CN107033249B

CN107033249B - sTie2融合蛋白、其载体及含有sTie2融合蛋白的药物组合物

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Publication number: CN107033249B
Application number: CN201710341378.1A
Authority: CN
Inventors: 罗德伦; 徐凯; 吴秀锦
Original assignee: Chengdu Kaile Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: CHENGDU NUON GENE TECHNOLOGY CO.,LTD.
Priority date: 2017-05-16
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2020-07-14
Anticipated expiration: 2037-05-16
Also published as: CN107033249A

Abstract

本发明公开了一种sTie2融合蛋白，属于基因工程领域和蛋白质工程领域，所述sTie2融合蛋白为sTie2‑738.SV，优选为sTie2‑544.SV，其包括Tie2细胞外配体识别和结合关键区域和sTie1‑C末端氨基酸序列；还公开了sTie2融合蛋白的载体、生产sTie2融合蛋白的细胞、含有sTie2融合蛋白的药物组合物及其制剂；本发明提供的融合蛋白可以使新生血管萎缩并消失，可以极大提升对血管新生性疾病的治疗效果，作用效率高、稳定性好、产率高，并且对血管增生的抑制能力在多种不同类型的动物新生血管增生模型中得到证实。

Description

sTie2融合蛋白、其载体及含有sTie2融合蛋白的药物组合物

技术领域

本发明涉及基因工程领域和蛋白质工程领域，尤其涉及一种sTie2融合蛋白、其载体及含有sTie2融合蛋白的药物组合物。

背景技术

血管的生成及维系是动物和人体各种组织和器官生成和功能运转的基本保障。主导血管新生过程包括内皮细胞增殖、迁移和分化、细胞外基质的降解、毛细血管的出芽新生等，受到多种因子的调控。现已发现的血管内皮细胞生成刺激因子包括：血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,简称VEGF)、血管通透因子(VPF)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血管生成素(Angiopoietin,简称Ang)等，这些因子与内皮细胞表面受体相结合，激活细胞内不同的信号传递途径，进而调节血管内皮细胞活动。VEGF及其受体(简称VEGFR)是其中最重要的一类调节因子，调控血管的新生。另一类参与血管生成及维持的因子是Ang及其受体(Tyrosine kinase with immunoglobulin like and epidermal growthfactor homology domains,即Tie受体)。VEGF/VEGFR及Ang/Tie体系是目前得到确认的、最重要的调节血管生长和维持的信号转导通路，共同参与血管的构建和维系，并相互影响。

VEGF结合受体主要有两种：VEGF受体1(VEGFR-1，又称Flt1)，VEGF受体2(VEGFR-2，又称FLK1或KDR)，具有相似的结构，均由三种不同的功能区域组成；第一个功能区是位于细胞外，由7个免疫球蛋白样结构域组成，是VEGF与受体结合的关键识别和结合区域。第二个功能区是由疏水性氨基酸组成的跨细胞膜部分，第三个功能区是细胞内部分，包含酪氨酸激酶基团。当受体被VEGF激活后，细胞内的酪氨酸激酶基团磷酸化，酪氨酸激酶活性受到激活，发生一系列的信号传递，进而引起血管新生。

Ang具有促进血管生成作用，其家族成员包含Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。Ang受体有两种类型：Tie1和Tie2。Tie1和Tie2受体在内皮细胞表面特异表达，由三种不同的功能区域组成，结构与VEGFR类似：第一个功能区是位于细胞外的Ang识别及结合区域，由2个免疫球蛋白C2样结构域、3个EGF样结构域和3个III型粘连蛋白样结构域组成，是识别和结合Ang的关键区域。第二个功能区是由疏水性氨基酸组成的跨细胞膜部分。第三个功能区是细胞内部分，含有酪氨酸激酶基团。当Tie受体被Ang被激活后，细胞内区域的酪氨酸激酶基团磷酸化，酪氨酸激酶活性受到激活，发生一系列的信号传递，进而促进血管新生或引起血管崩解。VEGFR和Tie受体具有同源性，分别接收来自VEGF或Ang的调节，共同参与和协调新生血管的形成、生长、成熟和维持。

Tie2受体参与血管生成和维持的作用机理以及研究得比较清楚。Tie2受体可以与Ang-1和Ang-2生成因子结合，导致不同的信号通路的激活。Ang-1能结合并诱导Tie2的酪氨酸磷酸化，虽然不会直接刺激内皮细胞的新生，但其在细胞的表达与发育中的血管发育和成熟紧密相连(Davis,Aldrich et al.1996,Suri,Jones et al.1996)(Suri,McClain etal.1998)。敲除Ang-1基因后的小鼠显示血管生成缺陷，证明Ang-1是Tie2的主要生理配体，Tie2具有关键的体内血管生成作用(Suri,Jones et al.1996)。通过同源筛选鉴定出的Ang-2，经实验证实为Tie2受体的天然拮抗剂。过度表达的Ang-2破坏小鼠胚胎中的血管形成(Maisonpierre,Suri et al.1997)。这些结果支持Tie2受体在血管生成中的重要作用。

病理性血管增生或减少是许多疾病的直接发病原因，如视网膜新生血管性疾病、类风湿性关节炎、毛细血管瘤等血管新生引起的疾病。肿瘤组织中血管增生和碎片化，也在肿瘤发生和转移过程中发挥着重要的作用。肿瘤组织中的血管新生与VEGF直接相关，肿瘤细胞分泌大量VEGF促使供应肿瘤的血管生成，抑制VEGF可以抑制肿瘤血管系统形成，进而抑制肿瘤生长。除了VEGF/VEGFR通路以外，血管生成素Ang/Tie信号通路被认为是另一个非常有吸引力的治疗干预系统，因为其重要性不仅表现在对血管生成和血管内环境稳定上，同时也是血管生成和炎症通路的重要调控环节。

肿瘤的增殖和转移与人肿瘤血管的生成密不可分。血管的正常情况下，血管增值速度缓慢，并受到严格的调控，一旦完成即迅速得到抑制。新血管生成是肿瘤迅速增殖和转移的重要条件之一，新生的血管网为肿瘤的生长和转移提供养料和氧气，运走代谢产生的废物，刺激肿瘤的生长。如果没有血管供应营养，肿瘤细胞将逐渐停止生长并死亡，失去致瘤性。大量动物及临床试验表明阻断肿瘤血管新生能够有效治疗肿瘤，因此血管生成是肿瘤治疗的一个重要的靶点。

眼底新生血管性疾病是另一类血管异常引起的疾病，是导致老年人视力丧失的重要原因，包括脉络膜新生血管(choroidal neovasularization,CNV)和视网膜新生血管，前者包括湿性年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)、特发性CNV、高度近视眼底病变、外伤或发育引起的Bruch′s膜异常而继发的CNV等，后者主要包括糖尿病视网膜病变、视网膜静脉栓塞或各种血管炎症引起的视网膜新生血管。新生血管因其管壁结构的不健全而发生出血、渗漏导致视功能不同程度受损甚至视力丧失。

目前认为治疗眼底新生血管性疾病最有效的方法是玻璃体腔注射VEGF阻断剂，多为人源化抗体或受体融合蛋白，如已临床应用的Ranibizumab(商品名Lucentis，雷珠单抗)，Bevacizumab(商品名Avastin，贝伐单抗)，Aflibercept(商品名Eylea,阿柏西普)和Conbercept(商品名朗沐，康柏西普)等。抗VEGF药物可以使湿性AMD患者视力提高(Rosenfeld,Brown et al.2006,Brown,Michels et al.2009,Martin,Maguire etal.2011,Zhang,Zhang et al.2011,Heier,Brown et al.2012)、使视网膜新生血管萎缩从而减少玻璃体出血风险(Ahmadieh,Shoeibi et al.2009,Ahn,Woo et al.2011)，因而在临床工作中被广泛应用；但并不是所有患者均可受益。由多中心研究完成的著名PIER研究揭示：一年6次给抗VEGF药后,34％的患者视力无改善(Regillo,Brown et al.2008)；而MARINA研究揭示：1年12次给药仍有约12％的患者视力降至20/200或以下(法律盲)(Rosenfeld,Brown et al.2006)；一类新药康柏西普眼用注射液的临床试验，采用了与Lucentis PIER试验同样的给药方案，有19.17％的受试者反复多次给药后视力未提高(Li,Xu et al.2014)；临床观察中有10％-30％的湿性AMD患者对抗VEGF治疗无应答(Krebs,Glittenberg et al.2013,Otsuji,Nagai et al.2013)；在抗VEGF治疗视网膜血管性疾病中也可以发现无论是视网膜新生血管还是黄斑水肿均存在应答不一情况(Krebs,Glittenberg et al.2013,Otsuji,Nagai et al.2013)。据研究追踪7年以上雷珠单抗治疗的随诊结果，与治疗基线相比，在治疗头2年里，平均视力稳步提高，最高达11.2个字母，但之后逐渐下降，7年以上平均视力下降8.6个字母，并有继续下降和出现地图样萎缩(Geographic atrophy,GA)或原有GA加重的趋势，其中，1/3病人视力稳定，1/3病人视力提高，而1/3病人下降15个字母以上(Rofagha,Bhisitkul et al.2013)。超过70％的湿性AMD患者在接受抗VEGF药物治疗后并没有出现显著的视力改善。对于这些无应答的患者，不仅视功能得不到改善，价格昂贵的抗VEGF药物还给患者造成巨大的经济损失、沉重的精神负担和身体上的痛苦，以及引发眼部感染等并发症的风险，因此，抗VEGF治疗的临床无应答现象已被列为2017年眼底病治疗的三大挑战之一。探索抗VEGF药物治疗“无效”产生的分子机制、进一步寻求对这些无应答患者的有效治疗药物和预测方法，对实现眼底新生血管性疾病的个性化精准治疗，具有重要的理论意义和潜在的临床应用价值。

现有的血管生成研究主要集中在VEGF及其受体VEGFR的信号通路上，并由此产生了数个新生血管性疾病的抗VEGF治疗法。但由于部分患者无应答，寻找VEGF以外的新的治疗靶点极为必要。Ang及其受体Tie2代谢途径在血管发育和稳态调节中具有至关重要的功能(Daly,Eichten et al.2013)，被列为重点关注的热点之一。血管生成素有4种亚型，其中研究最深入的是Ang-1和Ang-2。Tie2是血管内皮细胞产生的酪氨酸激酶受体，能结合所有亚型的血管生成素。Ang1是Tie2的强激动剂，主要由血管壁的周细胞产生。Ang-1/Tie2信号通路被认为具有促进血管成熟和稳定的功能，对血管成熟、黏附、迁移和生存至关重要。相比之下，Ang-2主要由血管内皮细胞在血管构造重建时产生，并在很大程度上作为Ang-1/Tie2信号通路的拮抗剂，促进肿瘤血管生成和炎症反应。Ang-2促进细胞的死亡和破坏血管，当与Tie2结合时，它可以促进新血管形成(Augustin,Koh et al.2009,Fagiani andChristofori 2013)。Ang-2在人类多种癌症患者血液中呈现高表达，使用Ang2抑制剂的临床前期研究已取得一定疗效，基因敲除小鼠的实验也确定Ang-2是重要的肿瘤血管生成和肿瘤生长因子。我们的研究发现，眼底新生血管性疾病患者眼中除了VEGF高表达外，Ang-2也呈现高表达：我们检测了51例增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabeticretinopathy，PDR)(12例术前3-5天接受过抗VEGF药物治疗，42例直接手术)和9例黄斑裂孔行玻璃体切除患者的玻璃体标本，接受过抗VEGF药物治疗组玻璃体液中Ang2的含量为2121.78±2972.07pg/ml，未接受组玻璃体液中Ang2的含量为1294.61±1664.16pg/ml，而9例黄斑裂孔病人玻璃体中Ang2的含量全部在定量检测限187.5pg/ml以下，这提示我们Ang2是眼底新生血管性疾病中的一个重要因子，而且抗VEGF药物可能会刺激Ang2的异常表达。美国食品药物监查局(FDA)在2012年批准了以Tie2通路为靶点的瑞格非尼(Regorafenib)用于结直肠癌治疗。瑞格菲尼是一种化学物质，分子式是C21H15N4O3F4Cl。瑞格菲尼的临床应用，实现了以Ang/Tie2受体系统作为治疗靶点的可能，为更多的以此靶点为目标的新药研制铺平了理论基础。

另外，抗VEGF单抗治疗(如：Avastin)与结肠直肠癌患者动脉血栓栓塞形成有关。然而，其机制尚不清楚，血栓形成可能是通过Fc的gammaRIIa(IgG)受体介导的血小板活化的结果(Meyer,Robles-Carrillo et al.2009)。小鼠血小板上不存在Fc gammaRIIa的结合位点，因此小鼠的临床前检测未能预测血栓形成。Avastin免疫复合物(IC)通过与FcgammaRIIa结合激活血小板，因此在转入人源Fc gammaRIIa(hFcR)小鼠体内注射Avastin，在肝素存在下，显示出hFcR小鼠产生了血栓。Avastin治疗结肠直肠癌血栓形成的主要原因是VEGF通路的阻断导致血管炎症和凝血。Avastin通过与VEGF形成复合物和血小板FcgammaRIIa受体的激活来诱导血小板聚集，脱粒和血栓形成，因此，使用一种免疫源性小、与VEGF等不能形成复合物的纯化标签来代替Fc区域，对克服血栓形成，甚或抑制血管纤维化等具有潜在意义。

发明内容

本发明的目的之一，就在于提供一种sTie2融合蛋白，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种sTie2融合蛋白，所述sTie2融合蛋白为sTie2-738.SV，所述sTie2-738.SV包括第一肽段区和第二肽段区，所述第一肽段区为Tie2细胞外配体识别和结合关键区域，所述第二肽段区为sTie1-C末端氨基酸序列，所述sTie1-C末端氨基酸序列由11个氨基酸构成。

作为优选的技术方案：所述sTie1-C末端氨基酸序列为ERAGPTGPPGL。

作为优选的技术方案：所述sTie2融合蛋白为sTie2-544.SV，所述sTie2-544.SV的第一肽段区去除2个粘连蛋白Ⅲ型区域。

作为优选的技术方案：在第二肽段区的末端还包括由6个His串联组成的His标签。

作为优选的技术方案：所述sTie2-738.SV.6His具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

作为优选的技术方案：所述sTie2-544.SV.6His具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

编码sTie2-738.SV.6His的基因具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；

编码sTie2-544.SV.6His的基因具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

VEGFR和TIE受体蛋白质同为跨膜的酪氨酸激酶，其细胞外的受体配体结合区域在生理或病理情形下会被蛋白水解酶作用，产生可溶性的受体，在人的血清和内皮细胞培养液中均可检测到蛋白酶水解后留下的sFLT1、sFLK1、sTie1以及sTie2等。目前还不甚清楚这些可溶性受体蛋白的生理作用，但它们能与各自的配体结合，起到血管生成拮抗剂的作用。sFlt1和sTie1不仅可以通过蛋白水解酶切割跨膜受体产生，还有可能通过mRNA成熟时不同拼接(splicing variant,简称SV)方式产生。这种方式产生的sFlt1和sTie1与蛋白水解酶切割产生的受体片段具有明显不同的生物学意义，多肽的C末端氨基酸序列也有所不同，sFlt1的C末端含有31个独特的氨基酸(Kendall and Thomas 1993)，sTie1的C末端含有11个独特的氨基酸(Jin,Zhang et al.2008)，并均有结合其配体的能力，因此也能起到血管生成因子拮抗剂的作用。目前对sTie1-C末端或sFlt1-C末端的功能还没有分析报道，但已有的研究证实，它们的存在并不影响可溶性Flt1或可溶性Tie1与其配体的结合能力。本发明对sFlt1-C及sTie1-C与蛋白水解酶裂解产生的可溶性Flt1或Tie1片段末端氨基酸残基的对比分析结果显示二者有很大的差异，具体结果总结见图1。

通过对Flt1、sFlt1、KDR和sKDR-662氨基酸序列的分析比较(图1a)，天然产生的sFlt1含有与蛋白水解产生的Flt1片段不具同源性的31氨基酸的C末端(sFlt1-C:GEHCNKKAVFSRISKFKSTRNDCTTQSNVKH)，并具备拮抗VEGF的能力(Kendall and Thomas1993)。同样的，对Tie2、Tie1、sTie2和sTie1进行比较(图1b)，天然产生的sTie1的C末端有11个独特的氨基酸残基(sTie1-C:ERAGPTGPPGL),并且具有完整的结合Ang-1和Ang-2的能力(Jin,Zhang et al.2008)。对这几种蛋白质C末端进行亲水性分析，蛋白水解产生的可溶性Tie2氨基酸残基(739-762：AAEEGLDQQLILAVVGSVSATCLTI)，具有很好的水溶性，并可能形成二级结构；天然产生的sTie1的C末端氨基酸残基(741-762：QAEGPVQESRERAGPTGPPGL)为强疏水性，有二级结构，不会形成二聚体；融合蛋白sTie2-738.SV C末端氨基酸残基(741-749：ESQAPERAGPTGPPGL)与天然sTie1-C末端碱基残基的接近，为强疏水性，不易溶解，比较刚性，不容易形成二级结构，见图1c。蛋白质C末端的生化特性及结构改变，影响蛋白质的可溶性和稳定性。

本发明在保留Tie2细胞外配体识别和结合关键区域的条件下，加入sTie1-C末端的独特氨基酸序列，模拟sTie1-C天然序列形成融合蛋白sTie2-738.SV，该构建优选进一步去除2个粘连蛋白Ⅲ型区域，构建了更为小巧的sTie2-544.SV融合蛋白。sTie2-544.SV融合蛋白保留了sTie1-C末端氨基酸残基序列，维持与sTie2-738.SV融合蛋白C末端相似的疏水性和结构，增加蛋白质的稳定性。这些融合蛋白及维持C末端相似疏水性和结构的变异体，如在VEGFR、Tie等功能性氨基酸序列上，在其C末端加上sTie1-C或sFlt1-C的氨基酸残基序列，具有阻断Tie2受体的信号传导能力，导致毛细血管崩解。可以在真核细胞，如HEK293T或CHO中进行高表达。最近的研究结果证明Tie2，而非Tie1，能结合Ang1和Ang2，是维持血管稳定的主要因子。

本发明以天然表达的sTie1序列为蓝本，用sTie1-C末端序列改造Tie2序列，形成含有sTie1-C末端的可溶性Tie2融合蛋白：sTie2-738.SV(图2)。用基因工程技术构建和生产的sTie2-738.SV含有Tie2受体细胞外片段，能够阻断Tie2信号传导，抑制血管新生及生长。经过对纯化的sTie2-738.6His、sTie2-738.SV.6His以及sTie2-738.Fc融合蛋白在产率、稳定性和活性方面的分析，证实sTie1-C末端序列的加入明显增加了分泌型sTie2融合蛋白的产率和血清稳定性，进而提高了该融合蛋白及其衍生物抗微血管生成的活性。

本发明还提供了一种融合蛋白，该融合蛋白还含有由6个His串联组成的His标签，可经Ni-NTA亲和柱选择性地纯化。His标签具有很小的免疫源性，对融合蛋白的稳定性、水溶性和生产效率没有影响。提供一个不同于Fc区域的替代标签，有望减少对机体免疫系统的刺激，避免Fc引起的副作用，如眼内炎症反应、眼底血管的纤维化、地图样萎缩等。

本发明还提供了上述融合蛋白的载体，其载体优选为质粒。

本发明还提供了生产上述融合蛋白的细胞，优选为真核细胞。

本发明还提供了上述融合蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂组成的药物组合物，其中制剂形式优选为注射剂或冻干粉针剂。

本发明的要点在于现有技术中抑制血管新生药物对部分病人无效、特异性差、且含有的某种片段(如FC片段)促进血管血栓化的缺陷，设计并构建了一系列由ANG受体的不同片段和连接片断相融合而形成的融合蛋白，通过鸡胚尿囊膜毛细血管生成抑制实验等筛选出对微血管生成具有最大抑制作用的融合蛋白。sFlt1-C和sTie1-C是天然产生的VEGFR1和Tie1受体的C末端突变体，能够增加蛋白分泌性和稳定性。这些受体片段之间的连接部分使蛋白具有足够高的结构弹性，并且增加了融合蛋白的稳定性和分泌性，与不包含连接片段的融合蛋白相比，包含连接片段的融合蛋白有更高的生物活性、表达量和血清半衰期，从而能更有效降低病人用药成本、抑制血管生成和生长。

本发明涉及的融合蛋白可以通过基因重组技术获得，该技术为常规技术，首先获得编码上述蛋白的DNA序列，该序列可以在NCBI的genbank中下载得到，然后通过PCR扩增获得上述蛋白的DNA并克隆到载体中，载体可以是分子生物学常用的病毒、质粒或DNA片段，因为融合蛋白含有跨膜位点或者可溶性蛋白的分泌序列，因此可以保证蛋白从细胞中分泌出来。载体中包含驱动基因表达的启动子、蛋白翻译起始和终止信号，还含有真核细胞选择性基因，有利于稳定转染宿主细胞株的选择。

由于Tie受体和VEGFR受体的免疫球蛋白样区域之间并没有明显分界，因此氨基酸序列长度可以有一定变化，所以本发明设计的融合蛋白各个独立的功能区域之间的氨基酸序列也可以有一定变化。它们都属于本发明的范围。

由于本发明提供的VEGFR受体和Tie受体片段都有抑制血管生成作用，因此它们可以以合适的方式拼接，进而形成新的具有稳定功能结构的蛋白发挥抑制血管生成作用，它们都属于本发明范围。

不同物种的种属之间，对同义密码子的使用频率是不同的。在外源基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配的情况下，目的基因的表达水平会显著提高。因此在本发明基础上进行密码子优化也属于本发明范围。

在完成上述融合蛋白的质粒构建以后，即可用质粒DNA转染细胞，表达相应的融合蛋白。能够表达这种融合蛋白的系统有多种，它们包括但不限于：哺乳动物细胞、细菌、酵母菌、昆虫细胞等。从哺乳动物表达的蛋白有糖基修饰，由于本发明的融合蛋白质的序列中包含糖基化，细菌、酵母、昆虫细胞表达量虽然比哺乳动物高，但是表达的蛋白缺乏糖基化或者糖链不同，因此哺乳动物细胞表达系统最好，如：HEK293T细胞、CHO细胞、BHK细胞、SP20细胞等等，许多其它细胞，如昆虫细胞sf9也可以用于这些蛋白质的表达和生产，因此都包含在本发明使用的细胞之列。转染的方法有多种，包括但不限于电转染、脂质体转染、钙介导等等。

融合蛋白表达后可以用酶联免疫吸附实验或者其它方法测定培养液中蛋白质的浓度，融合片段含有的HIS标签不仅增加蛋白稳定性和亲和性，而且有利于纯化，可以通过Ni-NTA亲和层析柱提取所表达的融合蛋白。

本发明通过脂质体转染从HEK293T细胞培养液中获得相应的各种融合蛋白，从培养液中获得重组蛋白以后可以通过体外结合实验比较各融合蛋白和VEGF及ANG受体的亲和性，能够有效抑制VEGF对血管内皮细胞生长的促进作用，抑制内皮细胞分裂。

目前抗VEGF治疗湿性老年黄斑的主要缺点是仅有三分之一的患者接受治疗后视力改善后可以长期维持，大部分患者在接受抗VEGF药物治疗后并没有出现显著的视力改善(或者短期改善后出现视力下降)。目前市面上的药物只能抑制血管新生而不能使已有血管缩小或消失，甚至有可能加剧血管纤维化。本发明提供的融合蛋白可以使已有血管萎缩并消失，可以极大提升治疗效果(图10c和10d)。和目前现有技术先比，本发明提供的融合蛋白作用效率高、稳定性好、产率高，可溶性Tie2融合蛋白对血管增生的抑制能力在多种不同类型的动物新生血管增生模型中得到证实，包括：鸡胚尿囊膜微血管生成实验(图11)、小鼠氧致视网膜病变(OIR)模型(图12)，以及激光致小鼠脉络膜新生血管实验。

本发明还提供了含有包含有所述蛋白的药物组合物，该药物组合物可以按照制剂学常规技术制成任何形式的药物制剂，组合物中可以含有药物可接受的载体。

本发明的药物组合物其中还包括任何一种或几种其它的具有协同作用的抑制血管新生的药物，所述组合物可以和其它治疗方法一起治疗血管新生相关疾病，其他治疗方法选自化学疗法、反射疗法、基因疗法等

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的融合蛋白可以使新生血管萎缩并消失，可以极大提升治疗效果作用效率高、稳定性好、产率高，并且对血管增生的抑制能力在多种不同类型的动物新生血管增生模型中得到证实。

附图说明

图1：天然产生的可溶性Flt1(sFlt1)和可溶性Tie1(sTie1)的C末端修饰分析比较；

其中，图1a为FLT1,sFLT1,KDR和sKDR-662氨基酸序列比较；

图1b为TIE2,TIE1,sTIE2和sTIE1氨基酸序列比较；

图1c为TIE2,sTIE2和sTIE2-738.SV C末端氨基酸残基亲水性比较；

图2：Tie2受体的构成成份和重组融合蛋白的功能区域构成及分布

图3：以sTie2-738.SV.6His表达质粒图谱为代表的Tie2受体重组融合蛋白表达质粒的构建图

图4：培养细胞经不同质粒转染后细胞裂解物和培养上清中融合蛋白含量比较；

图5：Western Blot分析法对Tie2重组融合蛋白免疫抗体识别鉴定；其中，1为sTie2-738.6His(理论分子量83.2kda)，2为sTie2-738.SV.6His(理论分子量84.1kda),3为sTie2-544.SV.6His(理论分子量62.2kda),4为sTie2-738.Fc(理论分子量108.7kda)；

图6：纯化Tie2重组融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析；其中，1为sTie2-544.SV.6His，2为sTie2-738.6His，3为sTie2-738.SV.6His；

图7：图7a.纯化的融合蛋白sTie2-738.SV.6His对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制结果；其中，A、B、C、D分别为采用“0.5％FBS+RPMI培养液”处理后，孵育第8、9、10、11天的结果图，A显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管正在生成”，B显示为“鸡胚发育良好，鸡胚尿囊膜、微血管生长正常”，C显示为“鸡胚发育良好，微血管数量明显增加，尿囊膜完整”，D显示为“鸡胚发育良好，尿囊膜完整，微血管数量稳定”；E、F、G、H分别为采用“0.5％FBS+RPMI培养液+sTie2-738.SV.6His 20μg”处理后的结果图，E显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管正在生成。鸡胚发育良好”，F显示为“加药24小时后，尿囊膜表面微血管已经/正在崩解，部分消失”，G显示为“加药48小时后，微血管已经消失，鸡胚发育良好，尿囊膜完整”，H显示为“加药72小时后，尿囊膜完整，微血管消失，鸡胚发育良好”

图7b.鸡胚尿囊膜微血管生成抑制的统计结果；

图8：纯化sTie2重组融合蛋白抑制鸡胚尿囊膜微血管生成的效率比较。

图9：图9a.阴性对照对鸡胚尿囊膜微血管生成的影响；其中，A显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管大部分生成”，B显示为“鸡胚发育良好，鸡胚尿囊膜、微血管生长正常”，C显示为“鸡胚发育良好，鸡胚尿囊膜毛细血管数量明显增加，尿囊膜完整”；

图9b.5μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用；其中，A显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管大部分生成”，B显示为“加药24小时后，微血管已经/正在崩解，部分消失”，C显示为“加药48小时后，微血管部分消失，鸡胚发育良好，尿囊膜完整”；

图9c.5μg抗VEGF抗体(Avastin)对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用；其中，A显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管大部分生成”，B显示为“加药24小时后，尿囊膜表面微血管崩解，部分消失”，C显示为“加药48小时后，尿囊膜完整，微血管大部分消失，鸡胚发育良好”；

图10：sTie2-738.SV.6His融合蛋白对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用的剂量效应：图10a.阴性对照对鸡胚尿囊膜微血管生成的影响；其中，A显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管大部分生成，鸡胚发育良好”，B显示为“鸡胚发育良好，鸡胚尿囊膜、微血管生长正常”，C显示为“鸡胚发育良好，尿囊膜完整，毛细血管数量明显增加”，D显示为“鸡胚发育良好，尿囊膜完整，毛细血管数量稳定”；

图10b.1μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用；其中，A显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管大部分生成，鸡胚发育良好”，B显示为“加药24小时后，尿囊膜表面微血管已经/正在崩解，部分消失”，C显示为“加药48小时后，微血管已经消失，鸡胚发育良好，尿囊膜完整”，D显示为“加药72小时后，尿囊膜完整，微血管消失，鸡胚发育良好”；

图10c.5μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用；其中，A显示为“加药前，尿囊膜形成，微血管大部分生成，鸡胚发育良好”，B显示为“加药24小时后，尿囊膜表面微血管已经/正在崩解，部分消失，微血管出血严重”，C显示为“加药48小时后，微血管已经消失，鸡胚发育良好，尿囊膜完整”，D显示为“加药72小时后，尿囊膜完整，微血管消失，鸡胚发育良好”

图10d.20μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制作用；

图10e.纯化Tie2融合蛋白质对鸡胚尿囊膜微血管生成的剂量抑制实验结果分析；

图11：纯化的Tie2重组融合蛋白中sTie1-C末端对鸡胚尿囊膜微血管生成抑制率的影响；

图12：纯化的sTie2-738.SV.6His重组融合蛋白抑制OIR小鼠眼底新生血管增生；其中，左眼为空白对照，右眼为给药眼；

图13：纯化的sTie2-738.SV.6His重组融合蛋白抑制激光致小鼠脉络膜新生血管实验。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明作进一步说明。以下实施例对本发明所构建的融合蛋白构建实验和应用做了详细说明，但是本发明的内容以及用途不限于实施例范围。

实施例1：融合蛋白表达质粒的重组构建

本发明在人源Tie2基因序列(GenBank:NM_000459)模版的基础上进行基因工程改造，设计了5种含有不同功能区域的Tie2基因部分表达序列(图2)。1.Tie2-781：含有Tie2基因的1-781个氨基酸，具有跨膜区域，不具备细胞外分泌能力。2.sTie2-751.6His：含有Tie2基因的1-751位氨基酸，不含跨膜区域。C末端加上了6个His氨基酸标签。为蛋白酶水解形成的可溶性sTie2模拟物。3.sTie2-738.SV.6His：含有Tie2基因的1-738位氨基酸，该片段与可溶性sTie1的sTie1-C末端序列前的细胞外结合区域兼容，不含跨膜区域。C末端加上sTie1-C的11个氨基酸序列和6个His氨基酸标签。4.sTie2-738.Fc：含有Tie2基因的1-738位氨基酸，该片段与可溶性sTie1的sTie1-C末端序列前的细胞外结合区域兼容，不含跨膜区域。C末端加上人源化的免疫球蛋白G的Fc区。5.sTie2-544.SV.6His：含有Tie2基因的1-544位氨基酸，保留一个粘连蛋白区域，C末端加上sTie1-C的11个氨基酸序列和6个His氨基酸标签。sTie2-738.SV.6His和sTie2-544.SV.6His的氨基酸序列列于附表。

本发明对上述5种融合蛋白的氨基酸序列进行转换，获得相对应的核酸序列，并经过针对真核细胞进行表达的密码子优化处理，sTie2-738.SV.6His和sTie2-544.SV.6His的核酸序列列于附表。对基因片段进行人工合成，并分别克隆到含有CMV启动子的表达质粒载体中，可以在真核细胞中表达出特定的蛋白质，图3为代表性的sTie2-738.SV.6His表达质粒图，其余的蛋白质表达质粒具有相似的结构。

实施例2：C末端氨基酸组成在不同细胞中表达对可溶性蛋白表达量及细胞外分泌的影响

用5种分别含有Tie2-781、sTie2-738.6His、sTie2-738.SV.6His、sTie2-738.Fc以及sTie2-544.SV.6His基因表达序列的质粒DNA分别转染培养细胞，用ELISA测定法测定细胞培养上清和细胞裂解液中Tie2蛋白的含量，比较sTie1-C末端对融合蛋白产率和分泌量的作用。具体做法为：在6孔板里接种2.4x10^4细胞。用2.5μg与lipefectamine细胞转染试剂(Life Technology)混合，加入培养细胞中，混匀，转染24小时后，置换入含1％FBS的DMEM培养液，孵育24小时，取上清，收集细胞，分别利用ELISA定量测定法测定样本中Tie2的含量，细胞上清中Tie2的测定含量为：细胞上清含量–1％FBS-DMEM培养液的本底含量。在所有测试过的细胞中，HEK293T细胞的产量最高(图4)。Tie2-781转染的细胞上清中没有测到Tie2的表达。而加了sTie1-C末端的sTie2-738.SV.6His和sTie2-544.SV.6His转染细胞的上清中测得高表达的Tie2，比Fc为末端的sTie2-738.Fc质粒产率高出3.5倍。也比没有sTie1-C末端的sTie2-738.6His高出20％左右。实验结果证明sTie1-C序列对融合蛋白的分泌和表达均有一定的提高。用H1299、3T3以及HeLa细胞重复，均得到类似的结果，但产率低于HEK293T细胞。

凝胶电泳蛋白印迹免疫染色法(Western Blot)鉴定融合蛋白。用含有sTie2-738.6His、sTie2-738.SV.6His、sTie2-738.Fc以及sTie2-544.SV.6His基因表达序列的质粒DNA分别转染的HEK293T培养细胞，24小时后，含1％FBS的DMEM培养基进行更换，继续培养24小时，收集培养液。取100μl培养上清，进行真空浓缩。用10％的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行电泳分析。转至硝酸纤维素膜后用抗Tie2小鼠抗体进行杂交和染色。结果如图5，转染的HEK293T细胞上清中可以测到80kDa左右的sTie2-738.6His融合蛋白带(83.2kDa)，sTie2-738.SV.6His融合蛋白带(84.1kDa)，sTie2-544.SV.6His融合蛋白带(62.2kDa)，和sTie2-738.Fc融合蛋白带(108.7kDa)。

实施例3：培养细胞HEK293T生产融合蛋白和Ni-NTA层析柱纯化方法

融合蛋白的收集：用含10％FBS的DMEM培养基(HyClone)培养HEK293T细胞，待细胞密度生长至60％-80％时，更换新鲜10％FBS DMEM培养基，将重组质粒和脂质体混合物，以脂质体转染的方式转染进入细胞，转染后第二天用含1％FBS的DMEM培养基换液，再继续培养至第三天，收集培养液。以后连续三天，每天换新鲜1％FBS的DMEM培养基，培养24小时后收获培养液上清。上清液中含有细胞表达的融合蛋白。用ELISA测定法鉴定,确认sTie2融合蛋白的表达量。

蛋白纯化过程：收集细胞培养液上清，以1500g，离心10分钟，收集培养液上清。上清再以13000g，在4℃下离心15分钟。取上清液转移到500ml输液瓶中,加入50mM NaH2PO4；300mM NaCl；NaOH调整PH至8.0，0.22um滤膜过滤，4℃暂存。平衡Ni-NTA亲和层析柱(Qiagen)，样品上清液上柱,流速0.4-0.6ml/分钟。待样品上清液大致流净，加入6ml NPI-10(10mM咪唑)洗涤杂蛋白。加入8ml NPI-20洗杂蛋白。加入500ul NPI-200(200mM咪唑)洗脱目的蛋白，收集目的蛋白。轻轻加入500μl NPI-300洗脱目的蛋白，收集目的蛋白。重复一次。将收集的蛋白溶液转移到30kd超滤管中，4℃离心10分钟，去除低分子量的杂蛋白质。加入1.5ml PBS溶液,4℃离心10分钟,洗去咪唑。3次重复。最终得到蛋白浓缩体积约400-500ul。浓缩的纯化融合蛋白经ELISA测定Tie2蛋白质浓度,10％的SDS-PAGE法鉴定蛋白质及纯度，收集的蛋白及待检测样本-80℃保存。图6显示一个批次生产的sTie2-544.SV.6His、sTie2-738.6His以及sTie2-738.SV.6His融合蛋白在10％SDS-PAGE的电泳结果及纯度分析。sTie2-544.SV.6His融合蛋白纯度达到90％以上，sTie2-738.SV.6His融合蛋白纯度达到80％以上。

实施例4：融合蛋白对鸡胚尿囊膜血管新生抑制效应的实验方法及实验结果分析

使用鸡胚尿囊膜微血管生成模型可以对受试物抑制血管生成的能力进行定量的测定，具体方法如下：

将出生1-2天的种鸡蛋消毒后装入恒温恒湿箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，SPX-250C)(37℃，湿度H＝60-70％)，孵育6天(24小时计一天)，每天早晚各翻蛋一次；第6天时，分别滴加100μl RPMI培养液，轻轻揭开壳膜，密封种鸡蛋，继续将置于恒温恒湿箱中孵育，不翻蛋。24小时后，对尿囊膜上微血管进行拍照分析，挑选出尿囊膜微血管生成良好的健康鸡胚，依据实验的具体情况对选中的鸡蛋进行随机分组。加入150μl含0.5％FBS的RPMI培养液，密封鸡蛋；继续将种鸡蛋置于恒温恒湿箱孵育；每24小时对鸡胚尿囊膜微血管进行拍照。对尿囊膜微血管的影像图用PhotoShop软件进行处理，沿血管中线标示微血管，计数拓印的微血管像素，进行统计分析。

用含0.5％FBS的RPMI培养液作为阴性对照和sTie2-738.SV.6His融合蛋白抑制鸡胚尿囊膜微血管生成的示范结果见图7。图7a显示经过RPMI培养液和20μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白处理后4天中，鸡胚尿囊膜血管持续改变。可用的血管及微血管分枝用PhotoShop软件进行拓印。拓印的微血管像素统计结果列于图7b，sTie2-738.SV.6His融合蛋白(20μg)有明显抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成的作用，且抑制作用呈浓度依赖性(图10e)。用培养液作阴性对照对鸡胚尿囊膜微血管的生成没有抑制作用。持续观察至第13天的结果证实，鸡胚发育良好，二者对鸡胚发育没有负面影响，显示sTie2-738.SV.6His融合蛋白在此浓度下对鸡胚发育不产生毒性。

实施例5：融合蛋白抑制鸡胚尿囊膜微血管新生的效率

利用实施例4所描述的鸡胚尿囊膜微血管抑制效率定量测定分析方法，用含0.5％FBS的RPMI培养液作为阴性对照，Avastin抗VEGF抗体作阳性对照，比较纯化的sTie2-544.SV.6His、sTie2-738.SV.6His和sTie2-738.Fc融合蛋白对鸡胚尿囊膜新生微血管的抑制作用。每个实验组由3个有效的健康鸡胚组成，以第8天(加药前)的微血管像素计数为标准为基准(记为：10,000),不同时间获得的微血管像素值均以加药前为基准进行校正，每个药物组的微血管像素的平均值及标准差，列于图8。经过RPMI培养液、20μg融合蛋白或20μgAvastin处理24小时后，鸡胚尿囊微血管生成均受到抑制，抑制效果统计上无差别；48小时及72小时后，sTie2-544.SV.6His、sTie2-738.SV.6His融合蛋白显示出比sTie2-738.Fc融合蛋白及阳性对照更强的血管生成抑制作用。所有鸡蛋持续观察至第13天，鸡胚发育良好。

图9比较5μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白与5μg阳性对照的重复结果。

图10比较1μg、5μg和20μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白对鸡胚尿囊膜微血管生成的抑制结果。sTie2-738.SV.6His融合蛋白对鸡胚尿囊膜微血管的抑制呈现出剂量相关性(图10e)。融合蛋白处理24小时后(第九天)，在5μg及20μg的剂量组，观察到正在出血的尿囊膜微血管(图10c)和正在崩解的微血管(图10d)。

实施例6：融合蛋白血清稳定性分析

蛋白质作为药物使用，一般需通过静脉注射用药。血清中含有多种蛋白质酶，是蛋白质药物失去药效的限制性因素，蛋白质在血清中的稳定性对其成药性有决定性的意义。为了比较sTie1-C末端对血清降解的拮抗作用，本发明用10μl的FBS与100μl分别含有20μg纯化sTie2-738.6His或20μg sTie2-738.SV.6His融合蛋白的培养液进行混合,在37℃下共同孵育2个小时，然后测试处理后的融合蛋白对鸡胚尿囊膜新生微血管的抑制作用。每个实验组由3个有效的健康鸡胚，以第8天(加药前)的微血管像素计数为标准(记为：10,000),对不同时间获得的微血管像素值均以加药前为基准进行校正，每个药物组的微血管像素的平均值及标准差，列于图11。处理24小时后，鸡胚尿囊微血管生成均受到抑制，sTie2-738.6His融合蛋白血管生成抑制率为67.4％，sTie2-738.SV.6His融合蛋白为45.4％。48小时后，前者的抑制率为48.1％，后者的抑制率为33.3％。含有sTie1-C末端的融合蛋白对血管生成的抑制率提高了47.1％。所有鸡蛋持续观察至第13天，鸡胚发育良好。

实施例7：小鼠氧致视网膜病变(OIR)模型中sTie2融合蛋白抗眼底血管增生疗效比较

OIR模型原理为：小鼠在相对高氧的环境中，视网膜血管发生闭塞，形成视网膜无灌注区。回到正常大气中后，进入了一个相对缺氧的环境，此时视网膜血管发生代偿性扩张，最后形成新生血管。采用Tie2融合蛋白、抗VEGF融合蛋白和生理盐水对模型动物单眼给药，与不给药的对侧眼进行比较，观察Tie2融合蛋白与抗VEGF融合蛋白对新生血管的抑制作用。具体做法为：SPF级初生C57BL/6小鼠若干窝。所有动物在标准SPF极饲养间饲养。饲料、给水、光照、温度等条件均一致。小鼠出生3天后将每两窝合笼饲养，第7天时将一母鼠及两窝小鼠一起放入含氧体积分数为75％的饲养箱中，孵育温度维持在23℃，用氧气分析仪监测并调控箱内氧气浓度。第12天时将其放回正常室内空气中饲养。箱内温度为23℃±2℃。昼夜时间维持12小时/12小时。另一母鼠放在正常室内空气中饲养，每日更换母鼠。该方法与传统法比较，具有成活率高、成模率高，简单、稳定、重复性佳等优点。分组：将所有C57BL/6小鼠按随机、双盲方法，分为三组：1)阴性对照组：生理盐水；2)阳性对照组：抗VEGF抗体；3)试验药物组：sTie2-738.SV.6His融合蛋白。给药：第12天时出氧箱时分别给予乳鼠右眼玻璃体腔注射药物或生理盐水，注射量为1μl。第17天时处死动物，进行视网膜铺片和荧光免疫组化染色检查，测量视网膜血管无灌注区的面积，定量分析sTie1-C末端对于实验性CNV形成的影响。结果显示，对照组和实验组均成功建立了CNV模型，阳性实验组CNV的形成受到抑制，sTie2-738.SV.6His融合蛋白组CNV的形成也受到几乎同样程度的抑制(图12)。sTie2-738.SV.6His融合蛋白可以抑制实验性CNV的发展，提示抗Tie2途径可能成为治疗CNV有效的生物学方法之一。

实施例8：小鼠激光致脉络膜新生血管生成模型测定sTie2融合蛋白抗眼底血管增生的疗效

激光致脉络膜新生血管生成病变模型中实验的小鼠种属为：SPF级C57BL/6j，年龄约为6-8周，雄性。C57BL/6j小鼠入室后，适应环境至少7天。所有动物在标准SPF级饲养间饲养，给水、光照、温度等条件均一致。激光致脉络膜新生血管模型建模过程为：1).麻醉：腹腔内注射4.3％水合氯醛麻醉小鼠(按1.2ml/100g剂量进行操作)；2).散瞳：复方托吡卡胺滴眼液点眼3次，每次间隔3-5分钟；3).激光光凝：取所有小鼠左眼及右眼为实验眼，先予1％羟甲基纤维素点眼，以盖玻片为接触镜，裂隙灯显微镜下绕视乳头周围大约1-2PD(视乳头直径)并避开大血管，等距离光凝4个点，以见到气泡产生作为Bruch′s膜被击穿的标准，4个光凝点均出现气泡的小鼠才能入选本实验。激光参数：倍频Nd:YAG激光机(美国)，光斑直径50μm，曝光时间0.05秒，能量250mW；4).结束后予以妥布霉素眼膏涂眼，置于电热毯上等待复苏。

将实验鼠随机双盲分2组(试验组和生理盐水对照组)，双眼给药，每只眼给予纯化的融合蛋白sTie2-738.SV.6His 1-3μl(融合蛋白浓度：1μg/μl)或生理盐水1～3ul。于造模后第7天行麻醉后荧光造影，并计算渗漏分级与渗漏面积。图13显示，融合蛋白sTie2-738.SV.6His给药组小鼠的眼底血管增生得到抑制，眼底血管渗漏面积低于生理盐水处理的阴性对照组。结果显示融合蛋白sTie2-738.SV.6His具有动物模型中抑制小鼠眼底新生血管生成的能力。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都诺恩生物科技有限公司

<120> sTie2融合蛋白、其载体及含有sTie2融合蛋白的药物组合物

<130> 20170505

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 755

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

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<210> 3

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ggcaggacct gcaaggagcg gtgctctggc caggagggct gcaagagcta cgtgttctgt 840

ctgccagatc cctatggatg ctcctgtgca accggatgga agggactgca gtgcaacgag 900

gcctgtcacc caggcttcta cggccccgac tgcaagctga ggtgctcctg taacaatggc 960

gagatgtgcg atcgctttca gggatgcctg tgctctccag gatggcaggg actgcagtgc 1020

gagagggagg gcatccctag aatgacacca aagatcgtgg acctgccaga tcacatcgag 1080

gtgaactccg gcaagttcaa tcccatctgt aaggcctctg gctggcctct gccaacaaac 1140

gaggagatga ccctggtgaa gccagacgga accgtgctgc accctaagga ctttaatcac 1200

acagatcact tctctgtggc catctttacc atccacagaa tcctgccacc cgatagcggc 1260

gtgtgggtgt gctccgtgaa cacagtggcc ggcatggtgg agaagccctt caatatcagc 1320

gtgaaggtgc tgcccaagcc tctgaacgcc cctaatgtga tcgacaccgg ccacaacttc 1380

gccgtgatca atatcagctc cgagccttac tttggcgatg gcccaatcaa gagcaagaag 1440

ctgctgtaca agcctgtgaa ccactatgag gcctggcagc acatccaggt gacaaacgag 1500

atcgtgaccc tgaattacct ggagccaagg accgagtatg agctgtgcgt gcagctggtg 1560

aggaggggag agggaggaga gggacaccca ggccccgtgc ggcggttcac cacagcctct 1620

atcggactgc ctccaccaag gggcctgaac ctgctgccaa agagccagac cacactgaat 1680

ctgacctggc agcccatctt cccttctagc gaggacgact tctacgtgga ggtggagagg 1740

cgctccgtgc agaagtctga ccagcagaac atcaaggtgc ctggcaatct gacatccgtg 1800

ctgctgaaca atctgcaccc aagggagcag tatgtggtgc gggccagagt gaacaccaag 1860

gcacagggag agtggagcga ggacctgaca gcctggaccc tgtccgatat cctgcctcca 1920

cagcccgaga acatcaagat cagcaatatc acacactcct ctgccgtgat ctcctggacc 1980

atcctggacg gctactctat cagctccatc acaatccgct ataaggtgca gggcaagaac 2040

gaggaccagc acgtggatgt gaagatcaag aatgccacaa tcacccagta ccagctgaag 2100

ggcctggagc cagagaccgc ctatcaggtg gatatcttcg ccgagaacaa tatcggctct 2160

agcaatcccg ccttttctca cgagctggtg acactgcctg agagccaggc cccagagcgg 2220

gccggcccca ccggcccccc tggcctgcac caccaccacc accactga 2268

<210> 4

<211> 1686

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atggactccc tggcctctct ggtgctgtgc ggcgtgagcc tgctgctgtc cggaacagtg 60

gagggagcca tggacctgat cctgatcaac agcctgcccc tggtgtccga tgccgagaca 120

tctctgacct gtatcgcctc cggctggagg cctcacgagc caatcaccat cggccgcgat 180

ttcgaggccc tgatgaacca gcaccaggac cctctggagg tgacacagga tgtgacccgg 240

gagtgggcca agaaggtggt gtggaagaga gagaaggcca gcaagatcaa tggcgcctac 300

ttctgcgagg gacgggtgag aggagaggcc atcaggatcc gcaccatgaa gatgcggcag 360

caggccagct ttctgcctgc caccctgaca atgaccgtgg acaagggcga taacgtgaat 420

atctccttca agaaggtgct gatcaaggag gaggacgccg tgatctataa gaatggctct 480

tttatccaca gcgtgcccag acacgaggtg cctgacatcc tggaggtgca cctgccacac 540

gcacagccac aggatgcagg cgtgtacagc gcccggtata tcggcggcaa cctgttcaca 600

tccgccttta ccagactgat cgtgcggaga tgcgaggcac agaagtgggg acccgagtgt 660

aatcacctgt gcacagcctg tatgaacaat ggcgtgtgcc acgaggacac cggagagtgc 720

atctgtcccc ctggcttcat gggccggaca tgcgagaagg cctgtgagct gcacacattt 780

ggcaggacct gcaaggagcg gtgctctggc caggagggct gcaagagcta cgtgttctgt 840

ctgccagatc cctatggatg ctcctgtgca accggatgga agggactgca gtgcaacgag 900

gcctgtcacc caggcttcta cggccccgac tgcaagctga ggtgctcctg taacaatggc 960

gagatgtgcg atcgctttca gggatgcctg tgctctccag gatggcaggg actgcagtgc 1020

gagagggagg gcatccctag aatgacacca aagatcgtgg acctgccaga tcacatcgag 1080

gtgaactccg gcaagttcaa tcccatctgt aaggcctctg gctggcctct gccaacaaac 1140

gaggagatga ccctggtgaa gccagacgga accgtgctgc accctaagga ctttaatcac 1200

acagatcact tctctgtggc catctttacc atccacagaa tcctgccacc cgatagcggc 1260

gtgtgggtgt gctccgtgaa cacagtggcc ggcatggtgg agaagccctt caatatcagc 1320

gtgaaggtgc tgcccaagcc tctgaacgcc cctaatgtga tcgacaccgg ccacaacttc 1380

gccgtgatca atatcagctc cgagccttac tttggcgatg gcccaatcaa gagcaagaag 1440

ctgctgtaca agcctgtgaa ccactatgag gcctggcagc acatccaggt gacaaacgag 1500

atcgtgaccc tgaattacct ggagccaagg accgagtatg agctgtgcgt gcagctggtg 1560

aggaggggag agggaggaga gggacaccca ggccccgtgc ggcggttcac cacagcctct 1620

atcggactgc ctgagcgggc cggccccacc ggcccccctg gcctgcacca ccaccaccac 1680

cactga 1686

Claims

1.一种sTie2融合蛋白，其特征在于：所述sTie2融合蛋白为sTie2-738.SV，具有如SEQID NO：1所示的氨基酸序列；或所述sTie2融合蛋白为sTie2-544.SV ，其具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的sTie2融合蛋白的载体，其特征在于：所述载体为质粒。

3.用于生产权利要求1所述的sTie2融合蛋白的细胞，其特征在于：所述细胞为真核细胞。

4.含有权利要求1所述的sTie2融合蛋白的药物组合物。

5.含有权利要求1所述的sTie2融合蛋白的药物制剂，其特征在于：所述药物制剂为注射剂或冻干粉针剂。