고; 이소루이신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 Met 또는 M이고; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이고; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 쓰레오닌은 Thr 또는 T이고; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이고; 히스티딘은 His 또는 H; 글루타민은 Gln 또는 Q이고; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 리신은 Lys 또는 K이고; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 Glu 또는 E이고; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은 Trp 또는 W이고; 아르기닌은 Arg 또는 R이며; 글리신은 Gly 또는 G이다.
즉, 예를 들어 A R G는 연속 스트레치, 즉 알라닌, 아르기닌 및 글리신으로 이루어진 트리펩티드이며, R A R은 아르기닌, 알라닌 및 아르기닌의 연속 스트레치이다.
본 발명은 서열 1 내지 6에 구체적으로 언급된 올리고펩티드에 관한 것일 뿐만 아니라 생물학적 동등물, 즉 다른 구조를 갖지만 유사하거나 필적할만한 생물학적 효과를 나타내는 물질, 특히 유사하거나 필적할만한 구조 및(또는) 기능을 가지며 TPO-R 조절자로서 작용하는 그의 유도체에 관한 것이다. 이러한 생물학적 동등물, 특히 유도체는 가수분해 또는 단백질분해에 대한 감응성 및(또는) TPO 수용체에 대한 증가된 친화성과 같은 다른 생물학적 특성에 있어서 본 발명의 올리고펩티드와 차이가 있을 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 예를 들어 본 발명의 올리고펩티드의 제약상 허용되는 염, 아미드 또는 에스테르에 관한 것이다.
따라서, 자연 발생적인 아미노산만으로 이루어진 올리고펩티드 이외에, 펩티드 모방체 또는 펩티드 유사체가 또한 제공된다. 펩티드 유사체는 주형 펩티드와 유사한 특성을 갖는 비-펩티드 약물로서 통상적으로 사용된다. 이러한 유형의 비-펩티드 화합물은 "펩티드 모방체" 또는 펩티드모방체"라고 불리운다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드 모방체를 사용하여 동등하거나 증가된 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 패러다임 폴리펩티드 (즉, 생물 또는 약리 활성을 갖는 폴리펩티드), 예를 들어 자연 발생적인 수용체-결합 폴리펩티드와 구조적으로 유사하지만, 당업계에 공지된 방법에 의해 -CH2-NH-NH-, -C-CH2-S-, -CH2-CH2-, -CH=CH- (시스 및 트랜스), -COCH2-, -CH(OH)-CH2-, 및 -CH2-SO-로 이루어진 군으로부터 선택되는 연결에 의해 임의로 치환된 하나 이상의 펩티드 연결을 갖는다. 특히 바람직한 비-펩티드 연결은 -CH2-NH-이다. 이러한 펩티드 모방체는 폴리펩티드 형태들에 비해서 상당한 이점을 가질 수 있으며, 그러한 예로는 향상된 화학적 안정성, 강화된 약리학적 특성 (반감기, 흡수, 효과, 효능 등), 보다 경제적인 생산 변화 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물학적 활성), 감소된 항원성 등을 들 수 있다. 펩티드모방체의 표지화는 일반적으로 정량적 구조-활성 데이타 및(또는) 분자 모델링에 의해 예상되는 펩티드모방체상의 비-간섭 위치에 직접적으로 또는 아미드기와 같은 스페이서를 통해 하나 이상의 표지를 공유결합 부착시키는 것을 포함한다. 이러한 비-간섭 위치는 일반적으로 거대분자(들), 예를 들어 펩티드모방체가 결합하여 치료 효과를 나타내는 이뮤노글로불린 거대족 분자와 직접적인 접촉을 형성하지 않는 위치이다. 펩티드모방체의 유도체화, 예를 들어 표지화는 펩티드모방체의 바람직한 생물 또는 약리 활성을 실제적으로 방해하지 않는다. 일반적으로, 수용체-결합 펩티드의 펩티드모방체는 높은 친화성으로 수용체에 결합하며 검출가능한 생물 활성을 보유하는데, 즉 하나 이상의 수용체-매개된 형질 변화에 대하여 아고니스트 또는 길항제이다.
본 발명에 있어서, 하나 이상의 L-아미노산의 동일한 유형의 D-아미노산으로의 치환 (예를 들어, L-리신을 대신하여 D-리신)을 이용하여 보다 안정한 펩티드를 생성시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 식으로 확인된 켄센서스 서열, 또는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 펩티드를 고리화하는 분자내 디술피드 브리지를 형성할 수 있는 내부 시스테인 잔기를 부가하여 생성될 수 있는 실질적으로 동일한 컨센서스 서열 변이체를 포함하는 올리고펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 상기 선형 올리고펩티드에 관한 것일뿐만 아니라, 예를 들어 첫번째와 마지막 아미노산 사이에서 아미드 결합에 의해 고리화된 올리고펩티드에 관한 것이기도 하다.
"합성 또는 비-자연 발생적인 아미노산"이라는 용어는 생체내에서 자연적으로 발생하지 않음에도 불구하고 본 발명의 올리고펩티드내에 혼입될 수 있는 아미노산을 의미한다. 다른 바람직한 합성 아미노산은 아미노기가 하나 이상의 탄소 원자에 의해 카르복실기로부터 분리된 아미노산, 예를 들어 베타-알라닌 또는 감마-아미노부티르산을 포함한다. 특히 바람직한 합성 아미노산은 자연 발생적인 L-아미노산, L-1-나프틸-알라닌, L-2-나프틸알라닌, L-시클로헥실알라닌, L-2-아미노 이소부티르산, 메티오닌의 술폭사이드 및 술폰 유도체의 D-아미노산을 포함한다.
"검출가능한 표지"라는 용어는, 본 발명의 올리고펩티드, 올리고펩티드 모방체 및(또는) 항체에 공유적으로 부착되는 경우, 생체내 계, 예를 들어 상기 올리고펩티드 또는 올리고펩티드 모방체가 투여된 환자, 또는 시험관내에서 이러한 올리고펩티드 및 올리고펩티드 모방체의 검출을 허용하는 물질을 의미한다. 적합한 검출가능한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 방사성동위원소 및 형광성 표지 (예를 들어, 플루오레세인)가 포함된다.
검출가능한 표지의 올리고펩티드 또는 올리고펩티드 모방체로의 공유결합 부착은 당업계에 잘 알려진 통상의 방법에 의해 수행할 수 있다. 예를 들어,125I 방사성동위원소가 검출가능한 표지로 사용되는 경우,125I의 올리고펩티드 또는 올리고펩티드 모방체로의 공유결합 부착은 아미노산 티로신을 올리고펩티드 또는 올리고펩티드 모방체로 혼입시킨 다음, 올리고펩티드를 요오드화함으로써 달성될 수 있다. 또한,32P는 예를 들어 펩티드 또는 펩티드 모방체상의 히드록실기를 통해 올리고펩티드 또는 올리고펩티드 모방체상에 포스페이트 잔기로서 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 올리고펩티드는 당업계에 공지된 통상의 방법, 예를 들어 표준 고상 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 표준 방법으로는 배제 고상 합성법, 부분 고상 합성법, 단편 축합법, 통상의 용액 합성법 및 재조합 DNA 기술이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 올리고펩티드는 재조합 방법 (문헌 (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY 1989) 참조)에 의해 직접 제조하거나 또는 예를 들어 특이적 결합 쌍 중 하나인 단백질에 대한 융합 단백질로 제조할 수 있으며, 친화성 시약을 사용하여 융합 단백질을 정제한 다음, 일반적으로 목적하는 펩티드를 생성하도록 조작된 부위에서 단백질분해에 의해 절단한다.
편리한 연결 부위, 예를 들어 시스테인 또는 리신을 제공하고, 안정성을 증대시키고, 특정 수용체에 결합시키고, 부위-지시적 작용을 제공하고, 용이한 정제를 제공하고, 형태를 안정시키기 위해 물리적 특징 (예를 들어, 용해성, 전하 등)을 변화시키는 등의 목적을 위해 올리고펩티드를 연장시킬 수 있다. 올리고펩티드를 융합 단백질로서 비-야생형 플랭킹 영역에 연결하거나, 연결기에 의해 연결하거나, 또는 시스테인 (디술피드) 또는 펩티드 결합을 통해 공유적으로 연결시킬 수 있다. 올리고펩티드는 다양한 이관능성 물질, 예를 들어 말레이미도벤조산, 메틸디티오아세트산, 메르캅토벤조산, S-피리딜 디티오프로피오네이트 등을 통해 연결할 수 있다. 올리고펩티드는 아미노산 쇄의 N- 또는 C-말단에서 단일 아미노산에 연결시키거나, 또는 내부적으로 연결시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고펩티드를 면역원성 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 난알부민 등에 공유적으로 연결하여 당해 올리고펩티드에 대한 항체 생산을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 올리고펩티드는 내부에서 또는 N- 또는 C-말단에서 쇄의 일부가 되도록 다른 펩티드 또는 단백질과 함께 발현시킬 수 있다. 이러한 융합 올리고펩티드는 융합 또는 결합 펩티드로 불리운다. 글리코실화를 비롯하여 다양한 발현 후 변형을 수행할 수 있다. 예를 들어, 적절한 코딩 서열을 이용함으로써 파르네실화 (farnesylation) 또는 프레닐화 (prenylation)를 제공할 수 있으며, 당해 펩티드는 하나의 말단에서 지질기에 결합될 것이고, 지질막, 예를 들어 리포좀으로 삽입될 수 있을 것이다. 본 발명의 올리고펩티드는 페길화 (PEGylated)될 수 있으며, 폴리에틸렌옥시기는 혈류중에서의 증가된 수명을 제공한다. 본 발명의 올리고펩티드는 또한 알부민과 같은 혈청 단백질에 결합될 수도 있다. 올리고펩티드를 단백질 융합에 의해, 또는 보체 결합을 증가시키는 IgG 이소타입의 Fc와 같은 다른 단백질과의 또는 다른 단백질로의 결합에 의해 또는 리신, 아브린 또는 디프테리아 독소 등, 특히 A 쇄와 같은 독소와의 결합에 의해 연결시킬 수 있다. 부위 지시적 작용에서 올리고펩티드를 항체에 연결시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 올리고펩티드를 포함하는 결합체 펩티드를 제공한다.
본 발명의 올리고펩티드는 유사한 생물 활성을 갖는 비-펩티드 화합물에 대한 구조 모델로서 작용할 수 있다. 당업자라면 다양한 기술을 이용하여, 본 발명의 올리고펩티드와 동일 또는 유사한 바람직한 생물학적 활성을 갖지만 용해성, 안정성, 및 가수분해 및 단백질분해에 대한 감응성에 있어서 리드 물질보다 더 바람직한 활성을 갖는 화합물을 제조할 수 있음을 알 것이다. 이러한 기술로는 펩티드 백본을 포스페이트, 아미드, 카르보네이트, 술폰아미드, 2급 아민 및 N-메틸아미노산으로 이루어진 백본으로 치환하는 것이 포함된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 올리고펩티드를 재조합적으로 생산하는 것에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 유전자 코드의 다의성으로 인해 6개 이상의 다양한 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 서열 1 내지 7에 나타낸 올리고펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 물론, 본 발명은 코딩된 올리고펩티드가 본 발명의 바람직한 TPO-R 조절 효과를 갖는다면, 예를 들어 뉴클레오티드 부가, 결실, 삽입 또는 역위에 의해 돌연변이된 상기 뉴클레오티드 서열에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 또한 통상의 물질 및 기술을 이용하여 숙주세포계에 도입 및 발현될 수 있는 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 부위, 전사 종결 신호 등과 같은 DNA 요소를 뉴클레오티드 서열에 결합시켜 발현을 촉진시키고 조절해야 한다. 사용된 특정의 조절 요소는 올리고펩티드 또는 결합체 펩티드의 분비가 요구되는지에 따라 발현을 위해 선택된 숙주세포계에 의존할 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 벡터는 박테리아, 바이러스, 포유동물 또는 효모 벡터일 수 있으며, 특히 바람직한 실시양태에서, 벡터는 적합한 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 상기 확인된 5' 및(또는) 3' 조절 요소를 포함한다.
숙주 세포에서의 본 발명의 올리고펩티드의 도입 및 발현을 위한 비히클로서다양한 벡터를 이용할 수 있다. 다른 숙주 세포 유형에 유용한 벡터는 잘 알려져 있으며, 예를 들어 포유동물 발현 벡터 pSG5 (Stratagene), p-RK1 (Genetics Institute), p-SVK3 (Pharmacia), p-EUK-C1 (Clontech), pCDM (Invitrogen), pc DNAI (Invitrogen), 및 박테리아 발현 벡터 pFLAG-1 (IBI), 모든 pET 시스템 플라스미드 (Novagen), pTrcHis (Invitrogen), pGEX 시리즈 (Pharmacia) 및 pKK 233-2 (Clontech)가 포함된다. 이러한 벡터는 숙주 세포에서 에피좀으로 유지되거나 또는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 숙주 세포 게놈으로의 통합을 촉진시킬 수 있으며, 이들 둘 다를 수행할 수도 있다. 벡터는 또한 다른 유용한 특징, 예를 들어 벡터가 성공적으로 도입된 세포의 선별 또는 검출을 가능케 하는 유전자를 포함할 수도 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 숙주 세포로는 원핵 및 진핵 숙주, 예를 들어 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 이, 콜라이 (E. coli), 효모, 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis) 난모세포, 곤충 세포, 식물 세포, 및 특히 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 헬라 (Hela) 세포, L(tk-) 세포, 초대 배양물, Cos17 세포, Cos1 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 및 CV1 세포를 비롯한 각종 포유동물 세포 유형이 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
글리코실화를 제공하는 숙주 세포는 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 세포를 상기 확인된 벡터로 형질감염시켜 세포를 유전적으로 변형시키는 방법에 관한 것이다. 형질감염은 통상의 방법, 예를 들어 생물학적, 물리적, 화학적 또는 전기적 유도된 형질감염법, 특히 전기천공법, 세포 융합법,레트로바이러스 또는 바이러스 매개 유전자 전달법, 리포좀 매개 유전자 전달법 또는 입자 충격법에 의해 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 세포에서 본 발명의 올리고펩티드를 생산할 수 있는 비인간 포유동물을 생산하는 방법에 관한 것이며, 여기서 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 비인간 포유동물 세포내로, 특히 8-세포-단계, 바람직하게는 1-세포-단계 이전에 도입되며, 이어서 적절한 조건하에서 육종하여 성체로 분화된 동물을 얻는다. 이 동물은 그의 생식 세포 또는 체세포, 특히 그의 염색체내에, 본 발명의 올리고펩티드를 발현시킬 수 있는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 포유동물은 설치류 또는 영장류이다. 상기 방법은 다양한 종류의 유전자 요법, 예를 들어 체세포 유전자 요법 또는 생식세포 유전자 요법을 허용할 수 있다.
본 발명은 또한 유전적으로 조작된, 특히 유전자변형 동물, 특히 포유동물, 특히 영장류, 마우스 및 이들의 세포를 포함한다. 적어도 세포의 일부에서 예를 들어 조절 요소의 조절하에 있는 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 형질감염된 센스 또는 안티센스 구조물을 포함하는 이러한 동물은 TPO-R의 활성이 변화되었기 때문에 연구 및 진단 목적에 있어서 유용하다. 유전자변형 동물에서, 예를 들어 본 발명의 센스 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열, 또는 이러한 뉴클레오티드 서열의 임의의 변형, 예를 들어 역위, 결실, 삽입, 부가 등을 이용하여 TPO-R을 변형시켜 동물을 형질전환시키고 유전적으로 조작된 동물을 얻을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 벡터 또는 올리고펩티드를 형질감염시키고 비인간 포유동물세포의 게놈내에 통합시켜 TPO-R 활성을 조절할 수 있는 올리고펩티드를 발현시킨다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 벡터 또는 올리고뉴클레오티드를 형질감염시키고 게놈, 특히 상동 재조합에 의해 내생 TPO-R 유전자내에 삽입시켜 변형된 TPO-R을 발현시키는 동물을 생산한다. 따라서, 본 발명은 유전적으로 조작된, 특히 야생형 동물과 대조적으로 변형된 TPO-R 기능을 나타내는 유전자변형 동물에 관한 것이다. 포유동물, 특히 비인간 포유동물 세포에서 이러한 변형된 기능은 아마도 뉴클레오티드 서열 변형을 포함하는 본 발명의 안티센스 또는 센스 구조물의 도입으로 인한 것이고(이거나) TPO-R에 대한 내생 뉴클레오티드 서열에서의 조작으로 인한 것일 수 있다. 이러한 변형물, 예를 들어 본 발명에 따라 설계된 TPO-Rp 코딩 서열의 다른 변이 또는 비변이 센스 또는 안티센스 카피의 삽입물, 또는 내생 유전자의 변형물을 사용하여, 상기 확인된 목적에 유용한 동물을 얻을 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 또한 상기 나타낸 변형물을 포함하는 단일 비인간 포유동물 세포 또는 세포 배양물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 세포를 본 발명에 따른 벡터로 형질감염시키는 단계, 올리고펩티드의 발현을 허용하는 조건하에 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계, 및 통상의 기술을 이용하여 올리고펩티드를 세포 또는 배양 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 올리고펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 올리고펩티드에 특이적으로 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 또는 이들의 단편에 관한 것이다. 이들 항체를 사용하여 본 발명의 올리고펩티드, 그의 구조적 유사체 또는 TPO-R 자체까지도 검출 및 단리할수 있다. 올리고펩티드 또는 TPO-R이 TPO-R 함유 또는 올리고펩티드 함유 공급원, 예를 들어 세포, 세포 일부 또는 세포 소기관에 존재하는 경우, 검출 또는 단리에 앞서 추가의 조작, 예를 들어 생물체를 파열시키는 통상의 방법, 예를 들어 효소적 세포 용해법이 필요할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 항체를 특이적으로 인식하고 그와 결합하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 올리고펩티드를 포함하는 혼합물로부터 본 발명의 올리고펩티드를 검출 및(또는) 단리하기 위한 면역분석에 관한 것이며, 여기서 본 발명의 항체를 혼합물에 가하고, 올리고펩티드를 검출 및(또는) 단리한다. 반대로, 면역분석에 의해 본 발명의 올리고펩티드를 프로브로 사용하여 본 발명의 항체를 검출할 수 있다.
본 발명의 올리고펩티드는 TPO 생산 및 수용체 결합 반응에 관여하는 많은 인자의 평가를 포함하여 TPO의 생물학적 역할을 분석하기 위한 특이적 수단으로서 시험관내에서 유용하다. 또한, 본 발명의 올리고펩티드는 그가 구조와 활성 사이의 관계에 대한 중요한 정보를 제공하기 때문에 TPO-R에 결합하여 그를 활성화하는 다른 화합물의 개발에 있어서 유용하다.
본 발명의 올리고펩티드는 또한 추가의 TPO 수용체 아고니스트를 스크리닝하는 분석에서 경쟁적 결합자로서 유용하다. 본 발명의 올리고펩티드는 변형 없이 사용하거나, 또는 검출가능한 신호를 직접 또는 간접적으로 제공하는 표지 잔기를 공유적 또는 비공유적으로 연결시켜 변형시킬 수 있다. 직접적 표지화로는 다음과같은 표지기가 포함된다: 방사성표지, 효소, 예를 들어 퍼옥시다제 및 알칼리 포스파타제, 및 형광 강도, 파장 변화 또는 형광 극성화에서의 변화를 모니터링할 수 있는 형광성 표지. 간접적 표지화로는 한 성분의 비오티닐화에 이어서 상기 표지기 중 하나에 커플링된 아비딘에 결합시키는 것을 들 수 있다. 화합물은 고상 지지체에 부착되는 경우 스페이서를 포함할 수도 있다.
TPO 수용체에 결합하는 능력을 기준으로, 본 발명의 올리고펩티드는 생물 체액, 조직 균질물, 정제된 천연 생물체, 조 추출물 등에서 막, 세포 기관, 구획, 생존 세포, 고정 세포상의 TPO 수용체를 검출하기 위한 시약으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고펩티드를 표지하여 표면상에 TPO-R을 갖는 세포를 확인할 수 있다. 또한, TPO-R에 결합하는 능력을 기준으로, 본 발명의 올리고펩티드는 동일 반응계내 염색, FACS (형광-활성화 세포 분류법), 웨스턴 블롯팅, ELISA 등에서 사용될 수 있다. 또한, TPO-R에 결합하는 능력을 기준으로, 본 발명의 올리고펩티드는 TPO-R을 단리 및 정제하거나, 세포 표면 또는 투과성 세포내에서 TPO-R을 발현시키는 세포를 단리 및 정제하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 통상의 방법에 따라 상기 스크리닝 및 단리 과정에서 예를 들어 고상 지지체에 고정된 본 발명의 올리고펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 한 실시양태, 특히 스크리닝 분석에서, 올리고펩티드는 분리된 샘플 수용 영역을 갖는 불용성 지지체, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트에 비-확산성으로 결합된다. 불용성 지지체는 올리고펩티드 또는 수용체가 결합될 수 있는 어떤 조성물로 이루어질 수 있고, 가용성 물질로부터 쉽게 분리되며, 전체 스크리닝 방법에적합하다. 이러한 지지체의 표면은 고상 또는 다공성이며, 임의의 편리한 형태일 수 있다. 적합한 불용성 지지체의 예로는 마이크로타이터 플레이트, 막 및 비즈가 포함된다. 이들은 통상적으로 유리, 플라스틱, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리사카라이드, 나일론 또는 니트로셀룰로스를 소재로 제조된다.
물론, 본 발명은 또한 고처리 스크리닝 및(또는) 단리 방법에서, 예를 들어 고정화제를 사용하지 않고 용액 중에서 올리고펩티드 및(또는) 이러한 올리고펩티드에 대한 항체를 사용하는 상기 단리 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 올리고펩티드는 각종 의학 연구 및 진단 용도를 위한 시판 시약으로 사용될 수도 있다. 이러한 용도로는 (1) 각종 기능 분석에서 TPO 또는 잠재적인 TPO 아고니스트의 활성을 정량하는 조정 표준으로서의 용도; (2) TPO-의존성 세포주의 증식 및 성장을 유지하기 위한 용도; (3) 공동결정화를 통한 TPO-수용체의 구조 분석에 있어서의 용도; (4) TPO 신호 전달/수용체 활성화의 메카니즘을 조사하기 위한 용도; 및 (5) TPO-수용체가 바람직하게는 활성화되거나 또는 이러한 활성화가 알려진 양의 TPO 또는 TPO 아고니스트에 대하여 편리하게 조정되는 기타 연구 및 진단 용도가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 올리고펩티드는 다른 사이토카인, 예를 들어 TPO와 함께 또는 단독으로 거대핵세포 및 그의 조상 세포를 시험관내 확장하는데 있어서 사용될 수 있다. 화학요법 및 방사선요법은 빠르게 분열하는 보다 성숙한 거대핵세포 집단을 사멸시킴으로써 혈소판감소증을 유발시킨다. 그러나, 이러한 치료 처치는 또한 비성숙되고 더 적은 유사분열 활성의 거대핵세포 전구체 세포의 수 및 생존성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 실시양태에 있어서 본 발명의 올리고펩티드에 의한 혈소판감소증의 개선은 시험관내 배양에 의한 거대핵세포 및 비성숙 전구체가 풍부한 환자 자신의 세포 집단에 화학요법 또는 방사선요법을 마무리한 이후의 환자를 이용하여 향상시킬 수 있다.
본 발명의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp 및(또는) 이들에 특이적으로 결합하는 항체를 또한 설치류, 및 인간을 비롯한 영장류와 같은 포유동물을 포함한 동물에 투여하여 특히 생체내에서 TPO-R을 활성화시키고(시키거나) 존재하는 혈소판 수를 증가 또는 유지시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고펩티드를 충분량 투여하여 생체내에서 TPO-R의 효과를 조절하는 것을 포함하는, TPO-관련 질환의 치료 방법을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 올리고펩티드 및 조성물을 투여하여, 특히 골수 이식, 방사선요법 및 화학요법과 연계되는 경우 혈소판 질환 및 혈소판감소증을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 혈액성 질환을 치료할 수 있다. 이러한 투여는 또한 TPO의 이용을 포함할 수도 있다.
따라서, 본 발명은 또한 TPO-R의 활성을 조절, 특히 증가 또는 감소시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 본 발명의 올리고펩티드 또는 그와 특이적으로 결합하는 항체는 TPO의 부재 또는 존재하에 TPO-R에 적용된다. 이러한 방법은 생체내 또는 시험관내 방법일 수 있다.
바람직한 실시양태에서 본 발명의 올리고펩티드 및 조성물은 화학요법, 방사선요법 또는 골수 이식에 앞서 또는 동시에, 또는 이러한 노출 이후에 예방적으로 투여될 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 활성 성분으로, 하나 이상의 본 발명의 올리고펩티드 및(또는) TPO-Rp 야생형 올리고펩티드를 제약상 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 전신 또는 국소적으로, 특히 혈관내, 경구, 폐, 비경구, 예를 들어 근육내, 복강내, 정맥내 (IV) 또는 피하 주사 또는 흡입에 의해, 예를 들어 미분 제형, 경피, 비강, 질내, 직장 또는 설하 투여 경로를 통해 투여될 수 있으며, 각 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제제화될 수 있다. 본 발명의 올리고펩티드 및(또는) TPO-Rp 야생형 올리고펩티드는 이러한 조성물내에서 제약상 허용되는 염, 부가 염, 에스테르, 아미드 및(또는) 유리 염기 형태로, 바람직하게는 제약상 유효량으로 사용될 수 있다.
경구 투여용 고체 투여 형태로는 캡슐제, 설용제 (lingualet), 정제, 환제, 분말제, 리포좀, 패취, 서방성 코팅제 및 과립제를 들 수 있다. 이러한 고체 투여 형태에서, 활성 화합물은 하나 이상의 불활성의 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 락토스, 수크로스 또는 전분과 함께 혼합된다. 이러한 투여 형태는 또한 불활성 희석제 이외의 추가의 물질, 예를 들어 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제를 포함할 수도 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 투여 형태는 또한 벌크제 및(또는) 완충제뿐만 아니라 향미제를 포함할 수도 있다. 정제 및 환제는 또한 장용 코팅제로 제조될 수 있다.
경구 투여용 액상 투여 형태로는 물과 같은 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함하는 엘릭서제와 함께 제약상 허용되는 에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽이 포함된다. 이러한 불활성 희석제 이외에, 조성물은 또한 삼투압 변화용 염, pH-조절성 화합물, 피부 침투제, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 및 감미제, 향미제, 및 항료제와 같은 보조제를 포함할 수도 있다.
비경구 투여를 위한 본 발명에 따른 제약 조성물은 무균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 에멀젼을 포함한다. 비수성 용매 또는 비히클의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 예를 들어 올리브 오일 및 옥수수 오일, 젤라틴, 및 주입가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 있다. 이러한 투여 형태는 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수도 있다. 이들은 예를 들어 박테리아 보유 필터를 통해 여과시키는 것, 멸균제를 조성물에 혼입시키는 것, 조성물에 방사선조사를 하는 것, 또는 조성물을 가열시키는 것에 의해 멸균시킬 수 있다. 이들은 또한 사용 직전에 무균수 또는 어떤 다른 무균 주사용 매질을 사용하여 제조할 수도 있다.
주사용 제제는 생리학적으로 허용되는 매질, 예를 들어 물, 염수, PBS, 수성 에탄올 및 수성 에틸렌 글리콜 등을 포함할 것이다. 사용될 수 있는 수용성 보존제로는 소듐 비술피트, 소듐 티오술페이트, 아스코르베이트, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로부탄올, 티메로살, 페닐머큐릭 보레이트, 파라벤, 벤질 알콜 및 페닐에탄올이 포함된다. 이러한 물질은 각각 약 0.001 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 2%의 양으로 존재할 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 수용성 완충제로는 알칼리 또는 알칼리 토금속 카르보네이트, 포스페이트, 비카르보네이트, 시트레이트, 보레이트, 아세테이트 및 숙시네이트 등, 예를 들어 소듐 포스페이트, 시트레이트, 보레이트, 아세테이트, 비카르보네이트 및 카르보네이트가 있다. 카르보메틸셀룰로스와 같은 첨가제를 담체로서 약 0.01 내지 약 5 중량%의 양으로 사용할 수 있다. 제제는 제제의 목적, 수용체 활성을 조절하는데 사용되는 특정 양식, 의도하는 치료 등에 따라 달라질 것이다.
직장 또는 질내 투여용 조성물은 활성 물질 이외에도 코코아 버터 또는 좌제 왁스와 같은 부형제를 포함할 수 있는 좌제인 것이 바람직하다. 비내 또는 설하 투여용 조성물은 또한 당업계에 잘 알려진 표준 부형제와 함께 제조된다.
본 발명의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp를 포함하는 조성물은 예방 및(또는) 치료 처치를 위해 투여할 수 있다. 치료적 사용에서, 조성물은 상기한 질병을 이미 앓는 환자에게 이 질병 및 그의 합병증의 증상을 치료하거나 적어도 부분적으로 저지하는데 충분한 양, 즉 치료 유효량으로 투여된다.
예방적 사용에서, 본 발명의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp를 포함하는 조성물을 특정 질병에 감응성이거나 이 질병의 위험이 있는 환자에게 투여한다. 이러한 양은 "예방 유효량"으로 정의된다. 이러한 사용에서, 정확한 양은 마찬가지로 환자의 건강 상태 및 체중에 따라 달라진다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 축적물 형태, 예를 들어 서방형 조성물로 투여될 수도 있다. 이러한 서방형 조성물은 예를 들어 콜라겐으로부터 제조된 매트릭스내에 올리고펩티드-함유 입자를 포함할 수 있다.
효과적인 치료를 위해 필요한 본 발명의 TPO 아고니스트의 양은 투여 방법, 표적 부위, 환자의 생리적 상태 및 투여되는 다른 약물을 비롯한 많은 다른 인자에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp는 포유동물 체중 1 kg 당 하루에 약 0.03 mg 내지 약 10 mg, 특히 약 0.3 mg 내지 약 1 mg의 투여량 범위로 투여되는 경우 TPO 매개 증상을 치료하는데 있어서 효과적이다. 사용되는 특정 투여량은 치료될 특정 증상, 투여 경로뿐만 아니라 증상의 심도 및 환자의 연령 및 전반적인 상태와 같은 인자에 따라 치료하는 의사의 판단에 의해 조절된다.
본 발명의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp는 단독으로 또는 TPO와 함께 투여되며, TPO-Rp의 투여량은 본 발명의 올리고펩티드의 TPO 증강 효과로 인해 (TPO의 규정 사용 투여량과는 다르게) 50% 또는 25%가지 줄어들 수 있다.
본 발명의 조성물, 바람직하게는 수용성 조성물은 본 발명의 하나의 단위 투여 형태로 사용되는 농도에서 어떤 실제적인 약리학적 활성을 나타내지 않으면서 체액으로 주사가능한 수용성 단백질 (이하, "수용성 단백질")을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 수용성 단백질로서, 혈청 알부민, 글로불린, 콜라겐 및(또는) 젤라틴이 바람직하다. 이러한 단백질은 일반적으로 주사가능한 제약 조성물로 사용되는 양으로 첨가될 수 있다. 즉, 예를 들어, 본 발명의 수용성 단백질과 올리고펩티드 사이의 중량비는 약 0.0001:1 내지 100:1, 바람직하게는 약 0.001:1 내지 약 10:1 또는 보다 바람직하게는 약 0.01:1 내지 약 1:1이다.
계속하여, 본 발명은 또한 상기 언급한 올리고펩티드 자체, 및 이 올리고펩티드를 특히 건조 및(또는) 정제된 형태, 또는 수용액 또는 수성/알콜성 용액 중에 포함하는 조성물에 관한 것이다. 수용성 조성물 또는 본 발명의 펩티드 염으로부터 제조된 용액의 pH는 이 pH가 약리학적으로 활성인 펩티드의 활성에 어떤 악영향을 주지 않으면서 일반적으로 주사를 위해 허용되는 범위내에 있는 것이어야 하며, 또한 이 pH는 용액의 점성에 큰 변화를 일으키지 않으면서 침전물 등을 형성시키지 않는 것이어야 한다. 즉, 용액의 pH는 바람직하게는 약 4 내지 7, 보다 바람직하게는 5 내지 6, 특히 5.3 내지 5.5이어야 한다.
본 발명의 수용성 조성물이 투여용 수용액으로 전환되는 경우, 상기 용액 중 약리학적으로 활성인 올리고펩티드 또는 그의 염농도는 바람직하게는 약 0.0000001 내지 10% (w/v), 보다 바람직하게는 약 0.000001 내지 5% (w/v) 또는 가장 바람직하게는 약 0.00001 내지 1% (w/v)이어야 한다.
본 발명의 조성물은 바람직하게는 본 발명의 약리학적으로 활성인 올리고펩티드, 및 필요하다면 추가의 첨가제, 예를 들어 상기 언급한 수용성 단백질을 함께 포함하는 단위 투여 형태를 가져야 한다. 따라서, 예를 들어 상기 언급한 2가지 또는 3가지 성분은 이들을 무균수 또는 무균 생리 염수중에 용해 또는 현탁시켜 앰플 또는 바이알 중에 형성되도록 제조된다. 이 경우, 제조 방법은 생리학적으로 활성인 올리고펩티드 염용액 및 또한, 필요하다면, 첨가제 용액을 혼합하는 단계 또는 분말 형태의 첨가제를 약리학적으로 활성인 올리고펩티드 염 용액에 가하는 단계를 포함하거나, 또는 적절한 방법의 임의의 다른 조합을 포함할 수 있다. 투여 형태는 또한 약리학적으로 활성인 올리고펩티드 염 및 필요하다면 첨가제가 공존하는 동결건조물 또는 진공건조 분말에 무균수 또는 무균 생리 염수를 가하여 제조할 수도 있다. 이러한 단위 투여 형태는 하나 이상의 통상의 첨가제, 예를 들어 pH 조절제 (예를 들어, 글리신, 염산, 수산화나트륨), 국소 마취제 (예를 들어, 자일로카인, 하이드로클로라이드, 클로로부탄올), 등장화제 (예를 들어, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨), 유화제, 흡수억제제 (예를 들어, 트윈 (Tween)(등록상표) 60 또는 80), 활석, 전분, 락토스 및 트라가칸쓰, 스테아르산마그네슘, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 보존제, 벤질 알콜, 메틸히드록시 벤조에이트 및(또는) 올레움 아라키드 히드로겐을 포함할 수 있다. 이러한 단위 투여 형태는 제약상 허용되는 부형제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 400 또는 덱스트란을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따라 이러한 성분들을 혼합하여 제조된다. 본 발명의 조성물의 성분들을 혼합하는 목적은 약리학적으로 활성인 올리고펩티드의 활성을 유지하고 가공 동안에 버블 형성을 최소화하기 위함이다. 성분들은 용기 (예를 들어, 병 또는 드럼)내에 동시에 또는 임의의 순서로 넣어진다. 용기내의 분위기는 예를 들어 무균의 깨끗한 공기 또는 무균의 깨끗한 질소 가스일 수 있다. 생성된 용액을 작은 바이알 또는 앰플로 옮길 수 있으며, 추가로 동결건조시킬 수 있다.
본 발명의 조성물의 액상 형태 또는 동결건조 분말 형태를 생분해성 중합체, 예를 들어 폴리(락트-글리콜)산 공중합체, 폴리(히드로부티르산), 폴리(히드록시부티르-글리콜)산 공중합체 또는 이들의 혼합물에 용해 또는 분산시키고, 이어서 예를 들어 필름, 마이크로캡슐 (마이크로스피어) 또는 나노캡슐 (나노스피어), 특히 연질 또는 경질 캡슐 형태로 제제화할 수 있다.
또한, 인지질, 콜레스테롤 또는 이들의 유도체를 포함하는 리포좀내에 캡슐화된 본 발명의 조성물을 생리 염수, 또는 생리 염수내에 용해된 히알루론산 용액중에 더 분산시킬 수 있다.
연질 캡슐에 본 발명의 액상 형태의 조성물을 충전할 수 있다. 경질 캡슐에 본 발명의 동결건조 분말 조성물을 충전하거나, 또는 본 발명의 동결건조 분말 조성물을 직장 투여 또는 경구 투여용 정제로 각각 압착시킬 수 있다.
물론, 본 발명의 조성물은 자가 투여를 위한 미리-충전된 주사기내에 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 올리고펩티드 및 야생형 TPO-Rp, 이러한 올리고펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포 및(또는) 본 발명의 항체의, 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증의 진단 또는 치료용 약물의 제조에 있어서의 용도에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 본 발명의 올리고펩티드 또는 야생형 TPO-Rp, 이러한 올리고펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 본 발명의 벡터, 본 발명의 숙주 세포 및(또는) 본 발명의 항체를 임의로 허용되는 담체와 함께 포함하는, 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증의 진단을 위한 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 진단용 조성물에 사용되는 상기 언급된 물질을 상기에 따라 표지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 표지된 올리고펩티드, 표지된 뉴클레오티드 서열, 표지된 세포 및(또는) 표지된 항체를 사용하여 TPO-R 관련 증상, 특히 질환을 특이적으로 검출할 수 있다. 유사하게, 상기 설명한 바와 같이, 표지된 물질을 사용하여 잠재적인 다른 약물을 확인 및 단리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 상기에 구체적으로 기술되어 있지만, 본 발명의 사상 및 의도된 범위을 벗어나지 않고 본 발명을 변형 및 변화시킬 수 있음은 물론이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 하기 청구의 범위에 나열되어 있다.
서열 1 내지 7은 본 발명의 올리고펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.
펩티드 길이는 WO 99/42127에 개시된 전장 (야생형이라고도 함) TPO-Rp에서의 위치에 따라 첫번째 및 마지막 아미노산의 번호에 의해 확인되며, 이는 TPO-Rp 야생형 아미노산 서열에 대한 것이고, 그의 제조는 본 발명의 개시 내용에 전부 포함되어 있다. 단일 아미노산 치환은 통상의 명명법에 따르며, 예를 들어 "R9A"는 TPO-Rp 야생형의 9번 위치의 원래의 아르기닌 잔기가 알라닌으로 치환된 것을 나타낸다.
도 1은 카르보플라틴 (180 mg/kg) 처리된 마우스에서 본 발명의 올리고펩티드의 효과를 나타낸다.
도 2는 카르보플라틴 (200 mg/kg) 처리된 마우스에서 본 발명의 올리고펩티드의 효과를 나타낸다.
도 3 내지 6은 HPLC 프로필 형태의 안정성 연구 결과를 나타낸다 (도 3: 0일, 건조 분말로부터 재구성된 1 mM 용액 0.30 nmole, 도 4A: 2일, 1 mM 용액으로 저장된 샘플, 도 4B: 2일, 건조 분말로서 저장된 샘플, 도 5A: 9일, 1 mM 용액으로 저장된 샘플, 도 5B: 9일, 건조 분말로서 저장된 샘플, 도 6A: 14일, 1 mM 용액으로 저장된 샘플, 도 6B: 14일, 건조 분말로 저장된 샘플).
실시예 1:
카르보플라틴 유도된 혈소판감소증의 치료에 있어서 TPO-Rp (야생형 및 본 발명의 올리고펩티드)의 효과: I
방법:
생체내 실험에 사용된 모델은 문헌 (Akahori et al. (1996) Stem Cells 14:678-689, Akahori et al. (1996) Br. J. Haematol. 94:722-728, Shibuya et al. (1998) Blood 91:37-45, Andrews et al. (1996) Stem Cells 14:661-677)에 이미 보고되어 있다. 도입된 개량 및 변형은 하기에 나타나 있다.
투여 스케쥴
각 시험 군 (PBS, TPO 또는 TPO-Rp)을 복강내 주입에 의해 투여되는 단일 일일 투여량으로 제공하였다. 일일 투여는 0일에 시작하여 실험 기간 (10일) 동안을 통하여 계속되었다. 각각 카르보플라틴 90 mg/kg을 2회의 복강내 주사 (군 11에 대하여 PBS)로 0일 및 4일에 제공하였다.
혈액 샘플링
혈액을 0일 (기준), 8일, 11일, 14일 및 18일에 취하였다. 마우스 (8주령의 수컷 C57BL/6Y 마우스)의 꼬리로부터의 샘플링에 의해 혈액을 얻은 다음, 소작 (cauterisation)하였다. 각 마우스로부터 80 ㎕ 부피의 혈액을 헤파린-처리된 혈액 수집용 튜브에 수집하였다. 이어서, 혈액 80 ㎕를 충분한 EDTA (0.225%)를 포함하는 염수 160 ㎕와 함께 혼합하여 항응고를 제공하였다.
생체내에서 서열 2 (TPO-Rp, 1-18, R9A, R11A) 및 서열 4 (TPO-Rp, 4-18, R9A, R11A)를 갖는 TPO-Rp의 효과를 야생형 펩티드 (TPO-Rp 야생형, 아미노산 서열: A R G G T L E L R P R S R Y R L Q L R A R L N)와 비교하여 카르보플라틴 유도된 혈소판감소증에 걸린 마우스에서 시험하였다. 카르보플라틴을 사용하여 혈소판감소증을 유도한다. 임상적 상황과 가능한 유사한 모델을 이용하기 위해, 이전에 보고된 카르보플라틴 모델 (Akahori et al. (1996) Stem Cells 14:678-689, Akahori et al. (1996) Br. J. Haematol. 94:722-728, Shibuya et al. (1998) Blood 91:37-45, Andrews et al. (1996) Stem Cells 14:661-677)을 주의깊게 연구하고 적절히 변형하였다. 또한, 제공된 약물에 가장 높은 반응을 나타내고, 동시에 스트레스가 최소인 상태의 동물을 이용하기 위해 동물 채혈 방법을 주의깊게 연구하였다 (상기 방법 참조). 따라서, 카르보플라틴의 투여량은 180 mg/kg으로 증가되며, 0일 (절반 투여) 및 4일 (두번째 절반 투여)에 2회의 복강내 (i.p.) 주사에 의해 제공되었다. 카르보플라틴은 8일에 심한 혈소판감소증을 유도하였다.
동물 군은 하기 표 1에 나타나 있다.
"생체내" 연구에서의 실험 군
군 총 투여량 동물
1 카르보플라틴a+TPO-Rp 야생형 0.03 mg/kg/일 8
2 카르보플라틴a+TPO-Rp 야생형 0.30 mg/kg/일 8
3 카르보플라틴a+TPO-Rp 야생형 0.90 mg/kg/일 8
4 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2 0.03 mg/kg/일 8
5 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2 0.30 mg/kg/일 8
6 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2 0.90 mg/kg/일 8
7 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 4 0.03 mg/kg/일 8
8 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 4 0.30 mg/kg/일 8
9 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 4 0.90 mg/kg/일 8
10 카르보플라틴a+TPO 2.4 ㎍/kg/일 8
11 카르보플라틴 없음 8
12 카르보플라틴a단독 12
a카르보플라틴 90 mg/kg은 0일 및 4일에 제공됨
도 1은 카르보플라틴 처리된 마우스에서 혈소판 수의 급격한 감소를 나타내며, 상기 언급된 여러 실험 군에 대한 실험 결과에 대한 요약이다. 결과는 각 동물의 기준값으로부터의 비율 변화로 나타나 있다. 도 1은 300 ㎍/kg/일 및 30 ㎍/kg/일의 투여량의 야생형 펩티드 TPO-Rp가 혈소판 수를 상당히 증가시킴을 보여준다. 이와 같은 매우 높은 카르보플라틴 투여량에서는 앞서 효과를 나타낸 사용된 농도 (2.4 ㎍/kg/일)의 TPO가 혈소판의 감소를 예방할 수 없음이 언급되어야 한다. 도 1은 또한 서열 2, 즉 잔기 1-18, 및 R9A, R11A를 갖는 짧은 TPO-Rp 펩티드가 2가지 투여량, 즉 300 ㎍/kg/일 및 30 ㎍/kg/일에서 카르보플라틴 유도된 혈소판 감소를 강하게 보호하였음을 나타낸다. 이러한 2가지 투여량에 의해 유발된 보호 효과는 동등하게 현저하지만, 생존율 (하기 참조)을 기준으로 하면 30 ㎍/kg/일의 가장 낮은 투여량이 특히 유의하며, 300 ㎍/kg/일의 투여량은 TPO-Rp 야생형에 비해 상당한 효과를 갖는다. 0.9 mg/kg/일의 가장 높은 펩티드 투여량은 혈소판보호에 대한 효과가 매우 낮았으며, 이는 펩티드 응집으로 인한 것일 수 있다. 도 1은 서열 4, 즉 잔기 4-18을 갖는 가장 짧은 형태의 TPO-Rp 펩티드가 R9A, R11A와 함께 카르보플라틴 처리된 동물에서 혈소판 수준에 대한 어떤 효과를 나타내었음을 보여준다. 사용된 펩티드, 즉 야생형 TPO-Rp, TPO-Rp 1-18 (R9A, R11A) 및 TPO-Rp 4-18 (R9A, R11A) 중 어떤 것도 다른 혈액 성분에 대한 중요한 효과를 갖지 않는다. 또한, 어떤 처리도 동물의 체중에 영향을 주지 않는다.
처리된 동물의 생존율을 조사하는 것은 중요하다. CHI-스퀘어 분석에 의해 통계적으로 평가한 결과, 가장 유의한 효과 및 이에 따른 가장 높은 생존율이 TPO-Rp, 1-18 (R9A, R11A) 펩티드에서 관찰되었다. 야생형 펩티드로의 처리 또한 통계적으로 유의한 생존율을 나타낸다.
상기 사실은 모두 펩티드 TPO-Rp 1-18 (R9A, R11A)이 카르보플라틴 유도된 혈소판감소증을 상당히 회복시키며 화합물의 "생체내" 활성을 10배 향상시킨다는 것을 분명히 나타낸다.
실시예 2:
카르보플라틴 유도된 혈소판감소증의 치료에 있어서 TPO-Rp (야생형 및 본 발명의 올리고펩티드)의 효과: II
방법: 투여 스케쥴
각 시험 군에 대해 복강내 주사에 의해 투여된 단일 일일 투여를 제공하였다. 일일 투여를 0일에 시작하여 실험 기간 (13일) 동안 계속하였다. 최소 투여량을 지시된 날짜: 0일 및 4일; 0일, 4일 및 8일; 0일, 4일, 8일 및 12일; 8일 내지 14일에 제공하였다. 카르보플라틴 100 mg/kg을 2회 복강내 주사로 0일 및 4일에 제공하였다.
혈액 샘플링
혈액을 0일 (기준), 8일, 11일, 14일 및 18일에 취하였다. 마우스 (8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스)의 꼬리로부터의 샘플링에 의해 혈액을 얻은 다음, 소작하였다. 각 마우스로부터 80 ㎕ 부피의 혈액을 헤파린-처리된 혈액 수집용 튜브에 수집하였다. 이어서, 혈액 80 ㎕를 충분한 EDTA (0.225%)를 포함하는 염수 160 ㎕와 함께 혼합하여 항응고를 제공하였다.
카르보플라틴의 투여량을 200 mg/kg으로 증가시키고, 0일 (절반 투여) 및 4일 (두번째 절반 투여)에 2회의 복강내 (i.p.) 주사에 의해 누적 투여로 제공하였다. 11일에 카르보플라틴은 심한 혈소판감소증을 유도하였다.
사용된 동물군은 하기 표 2에 나타나 있다.
"생체내" 연구에서의 실험 군
군 총 투여량 투여 스케쥴(일)
1 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2, 0.3 mg/kg/일 0일 내지 13일
2 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2, 0.3 mg/kg/일 0일
3 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2, 0.3 mg/kg/일 0일 및 4일
4 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2, 0.3 mg/kg/일 0일, 4일 및 8일
5 카르보플라틴a+TPO-Rp 서열 2, 0.3 mg/kg/일 0일, 4일, 8일 및 12일
6 카르보플라틴a+TPO 서열 2, 0.3 mg/kg/일 8일 및 14일
7 카르보플라틴a+TPO, 2.4 ㎍/kg/일 0일 내지 13일
8 카르보플라틴a+TPO, 10 ㎍/kg/일 0일 내지 13일
9 카르보플라틴a+TPO, 10 ㎍/kg/일 8일 내지 14일
10 카르보플라틴 없음 -
11 카르보플라틴a단독 0일 및 4일
a카르보플라틴 100 mg/kg은 0일 및 4일에 제공됨
결과:
도 2는 모든 실험 군에서 카르보플라틴 처리된 마우스의 결과에 대한 요약이다 (RCN-O1303는 서열 2를 갖는 올리고펩티드를 나타낸다). 결과는 각 동물로부터의 기준 혈소판 수치로부터의 비율 변화로 나타내었다.
도 2는 300 ㎍/kg/일의 투여량의 펩티드가 혈소판 수를 증가시킨다는 것을 보여준다. 매우 통상적인 임상 상황인 심한 혈소판감소증의 경우 화합물의 효능을 시험하기 위해 카르보플라틴 투여량을 실시예 1에 비해 증가시켰음을 언급해야 한다. 2.4 ㎍/kg/일의 농도로 사용되는 TPO 호르몬은 - 카르보플라틴 투여량 180 mg/kg의 실시예 1에서와 같이 - 마찬가지로 혈소판 감소를 보호할 수 없었다. 10 ㎍/kg/일의 더 높은 투여량에서, TPO는 통계적 유의성을 갖는 어떤 효과를 나타내었다. 그러나, 서열 2를 갖는 올리고펩티드에 의해 유발되는 보호 효과는 이러한특정 카르보플라틴 모델에서 TPO에 의해 유발되는 것보다 더 컸다.
도 2는 감소된 올리고펩티드 투여량의 가능성이 시험된 결과에 대한 요약을 나타낸다. 0.3 mg/kg/일의 농도의 올리고펩티드를 0일 단독; 0일 및 4일; 0일, 4일 및 8일; 및 0일, 4일, 8일 및 12일에 제공하였다. 현저하게, 0일 및 4일의 펩티드 투여만이 카르보플라틴 처리된 마우스에서 보호를 나타내기에 충분했던 것으로 보인다. 통계적으로 유의한 보호 수준은 11일 및 14일에 관찰되었다. 최소 처리군이 반응에 있어서 큰 다양성을 나타낸다는 것은 주목해야할 관심거리이다. 동일한 처리에 대하여 개인이 다르게 반응한다는 것은 알려져 있는 사실이기 때문에, 이러한 상황이 특별한 것은 아니다. 그럼에도 불구하고, 0일 및 4일에만 제공하는 경우, 서열 2를 갖는 올리고펩티드에 의해 유발되는 통계적으로 유의한 효과가 있다. 게다가, 0일, 4일 및 8일의 투여, 또는 0일, 4일, 8일 및 12일의 투여는 혈소판감소증에 대한 유의한 효과를 나타내었다. 이러한 최소 투여량으로 관찰되는 효과는 올리고펩티드의 지속적인 투여 (0일 내지 13일)에 의한 효과에 견줄만한다. 투여량은 감소되었지만 치료 효과는 동일한 이러한 가능성은 임상적으로 분명히 이로울 수 있다.
야생형 TPO-Rp 및 본 발명의 올리고펩티드를 사용한 연구는 펩티드 작용 메카니즘이 천연 호르몬의 것과는 다르다는 것을 나타내었다. 먼저 화학요법을 처치받고 수일 후에 TPO로 처리받은 환자에 대한 TPO 효과는 결여되어 있는 것으로 보인다. 따라서, 다음 실험을 수행하였다.
0일부터 화학요법제를 제공받은 카르보플라틴 처리된 동물군에 0일부터 14일에 걸쳐 10 ㎍/kg/일의 투여량으로 TPO를 투여하였다. 유사하게, 다른 군에서, 0일에 치료를 시작한 카르보플라틴 처리된 동물에게 0일 내지 14일에 걸쳐 서열 2를 갖는 올리고펩티드를 0.3 mg/kg/일의 투여량으로 제공하였다. 결과는 도 2에 나타나 있다. TPO는 혈소판감소증에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았다. 대조적으로, TPO-Rp (서열 2)는 그가 치료 시작 이후에 제공되었음에도 불구하고 혈소판 수준을 회복시키는 것으로 나타났다. 올리고펩티드 처리된 동물에서 통계적으로 유의한 혈소판 수준의 증가는 그의 보호 효과가 치료 시작시에 제공되는 경우에만 나타나지는 않는다는 사실을 시사한다. 이러한 연구 결과는 본 발명의 올리고펩티드가 치료 개시 이후에 제공되는 경우 카르보플라틴의 유해한 효과를 예방하는 능력이 있음을 보여줄뿐만 아니라, 이 올리고펩티드가 TPO와는 다른 작용 메카니즘을 갖는다는 사실을 암시한다. 따라서, 이러한 두가지 효과, 즉 (i) 최소 투여 스케쥴 및 (ii) 상이한 작용 메카니즘은 상당한 이점을 제공한다.
실시예 3:
생체외 올리고펩티드의 약물통태학
방법:
야생형 TPO-Rp, TPO-Rp 1-18 (R9A, R11A, 서열 2) 및 TPO-Rp 4-18 (R9A, R11A, 서열 4)의 분해 프로필을 인간 혈청 (200명의 환자들로부터의 혈청 푸울) 및 래트 혈장 (동물 50마리로부터의 혈장 푸울)에서 연구하였다. 분해를 검출할 수 있도록,125I-표지된 펩티드 (Y14에서 표지됨)를 사용하였다. 온전한 펩티드 및 표지된 분해 산물만이 HPLC 분석에 의해 검출되었다. 따라서, 다른 지점에서 수행된 이러한 분석으로 주어진 펩티드가 분해되는 시기가 분명하게 검출된다. 인큐베이션을 37 ℃에서 수행하였다. 표지된 펩티드의 농도는 이 연구에서 약 1 μM이었다.
결과:
푸울링된 래트 혈장에서의 펩티드 분해 결과는 하기 표 3에 제시되어 있다. TPO-Rp의 반감기는 약 12분인 것으로 나타났다. 서열 2를 갖는 TPO-Rp 1-18은 약간 더 짧은 대략 1.1분의 반감기를 나타내었지만, 서열 4를 갖는 올리고펩티드는 래트 혈장에서 매우 짧은 반감기인 약 0.5분을 나타내었다.
37 ℃에서 펩티드의 생체외 안정성
펩티드 반감기 (분)
펩티드 푸울링된 래트 혈장 푸울링된 인간 혈청
TPO-Rp, 야생형 12.1 1.9
TPO-Rp (1-18; R9A, R11A) 1.1 9.6
TPO-Rp (4-18; R9A, R11A) 0.5 4.9
푸울링된 인간 혈청에서의 펩티드 분해 결과는 표 3에 나타나 있다. 래트 혈장에서와는 다르게, 인간 혈청에서 TPO-Rp 야생형 펩티드는 약 1.9분의 반감기를 갖는다. TPO-Rp 4-18 (R9A, R11A)은 향상된 안정성 및 약 4.9분의 반감기를 갖는다. 올리고펩티드 1-18 (R9A, R11A)에서는 상당히 더 긴 약 9.6분의 반감기가 나타났는데, 이는 야생형 올리고펩티드에 비해 안정성이 5배 더 향상된 것이다. 대부분의 펩티드는 2 내지 3분의 비교적 짧은 반감기를 갖기 때문에, 이는 상당히 개선된 것이다. TPO-Rp 1-18 R9A, R11A는 래트 혈장에서 반감기가 더 짧음에도 불구하고 야생형 TPO-Rp에 비해 생체내 활성을 개선시키는 것으로 나타났다는 것은 주목해야 한다.
래트에서 정맥내 환괴 투여 이후의 TPO-Rp 1-18 R9A, R11A (3 mg/kg)의 생체내 분해 연구는 혈중에서 7.3분의 계산된 반감기를 나타내었다.
실시예 4:
펩티드 안정성
방법:
사용된 HPLC 방법은 역상 칼럼 시스템, C8 MICROSORB MV 칼럼 (Rainin Instrument Company)으로부터의 용출 동안 샘플의 UV 검출을 기초로 한 것이었다. 2 완충액 시스템은 9.5% 5 mM TFA (완충액 A) 및 5% ACN (완충액 B)으로 시작한다. 샘플 주입 이후에, B의 비율은 10%로 빠르게 증가된 다음, 10분에 걸쳐 35%로 서서히 증가되었다. 샘플 용출 시기 이후에 완충액 B를 90%로 증가시켜 칼럼을 잠깐 세척하였다.
결과:
3가지 온도, 즉 실온 (약 20 ℃), 4 ℃ 및 -20 ℃에서 3가지 펩티드를 보관한 다음, HPLC 분석에 의해 야생형 TPO-Rp, TPO-Rp 1-18 (R9A, R11A, 서열 2) 및 TPO 4-18 (R9A, R11A, 서열 4)의 안정성을 어드레싱하였다. 펩티드를 1 mg의 건조 분말 또는 1 mM 수용액으로 보관하였으며, 각 조건에서 부형제는 사용하지 않았다. 0일에 이러한 세가지 펩티드의 HPLC 용출 프로필을 확립한 다음, 펩티드, HPLC 용출 프로필을 2일, 9일 및 14일에 재시험하였다.
도 3은 1 mM 펩티드 용액을 건조 분말로부터 제조하였을 때, 연구 개시 시점에서 30 nmole의 야생형 TPO-Rp 및 더 짧은 올리고펩티드에 대한 HPLC 프로필을 나타낸다. 도 4는 연구 2일에 1 mM 용액 (도 4A, 또는 건조 분말 도 4B)으로 저장된 펩티드의 HPLC 프로필을 나타낸다. 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, 펩티드 안정성 연구 9일의 결과는 펩티드 HPLC 프로필에 있어서 변화가 없음을 보여주며, 따라서 실온, 4 ℃ 또는 약 20 ℃에서 보관하는 경우 큰 펩티드 안정성을 나타낸다. 현저하게, 펩티드 안정성 연구 14일에, 도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, 야생형 TPO-Rp 및 본 발명의 두 올리고펩티드는 변하지 않은 HPLC 프로필을 나타내었다. 실온, 4 ℃ 또는 약 20 ℃에서 1 mM 용액 또는 분말로서 보관되는 경우 펩티드 분해에 대한 징후는 검출되지 않았다. TPO-Rp 및 본 발명의 올리고펩티드는 1 mM 수용액 또는 건조 분말로서 실온, 4 ℃ 또는 약 20 ℃에서 펩티드 분해에 대한 어떠한 징후도 없이 2주 동안 보관될 수 있는 것으로 결론지을 수 있었다.
추가의 연구는, 야생형 올리고펩티드 TPO-Rp 및 서열 2를 갖는 펩티드를 1 mM 수용액, 염수 또는 0.1% 인간 알부민 함유 염수로서 제조하여 -20 ℃, 4 ℃ 및 실온에서 1주, 3주 및 4주 동안 유지한 결과, HPLC 연구에서 어떠한 분해 징후도 나타나지 않았음을 보여주었다.
실시예 5
TPO-Rp 1-18 R9A, R11A의 제제 및 제조 방법
5A) 비히클 용액
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성분 % w/v mg/ml 4L 배치
아세트산나트륨, 삼수화물, USP0.1361.3615.444 gm
10 mM (F.W. 136.08)
주사용수, USP 적정량1001 mL4리터
pH*5.3±0.2
*(pH 조정을 위해 필요하다면 10N HCl에 이어서 1N HCL 또는 1N NaOH 용액)
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만니톨, USP5.050200 gm
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제조 방법:
1. 주사용수 (WFI) 90% (3.6 리터)를 적합한 유리 용기에 가한다.
2. 5.444 gm 아세트산나트륨, 삼수화물을 1번에 가한다.
3. 2번의 pH를 10N HCl (약 600 ㎕) 및 필요하다면 추가의 1N HCl 또는 1N NaOH 용액을 사용하여 pH 5.3 +/- 0.2로 조정한다.
4. 만니톨 200 gm을 가하고 3번에 용해시킨다. 이를 완전히 용해될 때까지 천천히 교반하면서 혼합한다.
5. 충분량의 WFI를 4번에 4리터의 최종 부피로 가한다. 이를 균질해질 때까지 교반하면서 혼합한다.
6. 무균 조건하에, 5번의 용액을 0.2 미크론 막을 통해 무균 용기로 여과한다.
7. 용액 (100 mL/바이알)을 무균화 방법에 따라 제조된 7개의 타입 I 유리 바이알에 무균적으로 채운다. 또한, 2개의 유사하게 무균처리된 바이알 (바이알 당 10 mL)을 위와 같이 채우고 샘플을 넣는다. 테플론 (Teflon) 그레이 부틸 마개 및 알루미늄 밀봉제로 밀봉한다.
5B) 주사용 용액 (1 mg/mL)
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성분 % w/v mg/ml 600 mL 배치
TPO-Rp 1-18, R9A, R11A0.110.66 gm*
(무수 유리 염기) 분말*
비히클5A 참조1001 mL600 mL
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유의: (5B, 5C, 5D의 경우)
TPO-Rp 1-18, R9A, R11A를 함수성 아세트산 염으로 공급한다. 양은 다음과 같이 계산한다:
펩티드 분말의 양 (함수성 아세트산 염) =
요구되는 유리 염기의 양 / 펩티드 함량 %
*90.7%의 펩티드 함량을 기준으로 함
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제조 방법:
1. 정확한 양의 비히클 용액 (600 mL)을 적합한 유리 용기에 가한다.
2. 정확한 양의 올리고펩티드 분말 (0.66 gm 분말)을 1번에 가하여 용해시키고 잘 혼합한다.
3. 2번 용액의 pH를 측정하고 필요하다면 pH 5.3 +/- 0.2로 조정한다.
4. 3번 용액을 무균 조건하에 0.2 미크론 막 (Milipore Durapore 막 또는 동등물)을 통해 무균 여과한다.
5. 용액 (75 mL/바이알)을 무균화 방법에 따라 제조된 7개의 무균 타입 I 유리 바이알에 무균적으로 충전한다. 유사하게 무균화된 추가의 2개의 바이알 (바이알 당 10 mL)을 또한 위와 같이 충전하고 샘플을 넣는다. 테플론 페이스드 그레이 부틸 마개 및 알루미늄 밀봉제로 밀봉을 수행한다.
5C) 주사용 용액 (5 mg/mL)
성분 % w/v mg/ml 600 mL 배치
TPO-Rp 1-18, R9A, R11A0.553.3 gm*
(무수 유리 염기) 분말*
비히클5A 참조1001 mL600 mL
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제조 방법: 5B를 참조하되 상기 표에 따른 양으로 변형함.
5D) 주사용 용액 (9 mg/mL)
성분 % w/v mg/ml 650 mL 배치
TPO-Rp 1-18, R9A, R11A0.996.45 gm*
(무수 유리 염기) 분말*
비히클5A 참조1001 mL650 mL
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제조 방법: 5B를 참조하되 상기 표에 따른 양으로 변형함.
실시예 6:
방법: "시험관내" 신호화 연구
세포의 처리: 1 x 페니실린/스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 10% 태아 우 혈청 (Hyclone) 및 1 ng/ml GM-CSF를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 약 1 x 106세포의 밀도로 TF-1 세포를 배양하고, 원심분리하여, 3% 혈청을 함유하고 GM-CSF를 함유하지 않는 배지중에 재현탁시켰다. 세포를 37 ℃ (5% CO2)에서 14 내지 18시간 동안 영양을 차단하고, 회전시키고, 혈청 및 GM-CSF를 함유하지 않는 배지중에 1 x 106세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 세포 현탁액 2 ml를 37 ℃에서 30분 (5% CO2) 동안 올리고펩티드 또는 TPO (실험마다 지시됨)로 처리하였다. 빙냉 세포 세척 완충액 10 ml를 팰콘 (Falcon) 튜브마다 가하고, 4 ℃에서 3,000 rpm으로 빠르게 원심분리하였다. 배지를 주의하여 흡출하고, PBS로 2회 반복 세척하였다.
다음 단계를 얼음상에서 수행하였다. 배지를 흡출하고, 튜브 당 2 x 용해완충액 0.6 ml를 가하였다. 이를 피펫 조작으로 반복적으로 흡입 및 배출시키고 , 에펜도르프 (Eppendorf) 튜브에 옮기고, 얼음상에 대략 30분 동안 위치시키고, 14,000 x g로 10분 동안 원심분리하였다. 상등액 (용해물)을 면역침전에 사용하였다.
면역침전: 감마바인드 (GammaBind) G 세파로스 (Sepharose) 슬러리 20 내지 40 ㎕를 면역침전마다 사용하였다. 에펜도르프 튜브에서 0.5 x 용해 완충액으로 단백질 G 비즈를 수회 세척하고, PY-99 항체 (Santa Cruz-Biotechnology) 1 내지 4 ㎍을 면역침전마다 가하였다. 튜브를 실온에서 2시간 동안 끝에서 끝으로 (end-over-end) 회전시키면서 인큐베이션하였다. 용해물을 가하고, 튜브를 4 ℃에서 밤새 끝에서 끝으로 회전시키면서 추가로 인큐베이션하였다. 비즈를 1 x 용해 완충액으로 3회, pH 6.5의 0.5 M Tris로 1회 세척하였다. SDS-샘플 완충액 50 ㎕를 가하고, 샘플을 3분 동안 보일링한 다음, 겔에 가하였다.
웨스턴 블롯 분석: 약 10 ㎕/샘플을 8% 폴리아크릴아미드 미니 겔에 러닝하고, PVDF 막 (Millipore)에 옮기고, 차단용 완충액 중에서 1시간 동안 차단시키고, 1:1,000의 희석으로 4 ℃에서 밤새 알파STAT5 항체 (Santa Cruz-Biotechnology)와 함께 인큐베이션하였다. 막을 세척하고, 적절한 알칼리 포스파타제 결합된 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 1:2,000의 희석으로 인큐베이션하였다. PVDF-막을 블로토 (Blotto)로 세척하고, NBT/BCIP (Cappel)로 전개하였다.
결과:
HPLC 분석에 의해 어떠한 분명한 분해도 나타내지 않은 (실시예 4 참조) 올리고펩티드가 그의 생물학적 활성을 여전히 유지하는지를 평가하였다.
본 발명의 올리고펩티드 및 야생형 TPO-Rp의 활성을 시험관내 신호화 분석에 의해 조사하였다. 상기 확인된 표준 방법을 이용하여, HPLC 분석을 수행한 펩티드 샘플로 TF-1 세포를 자극하였다. TPO-R 신호 전달에 의해 활성화되는 JAK2 키나제의 기질인 STAT5의 인산화 및 그에 따른 활성화를 측정하였다. 안정성 연구의 "18일"에 3 μM의 농도에서, 안정성 연구의 "30일"에는 50 nM 및 50 μM의 농도에서 펩티드를 시험하였다. 모든 펩티드를 독립적인 실험으로 3회 내지 4회 평가하였다. 모든 데이타를 수집하고, 웨스턴 블롯을 스캐닝하고, STAT5 인산화의 강도를 정량하였다.
모든 실험으로부터의 데이타 (평균 +/- SEM)를 표 4 내지 9 (하기 참조) (W: 물, S: 염수, H: 0,1% HSA)에 제시하였다. 이 결과는 다른 조건하에 보관되었을 때 펩티드 활성에 있어서의 어떤 차이를 나타낸다. 안정성 연구의 "18일"에, TPO-Rp (1-18, R9A, R11A) 펩티드는 실온에 보관되었을 때 유의하게 감소된 활성을 나타내었다. 화합물이 4 ℃ 또는 -20 ℃에 보관되었을 때 활성이 유지되었다. 펩티드 용액이 물 또는 염수중에서 제조되었을 때 활성이 보존되었음에도 불구하고, 화합물의 활성은 0.1% HSA를 첨가하였을 때 뚜렷하게 잘 보존되었다. 이러한 관찰 결과는 안정성 연구의 "30일"로부터의 결과로 확인되었다. 서열 2를 갖는 펩티드는 물에 용해시켜 -20 ℃에서 보관한 경우 30일 후에도 활성을 유지하였다. 염수 또는 염수에 더하여 0.1% HSA 중에 보관되는 경우, 용액은 두가지 온도, 즉 4 ℃ 및 -20 ℃에서 보관되었을 때 활성을 유지하였다. 안정성 연구의 "30일"에 비교하는 방법에 의해, 야생형 TPO-Rp는 -20 ℃에서 수용액으로 보관되었을 때 상당한 활성의 감소를 나타내었다.
상기 안정성 연구에 의해, TPO-Rp (1-18, R9A, R11A, 서열 2)가 임의의 용매 중에서 -20 ℃에서 보관되었을 때 1개월 동안 활성을 유지하는 보다 안정한 분자라는 것이 밝혀졌다. 흥미롭게도, 임의의 용매 또는 온도 조건하에서 펩티드의 어떠한 분해 패턴도 관찰되지 않았음에도 불구하고, 활성 분석은 어떤 차이점을 나타냈다.
실시예 7:
짧아진 TPO-Rp 올리고펩티드의 생물 활성
방법:
서열 1 내지 7을 갖는 올리고펩티드를 고상 합성에 이어서 예비 HPLC 정제에 의해 90 내지 95%의 순도로 합성하였다.
올리고펩티드의 동일성을 질량분광법 및 아미노산 분석에 의해 시험하였다. 나타낸 MW는 질량분광기 (M+H+)로부터의 것이다 (서열 1: 2141, 서열 2: 1971, 서열 3: 1857, 서열 4: 1687, 서열 5: 2240, 서열 6: 2069, 서열 7: 2736, 야생형: 2755).
본 발명의 올리고펩티드의 투여량-반응 곡선을 수행하고, 그의 활성을 야생형 TPO-Rp와 비교하였다.
펩티드 투여 반응 활성은 주로 시험관내 신호화 분석에 의해 평가하였다.TPO-Rp 신호 전달에 의해 활성화되는 JAK2 키나제의 기질인 STAT5의 인산화에 따른 활성화를 측정하였다. 각 올리고펩티드 활성을 넓은 범위의 농도에 걸쳐 어드레싱하였다. 펩티드를 0.3, 3, 10, 30 nM 및 0.1, 0.3, 3 및 30 μM TPO-Rp의 농도에서 시험하였다. 각 실험에서 STAT5 인산화의 측정으로서 올리고펩티드의 활성을, TPO-R을 통해 최대 활성화 및 신호화를 제공하는 호르몬 농도인 10 ng/ml의 TPO를 이용하여 얻어진 활성과 비교하였다. 모든 펩티드를 독립적인 실험으로 4회 내지 5회 평가하였다. 모든 데이타를 수집하고, 웨스턴 블롯을 스캐닝하고, STAT5 인산화의 강도를 정량하였다.
결과:
각 올리고펩티드의 활성을 그의 최대 활성의 비율로 어드레싱하였으며; 따라서 100%의 활성은 30 μM의 올리고펩티드 농도로 얻어진 STAT5 단백질 인산화의 수치로 정해졌다.
결과는 모든 올리고펩티드가 야생형 TPO-Rp에 필적하는 활성을 보유한다는 것을 분명히 나타낸다. 표 10 (하기 참조)은 시험된 모든 올리고펩티드에 대한 대략적인 EC50수치에 대한 요약이다.
올리고펩티드의 제1 세트 (A1 - L18, 서열 1 및 2)는 야생형 TPO-Rp에 필적하는 활성뿐만 아니라 그의 R9A, R11A 형태 (약 EC5010 nM)로서 향상된 효능을 나타내었다. 뚜렷하게, 올리고펩티드의 이러한 부분은 알라닌 워킹 및 구조 분석을 통해 어드레싱되는 경우 TPO-Rp 활성에 대하여 결정적인 것으로 나타났다. 활성증가는 올리고펩티드 구조, 안정성 또는 이들 모두의 향상으로 인한 것일 수 있다.
아미노산 15개 길이의 가장 짧은 올리고펩티드 (G4-L18, 서열 3 및 4)는 두가지 형태로서 야생형 TPO-Rp에 필적하는 활성을 보유하였다. 올리고펩티드의 3번째 세트 (G4-R21, 서열 5 및 6)는 두가지 형태로서 야생형 TPO-Rp와 동일한 활성을 나타내었다.
실시예 8:
래트에서 서열 2를 갖는 펩티드의 28일 정맥내 독성 연구
서열 2를 갖는 펩티드의 국소 및 전신 독성을 Crl:CD (등록상표) (SD) IGS BR 래트에서 이러한 28-일 정맥내 연구에 의해 특성화하였다. 높은 투여량 군에서의 효과로부터의 회복은 아래와 같은 28-일의 회복 기간을 통해 평가하였다. 펩티드를 3가지 독성학 군 (군 2, 3 및 4) 및 3가지 독성동력학 군 (군, 2A, 3A 및 4A)에 대하여 각각 5, 15 및 45 mg/kg/일의 투여 수준으로 최소 28일 연속하여 측부 꼬리 정맥을 통해 환괴 정맥내 주사하여 투여하였다. 공존하는 비히클 군 (군 1)은 비교할만한 요법으로 5% 만니톨 용액, 10 mM 아세트산나트륨을 투여받았다. 비히클 및 45 mg/kg/일의 군은 각각 수컷 15마리 및 암컷 15마리로 구성되었고, 5 mg/kg/일 및 15 mg/kg/일의 군은 각각 수컷 10마리 및 암컷 10마리로 구성되었으며, 3번째 독성동력학 군은 각각 수컷 9마리 및 암컷 9마리로 구성되었다. 모든 군들에 대한 투여 부피는 5 ml/kg이었다.
독성학 군으로 정해진 모든 동물의 투여에 앞서, 투여 직후, 투여 1시간 후, 및 회복 기간 동안 하루에 1번 독성의 임상 징후에 대하여 관찰하였다. 세부적인물리적 검사를 수행하였으며, 각각의 체중 및 사료 소비를 매주 기록하였다. 임상 병리학 파라메타 (혈액학, 혈청 화학 및 요분석)를 투여 개시에 앞서 치료 기간의 중간 시점, 및 1차 및 회복 부검 시점에서 평가하였다. 골수 도말물을 시험전 기간 동안 및 계획된 부검시에 수집하였다. 혈청은 1차 부검시에 항체 결정을 위해 수집하였다. 투여 개시에 앞서, 연구 3주 동안 및 회복 기간 동안, 연구 7주 동안 안과적 검사를 수행하였다. 모든 동물에 대하여 철저한 부검을 수행하였다. 선택된 기관을 1차 및 회복 부검에서 칭량하였다. 1차 부검에서 수집한 선택된 조직을 현미경으로 검사하였다.
독성동력학 연구 부분으로 배정된 별도의 동물 세트로부터 0일, 6일, 14일, 20일 및 27일에 혈장 시험 항목 수준을 결정하기 위해 혈액 샘플을 수집하였다.
생존, 체중, 사료 소비, 임상 병리학적 파라메타, 기관 중량 및 골수 세포학은 펩티드의 처리에 의해 영향받지 않았다. 펩티드와 관련하여 안과적, 거시적 또는 미시적으로 관찰된 결과는 없었다.
서열 2를 갖는 펩티드는 28일 동안 수컷 및 암컷 래트에게 투여되는 경우 충분히 허용되었다. 수컷 래트에서 전립선 중량 감소를 기준으로, 암컷에서 비-관찰된 효과 수준 (No-Observed-Effect-Level; NOEL)은 45 mg/kg/일이었다.
실시예 9:
원숭이에서 서열 2를 갖는 펩티드의 28-일 정맥내 독성 연구
서열 2를 갖는 펩티드의 국소 및 전신 독성을 시노몰구스 (Cynomolgus) 원숭이에서 28-일 정맥내 연구에 의해 특성화하였다. 28-일 회복 기간 이후에 펩티드효과의 가역성을 평가하였다. 펩티드를 3가지 군들에 대하여 복재 정맥을 통한 정맥내 환괴 주사에 의해 28일 동안 연속하여 5, 15 및 30 mg/kg/일의 투여 수준으로 투여하였다. 암컷 원숭이는 수컷 원숭이보다 하루 늦게 투여를 시작하도록 조정하였다. 비히클 대조군은 비교할만한 요법으로 5% 만니톨 용액, 10 mM 아세트산나트륨을 투여받았다. 비히클 대조군 및 30 mg/kg/일 군은 각각 수컷 원숭이 5마리 및 암컷 원숭이 5마리로 구성되었다. 5 및 15 mg/kg/일 군은 각각 수컷 원숭이 3마리 및 암컷 원숭이 3마리로 구성되었다. 모든 군의 투여 부피는 5 ml/kg이었다.
모든 원숭이를 실시예 8에 기재된 바와 같이 관찰하였다.
서열 2를 갖는 펩티드 혈장 농도의 결정 및 독성동력학 파라메타의 계산을 위해 0일, 7일, 14일, 21일 및 27일에 3가지 원숭이/성별/군으로부터 혈액 샘플을 수집하였다.
이 연구에서 사망한 개체는 없었다. 펩티드의 정맥내 주입 이후에 대부분의 투여군의 대부분의 원숭이들에서 임상 징후의 변화가 나타났다. 펩티드 5 mg/kg/일을 투여받은 수컷에서, 화합물과 관련된 임상 징후는 전혀 없었다. 15 mg/kg/일을 투여받은 수컷에서, 안면 홍조 (3/3) 및 타액분비 (1/3)가 관찰되었다. 30 mg/kg/일을 투여받은 수컷은 안면 홍조 (4/5), 신체 표면의 홍조 (3/5), 타액분비 (3/5), 구토 (1/5) 및 근 긴장 감소 (1/5)를 나타내었다. 5 mg/kg/일을 투여받은 암컷은 안면 홍조 (2/3)를 나타내었다. 15 mg/kg/일을 투여받은 암컷에서, 안면 홍조 (3/3), 신체 표면의 홍조 (2/3) 및 타액분비 (1/3)가 나타났다. 30 mg/kg/일을 투여받은 암컷은 뚜렷한 안면 홍조 (5/5), 신체 표면의 홍조 (4/5), 타액분비(4/5), 구토 (2/5) 및 근 긴장 감소 (1/5)를 나타내었다. 모든 임상 징후는 감소되었으며, 펩티드의 투여 1시간 후에는 더 이상 분명하지 않았다. 이러한 임상 징후 중 어떠한 것도 회복 기간 동안에는 나타나지 않았다.
체중, 임상 병리 파라메타 (혈액학, 혈청 화학 및 요분석학), 생리학적 파라메타 (체온, 심장 박동 속도, 혈압 및 호흡 속도), 심전도 평가 및 기관 중량은 펩티드로의 처리에 의해 영향받지 않았다. 시험 펩티드와 관련하여 안과학적, 거시적 또는 미시적으로 관찰된 결과는 없었다. 수컷과 암컷 사이에서 펩티드-관련된 관찰 결과에 있어서의 뚜렷한 차이는 없었다.
서열 2를 갖는 펩티드는 수컷 또는 암컷 원숭이에게 28일 동안 30 mg/kg/일의 투여량 이하로 투여되는 경우 충분히 허용되었다. 투여 직후의 안면 홍조를 기준으로, 비-관찰된 효과 수준 (NOEL)을 수컷 원숭이에서 5 mg/kg/일에서 확립하였다. 암컷에서 NOEL은 확립되지 않았다. 임상 징후 및 근육 약화 (연구 1일에 수컷 1/5 및 암컷 1/5에서만 관찰됨)는 일시적이었으며, 어떠한 다른 시험 항목 관련된 효과도 관찰되지 않았기 때문에, 비-관찰된 역효과 수준 (NOAEL)은 두 성별 모두의 원숭이들에서 30 mg/kg/일에서 확립되었다.
실시예 10:
서열 2를 갖는 펩티드의 히스타민 방출에 대한 효과
서열 2를 갖는 펩티드의 히스타민 방출에 대한 효과를 시험관내의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 시험하였다.
4마리의 다른 개체로부터의 PBMC를 시험하였다. 백혈구 현탁액을 3 μM 내지 10 mM 범위의 여러 농도의 서열 2를 갖는 펩티드와 함께 인큐베이션하였다. 인간 항-IgE 항체 및 완충액을 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용하였다. 히스타민 방출량을 ELISA (IBL, 카탈로그 번호 RE 59221)로 정량하였다. 분석 감도는 2.4 ng/mL이다.
3 μM 내지 10 mM 농도 범위를 선택하여 정맥내 주입시 얻어진 수준에서 펩티드의 히스타민 방출을 평가하였다. 따라서, 30 mg/kg의 농도는 주사 직후 약 38 μM에 상응하였으며, 이는 조직 kg 당 400 ml의 분포 부피로 생각된다. 펩티드는 세포외 유체내에 자유롭게 분포하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 10 mM에서 가장 높은 펩티드 농도는 세포외 유체내에서 가장 높은 농도보다 대략 100배 이상이다.
10 mM의 가장 높은 농도에서, 펩티드는 비교적 소량이지만 15 ng/ml의 유의한 히스타민 방출을 나타낸다. 이 수치는 양성 대조군 (항-IgE)보다 약 10배 더 낮다. 3.3 mM 이하의 농도에서 펩티드는 인간 PBMC에서 히스타민 방출에 대한 효과를 나타내지 않는다. 이 범위는 모든 치료 생체내 농도를 포함한다. 적지만 유의한 히스타민 방출이 시험관내에서 10 mM의 가장 높은 펩티드 농도에서 관찰되었다. 이 농도는 어떤 치료 투여량보다 유의하게 더 높다.
실시예 11:
실시예 8 및 9에서 시험된 시노몰구스 원숭이 및 래트로부터의 혈청 샘플을 분석하여 원숭이 및 래트에서 IgG 존재를 검출하였다. 32개의 원숭이 혈청 샘플 및 80개의 래트 혈청 샘플중 어떤 것에서도 서열 2를 갖는 펩티드에 대한 항체가 검출되지 않았다.

Claims (33)

  1. 하기 구조식으로 표시되는 15 또는 18개의 아미노산을 포함하는, 트롬보포이에틴 (TPO) 수용체 조절제의 생물학적 활성을 갖는 올리고펩티드 또는 그의 생물학적 동등물.
    X1G T L E L X2P X3S R Y R L Q L X4
    상기 식에서,
    X1은 A R G이거나 존재하지 않고,
    X2는 R 또는 A이고,
    X3는 R 또는 A이며,
    X4는 R A R이거나 존재하지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, 서열 1 내지 6에 정의된 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고펩티드 또는 그의 생물학적 동등물.
  3. 서열 7에 정의된 아미노산 서열을 갖는 올리고펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드서열.
  5. 제4항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 박테리아, 바이러스, 포유동물 또는 효모 벡터인 벡터.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 적합한 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 5' 및(또는) 3' 조절 요소를 추가로 포함하는 벡터.
  8. 적합한 조건하에서 제1항 또는 제2항의 올리고펩티드를 발현시킬 수 있는 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 포유동물, 효모 또는 박테리아 세포인 숙주 세포.
  10. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 세포를 형질감염시켜 세포를 유전적으로 변형시키는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 화학적 또는 전기적으로 유도된 형질감염, 특히 전기천공 또는 세포 융합, 레트로바이러스 또는 바이러스 매개 유전자 전달, 리포좀 매개 유전자 전달 또는 입자 충격에 의해 세포를 형질감염시키는 방법.
  12. 제4항에 따른 뉴클레오티드 서열이 비인간 포유동물 세포로 도입되는 것인, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 올리고펩티드를 생성할 수 있는 비인간 포유동물의 생산 방법.
  13. 제4항의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생식 세포 및(또는) 체세포, 특히 제8항 또는 제9항에 따른 숙주 세포를 포함하는 비인간 포유동물.
  14. 제13항에 있어서, 설치류 또는 영장류인 비인간 포유동물.
  15. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 세포를 형질감염시키는 단계, 및 올리고펩티드의 발현 및 세포 또는 배양 배지로부터의 올리고펩티드의 회수를 허용하는 조건하에 상기 배양 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 올리고펩티드의 제조 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 올리고펩티드에 특이적으로 결합하는 항체.
  17. 제16항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 그의 단편인 항체.
  18. 제16항 또는 제17항의 항체에 특이적으로 결합하는 항체.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드, 제4항의 뉴클레오티드 서열, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 벡터, 제8항 또는 제9항의 숙주 세포, 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체를 임의로 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는, 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증 치료용 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드, 제4항의 뉴클레오티드 서열, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 벡터, 제8항 또는 제9항의 숙주 세포, 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체를 임의로 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는, 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증 진단용 조성물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 트롬보포이에틴을 추가로 포함하는 제약 또는 진단용 조성물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 정제, 환제, 캡슐제, 과립제, 좌제, 분말제, 패취, 리포좀, 코팅제, 주사, 주입 또는 경구 투여용 용액제, 시럽, 현탁액제, 에멀젼, 스프레이, 흡입제, 에어로졸, 페이스트, 연고 또는 로션 형태의 제약 또는 진단용 조성물.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드, 제4항의 뉴클레오티드 서열, 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 벡터, 제8항 또는 제9항의 숙주 세포 및(또는) 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체의, 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증의 진단 또는 치료용 약물의 제조에 있어서의 용도.
  24. 제23항에 있어서, 약물이 트롬보포이에틴을 추가로 포함하는 것인 용도.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드 또는 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체를 트롬보포이에틴의 존재 또는 부재하에 TPO-R에 가하는 것인, 트롬보포이에틴-수용체 (TPO-R)의 활성을 조절하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 조절이 상기 활성의 증가 또는 감소인 방법.
  27. TPO-R에 결합하거나 세포내 신호화 경로를 활성화하는데 있어서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드와 경쟁하는 능력에 대하여 잠재적인 약물을 스크리닝하는 것을 포함하는, 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증의 진단 또는 치료에 효과적인 약물의 스크리닝 방법.
  28. 트롬보포이에틴 아고니스트의 처치에 민감한 질환을 앓는 환자에게 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드 및(또는) 야생형 TPO-Rp를 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 치료 방법.
  29. 제27항에 있어서, 질환이 골수 이식, 방사선요법, 화학요법 또는 알러지 반응으로부터 발생하는 혈액성 질환 또는 혈소판감소증이거나, 특발성 질환인 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 트롬보포이에틴을 추가로 포함하는 방법.
  31. 야생형 TPO-Rp, 야생형 TPO-Rp를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 이 벡터를 포함하는 숙주 세포 및(또는) 야생형 TPO-Rp에 특이적으로 결합하는 항체의, 혈액성 질환, 특히 혈소판감소증의 치료용 약물의 제조에 있어서의 용도.
  32. TPO-R의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드로의 결합을 허용하는 조건하에 상기 올리고펩티드를 TPO-R 함유 공급원에 가하는 단계, 및 그로부터 TPO-R을 단리하는 단계를 포함하는, TPO-R 함유 공급원으로부터 TPO-R을 검출 또는 단리하는 방법.
  33. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 올리고펩티드에 제16항 또는 제17항의 항체를 가한 혼합물로부터 이 항체에 결합된 올리고펩티드를 검출 및(또는) 단리하는것인, 상기 올리고펩티드를 검출 및(또는) 단리하는 면역분석법.
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