CN1921877A - 陪伴蛋白10对Toll样受体诱导的细胞因子和趋化因子分泌的调节 - Google Patents

Abstract

本发明提供了使用陪伴蛋白10(Cpn10)来调节Toll样受体信号传导和/或Toll样受体诱导性免疫调节剂分泌的方法。Cpn10可负性调节Toll样受体激动剂诱导的促炎细胞因子和趋化因子分泌，其实例分别为IL－6和RANTES。Cpn10可正性调节Toll样受体激动剂诱导的抗炎细胞因子和趋化因子分泌，其实例为IL－10。这些Cpn10的免疫调节活性可用于治疗促炎细胞因子和趋化因子过度分泌引起的疾病、紊乱和病症。本发明还涉及根据调节Toll样受体信号传导和/或Toll样受体诱导性免疫调节剂分泌的能力，生产、设计和/或筛选Cpn10激动剂和拮抗剂。

Description

陪伴蛋白10对Toll样受体诱导的细胞因子和趋化因子分泌的调节

技术领域

本发明涉及使用陪伴蛋白10调节Toll样受体的信号传导和/或Toll样受体诱导的免疫调节剂的产生和/或分泌。更特别地，本发明涉及调节Toll样受体诱导的细胞因子和趋化因子的分泌以治疗由于免疫调节剂分泌过度而引起的疾病、紊乱和病症。本发明也涉及生产、设计和/或筛选陪伴蛋白10的激动剂和拮抗剂。

背景技术

Toll样受体家族在昆虫、动物和植物的炎症和免疫中具有重要地位。Toll样受体(TLR)是由包括淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞的单核系细胞表达的。

TLR2被脂磷壁酸和脂肽之类的TLR2激动剂活化，它们可以是某些细菌外壁的成分。TLR3被激动剂活化，如来自病毒的双链RNA。

TLR4被脂蛋白或脂多糖(LPS)或内毒素活化，它们是革兰氏阴性细菌的外壁成分。

TLR被病原体或其来源的分子活化，诱发细胞内的信号传导，主要引起转录因子NF-κB的活化(Beg，2002，Trends Immunol，2002 23509-12.)和细胞因子产生的调节。但也可触发一系列其他的通路，包括p38有丝分裂原活化的激酶、c-Jun-N-末端激酶和细胞外信号相关的激酶通路(Flohe等人，2003，J Immunol，170 2340-2348；Triantafilou &Triantafilou，2002，Trends Immunol，23 301-304)。不同的TLR连接诱导的基因表达模式是不同的，但经常重叠。例如，大部分被TLR3激动剂上调的基因和双链RNA也可被TLR4激动剂和LPS上调(Doyle等人，2002，Immunity，17 251-263)。在巨噬细胞中TLR4被LPS活化引起TNF-α、IL-12IL-1β、RANTES和MIP1β分泌(Flohe等人，见前文；Jones等人，2002，J Leukoc Biol，69 1036-1044)。

哺乳动物陪伴蛋白10(也被称为热休克蛋白10)首先被描述为参与蛋白质折叠的线粒体蛋白，是细菌蛋白GroES的同源物。GroES和陪伴蛋白10(Cpn10)寡聚为7元环，作为盖子结合在杯状结构上，其包括7个GroEL或Hsp60分子，可将变性的蛋白束缚在复合体上(Bukau & Horwich，1998，Cell，92 351-366；Hartl & Hayer-Hartl，2002，Science，295 1852-1858)。Cpn10也常常发现在细胞表面上(Belles等人，1999，Infect Immun，67 4191-4200；Feng等人，2001，Blood，973505-3512)和细胞外液中(Michael等人，2003，J Biol Chem，2787607-7616；Johnson等人，2003，Cir Rev Immunol，23 15-44)。

Cpn10也已经显示是早期妊娠中存在的一种抑制因子，并在试验性自体免疫脑脊髓炎、迟发型超敏反应和同种异体移植排斥模型中显示出免疫抑制活性(Zhang等人，2003，J Neurol Sci，212 37-46；Morton等人，2000，Immunol Cell Biol，78 603-607)。

最近在国际申请WO 02/40038中描述的使用结核分支杆菌Cpn10的研究表明，该分子在如癌症、过敏性反应的疾病和/或由Th2型免疫反应介导的病症的治疗中可能具有一定效果。该研究认为这可能是通过诱导如TNF-α和IL-6之类的细胞因子来完成的。

但Cpn10，特别是哺乳动物Cpn10发挥其免疫调节效应的作用机制尚不明确。

发明内容

意外的是，本发明者已经证明了Cpn10可以调节Toll样受体激动剂介导的对免疫调节剂分泌的刺激作用。

更特别地，Cpn10可以下调Toll样受体介导的对促炎症免疫调节剂的诱导，并可正性调节Toll样受体介导的对抗炎免疫调节剂分泌的诱导。

因此，本发明从广义上讲涉及陪伴蛋白10(Cpn10)对Toll样受体信号传导的调节。

在第一个方面，本发明提供了在动物、或来源于其中的一种或多种细胞、或组织或器官中调节Toll样受体信号传导的方法，包括以下步骤，对动物、细胞、组织或器官施用Cpn10或Cpn10的衍生物，以调节Toll样受体的信号传导。

在第二个方面，本发明提供了在动物、或来源于其中的一种或多种细胞、或组织或器官中调节免疫调节剂分泌的方法，包括以下步骤，对动物、细胞、组织或器官施用Cpn10或Cpn10的衍生物，以调节Toll样受体诱导性免疫调节剂的产生和/或分泌。

根据这些方面，本发明提供了调节Toll样受体信号传导和/或免疫调节剂的产生和/或分泌的方法，从而调节动物免疫反应，以预防性或治疗性地治疗疾病、紊乱或病症。

优选的疾病、紊乱或病症选自急性或慢性炎性疾病，如败血性休克、炎性肠病、关节炎、银屑病、心脏病、动脉粥样硬化、慢性肺病、恶病质、多发性硬化症、GVHD、移植和癌症。

根据本发明，Cpn10优选调节的Toll样受体选自TLR2、TLR3和TLR4。

更优选地，Toll受体选自TLR2和TLR4。

仍更优选地，Toll样受体是TLR4。

Cpn10适合调节由Toll样受体激动剂刺激、活化和/或诱导的Toll样受体信号传导和免疫调节剂的产生和/或分泌。

Toll样受体激动剂可以是病原体、病原体来源的分子或其产生的分子、或是合成的Toll样受体激动剂。

优选地，Toll样受体激动剂选自LPS、脂肽和双链RNA。

在一个实施方式中，Toll样受体是TLR4，激动剂优选LPS。

在另一个实施方式中，Toll样受体是TLR3，激动剂优选双链RNA。

在又一个实施方式中，Toll样受体是TLR2，激动剂优选脂肽。

在特殊的实施例中，脂肽可以是PAM₃CysSK₄。

适合地，动物或来源于其的细胞、组织或器官包括表达一种或多种Toll样受体的细胞。

优选地，细胞是免疫细胞。

更优选地，免疫细胞是单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或淋巴细胞。

优选地，动物是哺乳动物。

更优选地，动物是人。

根据前面所述的各个方面，在一个实施方式中，免疫调节剂是如TNF-α或白介素6(IL-6)之类的促炎细胞因子、或如RANTES之类的促炎趋化因子，在此不作限制。

在另一个实施方式中，免疫调节剂是如白介素-10(IL-10)之类的抗炎细胞因子、或如TGF-β之类的抗炎趋化因子，在此不作限制。

在免疫调节剂是促炎细胞因子或趋化因子的实施方式中，Cpn10的给药优选抑制、遏制或减少所述免疫调节剂的产生和/或分泌。

在免疫调节剂是抗炎细胞因子或趋化因子的实施方式中，Cpn10的给药优选增加、促进、加速或增强所述免疫调节剂的产生和/或分泌。

在第三个方面，本发明提供了一种分离的分子复合体，包括Toll样受体、Toll样受体激动剂和Cpn10。

优选地，Toll样受体选自TLR2、TLR3和TLR4。

更优选地，Toll受体选自TLR2和TLR4。

进一步优选地，Toll样受体是TLR4。

在一个实施方式中，Toll样受体是TLR4，激动剂是LPS。

在另一个实施方式中，Toll样受体是TLR3，激动剂是双链RNA。

在又一个实施例中，Toll样受体是TLR2，激动剂是PAM₃CysSK₄。

在一个特殊的实施方式中，本发明提供了一种分离的分子复合体，包括TLR4、LPS和Cpn10。

在第四个方面，本发明提供了一种产生、设计或筛选Cpn10激动剂的方法，包括以下的步骤：确定候选的激动剂是否可模拟或增加Cpn10对Toll样受体信号传导和/或Toll样受体诱导性免疫调节剂的产生和/或分泌的调节作用。

在第五个方面，本发明提供了一种产生、设计或筛选Cpn10拮抗剂的方法，包括以下的步骤：确定候选的拮抗剂是否可以抑制、减少、遏制或降低Cpn10对Toll样受体信号传导和/或Toll样受体诱导性免疫调节剂的产生和/或分泌的调节作用。

优选地，Toll样受体选自TLR2、TLR3和TLR4。

更优选地，Toll受体选自TLR2和TLR4。

进一步优选地，Toll样受体是TLR4。

在第六个方面，本发明提供根据前面所述的各个方面产生、设计或筛选的Cpn10激动剂或拮抗剂。

在本说明书中，“包括”、“含有”和“包含”都是以包含性而非排除性的含义来使用，应理解为意味着包含所述的整体或一组整体，但不排除任何其他的整体或一组整体。

附图说明

图1.Cpn10抑制LPS诱导的RAW264.7细胞活化和促炎介质的产生。

(A)Cpn10介导的对LPS诱导的NF-κB活性的抑制作用。在9个独立的实验中，100μg/ml Cpn10(Hsp10+)或缓冲液(Hsp10-)与RAW264-HIV-LTR-LUC细胞预培养2小时。然后以5、1和0.2ng/ml加入LPS，2小时后测量荧光素酶活性。5ng/ml LPS获得的荧光素酶的相对光单位(relative light unit，RLU)设定为100％相对荧光素酶活性，0％代表缺少LPS时获得的RLU。Cpn10不能单独刺激出现显著的RLU(数据未显示)。对每种浓度的LPS显示由Cpn10介导的RLU减少的平均百分比(±SD)，使用配对t检验计算显著性(significance)。

(B，C)Cpn10-介导的对LPS诱导的RANTES和IL-6分泌的抑制作用。RAW264.7细胞与指示浓度的Cpn10(Hsp10)培养2小时，然后加入1ng/ml LPS。6小时后，通过ELISA分析三份上清液中的RANTES和IL-6。显示由100μg/ml Cpn10介导的RANTES和IL-6分泌减少的平均百分比。显著性使用配对t检验进行计算。

图2.Cpn10对鼠系统中细胞因子分泌的作用。

(A)Cpn10处理降低LPS刺激的腹膜巨噬细胞产生TNF-α的能力。C57BL/6小鼠(n＝3)用Cpn10(Cpn10+)或对照稀释液(Cpn10-)处理。在第6天通过腹腔灌洗收获腹膜巨噬细胞，并从处理组中的每只动物中混合在一起。细胞以2×10⁵/孔接种在存在有LPS(1μg/ml)的孔中。在5小时时收集培养上清液，并通过ELISA测定TNF-α的水平。(没有LPS的孔没有产生可检测到的TNF-α——数据未显示)。显示三个孔的平均±SE，并根据CD11b染色标准化为每10⁵巨噬细胞的产生量。显示来自两个相同实验的数据，标明减少的平均百分比，并通过ANOVA计算显著性。

(B)Cpn10处理使脾细胞产生的IL-10增加。C57BL/6小鼠如上用Cpn10或对照稀释液处理。在第六天收获脾细胞，并将处理组中的每只动物的脾细胞混合起来，在存在有LPS(10μg/ml)的孔中以5×10⁵/孔进行培养。在48小时时收集培养上清液，通过ELISA测定IL-10水平。显示了三个孔的平均±SE。如A显示增加的平均百分比，并进行统计学计算。

(C)Cpn10处理使IL-10^-/-腹膜巨噬细胞的TNF-α产生减少。IL-10^-/-C57BL/6小鼠如上用Cpn10或对照稀释液处理，并如A收获腹膜巨噬细胞。在LPS(0.1、1或10μg/ml)的存在下培养5小时后，通过ELISA测定培养上清液中的TNF-α。显示了一个代表性试验中三个孔的平均±SE。使用非参数t检验比较Cpn10处理和对照动物的TNF-α水平。

图3.Cpn10处理人外周血单核细胞(PBMC)减少LPS-诱导的TNF-α和IL-6分泌，且不诱导耐受。

(A)Cpn10减少LPS-诱导的TNF-α分泌。在加入0.04ng/ml LPS之前1小时，将Cpn10(1和10μg/ml)或缓冲液(0)加入至来自8个不同供体的PBMC中。20小时后去掉上清液，分析TNF-α。显示减少的百分比，和使用配对t检验计算的显著性。对于所有的供体，10μg/ml Cpn10，在缺少LPS的情况下，诱导的TNF-α水平没有超过检测水平(31pg/ml)(数据未显示)。(B)用LPS预处理1小时不能诱导对随后LPS诱导的TNF-α分泌的耐受性。PBMC与标明的LPS预处理浓度接触。1小时后，用0.04ng/ml LPS刺激PBMC，20小时后分析上清液的细胞因子。(C)Cpn10减少LPS诱导的IL-6分泌。在加入0.04ng/ml LPS之前1小时，向来自8个不同供体的PBMC中加入Cpn10(1和10μg/ml)或缓冲液(0)。20小时后去掉上清液，分析IL-6。标出减少的百分比和有效性(如A进行计算)。对于所有的供体，10μg/mlCpn10，在缺少LPS的情况下，不能诱导检测水平(9pg/ml)以上的IL-6水平(数据未显示)。(D)用LPS预处理1小时不能诱导对随后LPS诱导的IL-6分泌的耐受性。PBMC与标明的LPS预处理浓度接触。1小时后，PBMC用0.04ng/ml LPS进行刺激，20小时后分析上清液中的细胞因子。

图4.在鼠炎症模型中Cpn10的活性。

(A)Cpn10减少LPS诱导的血清TNF-α和RANTES水平，并增加IL-10的水平。在5个独立的实验中，在静脉内给予10μg LPS之前30分钟，对C57BL/6小鼠(每组n＝3或4)静注给予缓冲液(Cpn10-)或100μg Cpn10(Cpn10+)。1.5小时后，处死动物，测定血清TNF-α、RANTES和IL-10水平；(后两者在3/5个实验中进行评价)。误差条线代表每个试验中的标准误差。标明了TNF-α和RANTES减少和IL-10增加的百分比(±SD)，并使用ANOVA检验计算显著性。

(B)用Cpn10移植前处理抑制GVHD死亡率，降低急性疾病的临床严重程度。同系基因阴性对照(n＝8)(白色圆圈)代表用同系基因B6D2F1骨髓和T细胞移植的B6D2F1小鼠。同种异体阳性对照(n-10)(白色方形)代表稀释液预处理的B6D2F1受体小鼠，其用来自稀释液预处理的B6供体小鼠的细胞移植。同种异体+Cpn10(n＝10)(黑色方形)代表接受来自B6供体小鼠骨髓和T细胞的B6D2F1受体，其中受体和供体在移植前均用Cpn10预处理。显示三组的Kaplan-Meier生存曲线和临床评分，用或不用Cpn10处理的同种异体组分别通过时序统计学(Log Rank Statistic)和非参数t检验进行比较。临床评分仅在第7天有显著性差异。

图5.(A)在给予弗氏完全佐剂(CFA)并给予和不给予Cpn10处理的BALB/c小鼠中呈现的皮下肉芽肿的面积。与缓冲液对照(较深阴影，右侧柱)比较的每对柱左侧的较浅柱显示Cpn10结果。(B-E)在RAW264-HIV-LTR-LUC细胞中，PAM3CysSK₄诱导的巨噬细胞活化被Cpn10抑制。(B)在加入Cpn10或稀释液2小时后加入PAM3CysSK₄2小时，然后进行荧光素酶测定。(C)加入Cpn10或稀释液2小时后，冲洗去掉Cpn10或稀释液，然后加入PAM3CysSK₄ 2小时，然后进行荧光素酶测定。(D)加入Cpn10或稀释液2小时后加入PAM3CysSK₄2小时，然后进行荧光素酶测定。(E)使用如(B)中相同的步骤，除了细胞用LPS而不是PAM3CysSK₄活化以外。上面的图面显示了相对光单位数据，下面则是Cpn10介导的抑制百分比。

图6.在缺少配基时，Cpn10不与TLR4或TLR2结合。上图：TLR4阳性对照。MD-2与TLR4免疫共沉淀(但不与TLR2)。下图：在这些条件下和缺少配基的条件下，Cpn10不与TLR4或TLR2有实际的(physically)相互作用。

图7.每天皮下给予Cpn10减少大鼠中佐剂关节炎期间的体重下降。佐剂关节炎期间的体重下降以均数(±SEM)表示(每组n＝10)。

图8.Cpn10介导的对LPS刺激的RAW264.7细胞的活性不是LPS污染所致。(A)对由于LPS污染Cpn10引起的耐受性检测显示，在LPS刺激之前2小时用LPS预处理不会抑制LUC活性。两份RAW264-HIV-LTR-LUC细胞用标明的LPS浓度预处理；2小时后细胞用5、1、0.2和0ng/ml LPS刺激，2小时后测定LUC活性。(B)胰蛋白酶处理的Cpn10不抑制LPS诱导的NF-κB活性。与缓冲液(对照)处理的细胞相比，用100μg/ml Cpn10(Hsp10)处理两份RAW264-HIV-LTR-LUC细胞2小时可显著地降低由5、1和0.2ng/mlLPS诱导的RLU；在减去本底后，RLU减少的百分比分别为29.7±0.8(SD)、50±4.6、和71±7.7(两因素ANOVA，p＜0.001，包括LPS浓度项)。与对照相比，对于5、1和0.2ng/ml LPS，用胰蛋白酶处理的Cpn10(胰蛋白酶Hsp10)处理赋予的减少百分比分别为0.1±8.8、11.6±4.2、和21±7.4，用胰蛋白酶处理的缓冲液(胰蛋白酶缓冲液)处理赋予的减少百分比分别为1.4±2.1、5.8±1.1、和14.9±2.4；(与对照相比或相互之间没有显著差异)。如期望的那样，胰蛋白酶处理刺激的LPS并不影响LPS的活性(胰蛋白酶LPS，p＞0.05)。(C)Cpn10介导的由LPS诱导的LUC活性减少是剂量响应性的。试验的安排如图1A，除了Cpn10(Hsp10)浓度如所标注的发生变化以外。对于每个LPS浓度，标注了在未用Cpn10预处理的对照细胞上的LUC活性的抑制百分比。

图9.静脉内输注而不是皮下注射Cpn10，诱导LPS驱动的体外PBMC TNF-α响应量的变化。A.在第0天(输注前约12小时)和第1天(输注后8小时)，LPS驱动的TNF-α产生。B.来自图9A的数据对输注前至输注后LPS驱动的TNF-α产生的变化作图。C.在第0天(输注前约12小时)与第1天(皮下注射Cpn10/安慰剂后8小时)LPS刺激的TNF-α产生的比较。

图10.每天静脉输注Cpn10 5天，诱导LPS驱动的体外PBMCTNF-α响应量的变化。第0天(输注前约12小时)分离的PBMC中LPS引发的TNF-α产生与第1、4和5天(大约输注后8小时)分离的细胞进行比较。另外，在第8和12天分离的PBMC(即，分别为最后的第5天Cpn10输注后的3天和7天)与第0天LPS刺激的响应进行比较。也检测细胞培养上清液中IL-6的产生，并证明具有如本文对TNF-α所描述的总体趋势。

具体实施方式

本发明至少部分地起源于下面的发现，在许多不同的人和鼠体外和体内系统中，Cpn10在包括单核细胞(monocytes and mononuclearcells)和巨噬细胞的细胞中，抑制LPS介导的促炎细胞因子TNF-α和IL-6、以及促炎趋化因子RANTES的分泌，并增加LPS诱导的抗炎细胞因子IL-10的分泌。

这与国际申请WO 02/40038中的内容相反，该申请提到分枝杆菌Cpn10的作用是通过增加表达TNF-α和IL-6之类的细胞因子来抑制Th2介导的免疫反应。

尽管不希望受任何特别的理论限制，但根据本发明，Cpn10的作用既不经Th1依赖也不经Th2依赖的机制。

本发明者已经出乎意料地证明了Cpn10影响Toll样受体信号传导以及对Toll样受体激动剂响应产生的免疫调节剂分泌。

更特别地，Cpn10减少Toll样受体激动剂刺激的NF-κB活化，以及TNF-α和RANTES分泌，并以剂量依赖的方式增加IL-10的分泌。

而且，本发明者也已经证明Cpn10、Toll样受体和Toll样受体激动剂可形成分子复合体。FRET分析表明，在TLR配基(例如LPS)的存在下，在Cpn10与Toll样受体之间有直接的相互作用，或至少它们具有非常紧密的空间接近性(相互在1-10nm之内)。

要理解的是Toll样受体激动剂可以是病原体(如细菌或病毒)、来源于病原体的分子、或由病原体(如细菌LPS、细菌内毒素、分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖、脂磷壁酸质、脂肽或病毒双链RNA)产生，或是合成的脂肽Toll样受体激动剂，例如与月桂酸或棕榈酸之类的长链酰化饱和脂肪酸连接的肽/氨基酸，例如TLR2激动剂PAM₃CysSK₄。

对于本发明的目的，“免疫调节剂”的含义是指由免疫系统细胞分泌的分子介质或与免疫系统细胞相互作用的分子介质，其在免疫反应活化、维持、成熟、抑制、遏制或增加中起作用。

“细胞因子”的含义是指由免疫系统细胞分泌的分子介质，其在免疫反应活化、维持、成熟、抑制、遏制或增加中起作用。细胞因子的非限制性实例是TNF-α、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-10(IL-10)。

“趋化因子”的含义是指起到促进和/或调节细胞迁移和活化的作用的分子介质。趋化因子的非限制性实例是MIP1α、MIP1β、RANTES和TGF-β。

“促炎免疫调节剂”的含义是指在炎症过程或炎性反应中起到作用或参与其中的细胞因子或趋化因子。

促炎免疫调节剂的非限制性实例是IL-6、TNF-α、IL-12和IL-1β、RANTES和MIP1β。

“抗炎免疫调节剂”的含义是指在抑制、遏制或减少炎性反应中起作用的细胞因子或趋化因子。

抗炎免疫调节剂的非限制性实例是IL-10和TGF-β。

“分离的”的含义是指已经从其天然状态移除或接受人为处理的材料。分离的材料可以基本上或实质上不含其天然状态下其正常伴随的组分，或可被处理为以人为的状态与其天然状态下其正常伴随的组分结合在一起。分离的材料可以是天然的、化学合成的或重组的形式。

“蛋白”的含义是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然的或非天然的氨基酸D-和L-氨基酸，在本领域中很容易理解。

“肽”是含有不超过50个氨基酸的蛋白。

“多肽”是含有不超过50个氨基酸的蛋白。

术语“核酸”在此使用是指单链或双链mRNA、RNA、RNAi和包含cDNA和基因组DNA的DNA。

Cpn10和Cpn10片段、变异体和衍生物

根据本发明，“Cpn10”或“陪伴蛋白10”是指任何真核状态的Cpn10，包括哺乳动物Cpn10，例如人、小鼠、大鼠和其他形式的Cpn10。

优选地，Cpn10是哺乳动物Cpn10。

更优选地，Cpn10是人Cpn10。

Cpn10蛋白可包括天然存在的修饰作用，例如糖基化或乙酰化和/或是天然的、化学合成的或重组形式。也要理解的是，Cpn10可以是指“Hsp10”。它们被视作相同的蛋白。

根据本发明，还也可使用Cpn10的片段。

在一个实施方式中，“片段”包括由小于100％，但至少30％，优选至少50％，更优选至少80％或进一步优选至少90％、95％或98％的Cpn10蛋白组成的氨基酸序列。

术语“片段”包括并包含“生物学活性片段”，即保留了Cpn10蛋白的生物学活性。例如，可根据本发明使用能够调节Toll样受体信号传导和/或免疫调节剂分泌的Cpn10生物学活性片段。生物学活性片段具有至少超过整个Cpn10蛋白50％的生物学活性，优选至少超过60％的生物学活性，更优选至少超过75％的生物学活性，进一步优选至少超过80％的生物学活性，最有利的是具有至少90％或95％的Cpn10的生物学活性。

在本文使用的“变异体”蛋白是其中一个或多个氨基酸已经被不同的氨基酸替代的蛋白。根据本发明可使用保留了天然或野生型Cpn10的生物活性的Cpn10蛋白变异体。本领域中很好理解的是，一些氨基酸可被改变为其它氨基酸，而大致具有相似的特性，不改变蛋白活性的性质(保守取代)。通常，可能对多肽特性产生最大改变的取代是(a)亲水残基(例如，Ser或Thr)取代，或被疏水残基(例如，Leu、Ile、Phe或Val)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代，或被其他残基取代；(c)带有正电侧链的残基(例如，Arg、His或Lys)取代或被带负电的残基(例如，Glu或Asp)取代；或(d)具有较大侧链的残基(例如，Phe或Trp)取代，或被具有较小侧链的残基(例如，Ala、Ser)或没有侧链的残基(例如，Gly)取代。

对于Cpn10变异体，可通过诱变Cpn10蛋白或诱变编码核酸，例如通过随机诱变或定向诱变来建立。核酸诱变方法的实例可见Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的第9章，见前，在此引入作为参考。

如在此所使用的，本发明的“衍生”Cpn10蛋白包括Cpn10蛋白，例如通过与其他化学部分结合或复合，或通过本领域中熟知的翻译后修饰技术改变的Cpn10蛋白，包括融合伴侣蛋白。

本发明预计的其他衍生物包括但不限于在蛋白合成过程中的聚乙二醇化、侧链修饰、掺入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及使用交联剂和对Cpn10蛋白施加构象限制的其它方法。本发明预计的侧链修饰的实例包括如通过醋酸酐的酰化作用对氨基的修饰作用；琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基的酰化作用；甲基乙酰亚氨酯(methylacetimidate)的脒化作用(amidination)；氰酸酯(盐)对氨基的甲氨酰化作用；吡哆醛-5-磷酸盐对赖氨酸的吡哆醛化(pyridoxylation)，然后用NaBH₄还原；通过与醛反应，然后用NaBH₄还原进行还原性烷基化作用；和用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)对氨基的三硝基苄基化作用。

羧基可通过碳二亚胺活化而修饰，通过形成O-酰基异脲，随后衍生为例如相应的酰胺。

精氨酸的胍基可通过与例如2，3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛的试剂形成杂环缩合产物而进行修饰。

巯基可通过如下方法修饰，例如过甲酸氧化为磺基丙氨酸；使用4-氯汞基苯磺酸、4-氯汞基苯甲酸盐；2-氯汞基-4-硝基酚、氯化苯基汞和其他汞制剂形成汞衍生物；与其他的硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代的马来酰亚胺反应；碘乙酸或碘乙酰胺的羧甲基化作用；和氰酸酯(盐)在碱性pH下的甲氨酰化作用。

色氨酸残基的修饰，例如可通过2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤对吲哚环的烷基化作用或N-溴代丁二酰亚胺的氧化作用。

酪氨酸残基的修饰可通过与四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物。

组氨酸残基咪唑环的修饰可通过焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化或碘乙酸衍生物的烷基化作用。

在肽合成过程中掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。

衍生物也可以包括融合伴侣和附加表位。公知的融合伴侣的实例包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人IgG的Fc段、麦芽糖结合蛋白(MBP)和六聚组氨酸(HIS₆)，它们特别用于通过亲和层析分离融合蛋白。为了通过亲和层析纯化融合多肽这一目的，亲和层析的相关基质分别是谷胱甘肽-、直链淀粉-、和镍-或钴-交联树脂。许多这样的基质可以以“试剂盒”的形式获得，如与(HIS₆)融合伴侣一起使用的QIAexpress^TM系统(Qiagen)和Pharmacia GST纯化系统。

融合伴侣的一个特殊实例是GST，如Morton等人，2000，ImmunolCell Biol 78 603-607中所述。在一些情况下，融合伴侣也具有蛋白酶切割位点，如X_a因子或凝血酶，其可使相关的蛋白酶部分地消化本发明的融合多肽，从而释放其中的重组Cpn10蛋白。然后释放的Cpn10蛋白可通过随后的层析分离而从融合伴侣中分离出来。例如，在用凝血酶切断GST-Cpn10的过程中，产生了衍生的GSM-Cpn10蛋白。

根据本发明的融合伴侣也包括在其“附加表位”的范围内，通常是可获得的特异性抗体的短肽序列。很容易获得特异单克隆抗体的附加表位的公知实例包括c-myc、血细胞凝集素和FLAG标记物。

根据本发明的Cpn10蛋白(包括片段、变异体、衍生物和同源物)可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来制备，包括化学合成和重组表达。

优选地，Cpn10是重组的Cpn10。

例如，重组Cpn10蛋白可通过包括下面步骤的方法进行制备：

(i)制备表达构建物，其包括编码Cpn10的分离核酸，在表达载体中与一条或多条调节核苷酸序列适当地连接；

(ii)用表达构建物转染或转化合适的宿主细胞；以及

(iii)在所述的宿主细胞中表达重组蛋白。

在Morton等人，2000，如上文描述的方法是重组Cpn10蛋白生产方法的一个实例。

治疗方法和药学组合物

本发明提供了Cpn10介导的对Toll样受体信号传导的调节方法，更特别地，对免疫调节剂的分泌的调节方法，可用来预防性或治疗性地治疗响应性疾病、紊乱或病症。

这些疾病、紊乱或病症可能是由过高水平的促炎细胞因子和趋化因子引起的，因此会对Toll样受体信号传导的抑制、遏制或减少发生响应。

可选择地或另外地，这些疾病、紊乱或病症可对Toll样受体信号传导和抗炎细胞因子和趋化因子分泌的增加、促进、提升或增强发生响应。

例如，Cpn10可减少小鼠中体内非致死性内毒素血症模型中TNF-α和RANTES的产生，并增加IL-10的产生。Cpn10在体内小鼠移植模型中还具有显著的免疫抑制活性，Cpn10的治疗增加了患移植物抗宿主疾病的小鼠的生存率。

Cpn10也可缓解患佐剂诱发的关节炎的大鼠的恶病质。炎性细胞因子水平增加与许多疾病的恶病质有关，例如癌症和风湿性关节炎。

除此之外，Cpn10可改善体内小鼠模型中的创伤愈合。

以单次静脉给药的方式在人体体内施用Cpn10，以剂量-响应的模式显著地降低先体外后体内LPS刺激后的促炎细胞因子反应，并明确地证明了在人类临床试验受试者中Cpn10具有免疫调节作用。

过度的炎症或未缩减的免疫反应对宿主是有害的，因此许多负反馈系统会发展以阻抑促炎介质的产生。一种这样的负反馈机制包括由单核细胞(mononuclear cell，monocytes)分泌的重要的免疫调节细胞因子，IL-10，它参与对炎症反应的限制和对免疫耐受的诱导。

Cpn10抑制但不会消除TNF-α、IL-6或RANTES的分泌。这是一种理想的特性，因为完全去除TNF-α(例如，通过抗TNF-α抗体)可引起免疫力低下，使患者易于感染，并降低肿瘤监视，使患者易发肿瘤。

Cpn10减少促炎免疫调节剂的产生和/或分泌的能力表明，将会发现Cpn10在促炎免疫调节剂分泌过度引起疾病的情况下的治疗性应用。

许多疾病与过度或慢性炎症有关，因此调节TLR受体信号传导产生的对细胞因子分泌的调节可具有广泛的临床益处。例如，TNF-α之类的促炎细胞因子的过度分泌是败血性休克之类的急性病症中引起死亡的原因之一，也是导致慢性炎性疾病中进行性组织损害的主要因素之一，上述慢性炎性疾病为例如炎性肠病(IBD)、关节炎、银屑病、充血性心脏病、多发性硬化、和慢性阻塞性肺病。

在组织或器官移植中，宿主或供体淋巴细胞能够分别将供体或宿主细胞抗原识别为外来物质和释放细胞因子，其活化固有免疫系统的细胞，引起移植组织或器官的排斥或移植物抗宿主疾病。免疫抑制剂在治疗和处置移植物排斥和移植物抗宿主疾病中具有重要地位。但药物对患者产生严重的副作用，而且非常昂贵，并在一些患者中几乎无效。

Cpn10、包括Cpn10的变异体、片段和衍生物，可对动物体内给药，或可体外给予从动物中获得的一种或多种细胞、组织或器官，从而调节Toll样受体信号传导和/或Toll样受体诱导性免疫调节剂的产生和/或分泌。

尽管不排除其他的形式，典型地包括变异体、衍生物和片段的Cpn10，可作为药学组合物被递送，该组合物进一步包括合适的药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

“药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂”是指固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其可安全地用于全身给药。根据给药的特殊途径，可使用本领域公知的各种载体。这些载体可选自糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、滑石、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、藻酸、磷酸盐缓冲溶液、乳化剂、等渗盐水和盐类，例如包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐的无机酸盐、例如醋酸盐、丙酸盐和丙二酸盐的有机酸以及无热原水。

一篇描述药学可接受载体、稀释剂和赋形剂的有用文献是Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，在此引入作为参考。

可使用任何安全的给药途径为患者提供本发明的组合物。例如，可使用口服、直肠、胃肠外、舌下、颊、静脉内、关节内、肌肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹膜内、脑室内(intracerebroventricular)、透皮和类似途径。肌肉内和皮下注射适合，例如致免疫的组合物、疫苗和DNA疫苗的给药。

剂型包括片剂、分散剂、悬液、注射液、溶液、糖浆剂、锭剂、胶囊、栓剂、气雾剂、透皮贴剂和类似物。这些剂型也包括专门为此目的设计的注射或植入可控释放装置或以此方式另外发挥作用的改进的其他形式植入体。治疗药物的可控释放可受例如疏水性聚合物包被的影响，上述疏水性聚合物包括丙烯酸树脂、蜡、高级脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纤维素衍生物，例如羟丙甲基纤维素。另外，通过使用其他的聚合物基质、脂质体和/或微球可影响可控释放。

上述组合物可以以与剂型相配伍的方式给药，其量是药学有效的。在本发明的上下文中，给予患者的剂量应足以在合适的时间周期内对患者产生有益的反应。给予药剂的量可根据要治疗的受试者的年龄、性别、体重、及其一般健康状况，以及要根据主治医生判断的因素来确定。

根据本发明的药学组合物和治疗方法可适合医学和/或兽医应用，因此可用于人和非人动物，包括哺乳动物，例如人、家畜、家养动物和观赏动物(performance animal)，在此不作限制。

Cpn10激动剂和拮抗剂

本发明考虑了制造、设计、筛选或产生Cpn10激动剂或拮抗剂的方法。

阐明Cpn10对Toll样受体信号传导和免疫调节剂分泌的作用，提供了新的和令人意想不到的机会，根据其对Toll样受体信号传导和免疫调节剂分泌的作用可特异地设计或筛选Cpn10激动剂和拮抗剂。大体上，这种免疫调节活性可能不依赖于Cpn10也具有的陪伴分子活性。

“激动剂”是指能增强另一个分子或受体位点活性的分子。

典型地，Cpn10激动剂可遏制、减少或抑制正常由Toll样受体激动剂所诱导的促炎细胞因子或趋化因子分泌。

典型地，Cpn10激动剂可增加、促进或增强正常由Toll样受体激动剂诱导的抗炎细胞因子或趋化因子的分泌。

“拮抗剂”是指可阻断或抑制另一个分子或受体位点活性的分子。

典型地，Cpn10拮抗剂可遏制、减少或抑制Cpn10对Toll样受体激动剂诱导的促炎细胞因子或趋化因子分泌的负性调节能力。

典型地，Cpn10拮抗剂可抑制Cpn10对Toll样受体激动剂诱导的抗炎细胞因子或趋化因子分泌的正性调节能力。

在一个实施方式中，激动剂或拮抗剂可以是Cpn10的模拟物，尽管本发明不限于具有与Cpn10相似结构的激动剂和/或拮抗剂。

在此使用的“模拟物”是指类似于Cpn10的一个或多个特殊结构和/或功能区或结构域的分子，包括具有激动剂或拮抗剂活性的修饰形式的Cpn10。

在一种特别的形式中，本发明提供了一种方法，通过确定候选Cpn10激动剂或拮抗剂是否调节Toll样受体信号传导和/或Toll样受体诱导性免疫调节剂的分泌，来制造、设计、筛选或产生Cpn10激动剂和/或拮抗剂。

要理解的是根据本发明，通过测量或检测细胞内或细胞外的分泌蛋白、报告基因化验、和检测或测量细胞内信号传导分子的化验，Toll样受体信号传导和免疫调节剂的产生和/或分泌可在基因表达水平进行测量或检测(例如，产生内源性细胞因子或趋化因子RNA)。

在一个特别的实施方式中，本发明提供了根据体外的NF-κB活性测量或检测Toll样受体信号传导的方法。

在另一个特别的实施方式中，本发明提供了根据一种或多种免疫调节剂的分泌，如IL-6、TNP-α、RANTES、IL-10、IL-12、和IL-1α的产生和/或分泌，测量或检测Toll样受体信号传导的方法。

在又一个特别的实施方式中，本发明提供了根据c-Jun-N-末端激酶和/或细胞外信号相关激酶的信号传导，测量或检测Toll样受体信号传导的方法。

根据本发明，含有Cpn10、Toll样受体和Toll样受体激动剂的分离的分子复合体可用来产生、设计或筛选Cpn10激动剂或拮抗剂。

在一种特别的形式中，分离的分子复合体包括Cpn10、TLR-4和LPS。

仅作为例子，候选激动剂可通过与Toll样受体和Toll样受体激动剂形成分子复合体的能力来鉴别。

仅作为例子，候选拮抗剂可通过防止或破坏含有Cpn10、Toll样受体和Toll样受体激动剂的分子复合体形成的能力来鉴别。

根据前面所述，要理解的是有几种技术可促进根据本发明的Cpn10激动剂和/或拮抗剂的产生。

非限制性的实例包括通过如在Nestler & Liu，1998，Comb.Chem.High Throughput Screen.1 113和Kirkpatrick等人，1999，Comb.Chem.High Throughput Screen 2 211中描述的方法，筛选分子库，例如合成化学物质库，包括组合库。

也要考虑的是天然分子库可通过如在Kolb，1998，Prog.Drug.Res.51 185中综述的方法学进行筛选。

更多构造方法可采用如在本领域中熟知的计算机辅助筛选结构数据库、计算机辅助建模和/或设计、或更多的传统的检测分子结合相互作用的生物物理技术。

计算机辅助结构数据库检索、建模和设计越来越被用作制造激动剂和拮抗剂分子的方法。数据检索方法的实例可见国际申请第WO94/18232号(涉及产生HIV抗原模拟物)、美国专利第5,752,019号和国际申请第WO 97/41526号(涉及鉴定EPO模拟物)，每一篇都在此引入作为参考。

通常，其它可应用的方法包括任何鉴定分子相互作用的各种生物物理技术。在Coligan等人编辑的CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE(John Wiley & Sons，1997)第20章中提供了可应用于潜在可用技术的方法，如竞争放射性配体结合化验、分析性超速离心法、微量量热法、表面等离子共振和以光学生物传感器为基础的方法，该文在此引入作为参考。

为了让本发明更容易被理解并被有效地付诸于实践，为技术人员提供了下面非限制性的实施例。

                       实施例

实施例1-Cpn10对LPS刺激的细胞因子和趋化因子的调节

材料和方法

Cpn10的生产和纯化

重组人Cpn10(GenBank登记号第X75821号)基本上如Ryan等人所述(Ryan等人，1995，J Biol Chem，27022037-22043)在大肠杆菌中产生。另外，不与Macro-Prep High Q(BioRad)结合的物质进一步通过S-Sepharose纯化，然后进行凝胶过滤(Superdex 200，AmershamBiosciences)。纯化的Cpn10在50mM Tris-HCl(pH 7.6)和150mMNaCl缓冲液中，通过具有0.2mm Mustang E膜的Acrodisc根据生产厂商的说明书进行过滤(Pall Corporation，Ann Arbor，MI.Cat No.MSTG5E3)，以去除残余的内毒素，并储存在-70℃。Cpn10的纯度通过SDS-PAGE确定为＞97％。在使用之前将样品解冻。在GroEL介导的硫氰酸生成酶重折叠化验中(Brinker等人，2001，Cell，107 223-233)，所有批次的Cpn10显示了与大肠杆菌GroES相同的摩尔活性(数据未显示)。通过鲎阿米巴样细胞裂解物化验(Bio Whittaker，Walkersville，MD)测定Cpn10的LPS污染为＜1EU/mg纯化Cpn10蛋白。

肿瘤细胞系

K562(人红白血病)、Mono Mac 6(人单核细胞系)、U937(人组织细胞性淋巴瘤)、P815(鼠肥大细胞瘤)、EL4(鼠T细胞淋巴瘤)、Jurkat(人T细胞白血病)、RAW264.7(ATCC TIB 71，鼠巨噬细胞)、L929(鼠纤维肉瘤)、B16(鼠黑素瘤)、HeLa(人宫颈癌)、和MCA-2(鼠纤维肉瘤)细胞系显示为支原体阴性。细胞在含有RPMI 1640(Gibco Labs，Life Technologies，Grand Island，N.Y.，USA)、10％胎牛血清(Life Technologies)、2mM谷氨酰胺(Sigma)、10mM HEPES(Sigma)、100μg/ml链霉素和100IU/mol青霉素(CSL Ltd，Melbourne，Australia)的无内毒素培养基中生长。

RAW264-HIV-LTR-LUC生物化验

RAW264-HIV-LTR-LUC细胞从液氮中复苏后，在25cm³培养瓶(Greiner Labortechnik，Frickenhausen，Germany)中在G418(200μg/ml)存在的情况下培养1周，并生长为悬浮培养物。RAW264-HIV-LTR-LUC细胞通过反复移液而分解，并以2.5×10⁵细胞/孔接种在24-孔板中，并培养过夜(37℃和5％CO₂)。来自大肠杆菌的LPS(Sigma L-6529.Strain055：B5，Sigma)溶解在无菌蒸馏水中，并在4℃以1mg/ml储存在玻璃瓶中。在使用前，取用样品之前立即将溶液剧烈地搅动。在以指定的浓度加入LPS后2小时将Cpn10加入细胞培养物，在2小时后，粘附细胞被处理进行荧光素酶化验(荧光素酶化验系统，Promega，Madison，WI)。荧光素酶活性在Turner Designs Luminometer TD 20/20上读数15秒。

RAW264.7IL-6和RANTES化验

RAW264.7细胞以2.5×10⁵细胞/孔接种在24-孔板中，并在37℃和5％CO₂培养过夜。在将Cpn10或缓冲液以三份加入至细胞中后2小时，加入LPS(1ng/ml)。6小时后，收集上清液三份，并通过DuosetELISA试剂盒(R & D Systems)分析产生的RANTES和IL-6。使用酶标仪(microplate reader，Magellan 3，Sunrise-Tecan，Durham，NC)测定每个样品的光密度(450nm)。

从来源于Cpn10处理动物的脾细胞和巨噬细胞产生的细胞因子

C57BL/6(H-2^b，Ly-5.2⁺)小鼠购自Australian Research Centre(Perth，Western Australia，Australia)，C57BL/6 IL-10^-/-小鼠(H-2^b，Ly-5.2⁺)由Australian National University(Canberra，Australia)提供。整个试验中使用的培养基是10％FCS/IMDM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，添加了50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、0.1mM非必需的氨基酸、0.02mM β-巯基乙醇、和10mMHEPES，细胞在pH 7.75，37℃和5％CO₂下进行培养。C57BL/6小鼠(每组n＝3)每天皮下注射Cpn10(100μg)或稀释液5天，下一日通过腹膜灌洗收获腹膜巨噬细胞，治疗组中的每只动物的细胞集中在一起。在LPS(1μg/ml)存在的情况下，细胞以2×10⁵/孔接种三份。在第5小时收集培养上清液，通过ELISA检测TNF-α的水平(见下)。根据FACS对输入细胞分析的CD11b染色，结果被标准化为每10⁵巨噬细胞的产量。对于IL-10的测定，从相同的动物中收获脾细胞，如上集中细胞，并在缺少(未显示)或存在LPS(10μg/ml)的情况下以5×10⁵/孔培养三份。在48小时收集培养上清液，通过ELISA测定IL-10水平(见下)。

体外用LPS刺激的鼠细胞的细胞因子化验

在TNF-α和IL-10 ELISA化验中使用的单克隆抗体对购自PharMingen(San Diego，CA)，并以生产厂商推荐的浓度使用。上清液以培养基1∶1 IL-10和TNF-α中稀释。通过俘获抗体来俘获细胞因子，通过直接生物素标记的检测抗体检测。然后使用链亲和素标记的辣根过氧化物酶(Kirkegaard and Perry laboratories，Gaithersbuxg，MD)和底物(Sigmafast OPD)来测定固定的生物素。使用Spectraflour Plusmicroplate reader(Tecan)在492nm对滴定板读数。重组细胞因子(PharMingen)用作ELISA化验的标准品。标准品操作两次，对于IL-10和TNF-α化验的敏感度为15pg/ml。

人PBMC TNF-α和IL-6测定

人外周血单核细胞(PBMC)从来自健康志愿者的肝素化血中通过Ficoll-Hypaque浮力密度梯度离心而分离。PBMC以200μl以10⁶活细胞/ml分散在96-孔组织培养板(Greiner)中。然后加入Cpn10，将板培养1小时，紧接着加入LPS，进一步在37℃、5％CO₂下培养20小时，之后收集上清液，分析双份样品中TNF-α和IL-6的产生(DuosetELISA kits；R & D Systems)。这些化验对TNF-α的敏感度为31pg/ml，对IL-6为9pg/ml。

LPS注射后小鼠血清TNF-α、RANTES和IL-10的化验

雌性8-10周龄BALB/c小鼠(Animal Resource Centre，Perth，Australia)置于热灯下大约10分钟，然后将其固定，以规定的剂量静脉注射Cpn10。30分钟后，使用相同的方法静脉注射10μg LPS。注射LPS 1.5小时后，通过心脏穿刺收集血液至1ml促凝管(MiniCollect，Interpath)中，并在4℃储存，以便使用ELISA试剂盒(R & D Systems)分析血清TNF-α和RANTES。使用鼠OptEIA IL-10特异ELISA(BDBiosciences Pharmingen)测定血清中产生的IL-10。

骨髓移植和移植物抗宿主疾病(GVHD)

雌性8-14周龄C57BL/6(B6，H-2^b，Ly-5.2⁺)、B6Ptprc^aLy-5^a(H-2^b，Ly-5.1⁺)和B6D2F1(H-2^b/d，Ly-5.2⁺)小鼠购自Australian Research Centre(Perth，Western Australia，Australia)。移植前，将Cpn10(每只动物100μg)或对照稀释液每天皮下注射给供体和受体动物，注射5天。移植后前两周，小鼠被圈在无菌微隔离笼中，接受酸化高压灭菌水(pH 2.5)和正常饮食。根据以前描述的标准方案对小鼠进行移植(Hill等人，1997，Blood，90 3204-3213；Hill等人，1998，J Clin Invest，102，115-123)。简言之，在第一天，B6D2F1小鼠接受1300cGy的全身照射(¹³⁷Cs源，108cGy/min)，分成两次进行，间隔3小时，以尽量减小胃肠毒性。供体骨髓(5×10⁶)和供体尼龙纤维纯化的脾T细胞(2×10⁶)重新悬浮在0.25ml Leibovitz′s L-15培养基(Gibco BRL，Gaithersburg MD)中，并静脉内注射给每个受体。每天监测生存者，每周测量GVHD临床评分。全身GVHD的程度通过评分系统进行评价，该评分系统综合了5个临床参数的变化：体重下降、体态(躬背)、活动度、皮毛肌理和皮肤完整性(最大指数＝10)(Hill等人，1997，见前；Hill等人，1998，JClin Invest，102 115-123；Cook等人，1996，Blood，88 3230-3239)。每只小鼠进行耳标记，为每个标准从0至2分级，不需要知道其治疗组。根据伦理学指导原则将具有严重临床GVHD(评分＞6)的动物处死，死亡日定为第二天。

统计学分析

使用SPSS Windows11.5.0版(SPSS Inc.)，采用单变量方差分析(ANOVA)、斯氏t检验、或log rank统计进行统计学分析。

结果

使用RA W264-HIV-LTR-LUC指示细胞显示Cpn10对LPS信号传导的抑制作用

为了研究Cpn10作为免疫抑制剂的作用，研究了Cpn10对LPS介导的NF-κB活化的抑制能力。RAW264-HIV-LTR-LUC细胞是鼠巨噬细胞系(RAW264.7)，可以稳定地表达荧光素酶报告基因和HIV长末端重复启动子，对于NF-κB刺激具有高度和迅速的反应性。这些细胞对细菌LPS刺激的巨噬细胞中的TLR4信号传导通路的分析提供敏感的生物化验(Sweet & Hume，1995，J Inflamm，45 126-135)。为了避免使用超过生理水平的LPS，确立了LPS浓度的滴定范围，代表大约最大LPS刺激荧光素酶活性的80％、50％和20％(分别为5、1和0.2ng)(数据未显示)。在这些浓度的LPS下，报告细胞与100μg/ml Cpn10预培养2小时能够显著地抑制LPS刺激的荧光素酶活性达30-50％(图1A)。较短的预培养时间提供较小的可重复的抑制作用，预培养时间超过18小时则无抑制作用(数据未显示)。

在LPS刺激的RAW264.7细胞中，Cpn10介导的对IL-6和RANTES产生的抑制作用

为了说明Cpn10介导的、对LPS诱导的NF-κB活化的抑制作用转变为促炎介质分泌的减少，研究了Cpn10对LPS诱导的促炎细胞因子IL-6和促炎趋化因子RANTES产生的抑制能力。使用LPS的剂量为1ng，在本测定中可诱导大约50％的最大RANTES产生量(数据未显示)。在这些化验中，2小时预培养时间(类似于上面使用的时间)不能诱导耐受性，不管使用多大的LPS剂量(数据未显示)。Cpn10介导的、对LPS诱导的RANTES(图1B)和IL-6(图1C)分泌的剂量相关性减少作用，表明在该系统中对NF-κB活化的抑制作用导致了促炎介质分泌的减少。

Cpn10介导的、对LPS诱导的TNF-α的抑制作用不依赖IL-10

为了确定Cpn10在更多的生理细胞群中的作用，小鼠用Cpn10处理，移除其腹膜巨噬细胞并在体外用LPS刺激。Cpn10的处理显著地减少了LPS诱导的这些细胞TNF-α的分泌(图2A)，表明Cpn10介导的对体内处理的巨噬细胞的效果与体外处理的RAW264.7细胞相似。

IL-10是潜在的免疫抑制性细胞因子，能够抑制TLR4的信号传导(Berlato等人，2002，J Immunol，168 6404-6411；Suhrbier & Linn，2003，Trends Immunol，24165-168)，当来自Cpn10处理动物的脾细胞用LPS刺激时，与对照动物相比，观察到IL-10的产生显著地增加(图2B)。但Cpn10介导的、由LPS诱导的TNF-α产生的减少(图2A)并不需要IL-10，因为当来自Cpn10处理的IL-10^-/-小鼠的腹膜巨噬细胞在体外用LPS刺激时，观察到相似的TNF-α分泌的减少(图2C)。因此，TNF-α分泌的减少和IL-10产生的增加似乎不依赖于Cpn10的处理。

Cpn10处理人外周血单核细胞(PBMC)

为了确定Cpn10在原代人细胞上是否也有活性，来自健康供体的PBMC用Cpn10或缓冲液预处理1小时，然后用0.04ng/ml LPS刺激20小时。该剂量的LPS被确定为确实能够刺激显著的TNF-α分泌的最低剂量(Johnson等人，2004，J Biol Chem，印刷中)，对应于人的剂量可产生类似于临床败血症的轻微的暂时综合征(Granowitz等人，1993，J Immunol，151 1637-1645；Lynn等人，2003，J Infect Dis，187 631-639)。在来自8个供体的PBMC中，1μg/ml Cpn10可介导减少平均23.7％，10μg/ml介导减少平均23.3％LPS-诱导的TNF-α分泌(图3A)，表明Cpn10也可减少PBMC中LPS诱导的TNF-α分泌。当使用0.1μg/mlCpn10时，没有观察到TNF-α分泌有显著的减少(数据未显示)。为了说明耐受性诱导在此系统中没有发生作用，PBMC用一定浓度范围的LPS预处理，1小时后用0.04ng/ml LPS刺激20小时。LPS预处理1小时并不抑制第二次LPS处理刺激的TNF-α分泌(图3B)，表明LPS的耐受性对Cpn10的活性不起作用。

IL-6是另一种已知的由LPS诱导的炎性细胞因子。为了确定Cpn10是否可抑制LPS诱导的IL-6分泌，来自8个供体的PBMC用1或10μg/ml Cpn10或缓冲液处理1小时，然后用0.04ng/ml LPS刺激20小时。观察到1或10μg/ml Cpn10分别可对LPS诱导的IL-6分泌产生平均18.6和24.4％的减少(图3C)。当使用0.1μg/ml Cpn10时，观察到IL-6的分泌没有显著的减少(数据未显示)。LPS预处理1小时不能抑制第二次LPS处理刺激的IL-6分泌，再次说明耐受性诱导在此系统中不发挥作用(图3D)。

Cpn10处理抑制体内LPS诱导的TNF-α分泌

使用修改的内毒素血症模型确定Cpn10在体内的递送是否能够抑制体内LPS诱导的TNF-α分泌。BALB/c小鼠在静脉注射10μg LPS之前30分钟静脉给予100μg Cpn10，1.5小时后取血。在几个重复的实验中，Cpn10的处理引起血清TNF-α平均47.6％的减少，血清RANTES平均40.1％的减少，血清IL-10水平平均43.3％的增加(图4A)。每天给予Cpn10预处理5天不能显著地提高TNF-α的这种抑制水平(数据未显示)。这些数据与以前的组织培养试验是一致的，并说明了在LPS激发后，体内Cpn10减少TNF-α的功效和增加IL-6的产生。

Cpn10缓解移植物抗宿主疾病(GVHD)的急性症状

异源骨髓移植(BMT)后的急性GVHD是T细胞介导的疾病，其中供体T细胞识别受体的同种异体抗原，以Th1显性的方式进行分化。当得到的T细胞来源的Th1细胞因子(主要是IFN-γ)被通过辐射损伤的胃肠粘膜漏出的LPS刺激时，使供体单核细胞接触抗原以释放致细胞病变量的炎性细胞因子(例如，TNF-α)。然后这些细胞因子和同种异体的反应性T细胞会增加胃肠损伤和LPS的漏出。如果供体单核细胞缺少TLR4，LPS被(治疗拮抗剂)有效阻断(Cooke等人，2001，J Clin Invest，107 1581-1589)，或TNF-α本身被中和，就能防止BMT模型中的GVHD死亡率。因此对围移植(peri-transplant)期中Cpn10给药改善GVHD的能力进行了研究。在移植前对移植供体和受体的Cpn10处理显著地降低GVHD死亡率(图4B)。另外，根据临床评分的测定，在BMT后早期GVHD的严重性也降低了(图4B)。尽管Cpn10能够延缓GVHD并降低早期死亡率，但最终动物仍然死于GVHD，这个结果与Cpn10不能消除TNF-α分泌或影响T细胞增殖和IFNγ分泌的结果是一致的(数据未显示)。在移植后用Cpn10处理的动物不能明显地影响GVHD(数据未显示)。

讨论

根据使用的系统以及LPS和Cpn10的剂量，Cpn10可介导对TNF-α分泌23-56％的抑制作用。根据该系统，Cpn10可增加LPS诱导的IL-10分泌大约40-200％，但对TNF-α分泌的抑制作用不依赖于IL-10产生的增加。

由于来源于大肠杆菌的LPS是公知的TLR4的激动剂，实验表明Cpn10通过NF-κB通路调节TLR4的信号传导。但Cpn10可能通过由TLR4和TLR2复合体刺激的其他通路来调节细胞因子的分泌。

Cpn10的抑制效应介导非常迅速，在30分钟(图4A)至2小时(图1A)内。这暗示抑制了早期的信号传导情况或活化了迅速负反馈机制，例如PI3K，而不是涉及IRAK或SOCS的晚期反馈机制(Fukao& Koyasu，2003，Trends Immunol，24358-363)。

特异的PI3K抑制剂渥曼青霉素，对Cpn10活性的作用没有检测到(数据未显示)，表明Cpn10不影响PI3K通路。

实施例2-Cpn10和TLR2

材料和方法

BALB/c小鼠皮下注射在CFA(Sigma)中乳化的卵清蛋白(10μg)(Sigma)。CFA含有分枝杆菌细胞壁提取物，被认为含有TLR2的脂肽激动剂(Lim等人，2003，Int Immunopharmacol，3 115-118；Tsuji等人，2000，Infect Immun；68 6883-6890；Kirschning & Schumann，2002，CurrTop Microbiol Immunol，270 121-44)。CFA已知可诱导肉芽肿(Bergeron等人，2001，Eur Respir J，18 357-361；Shah等人，2001，J AssocPhysicians India，49 366-368)。

Cpn10(100μg)每天施用两次，给药5天，之前注射两次CFA。在规定的时间测量皮下的肉芽肿。

结果

为了确定Cpn10是否能够影响CFA的肉芽肿形成活性，对Cpn10处理和缓冲液对照处理的小鼠注射CFA。Cpn10的处理显著地减小诱导产生的肉芽肿的大小(图5A)。

结论

由于CFA刺激TLR2，并且CFA诱导肉芽肿形成，Cpn10处理所介导的肉芽肿形成的减少提供了Cpn10也可抑制TLR2信号传导的证据。

实施例3-Cpn10通过TLR2激动剂PAM₃CYS-SK₄抑制NF-κR的活化

PAM3CysSK₄(脂肽)是已知的TLR2激动剂(Agrawal等人，JImmunol，2003，171 4984-9)，能够刺激HIV LTR(图5B-D)，其被认为可活化转录因子，例如NF-κB(Lee等人，J Immunol，2002，1684012-4017)。

材料和方法

PAM₃CysSK₄购自EMC Microcollection GmbH，并溶解在水中作为1mg/ml的日常储存稀释液。如前所述对LPS实施Cpn10和RAW264-HIV-LTR-LUC化验系统。简言之，RAW-LUG细胞以2.5×10⁵细胞/ml接种在24孔板中，并在37℃培养过夜。Cpn10以120μg/ml加入至细胞中，并在37℃培养2小时。然后在荧光素酶化验之前加入PAM₃Cys-SK₄(10ng/ml或2ng/ml或0ng/m1)2小时。1ng/ml或0.2ng/ml的LPS用作阳性对照。

结果

Cpn10通过TLR2激动剂PAM3CysSK₄抑制HIV LTR的活化(图5B)。不管在加入Cpn10之前(图5C)或加入PAM3CysSK₄之前(图5D)是否更换培养基，这种抑制作用都会维持。

结论

Cpn10能够抑制由TLR2激动剂刺激的巨噬细胞中促炎介质的活化信号。

实施例4-在配基存在的条件下，Cpn10与Toll样受体的免疫沉淀材料和方法

免疫沉淀

在来自分泌细胞的条件培养基(10ml/点)中，TLR4以TLR4细胞外结构域(ECD)与鼠Fc重链的融合物(T4:Fc)的形式提供。使用20μl蛋白A充填珠(PAS，CL4B，Sigma)，通过离心收集T4:Fc，在用SDS-PAGE分离之前沉淀团(pellet)用溶解缓冲液冲洗3次。蛋白质被电转移至Hybond-C硝酸纤维素膜上。膜在含5％奶粉的PBS和0.1％Tween 20中于37℃阻断(block)30分钟，用HRP交联的抗鼠抗体在37℃另外进行检测30分钟(Visintin等人，2003，J.Biol.Chem.278 48313-48320)。

为了结合，1μg杆状病毒MD-2或10μg Cpn10加入至T4:Fc/PAS混合物中，并在4℃培养过夜。TLR2用作对照诱饵(bait)。另外，10μg Cpn10使用2μg抗Cpn10多克隆抗体进行免疫沉淀。不向IP中加入Cpn10作为对照(以检测抗体的非特异本底条带)。MD-2(1μg)和Cpn10(10μg)均置于泳道中以显示负载总量(INPUT)。

结果

进行共免疫沉淀实验以确定重组的Cpn10是否与重组TLR2或TLR4:Fc融合蛋白直接相互作用。重组的MD-2用作对照(与TLR4相互作用但不与TLR2相互作用)。

图6(上面的图)证明了MD-2可与TLR4(但不与TLR2)共免疫沉淀。图6下面的图显示了在缺少配基的情况下，Cpn10实际上不与TLR4或TLR2相互作用。

实施例5-在配基存在的情况下，Cpn10与Toll样受体相互作用的FRET分析

介绍

细胞的质膜由侧面异质物(lateral heterogeneity)、斑块(patch)和微域组成。这些膜微域或脂筏富含鞘糖脂和胆固醇，参与膜分选和信号转导之类的细胞过程。在固有免疫识别细菌中脂筏形成的重要性已经使用生物化学和荧光显像技术进行了研究。发现参与LPS-细胞活化的受体分子，包括CD 14、Hsp70、Hsp90、趋化因子受体4(CXCR4)、生长分化因子5(GDF5)和TLR4，在LPS刺激后存在于微域中。脂筏的完整性对于LPS-细胞活化是重要的，因为如制霉菌素或MCD之类的脂筏破坏药物抑制LPS诱导的TNF-α分泌。这些结果表明整个细菌识别系统是基于细菌成分与CD14的结合，以及如Hsp70、Hsp90、CXCR4、GDF5和TLR4之类的多种信号分子在脂筏内CD14-LPS结合处的募集(Triantafilou等人，2002，J Cell Sci 115 2603)。

在体内和体外，剂量依赖的Cpn10降低LPS对人和鼠细胞刺激的信号强度。因此认为在LPS信号聚簇的过程中，Cpn10可通过直接与TLR4或与聚簇的其他成员之一结合，集中在脂筏上以破坏信号传导。

在此提到的结果表示的是使用Cpn10和兔多克隆抗Cpn10抗体从FRET化验获得的数据。

材料和方法

FRET测量

荧光共振能量转移(FRET)是非侵入性的显像技术，用于确定分子接近度。FRET可在1-10nm的距离上发生，并可有效增加光学显微镜对分子水平的分辨率。它涉及能量从供体分子的激发态非辐射性地转移至合适的受体上。能量转移的速率与供体和受体之间距离的6次幂成反比。

在该FRET研究中，样品用供体和接受体联合抗体进行标记，在受体分子完全光致退色后供体荧光的增加(脱淬灭)检测为能量转移。在受体光致退色后从供体荧光的增加计算FRET的影像。在此，FRET用来确定在脂筏中参与LPS诱导的细胞活化(MonoMac6细胞)的受体分子浓度。

结果

通过进行FRET实验，有可能研究Cpn10是否与脂筏共同定位(co-localising)。FRET测量的是在受体荧光基团被完全光致退色后脱淬灭的供体荧光。在破坏受体后供体荧光的增加表明由于能量转移，供体荧光在受体的存在下被淬灭了。

通过使用阳性对照，即单克隆抗体与GM1(神经节苷脂，脂筏关联分子)分子上不同表位之间的能量转移，检测能量转移效率，显示最大的能量转移效率(E％)是37±1.0。

也可使用FITC-GM1和罗丹明-MHC之间的阴性对照，它显示没有明显的能量转移(3±0.4)。这个本底FRET值被认为是由于两种物质以高浓度存在而随机FRET所产生的。

表1中显示的数据证明了CD14位于脂筏中，如最近发表的一篇文章所述(Triantafilou等人，J Cell Science 2002，见前)，但在LPS刺激前没有发现TLR4和Cpn10与脂筏有关系，很显然是在LPS刺激后被募集至该处的。

表2中的数据描述了再次使用FRET得到的Cpn10至TLR4聚簇的接近度。在表2中，阳性对照是TLR4本身，得到36±2.0的最大能量转移效率(E％)。

如表2中所示，在缺少LPS时，Cpn10与Hsp70、Hsp90或CXCR4无关，但证明在LPS刺激后与这些LPS活化聚簇成员有关联。同时证明在LPS刺激之前Cpn10与TLR4是否有关联的数据在此没有显示，在LPS刺激过程中Cpn10与TLR4有强烈的关联性。

实施例6-Cpn10和恶病质

材料和方法

佐剂诱发恶病质的诱导

本研究的目的是确定在佐剂关节炎发展过程中，给予大鼠Cpn10是否会对体重下降有所减轻。雌性Dark Agouti大鼠(n＝30，150-160g)在尾根部皮下注射0.1ml CFA。佐剂由弗氏不完全佐剂(Difco，Michigan，USA)组成，其中加入了10mg/ml加热灭活的结核分支杆菌H37RA(Difco)。在此模型中可检测到的关节炎疾病的发病通常在CFA注射后8-10天。

Cpn10的处理

从-2天至第13天，大鼠每天皮下注射0.25mg/kg(n-10)或2.5mg/kg Cpn10(n＝10)或稀释液对照(Tris/盐水缓冲液)(n＝10)，并每天称重。

统计学分析

观察接受Cpn10或稀释液对照的大鼠体重的差异，使用单变量方差分析(ANOVA)检验显著性。

结果

给予CFA后所有组中都有体重的净损失，似乎对照组更明显一些(图7)。

当0.25和2.5mg/kg Cpn10处理组的体重下降的数据集中起来，并于对照组相比较时，在体重下降方面有统计学上的显著性差异(p＝0.027)。在本例中将两个处理组数据集中进行判断的原因是，两组在该时间周期内的体重下降值相似(p＝0.94)。

结论

佐剂关节炎可引起机体组成和细胞因子的产生发生变化，模拟了慢性炎症性关节炎中促炎细胞因子引发的恶病质(Mayer，1997，Arthritis Rheum，40534-539)。体内或体外给予Cpn10减少由LPS和其他激动剂刺激的细胞产生的促炎细胞因子。

给大鼠两次用药以检测Cpn10的作用，其中该大鼠被单次注射CFA试验性地诱发恶病质。经皮下对相似体重和年龄的动物施予稀释液对照和Cpn10。CFA的给药引起体重明显地下降。通过对比Cpn10处理组和对照处理组，Cpn10处理大鼠体重下降的减轻有统计学的显著性。

包括TNF-α、IL-1β和IL-6的炎性细胞因子的水平升高，已知与许多疾病的恶病质有关，包括癌症和类风湿性关节炎(Argiles，2003.CurrOpin Clin Nutr Metab Care，6 401-406；Walsmith，2002，Int J Cardiol，8589-99)。我们已经显示了在内毒素血症和移植物抗宿主疾病的鼠模型、以及新分离的PBMC和单核细胞系的体外LPS刺激中，给予Cpn10可减少TNF-α、IL-6和RANTES的产生，并增加抗炎细胞因子IL-10的产生。

实施例7-Cpn10不诱导耐受性

材料和方法

RAW264-HIV-LTR-LUC生物化验

培养RAW264-HIV-LTR-LUC细胞，如上种入板中进行化验。细胞用LPS、Cpn10或对照缓冲液培养2小时，然后加入指定浓度的刺激性LPS。继续培养2小时后，处理粘附细胞进行荧光素酶化验(LuciferaseAssay System，Promega，Madison，WI)。荧光素酶的活性在TurnerDesigns Luminometer TD 20/20上读取15秒。

Cpn10的产生和纯化

如上生产和纯化重组人Cpn10。

胰蛋白酶处理Cpn10

如上通过Acrodisc过滤2.5％胰蛋白酶(Gibco)两次，并以40μg/ml加入至Cpn10(2-3mg/ml)中。在37℃培养过夜后，在加入生物化验之前，胰蛋白酶/Cpn10溶液加热至90℃15分钟以破坏胰蛋白酶活性。胰蛋白酶处理后，SDS-PAGE和Western印迹检测不到Cpn10，在硫氰酸生成酶重折叠化验中原料是无活性的(数据未显示)。

统计学分析

采用SPSS Windows11.5.0版(SPSS Inc.)进行统计学分析(单变量方差分析-ANOVA，斯氏t检验或log rank统计)。

结果

RAW264-HIV-LTR-LUC细胞中抑制LPS信号传导不是由于耐受性的诱导引起的

LPS的耐受是公知的现象，由此对LPS第二次刺激的反应减弱。如果两次LPS接触的时间间隔超过3小时，且在初次接触过程中LPS的浓度足够高以刺激巨噬细胞，通常可诱导对LPS的耐受。(West &Heagy，2002，Crit Care Med 30 S64-S73；Fujihara等人，2003，Pharmacol.Ther.100 171-194)。

为了形式上减低造成图1A中观察到的现象的耐受性诱导，RAW264-HIV-LTR-LUC细胞用一定浓度范围的LPS预处理2小时，然后用5、1和0.2ng/ml LPS刺激。用1至0.0005ng/ml浓度范围的LPS预处理并不抑制第二次LPS接触所诱导的LUC活性(图8A)。因此对于RAW264-HIV-LTR-LUC系统，2小时的预处理时间似乎不足以诱导耐受性。而且，亚刺激剂量(0.005-0.0005ng/ml)，可能类似于Cpn10制剂，也不能抑制LPS介导的LUC活性。因此LPS的耐受不可能是造成图1A中观察结果的原因，因为(i)LPS两次接触之间的2小时间隔不足以在RAW-264-HIV-LTR-LUC系统中引起LPS耐受性诱导，并且(ii)有可能污染Cpn10制剂的检测不到(或亚刺激水平)的LPS，不能介导LPS的耐受。

Cpn10对胰蛋白酶消化是敏感的

为了说明Cpn10的抑制性活性(图1A)在蛋白水解降解后丧失，用胰蛋白酶消化Cpn10，在加入至生物化验前通过加热破坏胰蛋白酶活性。通过SDS-PAGE/Western印迹和硫氰酸生成酶重折叠化验证实Cpn10被胰蛋白酶破坏(数据未显示)。(单独加热不会显著地影响LUC或硫氰酸生成酶重折叠化验中的Cpn10活性-数据未显示)。再次用Cpn10预处理显著地抑制LPS介导的荧光素酶活性(图8B，对照与Hsp10相比p＜0.001，见数字图例)。但胰蛋白酶/热处理的Cpn10不能抑制LPS的信号传导(图8B，胰蛋白酶Hsp10)，得到的数值类似于胰蛋白酶/热处理的缓冲液对照(图8B，胰蛋白酶缓冲液)。正如所预料的，胰蛋白酶的处理(然后在90℃加热15分钟)不会显著地影响大肠杆菌LPS的活性(图8B，胰蛋白酶LPS)。因此，Cpn10的蛋白水解降解导致了Cpn10制剂的抑制活性的丧失，表明Cpn10制剂的抗胰蛋白酶的污染物(例如，LPS)与抑制活性无关。

RAW264-HIV-LTR-LUC细胞中由Cpn10介导的、LPS刺激的LUC活性的降低是剂量反应性的

在图1A中显示的LUC活性降低的百分比是使用100μg/ml Cpn10获得的。为了确定Cpn10的活性是否是剂量反应性的，在加入LPS之前，RAW264-HIV-LTR-LUC细胞用一定浓度范围的Cpn10处理。(因此用100μg/ml处理表示重复图1A中所示的实验)。出现了很明确的剂量反应性，Cpn10从2至100μg抑制水平明显增加，在100μg/ml之后抑制水平持平(图8C)。

实施例8-Cpn10在人临床试验受试者中的作用

Ia期临床试验

材料和方法

19名年龄在18至55岁之间的健康正常志愿者入选Cpn10的14天I期实验，以评价Cpn10在双盲安慰剂对照方案中单次静脉输注或皮下注射给药的药代动力学和安全性。在筛选和填写知情同意书后，受试者禁食过夜，然后以1、2.5、5或10mg Cpn10静脉输注10分钟而给药，或以5mg皮下给药。在给药前(大约用药前12小时)、给药后8小时、和Cpn10用药后第6天收集用于分离PBMC的血样(50ml)。治疗后监测受试者14天的不良反应情况，以一定的间隔采血进行标准血液学和生化评价，以及检测抗Cpn10抗体的发展。

PBMC的分离和储存

通过在Ficoll-Hypaque Plus(Amersham)上使用生产厂商的方法进行密度梯度离心，从肝素化血中分离PBMC。两次冲洗步骤后，细胞重悬浮在冷冻培养基中(含有10％DMSO的胎牛血清[FBS])，并使用逐级下降冷冻法冻结在-70℃。细胞通过干冰运输，然后储存在液氮中备用。

PBMC刺激

将PBMC解冻，经FBS离心，然后冲洗并重新悬浮在含有10％FBS的RPMI中。细胞以1×10⁶活细胞/ml的终密度等分在含有或不含有LPS的24孔组织培养板中。在37℃，5％CO₂下培养20小时后，收集细胞培养上清液，并使用市售的人TNF-αELISA(R&D Systems)检测TNF-α的水平。

结果

我们在给予1mg(n＝1)、2.5mg(n＝3)、5mg(n＝3)、和10mg Cpn10(n＝3)或安慰剂(n＝3)的志愿者组别中，比较了在第1天和第0天(即，Cpn10给药后与Cpn10给药前相比)LPS驱动的反应。(注：来自受试者001和004(1mg Cpn10组)的PBMC由于血样溶血作用而没有活力。因此，来自此组PBMC的数据仅包括一名受试者)。图9A和9B证明了通过体外用一定浓度范围的LPS刺激PBMC，使Cpn10介导的TNF-α产生发生变化是剂量反应性的。即，在2.5mg组中3名受试者中的1个、5mg组中3名受试者中的3个、以及10mg组中3名受试者中的1个，其第1天相对第0天LPS驱动的反应是降低的。虽然由于组规模很小缺乏决定性，但当剂量增加至10mg时，数据似乎表明在5mg组可见轻微的逆转趋势。在经皮下注射给予5mg Cpn10的受试者中，对TNF-α的产生似乎没有Cpn10介导的效果(图9C)，但组规模仍太小不能提供结论性的数据。

结论

作为临床I期试验中Cpn10介导的免疫活性改变的指示物，我们在单次静脉输注或皮下注射Cpn10(或安慰剂)之前大约12小时、之后8小时收集外周血单核细胞(PBMC)。在缺少外源Cpn10的情况下，这些细胞用一定浓度范围的LPS刺激以评价TNF-α产生的水平。数据表明当以2.5至10mg范围的剂量给药时，Cpn10有降低促炎反应的作用。但本研究中的组非常小，将会积累更多的数据来支持关于Cpn10体内生物学作用的假设。尽管组规模太小，除了推测外不能对这些数据进行任何分析，但来自10mg剂量组的数据似乎与给予2.5和5mgCpn10组的TNF-α反应趋势不一致。

从皮下给予5mg Cpn10的受试者中分离的PBMC进行的该体外化验中没有作用，其最可能与通过ELISA在循环中可检测到(因此是生物可利用的)的蛋白的量相对较小有关。

我们注意到在一个时间点(用药后8小时)分离的PBMC，此时我们在血清中不再能够测量到Cpn10(数据未显示)，这支持如下观点，即该重组蛋白的t1/2很短(～1小时)，其生物学作用可能持续较长时间。也要指出的一个很重要的方面是，第1天与第0天(例如，在给予安慰剂的受试者中)相比LPS反应的变化(即，增加)在啮齿动物和人类中都是被大量文献证明的现象，被认为涉及应激反应(Granowitz等人，1993.J Immunol 151 1637)。也就是说，与第0天相比，在第1天PBMC的LPS驱动反应增强可能是由于试验的应激造成的，即给予未检验的药物、多次抽血等。Cpn10(应激蛋白组中的一员)可参与减轻炎性反应中与应激相关的加剧。

Ib期临床试验

材料和方法

10名年龄在18至65岁之间、目前没有接受过免疫调节治疗的患有多发性硬化症的志愿者入选28天的Ib期试验，以评价Cpn10多次静脉输注给药的安全性、耐受性和药代动力学。这是安慰剂作对照的、双盲多次剂量递增研究。类似于Ia期的设计，受试者以5或10mg的Cpn10(或安慰剂)静脉输注给药。在第1天和第5天大约用药前12小时和用药后8小时收集进行PBMC分离的血样。为了评价Cpn10生物效果的持续时间，在最后一次输注化合物(第5天)后3和7天抽血进行PBMC分离。

如Ia期临床试验中所述分离、储存和刺激PBMC。

结果

我们对给予5天，每天静脉输注2.5(n＝4)或5mg Cpn10(n＝4)或安慰剂(n＝2)的几组志愿者在第1、4、5、8和12天的LPS驱动反应与第0天进行比较(即，Cpn10使用后与Cpn10使用前比较)。图10证明了Cpn10介导的、由LPS体外刺激PBMC产生的TNF-α发生变化是剂量反应性的。要注意数据描述为在D1相对于D0、以及D4相对于D0等，响应LPS刺激所产生的TNF-α的百分比差异。也就是说，在5mg Cpn10处理组中，所有4个受试者在D1相对于D0由LPS驱动的反应减少了38-94％。在此组中对比D4与D0的TNF-α数值，TNF-α产生减少的百分比为36-72％，当比较D5与D0的TNF-α的产生时，减少百分比为38-59％。在“用药期间”，即试验中第1、4和5天，在2.5mg Cpn10处理组中任何时间点上LPS刺激的TNF-α均没有减少。

结论

在患有多发性硬化症的志愿者的Ib期临床试验中，作为Cpn10介导的免疫活性改变的指示物，我们在5天每天输注方案的第1、4和5天在静脉输注Cpn10(或安慰剂)之前大约12小时、和之后大约8小时，收集外周血单核细胞(PBMC)。另外，在最后一次输注Cpn10后3天和7天分离PBMC。在缺少外源Cpn10的情况下，这些细胞用LPS体外刺激以评价TNF-α产生的水平。数据表明当以5mg/天给药时，Cpn10可能有降低促炎反应的效果。即，在给予5mg/天Cpn10的组B中的四个受试者中，LPS刺激的TNF-α在第1、4和5天显著地降低。相反，在给予2.5mg/天Cpn10的受试者中，在“用药期间”，即第1、4和5天，LPS诱导的TNF-α产生没有明显地减少。在来自用安慰剂(Cpn10载体)输注的两个受试者的细胞中，LPS刺激的TNF-α的产生也没有减少。但本研究中的两个组非常小，将会积累更多的数据来支持关于Cpn10体内生物效果的假设。

如在Ia期试验中一样，我们注意到在一个时间点(用药后8小时)分离的PBMC，此时我们在血清中不再测量到Cpn10，这支持如下观点，即该重组蛋白的t1/2很短(～1小时)，其生物效果可能持续较长时间。但从这些很少的数据点不可能得到结论认为Cpn10对炎性细胞因子产生的长期效果可持续超过12小时。

如在Ia期试验中也注意到的，同样要指出一个重要的方面，即第1天与第0天(例如，在使用安慰剂的受试者中)相比LPS反应的变化(即，增加)在啮齿动物和人类中是被大量文献证明的现象，被认为与应激反应有关(Granowitz等人，1993，见前)。

在第8天和12天从安慰剂受试者以及一些给予Cpn10的受试者中分离的细胞产生的TNF-α，可能与如下事实有关，即在这些时间点上，受试者是门诊患者，因此他们可能已经不太紧张或处于应激状态。如以前所提出的，Cpn10(应激蛋白组成员之一)可参与减轻炎性反应中与应激相关的加剧。

总结

除了在线粒体内蛋白折叠中有重要作用，Cpn10似乎在特异性炎症过程的调节中具有细胞外作用。在许多不同的人和鼠体外系统和两种鼠疾病模型中，Cpn10均可抑制LPS诱导的促炎细胞因子TNF-α和IL-6和/或促炎趋化因子RANTES的分泌，并增加LPS诱导的抗炎细胞因子IL-10的分泌。Cpn10介导的TNF-α分泌的减少不是完全的；根据系统和LPS和Cpn10的剂量，Cpn10介导的TNF-α水平的减少大约为25-60％。根据系统，Cpn10可增加LPS诱导的IL-10分泌大约40-200％，但TNF-α分泌的减少并不依赖于这种IL-10的升高。

假定大肠杆菌来源的LPS是公知的TLR4激动剂，在此所述的实验表明Cpn10可下调TLR4的信号传导。Cpn10到底怎样介导其抑制活性尚不清楚，尽管似乎它发挥抑制作用非常快，在30分钟(图4A)至2小时(图1A)内。这可能暗示了早期信号传导的抑制或例如磷酸肌醇3-激酶(PI3K)之类的快速负反馈机制的活化。但我们使用特异的PI3K抑制剂渥曼青霉素不能阻断Cpn10活性，表明该通路不参与Cpn10的作用机制。

减少但不完全遏制TNF-α分泌的能力，使Cpn10区别于其他的抗炎治疗，特别是基于抗TNF-α抗体的方法，后者可实现有效地清除TNF-α。但，这样的清除可能不是经常需要的。例如，TNF-α抗体治疗已经显示最终会增加多发性硬化症的严重性(MS；Wiendl & Hohlfeld，2002，BioDrugs 16，183-200)。MS已经提出Cpn10可能作为治疗的靶标，因为据报道在MS的鼠模型中，Cpn10可减少临床症状和延缓疾病的发作(试验性自体免疫性脑脊髓炎；Zhang等人，2003，J Neurol Sci212，37-46)。

如在此所述，Cpn10减少炎症介质表达的能力表明在LPS、TLR4、和/或TLR2信号传导过度引起病状的情况下，可能发现Cpn10的治疗性应用。

而且，这种作用模式不是通过耐受性诱导或Th1/Th2反应的优先活化/遏制。

整个本说明书的目的是描述本发明的优选实施方案，而不限制本发明于任何一项实施方式或特定的特征集合。因此，本领域技术人员要理解的是，就本公开而言，对于示例性的特别实施方式能够做出各种修改和变化而不背离本发明的范围。

所有在此提到的计算机程序、算法、专利和科学文献在此引入作为参考。

表1.在供体-受体对之间的能量转移效率值

供体(Cy3)	受体(Cy5)	E±ΔE(％)
			未刺激的MM6细胞
GM1	GM1	37±1.0
			GM1	MHC I类	3±0.4
GM1	CD14	34±2.0
			GM1	TLR4	5±1.5
GM1	Cpn10	15±2.0
			用LPS刺激的MM6细胞
GM1	MHC I类	3±0.5
			GM1	CD14	35±1.5
GM1	TLR4	32±1.8
			GM1	Cpn10	28±2.0

在受体光致退色后，从供体荧光的增加检测不同配对之间的能量转移。数据表示为多个独立试验的平均±标准差。

表2.供体-受体对之间的能量转移效率值

供体(Cy3)	受体(Cy5)	E±ΔE(％)
			未刺激的MM6细胞
TLR4	TLR4	36±2.0
			Cpn10	CD14	12±0.5
Cpn10	Hsp70	9±1.0
			Cpn10	Hsp90	6±2.0
Cpn10	CXCR4	3±1.0
			用LPS刺激的MM6细胞
Cpn10	TLR4	36
			Cpn10	CD14	32±0.5
Cpn10	Hsp70	24±1.0
			Cpn10	Hsp90	18±12.0
Cpn10	CXCR4	12±1.0

在受体光致退色后，从供体荧光的增加检测不同配对之间的能量转移。数据表示为多个独立试验的平均±标准差。

Claims (39)

1.一种调节动物、或来源于其中的一种或多种细胞、或组织或器官中的Toll样受体信号传导的方法，包括对动物、细胞、组织或器官施用Cpn10从而调节激动剂诱导的Toll样受体信号传导的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的Toll样受体选自TLR2和TLR4。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述的激动剂是病原体，或来自病原体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的激动剂选自LPS或脂肽。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的动物是哺乳动物。

6.根据权利要求6所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

7.一种调节动物、或来源于其中的一种或多种细胞、或组织或器官中的免疫调节剂分泌的方法，包括对动物、细胞、组织或器官施用Cpn10或Cpn10衍生物从而调节Toll样受体激动剂诱导的免疫调节剂的产生和/或分泌的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述的Toll样受体选自TLR2和TLR4。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述的激动剂是病原体，或来源于病原体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述的激动剂选自LPS或脂肽。

11.根据权利要求7所述的方法，其中所述的免疫调节剂的产生和/或分泌由Cpn10负性调节。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的免疫调节剂是促炎细胞因子或趋化因子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述的促炎细胞因子是IL-6或TNFα。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述的促炎趋化因子是RANTES。

15.根据权利要求7所述的方法，其中所述的免疫调节剂的产生和/或分泌由Cpn10正性调节。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述的免疫调节剂是抗炎细胞因子或趋化因子。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述的抗炎细胞因子是IL-10或TGF-β。

18.根据权利要求7所述的方法，其中所述的动物是哺乳动物。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

20.一种预防性或治疗性地治疗动物对Toll样受体信号传导的调节有反应性的疾病、紊乱或病症的方法，所述的方法包括对所述动物施用Cpn10从而调节所述动物中激动剂诱导的Toll样受体信号传导的步骤。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的疾病、紊乱或病症选自急性或慢性炎性疾病，如败血性休克、炎性肠病、关节炎、银屑病、心脏病、动脉粥样硬化、慢性肺病、恶病质、多发性硬化症、GVHD、移植和癌症。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述的激动剂是病原体，或来源于病原体。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述的动物是哺乳动物。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

25.一种预防性或治疗性地治疗动物对Toll样受体诱导的免疫抑制剂的产生和/或分泌的调节有反应性的疾病、紊乱或病症的方法，所述的方法包括对所述动物施用Cpn10从而调节所述动物中Toll样受体激动剂诱导的免疫抑制剂的产生和/或分泌的步骤。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述的疾病、紊乱或病症选自急性或慢性炎性疾病，如败血性休克、炎性肠病、关节炎、银屑病、心脏病、动脉粥样硬化、慢性肺病、恶病质、多发性硬化症、GVHD、移植和癌症。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述的激动剂是病原体，或来源于病原体。

28.根据权利要求25所述的方法，其中所述的动物是哺乳动物。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的哺乳动物是人。

30.一种分离的分子复合体，包括Toll样受体、Toll样受体激动剂和Cpn10。

31.根据权利要求30所述的分离的分子复合体，其中所述的Toll样受体选自TLR2和TLR4。

32.根据权利要求31所述的分离的分子复合体，其中所述的Toll样受体是TLR4，激动剂是LPS。

33.根据权利要求31所述的分离的分子复合体，其中所述的Toll样受体是TLR2，激动剂是脂肽。

34.一种生产、设计或筛选Cpn10激动剂的方法，包括以下的步骤：确定候选Cpn10激动剂是否模拟或增强Cpn10对Toll样受体信号传导的调节作用。

35.一种生产、设计或筛选Cpn10激动剂的方法，包括以下的步骤：确定候选Cpn10激动剂是否模拟或增强Cpn10对Toll样受体诱导的免疫调节剂的产生和/或分泌的调节作用。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述的Toll样受体选自TLR2和TLR4。

37.一种生产、设计或筛选Cpn10拮抗剂的方法，包括以下的步骤：确定候选Cpn10拮抗剂是否抑制、减少、遏制或降低Cpn10对Toll样受体信号传导的调节作用。

38.一种生产、设计或筛选Cpn10拮抗剂的方法，包括以下的步骤：确定候选Cpn10拮抗剂是否抑制、减少、遏制或降低Cpn10对Toll样受体诱导的免疫调节剂的产生和/或分泌的调节作用。

39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法，其中所述的Toll样受体选自TLR2和TLR4。

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