JPS6136229A - 選択的制癌物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体とネオカルチ
ノスタチン（以下、ＮＣ８と称する）が化学的に結合し
た、ＣＥＡ産生癌に高い親和性を有し、正常細胞には全
く親和性を示さない選択的制癌物質に関する。

〔従来の技術〕

ＮＣ８は１０９個のアミノ酸から構成される分子量約１
０．７００の酸性蛋白に分子量約７００のクロモフォア
が結合した化合物で、強い制癌作用を有し、現在臨床に
おいて広く使用されているものである。しかし、ＮＣ８
も他の制癌剤と同様に癌細胞以外の正常細胞にも一部作
用して副作用を示すことがある。

従って、近年、制癌剤の斯かる副作用を改善しようとす
る多′くの研究がなされており、癌に対する特異的なモ
ノクローナル抗体にリシン、ダウンマイシン、マイトマ
イシン等の制癌剤を結合させて、癌細胞にのみ親和性を
有する選択的制癌物質を得ようとする試みがなされてい
る。

このような試みはＮＣ８についても行われており、例え
ば、木材らは、白血病に対するポリクローナルの免疫グ
ロブリンとＮＣ８をＷＳＣＤ法によって結合させる方法
（特開昭５４−１３２５０３号）を、またグンダラム・
ユングらはマウスミエローマ細胞が分泌するモノクロー
ナルなＩｇＧＫＮＣ８の蛋白部分を結合させ、これにク
ロモフォアを結合させてもＮＣ８活性が保持されている
こと（バイオケミカル・アンド・バイオフィジックス・
リサーチ・コミュニケーション、第１０１巻、第５９９
〜６０６頁、１９８１年）を報告している。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、木材らの方法で使用されている抗体は単
一の抗体で々いため、正常細胞に対する抗体も併有して
いると共に、モノクローナル抗体のように大量に生産す
るのが困難である。

またユングらの方法は、癌に対するモノクローナル抗体
でないため、癌細胞に対する選択性がないという欠点が
あった。

〔問題点を解決するための手段〕

そこで、本発明者は、癌細胞のみに選択的に作用するＮ
Ｃ８誘導体を提供すべく鋭意研究を行った結果、ＮＣ８
に、ＣＥＡ産生癌に選択的な親和性を有する抗ヒトＣＥ
Ａモノクローナル抗体を結合させると、当該癌に高い選
択性をもち、しかもＮＣ８に比較し血中持続性が長く、
毒性の低いものが得られることを見出し、本発明を完成
した。

すなわち、本発明は、抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体
とＮＣ８の結合物よりなる選択的制癌物質を提供するも
のである。

本発明で使用される抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体は
、例えばヒトのＣＥＡ（カルチノ・エンブリック・アン
チゲン）産生癌細胞で感作させたマウスの肺臓細胞とマ
ウス由来の骨髄腫細胞とからハイプリドーマを作り、こ
れよｐＣＥＡと結合性を示すモノクローナル抗体を産を
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に移殖Ｉせ、硫安塩析、カラ
ムクロマトグラフィー等で純化することにより製造され
る〔第４２回日本癌学会記事第１０３頁〕。ヒトのＣＥ
Ａ産生癌としては大腸癌、胃癌等が挙げられる。

本発明の選択的制癌物質は、例えば次のごとくして製造
される。

（１）抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体にＮ−スクシン
イミジル−３−（２−ピリジルジチオ）グロピオネー）
　（ＳＰＤＰ）を反応せしめて抗ヒトＣＥＡモノクロー
ナル抗体−ピリジルジチオプロピオネートを得る。

（２）　　Ｎ　Ｃ８Ｋ：８ＰＤＰを反応せｔ、ｋｔ）Ｃ
ＮＣ８−ビリジルジチオグロピオネートを得る。

（３）ＮＣ８−ピリジルジチオグロピオネートにジチオ
スライトールを反応せしめてＮＣ８−メルカプトグロビ
オネートを得る。

（４）抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体−ビリジルジチ
オグロピオネートにＮＣ８−メルヵプトグロピオネート
を反応せしめて抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体−ＮＣ
８結合体を得る〇本発明方法において、抗と）ＣＥＡモ
ノクローナル抗体（以下、ＩｇＧと称する）とＮＣ８の
結合そル数は反応時間、両者の使用量、ｐＨ等によって
調節することができｓ　　ＩｇＧ　　１分子当りＮＣ８
を１〜１（）モル結合させることができる。

本発明方法におけるＮＣ８とＩｇＧの結合様式は次の式
によって示される。

第１工程： （ＩＩＩ） 第３工程： （Ｖ） Ｈ８ＣＨ２−（ＣＨＯＨ）２−　ＣＨ２５Ｈ（ＶＷ） −　Ｈ８−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ−ＮＨ−犯μｓ（■） 第４工程： Ｈ８−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ−ＮＨ−ＮＣ８（■） （式中、ＮＣ３−ＮＨ２はネオカルチノスタチンを、Ｉ
Ｇ−ＮＨ２は抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体を示す） ＩｇＧ（１）をピリジルジチオプロピオネート化（第１
工程）するにはｓ　　ＩｇＧをその濃度が０．５〜３ｔ
ｎｇ／ｇＩｔになるように０．１　Ｍ食塩含有リン酸緩
衝液（ｐＨニア〜８）に溶かし、これに少量のエタノー
ルに溶かした５ＰＤＰを加え反応させる。

５ＰＤＰはＩｇＧの５〜３０倍モルを使用し、２０〜３
０Ｃの温度で３０分〜１時間反応を行うのが好ましい。

ピリジルジチオプロピオネート化の度合は５ｐＤｐの使
用量、反応液のｐＨによって調節することができ、Ｉｇ
Ｇの１〜１０個のアミン基がピリジルジチオプロピオネ
ート化されたＩｇＱ−ピリジルジチオプロピオネート（
Ｉｌｌ）を得ることができる。反応後は、セファデック
スＧ−２５等のカラムを用いてゲル渥過して未反応の５
ＰＤＰ及び副生するＮ−ヒドロキシサクシンイミドを分
離すればよい。

ＮＣＳ　（ＩＶ）　　のピリジルジチオプロピオネート
化（第２工程）は、第１工程と同様にして行われる。反
応後、予め０．１　Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）で平衡
化したセファデックスＧ−２５等のカラムを用いてゲル
沖過して、未反応の５ＰＤＰ及び副生するＮ−ヒドロキ
シサクシンイミドを分離すればＮＣ８の１〜２個のアミ
ン基がピリジルジチオプロピオネート化されたＮＣ８−
ピリジルジチオプロピオネート（Ｖ）が得られる０ＮＣ
８−ピリジルジチオプロピオネート（Ｖ）をチオール化
（第３工程）するには、ｐｉ（４〜５の酢酸緩衝液中で
、（■）にジチオスライトールを室温で１５〜３０分間
反応させることによって行われる。反応後、セファデッ
クスＧ−２５等のカラムを用いて未反応のジチオスライ
トール及び副生するピリジン−２−チオンを分離すれば
ＮＣ８−メルカプトプロピオネート（■）が得られる。

ＩｇＱ　−ＮＣ８結合体を得るには（第４工程）、０．
１Ｍ食塩含有リン酸緩衝液（ｐＨ７〜８）中で、ＮＣ８
−メルカプトプロピオネート（■）とＩｇＧ−ピリジル
ジチオプロピオネート（１）を反応させる。反応は、（
■）に対し１０〜２０倍モルの（■）を用いて、２０〜
３（）Ｃの温度で５〜４８時間行うのが好ましい。反応
後、七フアクリルＳ−２００等のカラムを用いて、未反
応の（ＩＩＩ）及び（■）を分離すればＩｇＧ−ＮＣ８
結合体（■）が得られる。

以上の反応工程において、ＮＣ８活性の減少は極めて少
なく、７５〜８５チの回収率で目的物を得ることができ
る。また抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体の抗体価の減
少も極めて少ない。

このようにして得られる本発明選択的制癌物質の抗ヒト
大腸癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合体の物性は次の
とおりである。

（１）紫外線吸収スペクトル 第１図：抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合
体 第２図：抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体第３図：ＮＣ
３ （２）抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体とＮＣ８との結
合モル数 抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体量はバイオラットプロ
ティーアッセイ法により、ＮＣ８ＪＬＦｉＭｉｃｒｏｃ
ｏｃｃｕ５１ｕｔｅｕ５　　の抗菌活性より求めた。そ
の結果、抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体量は１．２６
　＋ｙ／ｌｕｔ　（８，４μＭ　）　、ＮＣ３ｉＪは６
００Ｕ／５ｄ（３６，４μＭ）であり、両者の結合モル
比は抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体：ＮＣ８＝　１　
：　４であった。

（３）抗原癌細胞に対する親和性 培養細胞ＨＣＬ−１（ヒト肺癌由来のＣＥＡ産生細胞）
に対する親和性を酵素抗体法で測定した。

抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体 ０．０１μｙ／ゴまで有意に結合がみられた。

抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合体 ０．０１μｙ／−まで有意に結合がみられた。

（４）急性毒性 １群６匹のマウス（ＩＣＲ，♀、５〜６週令）を用い、
静脈注射後１４日間観察した。その結果は表−１のとお
りである。

（５）血中濃度 マウス（ＩＣＲ，♀、５週令）にｔｏｏｏＵ／ＬＬ。

を静脈注射し、経時的に血清をとり、ＰＨＡ−■法でＮ
Ｃ８量を測定した。その結果は表−２のとおりである。

表−２ 〔発明の効果〕 以上のとおり、本発明の選択的制癌物質は、ＮＣ８に比
較し、毒性が低く、血中持続性が長く、かつ、実施例に
示すごと＜、ＣＥＡ産生産生対し、高い親和性を有して
いるので、癌の治療剤として極めて優れている。

〔実施例〕

次に実施例を挙げて説明する。

実施例Ｉ ＢＡＬＢ／Ｃマウスにプリスタン０．５−を注射後、２
〜５日後にヒト大腸癌で感作したマウスの肺臓細胞と骨
髄腫を融合して得られたハイブリドーマ細胞を８　Ｘ　
１０’コ／マウス腹腔に注入し、８〜１０日後に腹水を
採取した。３０匹のマウスから約５９−の腹水が得られ
た。この腹水５９ｙｄに０．０１Ｍす／酸緩衝生理食塩
水ｐＨ７，２５９−を加え、さらに飽和硫安溶液９２．
７−加えて、１夜４Ｃに放置し、生じた沈殿を集めた。

この沈殿を０．０２Ｍ）リス塩酸緩衝液ｐＨ７，２に溶
解し、同緩衝液で１夜透析し、不溶の沈殿を遠心分離で
除き、上清液２６−を得る。

次いであらかじめ０．０２Ｍ）リス塩酸緩衝液で充分平
衡化したＤＥＡＥ−アフィゲル・ブルー１００−のカラ
ムにこの上清液２６−を吸着させ、同緩衝液５００ｄと
０．１　Ｍ　ＮａＣ１同緩衝液５００−でグライジェン
トで溶出させ、モノクローナル抗体分画３００　ｓｄを
得た。次いでこの分画をアミコンＹＭ−１０で限外濾過
濃縮後、０．０１Ｍ！ｊン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７，２
に対して１日透析し、純化した抗ヒト大腸癌モノクロー
ナル抗体５８−を得た。この溶液のタンパク質濃度は５
，５η＊／ＩＩ７！であり、アクリルアミドディスク電
気泳動で単一のバンドを示した。

実施例２ 実施例１で得た抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体１５＋
ｄを０．１Ｍ食塩を含む０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）１０−を加え、これに５ｐＤｐ試薬１．７５　
ｓｇをエタノール２Ｉ１１１！にとかしたものを加え、
２５Ｃで３０分攪拌する。攪拌後、反応液をあらかじめ
同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５２５０−
〇カラムに通し、同緩衝液で溶出させ、低分子部分を除
き、モノクローナル抗体のピリジルジチオプロピオネー
ト液４２−を得た。この溶液中のモノクローナル抗体濃
度は１．８ｑ／ｇＩｔであった〇ＮＣ８２００１５を０
．１　Ｍ　Ｎａｃ７を含む０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）２５ｍＫとがし、これに５ｐＤｐ試薬２８．
４ｑｌをエタノール３ｄにとがしたものを加え、２５Ｃ
で３０分分光光下拌する。攪拌後、反応液を予め０．１
　Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，５
＞で平衡化しであるセファデックスＧ−２５２５０−の
カラムに通し、同緩衝液で溶出させ、低分子部分を除き
、ＮＣ８−ピリジルジチオプロピオネート溶液５５ｄを
得る。この溶液中のＮＣ８濃度は３．３ｓｙ／−であっ
た。次にこの溶液５５−に１００　ｍＭ／ｊのジチオス
ライトール水溶液５−を加え、室温で３０分間遮光下攪
拌後、同様にセファデックスＧ−２５カラムに通し、　
ＮＣ８−メルカプトプロピオネート液７０−を得た。こ
の溶液のＮＣ８濃度は２．２シ〜であった。

次にこのＮＣ８−メルカプトプロピオネート液２６５ｍ
ｇに前述のモノクローナル抗体のピリジルジチオグロピ
オネート液２〇−を加え、ｌＮ−ＮａＯＨでｐＨを７．
２ニ調整後、２５ＣＴ２０時間遮光下攪拌する。撹拌後
、反応液を限外漣過で７　ｎｔに濃縮し、あらかじめ０
．０１Ｍ！ｊン酸緩衝生理食塩水で平衡化した七フアク
リルＳ　−２００カラム（１４０づ）に通し、同緩衝液
で溶出し、モノクローナル抗体ＮＣ８結合体の溶液１７
ゴを得た。この溶液はオフタロニーテストで抗ＮＣ８血
清との沈降バンドと抗マウスＩｇＧとの沈降バンドが寒
天中で完全に融合し、かつアクリルアミドディスク電気
泳動で単一のバンドを示した。

またこの溶液のＮＣ８濃度は６００　Ｕ／−であり、モ
ノクローナル抗体濃度は１．２６■／　ｍｌであったの
でＮＣ８のモノクローナル抗体に対する結合モル托は約
４と計算された。

実施例３ 〔実験材料〕 細胞：　ＨＬＣ−１（ヒト肺癌由来細胞、ＣＥＡ産生ず
る） ＨｅＬａＳ３（ヒト子宮癌由来細胞、ＣＥＡ産生しない
） 培養液：ペニシリン（１ｏｏ　Ｕ／＊　）ｓストレプト
マイシン（１００μｙ／−）を 含むＲＰＭＩ　１６４０培地に牛胎児血清を１０チ添加
したものを使用した。

薬剤：■抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体■抗ヒト大腸
癌モノクローナル抗体− ＮＣ８結合体 ■非免疫マウスＩｇＧ−ＮＣ８結合体 ■ＮＣ８ 〔実験方法〕 ＨＬＣ−１細胞あるいはＨｅＬａ５３細胞を１２ウエル
の培養プレート（Ｃｏ５ｔａｒ　３５１２　）に２×１
０２細胞／ウエルとなるように播き、２４時間、３７Ｃ
，５１ＣＯ□空気中で培養する。２４時間後、種々の薬
剤を一定時間処理する。その後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ
　）で２回ウェルを洗い、培養液を加えて４〜５日、３
７Ｃ，５％ＣＯ２空気中の条件で培養する。４〜５日後
、１チクリスタルバイオレット−エタノールで固定、染
色し。

各ウェルの細胞コロニー数をカウントする。

各薬剤の細胞傷害性Ｆｉ８ｕｒｖｉｖｉｎｇ　Ｆｒａｃ
ｔｉ□Ｈ（Ｓ、Ｆ）で表現した。

〔実験結果〕

１、標的細胞特異性（第４図） 第４図はＨＬＣ−１細胞（−）あるいはＨｅＬａ８３細
胞（Ｏ（）、）に各薬剤を３７　ｔ、Ｔ２０分間パルス
処理した場合の結果である。

ＨＬＣ−１細胞及びＨｅＬａ８３細胞はＮＣ８に対して
ほぼ同程度の感受性を示し％　　ＩＣ９０は約０．２Ｕ
／ｇｄであったＣａ）。抗ヒト大腸癌モノクローナル抗
体単独では１００μｌ／−の濃度でもいずれの細胞に対
しても傷害性は認められなかった（ｂ）。また、非免疫
マウスＩｇＧ−ＮＣ８結合体も両細胞に対する傷害性は
同程度でＩＣ，。はＮＣ８単独の場合と同じ約０．２Ｕ
／であった（Ｃ）。一方、抗ヒト大腸癌モノクローナル
抗体−ＮＣ８結合体ではＨｅＬａ８３に対してはＩＣ８
゜＝　０．２　Ｕ／ｇｔ、ＨＬＣ−１に対してはＩＣ，
。＝　０．０６　Ｕ／−であり、抗原陽性細胞であるＨ
ＬＣ−１に対して有意に高い選択的傷害性があった（ｄ
）。

２、低温で処理した場合の効果（第５図）癌細胞を含む
と思われる骨髄等を体外で処理する場合を想定して第５
図に示す実験を行った。これはＩ（ＬＣ−１細胞（−）
及びＨｅＬａ５３細胞（（）Ｏ）を各薬剤で水中で１５
分処理した結果である。

（ａ）に示すように低温ではＮＣ８単独の細胞傷害性は
著しく低下し、ＨＬＣ−１、ＨｅＩ、ａ８３いずれもＩ
Ｃ９ｏは約１０　Ｕ／ｄであった。一方、抗ヒト大腸癌
モノクローナル抗体−ＮＣ８結合体ではＨｅＬａ５３に
対しては’Ｃ９０はＮＣ８単独の場合と同程度で１０　
Ｕ／−あるいはそれ以上の高濃度を擬するのに対して、
ＨＬＣ−１に対してはＩＣ９０は約０．ＩＵ／−で３７
Ｇ処理の場合と同程度であった（ｂ）。このように、低
温で処理することにより抗原陽性細胞に対して著しく高
い選択的傷害性が期待できる。

実施例４ ヒト８状結腸癌をヌードマウス皮下に移植し、移植後１
０日目よりＮＣ８および抗大腸癌モノクローナル抗体−
ＮＣ８結合体を１日量５００Ｕ／ｌ’ｇづつ７回尾静脈
より投与し、投与開始時の腫瘍重量を１として相対重量
（長径×（短径）２×１４）を測定した。また投与後、
３５日目に屠殺して、腫瘍の実測ｌ蓋も測定して、イン
・ヒポでの効果を判定した。相対重量の変化は第６図に
示し、３５日後の実測腫瘍重数は表−３の通りであった
０ 表−３ 抗大腸癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合体は、明らか
にＮＣ８単独よりも腫瘍増殖抑制効果を示した０

【図面の簡単な説明】

第１図は抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合
体の紫外線吸収スペクトル、第２図は抗ヒト大腸癌モノ
クローナル抗体の紫外線吸収スペクトル、第３図はＮＣ
８の紫外線吸収スペクトルである。第４図の（ａ）はＮ
Ｃ８，（りは抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体、（Ｃ）
は非免疫マウスＩｇＧ−ＮＣ８結合体、（ｄ）は抗ヒト
大腸癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合体のＨＬＣ−１
細胞及びＨｅＬａ５３細胞に対する傷害性を示す図であ
る。第５図の（ａ）はＮＣ８、（ｂ）　Ｆｉ抗ヒト大腸
癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合体の低温でのＨＬＣ
−１細胞及びＨｅＬａ５３細胞に対する傷害性を示す図
である。第６図はヌードマウス移植ヒト大腸癌に対する
抗ヒト大腸癌モノクローナル抗体−ＮＣ８結合体の抛瘍
増殖抑制効果を示す図である。 以上 寸 味 」“Ｓ リ　　　　　　　　　　　　　　」°Ｓ＾　　　　　　
　　　　　」°Ｓ 居　　　　　　　　　　Ａ”Ｓ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体とネオカルチノス
   タチンの結合物よりなる選択的制癌物質。 ２、抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体が抗ヒト大腸癌モ
   ノクローナル抗体である特許請求の範囲第１項記載の選
   択的制癌物質。