JPS595120A - 単クロ−ン性抗ｃｅａ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏ
ｎｆｃａｎｔｉｇｅｎ　：以下ＣＥＡと略記する）分子
上の５種類の抗原決定基に対する反応特異性が同定され
た５種類の単クローン性抗ＣＥＡ抗体に関する。さらに
本発明は該単クローン性抗ＣＥＡ抗体産生細胞による単
クローン性抗ＣＥＡ抗体の製造方法ならびに該抗体を用
いる悪性腫瘍の検出方法に関する。

ＣＥＡは、大腸癌をはじめとする各種消化器癌や肺癌な
どの癌組織で産生される糖蛋白質であり、血中における
ＣＥＡの増量は悪性腫瘍の血清学的診断法として重視さ
れている。この血中ＣＩＡ濃度の測定は、抗ＣＥＡ抗体
を用いた免疫学的方法によっているが、ＣＥＡには関連
正常抗原として正常糞便抗原（ｎｏｒｍａｌ　ｆｅｃａ
ｌａｎｔｉｇｅｎ　：以下ＮＦＡと略記する）や非特異
的交差反応抗原（ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｃｒｏｓｓ
−ｒｅａｃｔｌｒＩｇａｎｔｉｇｅｎ　：以下ＮＣＡと
略称する）などが存在し、抗原分子全体を癌特異的と考
えることは困難である。

しかしＣＥＡはいろいろな腫瘍組織においてその産生が
著しく増量する癌関連抗原であり、血中におけるＣＦｉ
Ａ濃度の変化は腫瘍組織の消長をよく反映する好個の腫
瘍マーカーとして重視されており、またその抗原構造の
一部には明らかに癌特異的抗原決定基も含まれている。

一方、通常の免疫法で得られる抗ＣＥＡ抗体は甚だ多様
な反応特異性を持ち、それぞれに異った反応特異性を持
った多数の抗体分子種の混合物である。このととが上記
正常関連抗原の存在と共に従来の抗ＣＥＡ抗体を用いる
癌診断法の癌特異性を曖昧にしており、より反応特異性
の明確な抗ＣＥＡ抗体が強く要望されている。

反応特異性の明確な抗ＣＥＡ抗体の作製には、細胞融合
法を用いる単クローン性抗ＣＥＡ抗体の作製方法が試み
られている［　Ａｃｃｏｌｌａ、　Ｒ０８，ｅｔａｌ、
、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、８ｃｊ　Ｕ、
８．　Ａ、、　７７、５６３（１９８０）；Ｍｉｔｃｈ
ｅｌｌ、　Ｋ、　Ｆ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、、　１０　＊１（１９８
０）；　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｇ、Ｔ、ｅｔａｌ、　Ｂｒ、
Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　４Ｂ　。

１（１９８１）；　Ｋｕｐｃｈｉｋ、　Ｈ，Ｚ、　ａｔ
す、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｓ、、　４１　。

８３０６（１９８１）　）。従来報告された単りローン
性抗ＣＢＡ抗体は、いずれもＣＥＡとは反応するが、甚
だ複雑と考えられているＣＥＡ分子上の多くの抗原決定
基のいずれと反応する抗体であるのか特定されておらず
、明確な癌の診断に利用できるまで至っていない。

本発明者らは、先に特開昭５６−４６８１９号明細書に
開示した正常人糞便中のＮＦＡ［抗原物質ＮＦＡ−１、
ＮＦＡ−２およびＮＦＣＡ（−正常糞便交差抗原：　ｎ
ｏｒｍａｌ　ｆｅｃａｌ　ｄ’ｏｓｓｒｑａｃｔｉｎｇ
ａｎｔｉｇｅｎ　）の総称である〕および糞便ＮＣＡ（
以下ｆ−ＮＣＡと略記する）が抗ＣＥＡ抗体の反応特異
性の同定に有用であることを見出し本発明を完成するに
至った。

以下本発明の詳細な説明する。

ＣＥＡおよびこれら関連抗原の抗原構造の比較からＣＥ
Ａ分子上の抗原決定基を次の５種類に分けることができ
る。

１）個体特異的抗原決定基： 免疫抗原として用いたＣＥＡ−標品にのみ特例 異的な抗原決定基で、他の１体から得られた〇ＥＡ標品
には存在しないもの。

２）ＣＥＡ特異決定基： 癌組織から得られたＣＥＡ標品に共通して存在する抗原
決定基であるが、ＮＦＡやＮＣＡなどＣＥＡ関連正常抗
原にはみられないもので、最も癌特異性の高い抗原決定
基である。

３）ＮＦＡ−１共通決定基： ＣＥＡ、ＮＦＡ−２およびＮＦＡ−１の３者に共通して
存在する抗原決定基で、ＣＩＡ分子上の主要抗原決定基
の１つである。

４）ＮＦＣＡ共通決定基： ＣＩＡ、ＮＦＡ−２およびＮＦＣＡの３者に共通して存
在する抗原決定基で、これもＣＩＡ分子上の主要′抗原
決定基の１つである。

５）ＮＣＡ共通決定基： ＣＩＡ、ＮＦＡ−２，ＮＦＣＡおよびｆ−ＮＣＡの４者
に共通した抗原決定基で、ＣＥＡおよび関連抗原に最も
広く共通して認められる抗原決定基である。

ＣＩＡは、分子量約２０万±８万、糖と蛋白質が＃１ぽ
１：１の糖蛋白質であり、Ｇｏｌｄ　ａｎｄマ中に癌特
異性抗原として見出された（Ｊ、　ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、　１２１．４３９（１９６５）　、　Ｊ、　ｅ
ｘｐ、Ｍｅｄ、　　１２２゜４６７（１９６５）：］。

ＣｇＡの犬腸癌肝転移巣からの採取法は特開昭５６−４
７７６２号明細書に記載しである。

ＮＦＡ−２は、ＣＥＡと抗原的にも理化学的性状におい
ても甚だ類似した糖蛋白質で、分子量約２０万±５万、
糖と蛋白質との割合はほぼ１：ｌである。

ＮＦＡ−１とＮＦＣＡｉｉＮＦＡ−２の部分分解産物と
考えられるもので、Ｎ　Ｆ　Ａ　−１は分子量約２〜３
万、糖含量約１３チの小分子抗原であり、ＮＦＣＡは分
子“量的８万±３万の糖蛋白質性の抗原である。

ｒ−ＮＣＡは、ＣＢＡ％ＮＦＡ−２およびＮＦＣＡと交
差反応を示す糖蛋白質で、分子量約８万±３万、糖の含
量的２０９ｇである。

これら抗原々らびにその製造方法については、特開昭５
６−４６８１９号明細書に記載がある。

本発明は、上記５種の抗原決定基に向けられた単りロー
ン性抗ＣＩＡ抗体を提供する。本発明の単クローン性抗
ＣＥＡ抗体は次のごとく製造される。

ＣＢＡで免疫された動物の牌およびリンパ節より得られ
る抗体産生細胞とアザグアニン耐性腫瘍細胞とをポリエ
チレングリコールの存在下に融合させる。融合の方法は
［Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｇ、　＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ，Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２５６　、４９５　（１９７５）　）記
載の方法に従う。

抗ＣＥＡ抗体産生融合細胞には、上記５種類の抗原決定
基に向けられた抗体産生細胞の総てが含まれている。

まず、抗ＣＥＡ抗体産生融合細胞と抗体を産生じない融
合細胞とを区別するために、融合細胞培養上清と免疫に
用いたＣＥＡ標品を放射性ヨードで標識した抗原（Ｈｕ
ｎｔｅｒ、　Ｗ、　Ｍ、　＆　Ｇｒｅｅｎ−ｗｏｏｄ、
Ｆ、Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、　１９４．４９５　（１９６
２）　）との反応性をラジオイムノアッセイ［Ｆａｒｒ
の硫安沈殿法によるラジオイムノアッセイ：　Ｆａｒｒ
、　Ｒ，８゜シＩｎｆ、Ｄｌｓ、、　１０３．２３９　
（１９５８））にて検索し、実用に役立ちうる量（約１
０　ｎｇ／　ｔｎ１以上）の抗体を培養上清中に産出し
ている細胞を選ぶ。

選んだ細胞を限界希釈法〔護送ら、免疫実験操作法ＩＸ
、２９６３頁（１９８０）、日本免疫学会編〕にて単ク
ローン化する。

得られる単りローン性抗ＣＩＡ抗体産生細胞を以下のご
とく選別する。　第１表は選別のフローチャートを示す
。

単りローン性抗ＣＩＡ抗体産生融合細胞の培養上清と放
射性ヨード標識したＮＦＡ−２との反応をＦａｒｒのラ
ジオイムノアッセイにて検索し、わ 反応するクローンと反応しないクローンとに別２ける。

ＮＦＡ−２はＣＥＡと抗原的に甚だ類似しているので、
抗体産生細胞の大半（約９７％）はＮＦＡ−２と反応す
るが、ごくまれな例（約３チ）としてＮＦＡ−２と反応
しないクローンが得られる。ＮＦＡ−２と反応しないク
ローンの産生ずる抗体は、個体特異的抗原決定基かＣＥ
人特異決定基のいずれかに向けられた抗体を産生じてい
ることになる。これらのクローンの産生する抗体につい
て、免疫に用いたＣＥＡとは別の個体から得られた数個
のＣ’Ｆ、に％品との反応性を調べる。これら他のＣＥ
Ａ標品と反応しないものは、免疫に用いたＣＥＡとのみ
反応する個体特異的抗ＣＥＡ抗体である。この抗体を抗
体１という。抗体１は、免疫に用いたＣＥＡを抽出した
腫瘍組織だけの腫瘍特異的抗原性ないしは、ある特定の
遺伝形質をもった集団にのみ表現される抗原性（一種の
アロ抗原）を検出するための試薬として使用しうろこと
が考えられる。

一方、ＣＩＡ標品のいずれとも反応するものが甚だ稀な
例として得られる。これは、ＣＥＡには共通に反応し、
他の関連抗原とは反応しない抗Ｃ−ＥＡ特異抗体である
。この抗体を抗体２という。抗体２は、最も癌特異性の
高い抗体であり、癌の確定的診断や部位の診断あるいは
、放射線源や化学療法剤の癌組織へのキャリヤーとして
の用途など、癌の診断治療に多面的に応用できる。

抗ＣＥＡ抗体産生融合細胞の大半は、ＮＦＡ−２と反応
する抗体を産生ずるものであり、その中にはＣＩＡ分子
上のＮＦＡ−１共通、ＮＦＣＡ共通およびＮＣＡ共通の
３種の抗原決定基に向けられた抗体を産生ずる細胞の総
てが含まれている。そこで次に、上記と同様に放射性ヨ
ード標識ＮＦＡ−１との反応性を検索し、ＮＦＡ−１と
反応する抗ＮＦＡ−１共通抗体を産生ずる細胞を選ぶ。

この抗体を抗体３という。

ＮＦＡ−１は分子量は小さいが抗原活性が強いので、か
なりの頻度（約３５％）で抗ＮＦＡ−１共通抗体産生細
胞が検出される。この抗体３はＣＥＡとは強く反応する
が、Ｎ　Ｐ　ＣＡ＋ＮｃＡとはまったく反応せず、通常
の免疫法で得られる抗ＣＥＡ抗体よりははるかに反応特
異性が狭く、かつ明確な抗体である。従って、この抗体
３を用いれば、現在通常の免疫法で得られた抗ＣＥＡ抗
体で把握しているＣＥＡの挙動がより正確に把握される
ので、癌の診断治療において抗ＮＦＡ−１共通抗体はき
わめて有用である。

ＮＦＡ−１と反応したい抗体産生細胞を放射性ヨード標
識したｆ−ＮＣＡで検索し、ｆ−ＮＣＡと反応しないク
ローンと反応するクローンとに分別する。反応しないク
ローンの産生する抗体を抗体４という。この抗体４はＮ
ＦＡ−１ともｆ−ＮＣＡとも反応せず、ＮＦＣＡ共通決
定基に向けられた抗体と同定する。ＮＦＣＡ共通決定基
もＣＥＡ分子上の主要な抗原決定基の１種であるので抗
ＮＦＣＡ共通抗体産生細胞の頻度も比較的多い。この抗
体４も、通常の抗ＣＥＡ抗体に比べ、より正確にＣＥＡ
の挙動を把握する抗ＣＥＡ抗体として癌診断、治療上有
用である。

ｆ−ＮＣＡと反応するり關−ンの産生ずる抗体は、抗Ｃ
ＥＡ抗体である。この抗体を抗体５という。抗体５はＮ
ＦＡ−１を除＜ＣＥＡおよび関連抗原のほとんどと反応
する反応特異性の広い抗体である。

本発明の単クローン性抗ＣＥＡ抗体は、たとえば抗体産
生細胞をＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｅマウスの腹腔内に移植
して増殖させ石一般的方法〔護送ら、免疫実験操作法Ｉ
Ｘ、前出；　Ｋ２５ｈｌｅｒ、　Ｇ　、　＆　Ｍ　１ｌ
ｓｔｅｉｎ。

Ｃ，、Ｎａｔｕｒｅ、　２５Ｌ　　４９５　（１９７５
）　：ｌによって製造できる。

以上の操作により得られた５種類の抗体は、いずれも主
としてＩｙＭ　（約４０％）およびＩｙＧ（約５０％）
クラスに属するものであるが、約１０％程度にＩｙＡク
ラスの抗体も含まれる。

１ｐＭ抗体は、分子量約９５万、沈降恒数１９Ｓ。

糖の含量が約１０％の糖蛋白質であり１５分分子量約５
万Ｈ鎖（μ鎖）と約２，５万のＬ鎖（にまたはλ鎖）の
μ２に！またはμ２λ２よりなる基本構造が６量体を形
成した（μｌ　ｐ−１）＊または（μ２λｇ）１の構成
を有する。紫外線吸収スペクトルで２８０　ｎｍ附近に
極大吸収を示し、純水には溶けず生理的食塩液によく溶
けるオイゾロプリンの１種である。ＩｙＧ抗体は、分子
量約１５万、沈降恒数６．５Ｓ、糖含量が約２％のグロ
ブリンで、分子量約５万のＨ鎖（μ鎖）と２，５万のＬ
鎖（／−またはλ鎖）がγ！ｈまたはｒ！λ！の構成を
なし、紫外線吸収スペクトルで２８０ｎｍ附近に極大吸
収を有する。ＩｙＡ抗体社分子量約１６万、沈降恒数６
，５Ｂ、糖含量が約１０％のグロブリンである。分子量
約５．５万のＨ鎖（α鎖）とんまたはλのＬ鎖よりなり
、α２ｒ麿またはα２λ！の単量体が主であるが、時に
２〜３量体を作る。

２８０ｎｍ附近に極大吸収を有している。

本発明による単クローン性抗ＣＥＡ抗体を用いた抗原の
検索は、上記抗体１から抗体５までのそれぞれに異なっ
た反応特異性に応じ検索される対象も変化する。例えば
抗体２は最も癌特異性の高い抗体として腫瘍の確定的検
出に応用でき、抗体３および４はＣＥＡの消長をより正
確に把掘するために利用しうる。

このようＫそれぞれの抗体を目的に応じて使い分ける必
要があるが、以下一般的方法を記載する。

１、組織学的検索法　：細胞の浮遊液または塗抹標本あ
るいは組織切片を本発明の単りローン性抗ＣＩＡ抗体で
３７℃で３０分処理し、十分に洗浄したのち、螢光色素
（ｔｅｔｒａ　ｍｅｔｈｙｌｒ−ｈｏｄａｍｉｎｅ　１
ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｉたはｆｌｕｏｒｅｓｃ
ｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅなど）で標識した
抗マウス免疫グロブリン抗体溶液で３７℃で３０分処理
し、螢光顕微鏡で螢光陽性の細胞を検索する。螢光色素
の代りにペルオキシダーゼなどを抗マウス免・疫グロブ
リン抗体に結合させた酵素抗体法に°よる検索も可能で
ある。

２、血中ＣＩＡ濃度測定法　二　本発明の単りローン性
ＫＣＥＡ抗体による血中ＣＥＡ濃度の測定は、硫安沈殿
によるＦａｒｒの方法、抗マウス免疫グロブリン抗体を
用いる二抗体法、ジルコニウムゲルを用いるＺゲル法お
よび固相抗体サンドイツチ法のいずれＫても遂行しうる
が、以下抗マウス免疫グロブリン抗体による二抗体法の
例を示す。

検体血清５０（μｌをプラスチックチェーブ（例えば栄
研チーープ風１：栄研化学社製）にとり、０．５％ＢＳ
Ａを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）２００μｌ
を加えて希釈する。

５０倍に希釈した正常マウス血清にて、適描に希釈した
本発明の単クローン性抗ＣＥＡ抗体５０μｌを加え、３
７℃３０分反応させ、さらに　Ｉで標識した〇ＥＡ約１
．５■を含む液（ＳＯｐｇ）を加え、正確１１Ｃ８７℃
で１時間反応させる。次いで５０倍希釈正常マウス血清
５０μ！中の免疫グロブリンを十分に沈降させうる量の
抗マウス免疫グロブリン抗体を含むウサギまたはヤギ抗
マウス免疫グロブリン血清を１００μ！加え室温にて１
時間反応させ、生じた沈降物を遠心操作にて落とし、０
，９％食塩溶液にて沈降物を１回洗浄したのち、その放
射活性をガンマ−計測機にて測定する。ＣＥＡ１ｈｔ／
ｗＪから５０ｔｉｆ／ｍまでの各濃度の溶液を検体血清
と同様に処理し、標準検量線を作製し、検体の測定値よ
ね血中ＣＩＡ濃度を算出する。

正常人血清の測定値（正常値）は用いる単クローン性抗
ＣＥＡ抗体により異なるので、一般的には特定できない
が、平均正常値に標準偏差（Ｓ、Ｑ）の２倍の値を加え
た値以上の値を病的高値として悪性腫瘍検出の判断に用
いる。

本発明の単クローン性抗ＣＥＡ抗体は上述のごとき悪性
腫瘍（癌）の診断治療という臨床的有用性のほかに、細
胞の悪性変化に伴って起るＣＩＡ産生という一種の先祖
返り現象（遺伝子発現の胎児期への逆行）のメカニズム
の解明やＣＩＡの生物学的活性の探求、さらにその分子
構造の解明など、基礎医学的測置でも甚だ大きな有用性
をもっている。

以下本発明の実施例を示す。

実施例１゜ 約５退会のＢＡＬＢ／ａマウス（ｓｐＦ−ｒウス：靜岡
県夷験動物農業協同組合より入手）２匹をＣ］？ｌＡ（
特開昭：　１５６−４７７６２号）で免疫し九〇すなわ
ち初回的２０μ２のＣＥＡをＦｒｏｕｎｄのｃｏｍｐｌ
ｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔ　（Ｄ　Ｉ　Ｆ　ＣＯ社製）
を用いた抗原乳化液０．２−と共に腹腔内投与し、約ａ
週間後に約２０μＶのＣＲＡ溶液をそのｉｔ靜脈内に投
与した。２回目のＣＥＡ投与後、３日月にこれら１ウス
を層殺し、牌およびリンパ節より抗体産生細胞（類リン
パ球）を採取した。得られた約ｌＸｌ０’個の類リンパ
球とｌＸｌ０’個のアザグアニン耐性マウス骨髄腫由来
株化細胞Ｐａ−Ｘ６Ｂ−Ａ４８−Ｕｌ（以下ＰＲ−１１
１と略記する）　（Ｙｅｌｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、　ｅｔａ
ｌ、。

Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　ＭｉａｒｏｂｉｏＬ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、、　８１　：　１（１９７ｇ））とを混合し、
４５Ｎポリエチレングリコール（分子量約４０００、Ｓ
ｉｇｍａ社製）ＩＭＩを添加して、３７℃で、７分間イ
ンキユベートシた。融合細胞をＨＡＴ培地（４Ｘ１０−
’Ｍのアミノプテリン、１．６Ｘ１０−’Ｍのチミジン
およびＩ　Ｘ　１０”−’Ｍのヒボキサンチンを含む秀
美培地、ｐＨ７）を用いて、９６ウエルのミクロタイタ
ーに分注し、その約７０％のウェルに■（人Ｔ培地で生
育するＰ３−Ｕｌと類リンパ球との融合細胞の増殖をみ
た。ウェルの培地をＤ−λ４　Ｅ　Ｍ　（Ｄｕ１ｂｅａ
ａｏ’ｅ　ｍｏｄｉｆｉｅａ　ＭＫＭ　）に交換し、細
胞が十分に増殖したのち、その上演を免疫に用いた〇Ｅ
Ａ標品を放射性ヨードにて標識した抗原を用いてＦａｒ
ｒの硫安沈殿法によるラジオイムノアッセイによって検
索し、約２０個のウェルに抗ＣＥＡ抗体の存在を認めた
。

得られた抗ＣＥＡ抗体産生細胞を次のごとく限界希釈法
にて単クローン化した。

融合細胞を３細胞／ｄになるように１０％のｐｃ８（牛
胎児血清）を含むＤ−ＭｇＭで希釈し、その０．２　ｄ
をミクロタイタープレートの各ウェルに入れ、同上培地
を用いて３７℃、約２週間培養した。細胞増殖を始めた
ウェル中の細胞を単クローン融合細胞とする。

得られた単クローン融合細胞の培養上清とＣＩＡとの反
応を上記Ｆａｒｒの方法にて検索し約１０ｎＦ／＊／以
上の抗ＣＥＡ抗体を産生じている融合細胞を抗ＣＥＡ抗
体産生細胞細胞と同定する。２匹のマウスより通常２０
〜３０個の単りローン性抗ｃｇ人抗体産生融合細胞が得
られる・ 上記操作を十数間繰り返して得られた約３００株の抗Ｃ
ＩＥＡ抗体産生融合細胞の培養上清と放射性ヨードで標
識した〇ＨＡ、ＮＦＡ−２、ＮＩ’ＦＡ−１およびｆ−
ＮＣ！Ａとの反応性をＦａｒｒの硫安沈殿法によるラジ
オイムノアッセイによって検索した。結果を以下に示す
。

約３００株の抗ＣＥＡ抗体産生細胞の大部分はＮＦＡ−
２と反応する抗体を産生じているが、約１０株がＮＦＡ
−２と反応しない抗体を産生じていた。免疫に用い九〇
ＷＡとは別の個体より得た４つのＣ’ＫＡ標品とＮＦＡ
−２と反応しない抗体を産生じている細胞の培養上清と
の反応を調べた結果、２株がいずれのＣ’ＥＡ標品とも
反応し、最も癌特異性の高い抗ＣＥＡ特異抗体（抗体２
）を産生じ、他は免疫に用いたＣＲＡとのみ反応する個
体特異的抗ＣＥＡ抗体（抗体１）を産生ずる株であった
。

ＮＦＡ−２と反応する抗体を産生ずる約２００株の細胞
’ｊｉ’Ｎ　Ｆ　Ａ　−１で検索した結果、約７０株は
ＮＦＡ−１と反応する抗ＮＦＡ−１共通抗体（抗体３）
を産生ずる細胞であった。

ＮＦＡ−１と反応しない抗体を産生ずる約１００株の細
胞をｆ−ＮＣ’Ａで検索したところ、約６０株はｆ−Ｎ
ＣＡと反応しない抗ＮＦＣ’Ａ共通抗体（抗体４）を産
生ずる細胞であり、残りの約４０株はｆ−ＮＣＡと反応
する抗ＣＥＡ抗体（抗体５）を産生ずる細胞であった。

いずれの場合でも細胞の産生ずる抗体の量および検索に
用いた抗原との反♂の強さは細胞株ごとに異々っており
、細胞株間の多様性が認められた。

実施例２゜ 抗ＣＥＡ抗体産生融合細胞なりＡＬＢ／ｃマウスの腹腔
内に移植して単クローン性抗ＣＥＡ抗体を生産した例。

市販（静岡系実験動物農業協同組合より入手）のＢＡＬ
Ｂ１０マウス（５〜６週令、雌雄いずれも可）の腹腔１
ｃ　Ｏ，５ｄのｐｒｉｓｔａｎ（２，６，１０，１４−
ｔｅｔｒａ−ｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａａｅａａｎｅ　）
を投与し、７〜１０日のち１５Ｘ１０’〜１０７個の単
クローン性融合細胞を含むＤ−ＭＥｉＭｏ、５ｍ／を同
じく腹腔内に注射する。７〜１０日のち十分に腹水が貯
留したマウスから腹腔穿刺にて腹水を採取し、以後２日
おきに４〜５回腹水を採取したのち、最後に屠殺して全
採血を行う。上記の方法で得られる腹水量は融合細胞の
性状によ妙約２ｄから２０ｄ以上とまちまちであるが、
平均約１０肩／が得られる。この腹水および血清中に含
まれる単りローン性抗ＣＥ人抗体の濃度も融合細胞の性
状により約１　”ｆ　／　ｙｉｔから約ｔ　ｏ　ｍｙ　
／−以上トかなりの開きが認められ、得られる総量も２
〜３町から１ｏｏｑ以上と大きな差異が紹められる。

（自発的）手続補正書 １　事件の表示 昭和１５７年　％軒　願第１１３７８０号２、発明の名
称　単りロー性抗ＧＢＡ抗体３　補正をする者 事件上の関係特許出願人 イ；、　ｌ　４／　、？、ｌ　　　福岡県福岡市早良区
南庄δ丁目４番２３−５０４氏　名酩称）松　　岡　　
雄　　治 ４、代理人 さしかえる。　　　　　　方式　Ｃ 門　　　　細　　　　書 １、発明の名称 単クローン性抗ＣＥＡ抗体 ２、特許請求の範囲 （１）哺乳動物を所与の癌胎児性抗原で免疫することに
より、抗体産生能を有する細胞を産生じ、こうして産生
された細胞を哺乳動物から採取し、採取された細胞を他
の哨乳動物由来の株化腫瘍細胞と融合させ、得られた融
合細胞をクローニングし、得られた単クローンを培養し
、培養物から所望の単クローン性抗体を回収する工程か
らなる癌胎児性抗原に対して特異性を有する単クローン
性抗体の製造方法において、（イ）上記の所与の癌胎児
性抗原をマーカーとして用いることにより、上記融合細
胞を、マーカー抗原と反応する抗体産生能の観点から選
別すること、および（ロ）上記の所与の癌胎児性抗原以
外の第２の癌胎児性抗原と正常成人由来の局胎児性抗原
関連抗原とからなる群から選ばれた１棟以上の抗原をマ
ーカーとして用いることにより、上記のクローニングに
よって得られた単クローンを、単クローンの産生ずる単
クローン性抗体と上記の１８！以上のマーカー抗原との
反応性に関して選別することを特徴とする癌胎児性抗原
に対して特異性を有する単クローン性抗体の製造方法。

（２）哺乳動物が、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ、ヤギ、馬まだは牛である特許請求の範囲第１項によ
る方法。

（３）癌胎児性抗原関連抗原が、正常糞便抗原１、正常
糞便抗原２および正常成人由来の非特異的交叉反応抗原
の３者の中から選ばれた１種以上の抗原である特許請求
の範囲第１項による方法。

（４）選別が放射性物質で標識されたマーカー抗原を用
いるラジオイムノアッセイによって行なわれる特許請求
の範囲第１項による方法。

（５）抗体が抗血清の形である特許請求の範囲第１項に
よる方法。

（６）特許請求の範囲第１項記載の方法で選別された単
クローン性抗体産生能をもつ単クローン。

（力　抗体産生のために哺乳動物の免疫に用いられた癌
胎児性抗原と反応性を有するが、上記の癌胎児性抗原以
外の癌胎児性抗原およびすべての癌胎児性抗原関連抗原
とは反応性を有しない単クローン性抗体。

（８）すべての癌胎児性抗原と反応性を有するが、すべ
ての癌胎児性抗原関連抗原と反応性を有しない単クロー
ン性抗体。

（９）すべての癌胎児性抗原、正常糞便抗原１および正
常糞便抗原２と反応性を有するが、正常成人由来の非特
異性交叉反応抗原と反応性を有しない単クローン性抗体
。

ｅｌＧ　　すべての癌胎児性抗原および正常糞便抗原２
と反応性を有するが、正常糞便抗原１および正常成人由
来の非特異的交叉反応抗原と反応性を有しない単クロー
ン性抗体。

Ｑｌ）　　すべての癌胎児性抗原、正常糞便抗原２およ
び正常成人由来の非特異的交叉反応抗原と反応性を廟す
るが、正常糞便抗原１と反応性を有しない単クローン性
抗体。

０２１癌胎児性抗原および癌胎児性抗原関連抗原の濃度
をラジオイムノアッセイによって測定する方法において
、特許請求の範囲第１項記載の方法で得られた単クロー
ン性抗体を放射性物質で標識したマーカー抗体として用
いることを特徴とする方法。

本発明は、癌胎児性抗原（以下ＣＫＡという）の抗原決
定基に対して特異性を有する単クローン性抗体、その製
造方法および用法に関する。

（ＪＡは周知の癌特異的胎児性抗原であって、分子量約
９万±８万、糖と蛋白質との比約１；１の、ある種の糖
蛋白質である。癌特異抗原としてＣコＡがヒトの消化器
のアデノカルシノーマに存在することは、ＧＯＩ（１お
よびＦｒｅｅｄｍａｎ　Ｋよって報告された［　Ｊ、　
ＫＸＩ）、　Ｍｅ＋１．　、１２１．４３９　（１９６
５）　ｌ　１ｂｉ（１，、１２２８４６７（１９６５）
　］。たとえば血中のＣｌ１ｊＡ濃度をラジオイムノア
ッセイ忙よって測定し、これを臨床的にヒトの癌の診断
治療用マーカーとする場合や各種の基礎医学研究用にＣ
ＩＩｔＡが重要であることは周知である。しかし、ある
種のＣＦｊＡ関連正常抗原が存在しており、これらはＣ
ＩＡと免疫学的交叉反応性を有しているので、ＣＩＩｔ
Ａの癌特異性が不明確になっている。

この種のＣＩＡ関連抗原の例は、非特異的交叉反応抗原
（以下ＮＣＡという）および正常糞便抗原（以下ＮＦＡ
という）である。ＮＣＡは分子量約８万±３万、糖含量
的２０％のある種の糖蛋白質で、たとえばヒトの肺や牌
に存在している（　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　、　６９．２４９２　
（１９７２）　：）。次にＮＦＡはさらＶｃＮＦＡ−１
、ＮＦＡ　−２および正常糞便交叉反応抗ｉ（以下ＮＦ
ＣＡという）に分類サレル。ＮＦＡ　−２は分子量四方
±５万、糖と蛋白質との比約１＝１のある種の糖蛋白質
で、その抗原性および理化学的性状はＣＦＩＡと極めて
類似している。ＮＦＡ　−１およびＮＦＣＡ　ＦｉＮＦ
Ａ　−２の分解産物であると思われる。

ＮＦＡ　−１は分子量約２〜３万、糖含量約１３チの小
分子抗原であり、ＮＦＣＡは分子量約８万±３万の１種
の糖蛋白である。

他に、ヒトの正常糞便中に糞便非特異的交叉反応抗原（
以下ｆ　−ＮＣＡ　　という）という抗原が存在してい
る。ｆ　−ＮＣＡ　の抗原性は前記のＮＣＡのものと実
質的に同一で、Ｃ１、ＮＦＣＡおよびＮＦＡ　−２と交
叉反応性を示す。従って、ヒトの正常仇便中には、本発
明の目的に関係のある４種のＣ］１３Ａ関連抗原が存在
している。

癌マーカーとしてのＣＥＡの利用を改良するために、＋
ＩＡ関連抗原とＣＢＪとを正確に識別しなければならな
い。このだめに、ＣＢＡの抗原決定基に対して明確な特
異性を有する抗ＣＦｌｔＡ抗体の提供が従来試みられて
いる。しかし、公知の各種の多クローン性抗体には、反
応特異性が不明確であるという共通の欠点がある。すな
わち、これらの多クローン性ＣＥＡ抗体は、各種の抗体
混合物であって、ＣＢＡ分子上の多くの抗原決定基のほ
とんど全部と反応性を有している。この欠点をなくする
ために、各種の単りローン性抗ＣＦｔＡ抗体が重要視さ
れている。その理由は次の通りである。

（１１細胞融合という常法によって得られる単りローン
性ＣＩＡ抗体は、唯一つの抗原決定基に対してのみ特異
性を有しているから、抗原との反応性が均一であろう。

（２）単クローンの増殖によって、所望の均一性をもつ
多量の抗体が得られるであろう。

（３）多種類の単クローンを得ることができる。これら
は全体として、公知の多クローン性抗ＣＫＡ抗体と同様
に広範囲の特異性を持つであろう。

このようにして、単クローン性抗ＣＥＡ抗体の製造が、
たとえば次の文献にあるように試みられている。

Ａｃｃｏｌｌａ、　Ｒ，８，ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、
１ｌａｔｌ、　Ａｃａｄ、θｃｉ、ＵＳＡ、。

７７、５６３　（１９８０）　：　Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、
　Ｋ、　Ｆ、　、　Ｃａｎｃｅｒ工ｍｍｕｎｏｌ。

工ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、、　ＩＱ、　ｌ　（１９８０）
　＋　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｇ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ。

Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　４３．　ｌ　（１９８１）
　；　Ｋｕｐｃｈｉｋ、　ＨｏＺ、　ｅｔａｌ、　Ｃａ
ｎｃｅｒ　Ｒｅｅ、　、　４１　＋　３３０６　（１９
８１）。

これら既報の単クローン性抗体の反応特異性は、次の通
りに要約される。

（１）　　Ａｃｃｏｌｌａら、、　　２つのハイプリド
ーマから得られた抗体はＮＧＤ　（ＮＣＡと同等である
と思われる）と微弱に反応し、ＣＥＡと強く反応した。

これらの２つの抗体とＣＥＡとの反応には競合的阻害が
みられ力かった。各抗体はＣＥＡ分子上の別の抗原決定
基と反応するようである。

（２１Ｍｉｔｃｈｅｌｌ、　　１つの抗ＣＥＡ抗体が得
られた。

これはＣＥｊＡと反応したがＮＣＡと反応しなかった。

ＣＥＡとの反応を多クローン性ヤギ抗ＣＥＡ抗体で阻止
できなかった。

（３）　　Ｒｏｇｅｒｓら。　１つの単りローン性抗Ｃ
ｌ抗体が得られた。これはＩＩ！Ｉ！瘍組織からのＣＥ
Ａ標品と弱く反応したが、患者の血清中のＣＫＡと強く
反応したう （４１Ｋｕｐｃｈｉｋ　０９個のクローンのうちの１個
の単クローン性抗ＣＥＡ抗体が検討された。その反応特
異性と多クローン性ヤギ抗ＣＥＡ抗体と比較したところ
単りローン性抗ＣＢＡ抗体は、多クローン性抗ＣＦｉＡ
抗体と反応するＣＩＩＤＡ分子のうちの１部のＣＨｉＡ
分子とのみ反応した。

これらの公知の単りローン性抗（ＪｔＡ抗体の反応特異
性についてのよりくわしい検索はなされていない。

この間に我々は、ある種のＣＥＡ関連抗原すなわち前記
のＮＦＡ−１、ＮＦＡ−２およびＩＪＦＣＡがヒトの正
常糞便に存在することを見出し、これらの分離に成功し
た〔特開昭５６−４６８１９号、Ｃａｎｏｅｒ　Ｒｅｓ
、。

４１、７１３−７２０　（１９８１）　）。さらにとれ
らのＣＥＡ関連正常抗原を用いてＣＦｉＡ分子の抗原構
造を調べた結果、ＣＥＡ分子上の多くの抗原決定基を、
たとえば次の通り釦分類し得ることを提案した。

（１）個体特異的抗原決定基 免疫抗原として用いた個々のＣａｌ！ｉＡ標品にのみ見
出される特異的な抗原決定基で、他の個体から得られ九
ＣＢＡ標品には見出されないもの。

（２１ＣＥＡ％異決定基 癌組織から得られたＣＥＡ標品に共通して見出される抗
原決定基であるが、ＮＦＡやＮＣＡ々どＣＢＡ関連正常
抗原には見出されない。最も崩性異性の高い抗原決定基
である。

（３１ＮＦＡ　−１共通決定基 ＣＪＣＡ　、　ＮＦＡ　−２およびＮＦＡ　−１の３者
に共通して見出される抗原決定基で、ＣＫＡ分子上の主
要抗原決定基の１つである。

（４）　　ＮＦＣＡ共通決定基 ＣＦｉＡ　、　ＮＷＡ−２オよびＮＦＣＡの３者に共通
して見出される抗原決定基で、これもＣＩＡ分子上の主
要抗原決定基の１つである。

（５１ＮＣＡ共通決定基 ＣＫＡ　、　ＮＦＡ　−２、ＮＦＣＡオＪ：びＮＣＡ　
（７）　４者に共通して見出される抗原決定基で、Ｃ１
および関連抗原に最も広く共通して認められる抗原決定
基である。

本発明は、我々がひとの正常糞便から分離した上記のＣ
ＥＡ関連抗原を用いることによって、単りローン性抗Ｃ
Ｂ）Ａ抗体産生能を有する単クローンを、抗原との反応
性の観点において選別し得るという知見に基いている。

本発明の目的は、単りローン性抗ＣＭ抗体の製造方法、
この方法に用いられる単クローンおよびこの種の抗体の
用法を提供することにある。

本発明は、哨乳動物を所与のＣＢ＋Ａ標品（以下筒１　
ＣＫＡという）で免疫することによシ、抗体産生能を有
する細胞を産生じ、こうして産生された細胞を哺乳動物
から採取し、採取された細胞を他の哨乳動物由来の株化
腫瘍細胞と融合させ、得られた融合細胞（ハイブリドー
マ）をクローニングし、得られた単クローンを培養し、
培養物から所望の単クローン性抗体を回収する工程から
なる癌胎児性抗原（ＣＦｉＡ　）に対して特異性を有す
る単クローン性抗体の製造方法に関する。本発明の方法
は、（イ）上記の所与のＣＩ！ｉＡ　（第１　（ＪＡ　
）標品をマーカーとして用いることにより、上記融合細
胞を、マーカー抗原と反応する抗体産生能の観点から選
別すること、および（ロ）上記の所与のＣＫＡ　（第１
　ＣＢＡ　）以外のＣＩ！ＩＡ標品（以下筒２　ＣＫＡ
という）と正常成人由来のＣＥＩＡ関連抗原とからなる
群から選ばれた１種以上の抗原をマーカーとして用いる
ことによシ、上記のクローニングによって得られた単ク
ローンを単りＵ−ンの産生する単クローン性抗体と上記
のＩＮ以上のマーカー抗原との反応性の観点から選別す
ることを特徴としている。

次に本発明により、上記方法によって産生された単クロ
ーン性抗体および上記方法によって選別された単クロー
ンが提供される。

実用的には、ＣＦｌ！Ａ関連抗原としてはヒト成人の正
常糞便由来のＮＦＡ−１、ＮＦＡ−２およびｆ−ＮＣＡ
が選けれ、選別は放射性物質で標識されたマーカーを用
いる周知のラジオイムノアッセイ法によって行なわれる
。

本発明による単クローンから得られる単クローン性抗体
は、Ｃ［Ａ分子上の対応する抗原決定基との反応性が均
一かつ明確であるから、たとえばヒトの癌の診断治療の
ような臨床応用や各種の基礎医学研究用に有利に用いる
ことができる。

本発明の単クローンを、たとえば次のように常法によっ
て得ることができる。免疫される哨乳動物は、たとえば
マウス、ラット、モルモットのような小動物でも、ウサ
ギ、ヤギ、牛、馬のような大動物でもよい。動物を常法
により免疫する。たとえはマウスを、所与のＣＢＡ標品
すなわち第１Ｃ匙Ａ加μ２を含むフロイントの完全アジ
ュバントを用いた乳化液０．２４の皮下注射によって免
疫し、５週間徒に食塩水０．’；／ｌｌ中の同量のＣＫ
Ａの静脈注射によって免疫する。３日後に常法により動
物の牌およびリンパ節細胞を採取する。採取された抗体
産生細胞と適当な腫瘍細胞〔だとえばＰ　３−　Ｘ　６
３−　Ａｇ８．６．５．３（たとえばＰ３−Ｘ６３−Ａ
ｇＲ−ｕｌ　）、Ｅｌｐ　２１０−Ａｇ　１４．２１０
、ＲＣＹ３、Ａｇ１．２．３　など〕とをＩ×１０８抗
体産生細胞／Ｗｌ対１−２ＸｌＯ’呻瘍細胞／−の比で
、すなわち５対１から１０対１の比で混合し、常法によ
り、たとえばＨＶＪ　（仙台ウィルス）まだはＰＰ１Ｇ
　（ｒｌｆｌエリレングリコール）を用いて融合する。

ＨＡＴ培地を用いて選別すると、正常細胞は死滅し、融
合細胞が残存する。第１　ＣＢＡと反応する抗体産生能
の観点において、融合細胞を選別する。選別された融合
細胞は抗ＣＥＡ抗体産生能を有する融合細胞である。こ
れを常法によりクローニングし、得られた単クローンを
、単クローン由来の抗体とＣＥＡおよび（ＫＡ関連抗原
との反応性の観点から選別する。それ自体公知のラジオ
イムノアッセイ法によって実用的に選別することができ
る。下記の実施例で用いた選別法はＦａｒｒの硫安沈殿
法（Ｆａｒｒ、　Ｒ，８，、Ｊ、工ｎｆ、Ｄｉｓ、　、
　１０３．２３９（１９５８）］である。ＣＩＡ関連抗
原関連用的な例は正常成人糞便由来のＮＦＡ−１、ＮＦ
Ａ−２およびｆ　−ＮＣＡで、これらの性状は前記の通
シである。これらのＣＩＡ関連抗原の製造は後記参考例
に記載されている。

後記実施例１において行なわれた選別の結果が第１表に
示されている。

第１表において、正常成人糞便由来のＣＦｉＡ関連抗原
ＮＦＡ　−２は放射性ヨード標識され、次に単クローン
培養上清に加えられ、ラジオイムノアッセイが行なわれ
る。その結果、単クローン（クロー／Ａ、奥施例１では
約１ｏ株）と単クローン（クローンＢ、実施例１では約
２００株）が選別される。

クローンＡの産生ずる抗体Ａｔ１ＮＦＡ−２と反応しな
い。クローンＢの産生する抗体ＢはＮＦＡ　−２と反応
する。抗体ＡはヒトのＣＩＡと反応し、正常成人糞便由
来のＣＢＡ関連抗原と反応しない。

１つ以上の第２　ＣＩ！ｉＡ　（実施例でＪｔ　４種）
を用いて、同様の方法でラジオイムノアッセイを行なう
と、クローンＡからクローンＡｌ（実施例１では８株）
の産生ずる抗体１は第１　ＣＩＡと反応する。

第２　ＣＢＡと反応せず、クローンＡ２の産生する抗体
２は第１および第２　（ＪｉＡと反応する。

同様の方法でＮＦＡ　−１を用いて、ＮＦＡ　−２と反
応する抗体を産生ずるクローンＢを選別すると、クロー
ンＢ１およびＢ２が得られる。クローンＢ１（実施例１
では約７０株）の産生ずる抗体３は、ＮＦＡ−１および
１ｉＦＡ−２と反応する。クローンＢ２（実施例１では
約１００株）の産生ずる抗体Ｂ２は、ＮＦＡ−２と反応
し、ＮＦＡ　−１と反応しない。ＮＦＡ　−１の分子量
は小さいが、抗原活性は強いので、実施例１では約７０
株のクローンＢ１が得られた。

ｆ　−ＮＣＡを用いて同様の方法でクローンＢ２から、
クローンＢ２−１（実施例では約ω株）とＢ２−２（実
施例１では約４０株）が選別きれる。クローンＢ２−１
の産生する抗体４はｆ　−ＮＣＡと反応しないが、クロ
ーンＢ２−２の産生する抗体５はｆ−ＮＣＡと反応する
。

所望により、ＮＦＡ　−２以外の他の抗原をクローニン
グで得られたクローンの最初の選別に用いることができ
る。たとえば、ＮＦＡ　−１を最初に用いること忙よシ
、産生される抗体とのＮＦＡ　−１との反応性の観点か
ら単クローンを選別することができる。

本発明によって選別された５種類の単クローンから産生
される単りローン性抗ＣＦｉＡ抗体は、全体として、約
４０％が工ｇＭ、約５０チが工ｇＧ、約ｌＯ％が工ｇＡ
に属することがわかった。

本発明による単りローン性抗＋ＩＡ抗体を各種の臨床的
用途および基礎医学研究用に有利に用いることができる
。たとえは、抗体２は臨床用に最も有利であり、抗体３
は血中ＣＢＡ濃度の測定に価値があると考えられる。な
お、本発明による単クローンを常法によって工業的規模
で増殖することができる。

本発明による単りローン性抗ＣＩＡ抗体の用法は抗体の
反応特異性および用途によって異々るが、代表的な用法
を次に例示する。

１０組織学的検索法 たとえば細胞の浮遊液または塗抹標本あるいけ組織切片
のよう々細胞標品を本発明の単りローン性抗ｉＡ抗体で
３７°Ｃで（資）分処理し、食塩水で十分に洗浄したの
ち、螢光色素（ｔｅｔｒａｍｅ−ｔｈｙｌｒｈｏｄａｍ
ｉｎｅ　１ｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅまたはｆｌｕｏ
ｒｅｓ−ｃｅｉｎ　１ｅｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　）
で標識した抗マウス免疫グロブリン抗体溶液で３７°Ｃ
で加分処理し、螢光顕微鏡を用いて螢光陽性の細胞を検
索する。

所望によシ螢光色素の代わりに抗マウス免疫グロブリン
抗体に結合されたペルオキシダーゼを用いる酵素抗体法
による検索も可能である。

■、血中ＣＩＡ濃度測定法 本発明の単りローン性抗ＣＦｉＡ抗体による血中（ＪＡ
濃度の正確な測定は、次に例示するように、たとえば硫
安沈殿によるＦａｒｒの方法、抗マウス免疫グロブリン
抗体を用いる二抗体法、ジルコニウムケ゛ルを用いる２
ゲル法および固相抗体サンドインチ法などＫよって行な
うことができる。

（１）抗マウス免疫グロブリン抗体による二抗体法の例
。

ヒトの血清（資）μｔをプラスチックチューブ（たとえ
ば栄研チューブ陰１：栄研化学社製慕径９．８＃Ｉ＃＋
、長さ８　ｃｍ　）に入れ、０．５％Ｂ８Ａを含む０．
１　Ｍ酢酸緩衝液（１）Ｈ６，Ｏ）　２００μｔを加え
て希釈する。０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ，６，０）で（
資）倍に希釈した正常マウス血清を用いて、適当忙希釈
された本発明の単りローン性抗ＩＡ抗体液関μｔをとり
、上記チューブに入れて３７°Ｃで（９）分反応させる
。後記参考例１記載の方製 法で調Ｖされ１２６エで標識された適当なＣＩＡ標品（
１，５ｎｌＰ）の酢酸緩衝液溶液（５０μｔ）をチュー
ブに加え３７°Ｃで１時間反応させる。次すで正常マウ
ス血清（ｘ５０＋５０μｔ）中の免疫グロブリンを充分
に沈降させうる量の抗マウス免疫グロブリン抗体を含む
ウサギまだはヤギ抗マウス免疫グロブリン血清１００ｔ
１ｔを反応混合液に加え４°Ｃで一夜反応させる。生じ
た沈降物を遠心操作（３０００ｒ、　ｐ、　ｍ、／　３
０分）で落し、０．９４食塩溶液で沈降物を洗浄したの
ち、沈降物の放射性をガンマ−計測機で測定する。

ＣＥＡを１１　／１ｔｔｌから５０ｎｆ／ｓｌ　ｔでの
各濃度で含有する０、１Ｍ酢酸塩緩衝液（子牛ガンマグ
ロブリン１．２チおよびＢＡＡ　Ｏ，５％とを含み、１
）Ｈ６，０）を検体血清と同様に処理し、標準検量線を
作製する。検体血清中のＣＦｉＡの測定値よシ血中ＣＩ
Ａ濃度を算出する。

正常人血清の測定値（正常値）は用いる単りローン性抗
ＩＡ抗体の種類により一般に異なるので、簡単には特定
でき々いが、平均正常値に標準癲差（８，Ｄ、）の２倍
の値を加えた値以上の値を病的高値として悪性腫瘍検出
の判断に用いることが実用的である。

（２）　　固相抗体サンドイツチ法の例。

この方法は最も高感度である。原理は、プラスチック製
ピーズまたはチューブに本発明で得られた単りローン性
抗ＩＡ抗体の中の一種の抗体を固相−次抗体として吸着
結合させる。この固相−次抗体と検体中のＣＢＡとを反
応させたのち、−次抗体とは対応する抗原決定基の異な
った別の単りローン性抗ＣＩＵＡ抗体を　工でヨード化
した標識二次抗体として反応させると、検体中のＣＢＡ
量に応じて標識二次抗体が結合する。既知量のＣＩｒ１
ムを同じ操作で測定して得た検量線より検体中のＣＢＡ
量を算出する。

（ａ）　　固相−次抗体の作製 一次抗体としてどのような特性をもった単りローン性抗
ＣＩＡ抗体を選ぶかは測定系の目的によ如変わシ得るが
、最も普遍的な目的には、ｃｇム分子上の最も主な抗原
部位と考えられるＮＦＡ　−１共通部分に向けられた抗
体３を選ぶとよいので、抗体３の例について次に説明す
る。抗体３として分類された単クローン性抗ＣＥＡ抗体
の中からＣｉとの反応親和性（Ｋａ）が強いもの（少な
くともＫａ≧Ｉ　Ｘ　１０９Ｍ−１）を選ぶ。Ｋａの測
定は次の如く行なう。抗体３′標品の一定−Ｍｌ　（た
とえば１０μ２）に最高２００μｆまでのいろいろな量
の１″８Ｉで標識されたＣＦｉＡ　［０，０１Ｍ硼酸緩
衝食塩水（Ｂ、Ｂ、Ｓ、）ｐＨ８，０＋正常ウサギ血清
（１チ）およびＮａＮ、　（０，０５％　）を含む〕を
加える。各混合液を３７°Ｃ１１８時間保温した後、そ
れぞれ７５チ飽和硫安液（４００μｔ）を加え、４°Ｃ
に１時間保ち、次に遠心処理（１８００ＸＩｙ３０分間
）により上清を除去する。

沈降物を５０％飽オロ硫安溶液で洗浄する。上清（２０
０μＬ）および沈降物の放射活性をガンマカウンターを
用いて測定する。同様の方法をくシ返し、結合されたＣ
ＩＡと遊離ＩＡとの比を求め、これから常法（８ｔｅｖ
ｒａｒｄ　Ｍ。

Ｗ、　＆　Ｐｅｔｔｙ　ｌ’ｔ、　Ｅｌ、　、工ｍｍｕ
ｎｏｌ、、　２２．７４７　（１９７２））Ｋよシ反応
親和性（Ｋａ）を算出する。こうして得られた高親和性
の抗体３標品をラウリル硫酸す）リウム（０，０１％　
）、］！Ｊ）ＴＡ　（０，０５％）を含む０．００１　
Ｍリン酸靜衝液（１）Ｈ６，０）でたとえば５００倍忙
希釈しく抗体濃度として５〜１０μｆ／ＷＬｌ徨度）、
これをプラスチックピーズまたはチューブのコーチング
に用いる。

固相マトリックスとしては各種のプラスチック與チュー
ブやビーズを用いうるが、たとえば直径約６ｍのポリス
チレンピーズ（たとえば米国、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐ
ｌａｓｔｉｏ　Ｂａ１１社製）を十分洗浄したのち、上
記単りローン性抗ＣＩ！Ｉム抗体（抗体３）溶液に浸し
、室温に一夜静置する。ビーズを２回蒸留水で洗浄した
のち、０．００１　Ｍグリシン塩酸緩衝液ｐＨ２，３で
処理し、さらに蒸留水で２回洗浄したのち、０．５Ｍの
食塩と０．５　％ウシ血清アルブミン（ＢＡＡ）とを含
む０．１　Ｍリン酸緩衝液中に３時間浸し、最後は真空
乾燥して冷所に保存する。

（１））　　標識二次抗体の作製 標識二次抗体として伺を用いるかにより、得られる結果
は著しく異なる。後記第２表かられかるように、たとえ
ば抗体２を二次抗体として用いることによって得られる
ＣＥＡ測定系は、癌組繊中のＣＦｔＡとのみ反応するが
、ＮＦＡやＮＣムとは反応しない、最高の癌特異性をも
つ系であるが、抗体５を二次抗体として用いることＫよ
って得られる測定系は、ＣＩＩＣＡと共にＮＦＡ　−１
以外のすべての関連抗原をも測定し得る系である。また
抗体３として同定される各種抗体のなかでもその抗体と
反応する抗原決定基が一次抗体の抗原決定基と同一のも
のけ二次抗体に用い得ないが、抗体３に属する抗体のな
かでも、−次抗体の対応する抗原決定基以外の抗原決定
基と反応するものであれは、二次抗体として用いること
ができる。次の例は、抗体２を用いた最高の癌特異性を
有する測定系である。

抗体２として同定された各種抗体のなかから、ＣＩＡと
の反応親和恒数の最も高い（少なくともＫａ≧ｌＸ１０
’Ｍ−”　）ものを選ぶ。ＣＦｔＡト＊　７７　ｏ　−
ス４　Ｂを結合（ＩＯ！／　１．Ｏｆドライゲル）させ
たＣＦＩＡ吸着剤を用いて、上記単りローン性抗ＣＦｉ
Ａ抗体を特異的に精製しく参考例２参照）、得られた抗
体標品を公知のクロラミンＴ法（Ｈｕｎｔｅｒ　＆Ｇｒ
ｅｅｎ−ｗｏｏａ、　１ｇ６２．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌ
ｏｎｄｏｎ　）　１９４１４９５　：）によＪ、　１２
６１で標識し、放射活性の強さ約５ｎ　Ｃｉ　／　ｎｆ
’抗体の標識抗体を得る。

（０）　　ラジオイムノアッセイ 検体として得たヒト血清（または血漿）関μｔをプラス
チック製試験管（たとえば栄研チューブ９．８　Ｘ　８
０　ｆｌ　）にとり、ＢＡＡ　（０，５チ）を含む０．
１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ６，０ヲ２００μを加え、これに上
記の抗ＣＦｉＡ抗体を結合したビーズ１個を入れ、室温
で試験管を回転させながら４時間反応させる。反応後反
応液を吸引除去し、０．９４食塩水１ｄで１回洗浄し、
抗体２をヨード化して得た標識二次抗体液（１チＢＳＡ
を含む０．０５Ｍ）リス塩酸緩衝液で約６００　ｎＣｉ
　／　ｔｒｔｌに希釈した標識塩水で２回洗浄したのち
、ビーズの放射活性をガンマ−カウンターで測定する。

検量線作製用として、精製ＣＥＡを１ｎ１／１ｔｔｌ、
　　３Ｍ’／ｍｌ、　ｌ０ＩＶ／ｍＪ、　３０ｎＰ／＋
＋＋、／および１００　ｎｆ’　／　ｍ、ｌの濃度に、
１．２％ウシガンマグロブリンおよび０．５　％　ＢＡ
Ａを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液ｒｌＨ６，０で調製した各
標準溶液を用いる。各標準液５０μｔをとシ、上記検体
の処置と同様の操作によって、抗体でコーチングされた
ビーズおよび放射性ヨードで標識された二次抗体とそれ
ぞれ反応させる。とのようにして、各標準溶液の放射活
性（Ｂｃｐｍ）得る。ＥｃｐｍからＣＥＡを含まないコ
ントロールの値Ｂ′を差し引いたＢ　−Ｂ’を算出し、
対応するＣＫＡ濃度をプロットして検量線を描き、これ
を用いて検体中のＣＪｔＡ濃度を算出する。

抗体２を標識二次抗体と用いた本例では、正常人血清ま
たは血漿との反応は弱い。さらに正常人のＣＥＡ濃度の
平均値は用いる抗ＣＫＡ抗体標品の特性たとえばその親
和恒数Ｋａ［よって著しく異なり、具体的数値を容易に
特定できない。しかし実用的には正常人の平均値に標準
偏差（８，Ｄ、）の２倍の値を加えた値以上の値を病的
高値として悪性腫瘍検出の判断に用いることができる。

（３）以上に述べたように本発明は、ＣＥＡおよびＣＩ
Ａ関連抗原の濃度測定法を提供する。この方法は、本発
明による単りローン性抗ＣＦｉＡ抗体を放射性物質で標
識してマーカーとすることを特徴としている。この方法
によって、従来の多クローン性および単りローン性抗Ｃ
ＦｉＡ抗体を同じ目的に用いる場合に比較して、所望の
抗原の濃度を−そう正確に測定することができる。

癌の診断治療のほかに、本発明による単りローン性抗Ｃ
ＦｉＡ抗体を、たとえば、細胞の悪性変化に伴なう遺伝
子発現の胎児期への先祖帰り現象としての（ＪＡ産生や
ＣＦｉＡの生物活性および分子構造の解明に用いること
ができる。

下記の本発明の実施例において、　Ｆａｒｒのラジオイ
ムノアッセイ法は次の通り行なわれだ。

”’Ｉで標識されだＣＢＡ標品（５−１０ｎｆ＋５０μ
Ａ）および単クローンの培養上清（５０μｔ）を９６ウ
エルのマイクロタイタープレートの各ウェルに入れ、よ
く混合した。３７°Ｃで１時間静置した後、飽和硫安溶
液（１００μｔ）を各ウェルに加え、さらに３７°Ｃで
１時間静置した。次に反応混合物を遠心処理（２０００
ｒ、　ｐ、　ｍ、／　３０分間）して上清を分離し、そ
の１００μｔの放射活性をガンマカウンターで測定した
。

抗体と共に沈降した放射性ＣＫＡの量から、単りローン
性抗（ＪＡ抗体産生能をもつ融合細胞が同定された。

実施例１ 約５退会のＢＡＬＢ／ｃマウス（ＥＩＰＦマウス：静岡
系実験動物農業協同組合より入手）２匹をＣＫＡ　（参
考例１の方法で調製）で免疫した。すなわち各動物につ
いて、初回側μｆのＣＢＡをフロイントの完全アジュバ
ン）（ＤＩＦＣＯ社製）を用いた乳化液０．２−と共に
腹腔内投与し、５週間後に同量のＣＦ、Ａ（食塩水０．
２ｄ中ＣｌＡ２０μｆ）を各マウスの静脈内に投与した
。その３日後に動物を殺し、牌およびリンパ節より抗体
産生細胞（類リンパ球）を採取した。約１ｘ１０８個の
類リンパ球と１ｘｌＯ７個のアザグアニン耐性マウス骨
髄腫由来株化細胞Ｐ３−Ｘ６３−λｇＢ−ｕｌ　［Ｙｓ
ｌｔｏｎ、　Ｄ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｃｕｒｒ、Ｔ
ｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、工ｍｍｕｎｏ１．．８１．１　（
１９７Ｂ　）　〕と混合した。４５％（Ｖ／Ｔ）ポリエ
チレングリコール４０００　（米国シグマ社製）１ｗＬ
ｌを混合物に滴下し、３７°ＣＫ７分間保ち、その後Ｄ
−ＭＥＭ　（日永製薬製）１５ｄを混合物に滴下するこ
とにより、ポリエチレングリコールを希釈した。融合細
胞をＤ−ＭＥＭ　（３０ｒｔｔｌ　）で洗い、１０チウ
シ胎児血清（ＰＣＢ　）　（米国ＧｉｂｃＯ製）、ペニ
シリン（１００単位／　ｍｅ　）　ト’ｙ’ンタマイシ
ン（５０μり／１）とを含むＤ−ＭＥＭ　（１００ｍｌ
　）中に浮遊させた。細胞浮遊液（各Ｉ　ＷＬｔ　）を
９６のウェルに入れ（各Ｕウェルのミクロタイター板使
用）、炭酸ガス存在下で３７°Ｃに一夜放置した後、Ｈ
ＡＴ培地（４ｘ　ＩＱ−’Ｍのアミノプテリン、　　１
．６Ｘ１０−３ＭのチミジンおよびｌＸｌ０−’Ｍのヒ
ボキサンチンを含む培地、ｐＨ７）各１　ｍｌを各ウェ
ルに分注し、次に培地の半分を２日おきに新しいＨＡＴ
培地と取りかえた。１１日日月培地の半分をＨＴ培地（
上記ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）と取
りかえ、次に２日おきに培地の半分を１０％ＦＣ８を含
むＤ　−ＭＦｊＭと取りかえた。

＃１とんど全部（９８チ以上）の培地で融合細胞の発育
が認められた。培地の上清を各ウェルから採取し、前記
の第１　ＣＫＡを用いるＦａｒｒの硫安沈殿法によって
抗ＣＥＡ抗体を産生ずる融合細胞（ハイブリッドーマ）
を選別した。次に抗ＣＥＡ抗体産生能を有すると認めら
れた融合細胞を次のように限界希釈法によって単クロー
ン化した。

１０チのＰＣＢ　（ウシ胎児血清）を含むＤ−ＭＥＭで
融合細胞を３細胞／　ａｔになるように希釈し、各０．
２１をミクロタイタープレートの各ウェルに入れた。

廉 Ｘ線照射された若いＢＡＬＢ／Ｃマウスの脚線細胞（約
５ｘｌＯ’細胞／１）を含むＤ　−ＭＥＭを用いて３７
°Ｃで２週間培養後、ウェル中で増殖する細胞を単クロ
ーン融合細胞として同定し、さらに限界希釈法をくシ返
し行なうことにより、単クローン性を確実にしだ。

こうして培養上清中に約１０１　／ｌｕｇ以上の抗ＣＥ
Ａ抗体産生能をもつ単クローン性融合細胞が得られた。

実施例１で用いられた第１　ＣＦｉＡは後記参考例１記
載の方法で得られたものであるが、所望によりその他の
適当なＣＥＡ標品を同じ目的に用いることもできる。２
匹のマウスより通常２０−３０個の単りローン性抗ＣＥ
ＩＩＡ抗体産生融合細胞が得られる。

上記操作を士数回繰シ返して得られた約３００株の抗（
ＩＡ抗体産生融合細胞の培養上清と放射性ヨ−ドで標識
し九ＣＢＡ　、　ＮＦＡ　−２，１げＡ−１およびｆ　
−ＮＣＡとの反応性をＦａ。ｒｒの硫安沈殿法によるラ
ジオイムノアッセイによって検索した。結果を前記の第
１表に示す。

実施例２ 実施例１の方法で得られた抗体１から５まで（第１表参
照）を別々に第１ｃＦｉＡ、第２　ＣＥＡおよび正常人
糞便由来のｃｗｈ関連抗原すなわちＮＦＡ　−１、ＮＦ
Ａ　−２およびｆ−ＮＣＡを用いたＦａ　ｒｒのラジオ
イムノアッセイ法によって調べ、全抗体１から５までと
、上記全抗原との反応性を解明した。その結果を示す第
２表において、ｒ＋Ｊ　ｒ−Ｊは反応性の有無を現わし
ている。

第２表　単りローン性抗ＣＢＡ抗体とＣＥＡおよびＣＩ
Ａ関連抗原との反応性 抗　原　　　　　　抗体　１　　２３４５ヒトＣＢＡ第
ｉ”　　　　　　　＋　　　＋　　　＋　　　＋　　　
＋第２＄１　　　　　　＋　　＋　　＋　　４−　　＋
正常関連抗原 ＮＦＡ−１−−＋−− ＮＦＡ−２−−＋　　　＋　　　＋ （注）　中動物免疫用Ｃｌｌ１Ａ 中中第１　ＣＫＡ以外のＣＢＡ 第２表から本発明の単りローン性抗ＣＫＡ抗体が次の反
応特異性を有していることがわかる。

（１１全部の抗体１−５は第１　ＣＥｊＡすなわち動物
の免疫に用いられたＣＥＡと反応する。

（２）抗体１は第１　ＣＦｉＡのみと反応する個体特異
的抗体である。本抗体は個体ごとの癌の診断治療に有用
であると考えられる。

（３）抗体２は第１　ＣＢＡおよび第２０Ｆ！Ａと反応
するが、すべてのＣｌ１ｆＡ関連正常糞便抗原すなわち
ＮＦＡ−１、ＮＦＡ　−２およびｆ　−ＮＣＡと反応し
ない。なお実施例１では別々の患者から得られた４つの
Ｃｌム標品を第２　ＣＦｉＡとして用い、だ。本抗体は
抗ＩＡ％異抗体であって、最高の癌特異性を有するから
、各塊の臨床用（たとえば癌の診断確定、放射性物質や
抗癌剤を癌組織に送るための担体力と）や基礎医学研究
用等普遍的々用途に使用することができる。

（４）抗体３け第１　ＣＦｉＡおよび第２　ＣＩと反応
するほか、ＮＦＡ　−１およびＮＦＡ　−２とも反応す
るので、実用的価値のある抗体である。また抗体３産生
能をもつ単クローンを他の抗体産生能をもつ単クローン
よりも簡単力方法で選別することができる。

（５）他の抗体す々わち抗体４．５も、従来の多クロー
ン性および単り四−ン性抗ＣコＡ抗体とくらべて、より
明確々反応特異性と均一性とを有している。

実施例３ 抗ＣＦＩＡ抗体並生融合細胞をＢＡＬＢ　／　ｃマウス
の腹腔内に移植して単クローン性抗ＣＥＡ抗体を生産し
た例。

市販（静岡県夷験動物農業協同組合より入手）ＢＡＬＢ
１０マウス（５〜６週令、雌または雄）を試験動物とし
て用いた。各マウスの腹腔に０．５１１１０プリスタン
を投与し、７−１０日徒に５ｘｌＯ＠〜１０″′個／ｄ
の単クローン性融合細胞（実施例１の方法で得たもの）
を含むＤ−ＭＰＭ　Ｏ，５ｓｕを同じく腹腔内に注射し
た。７〜１０日のち十分に腹水が貯留したマウスから腹
腔穿刺にて腹水を採取し、以後２日おきに５回腹水を採
取したのち、マウスを殺して全採血した。得られる腹水
量は融合細胞の性状により異なり、約２ｄから２０ｄで
あったが、平均的１０１ｄが得られた。各動物の腹水お
よび血清中に含まれる単りローン性抗ＣＩ！ｆＡ抗体の
濃度も融合細胞の性状により異なり約１η／１から約１
（ＩＩグ／１であり、得られる抗体の量も２〜３■から
１００■以上とかなυの差が認められた。

参考例 下記の参考例において、加圧風乾法による溶液の濃縮は
次の方法によって行なわれた（以下風乾法という）。風
乾されるべき溶液を数本のセロファンチューブに入れた
。たとえば溶液（３ｔ）を８−９本のチューブ（米国ビ
スキング社製、　１Ｂ／３２、長さ１５０ｃｒ１１）に
分注し、チューブの上部を適当な導管を介して、たとえ
ば送風機に連結した。チューブを垂直に支え、下方的り
を脱塩水または適当な緩衝液を満たした容器に浸漬し、
残りの部分に扇風機からの風を当てた。

参考例１ 本明細書記載のＣＫＡ標品は、特記しない限り、次の方
法によって作成された〔資料。特開昭５６−４７７６２
号公報〕。

ヒトの大腸癌肝転移巣１２０ｆに生理食塩水７００１を
加えてすりつぶし、遠心処理（９０００ｒ、　ｐ、　ｍ
、７４０分間）により上清を得た。上清７１０ｄＫ６０
チ過塩素酸溶液８０　ｍ、ｌ　（過塩素酸濃度０．６　
Ｍ　）を加え、生じた沈殿を遠心処理（９０００ｒ、　
Ｐ、　ｍ、７４０分間）により除去し、得られた上清を
一夜流水で透析し、過塩素酸および透析性不純物を除去
した。透析η液をセロファンチューブ（ビスキング製、
１８／３２、長さ１５０　ｃｙｎ　）　３本に分注し、
前記の風乾法により合計８ｄＫ濃縮した。濃縮液を遠心
処理（１５０００ｒ、　り、　ｍ、／　３０分間）する
ことにより、ＣＫＡ粗抽出液を得た。

セファロース４Ｂ（スエーデン国、ファルマシア・ファ
イン・ケｉカルズムＢ製）のカラム（２，６ｘ　１７１
　ｔｙｎ　）を０．０５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ５，２）で洗浄し、上記のＣＩＡ粗抽出液７．５ｔ
ｔｔｉを負荷し、上記と同様の緩衝液で溶出した。カラ
ムの溶媒容量と同じ位置に溶出する分画４Ｂ−１のほか
、それぞれ２，１．２．５および２．７倍の位置に溶出
する分画４Ｂ−２ないし４Ｂ−４が得られた。ＣＫＡの
大部分を含む分画４Ｂ−２を回収し、前記の風乾法に＼
、。

より濃縮液（３，５ｔｇ）を得た。セファロース６Ｂ（
スエーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミカルズ製
）のカラム（１，９ｘ　１４５　ｃｍ　）を上記と同様
の緩衝液で洗浄し、上記の濃縮液３．５ｄを負荷し、同
様の緩衝液で溶出し、カラムの溶媒容量の１．６倍の位
置に非対称形のピークが出現した。溶出の初期に得られ
る分画６Ｂ−１（約２０ｍ／）は高分子量の不純物を含
み、終りに得られる分画６Ｂ−３（約％）はＮＣＡ　（
非特異的交叉反応抗原）を含んでいた。全体の約％に和
尚する中間部（約６０ｄ）を回収して集め、風乾法によ
って分画６Ｂ−２（３罰）を得た。セファデックスＧ−
２００（スエーデン国、ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ製）のカラム（１，９ｘ　１４５　ｃｍ　）を上
記と同様のリン酸す）　ＩＪウム緩衝液で洗浄した後、
分画６Ｂ−２（３１）を負荷して、同様の緩衝液で溶出
したところ、カラムの溶媒容量の約１．２倍の位置に対
称形のピ゛−クが出現した。このピークの中間％に位置
する分画（約４５ｘｌ）を回収して集め、風乾法により
濃縮した。この濃縮液から精製されたＣＥＡ　（５０■
）が回収された。その高純度であることが、たとえば免
疫電気泳動法（ウサギ抗体使用）Ｋよって確認された。

精製されだＣＥＡは一種の糖蛋白質であって、分子量は
約加万±８万、糖と蛋白質との比は約１：１、紫外線吸
収スペクトルにおける極大吸収は２７７ｎｍ、小さな肩
部が２８３ｎｍＫ見られた。

参考例２ 本明細書記載のＣＦｔＡ関連正常抗原すなわちＮＦＡ−
１、ＮＦＡ　−２およびｆ　−ＮＣＡは次の方法によっ
て得られた（資料。特開昭５６−４６８１９号公報）。

成人の正常糞便２５０ｔを０．６Ｍ過塩素酸溶液２５０
０ｄＫ加え、よくかくはんし、ガーゼで濾過し、食物残
渣などの不溶解物を除いた。これを遠心処理（７０００
ｒ、　ｐ、　ｍ、／　３０分間）して得た上清を流水で
一夜透析して、過塩素酸および透析性不純物を除いた。

透析内液を９本のセロファンチューブ（／ビ メスキング製、１８／３２、長さ１５０ｃｒｎ）に分注
し、前記の風乾法で合計３０　ｍｌまで濃縮した。同様
の操作を４回くり返すことにより、合計１２０−の粗抽
出液を得た。このものは合計的１０■の所望のＣＦｉＡ
関連正常抗原を含有していた。

特異抗Ｃ］ｒｉＡ抗体と結合された抗ＣＥＡ抗体吸着剤
（１０■、後記の方法で製造された）を上記の粗抽出液
に加え、４°Ｃで冴時簡反応させた。反応液を除去した
後、冷硼酸緩衝液（ｐＨ＝　８．０　＋　０．０１　Ｍ
硼酸緩衝液＋０．１５ＭのＮａＣＬを含む）で洗浄し、
グリシン塩酸緩衝液（０，１７５Ｍ　ｉ　ｐＨ＝　２．
３　＄　２００　ｍＪ　）で麟出した後、グリシンＮａ
ＯＨ緩衝液（１，０Ｍ　＋ｐＨ＝９）で中和することに
より、粗（ＪＡ関連抗原（乾燥重量９■）を含む溶液を
得たこの溶液を上記の風乾法で１．２ｍ／まで濃縮し、
セファロース５Ｂ（スエーデン国、ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズ製）のカラム（１，３Ｘ８０α）に負
荷した。リン酸塩緩衝液（０，ＯＩＭ　１ｌ）Ｎ５．０
　；０．１５Ｍ　ＮａＣｔを含む）で溶出し、各１ｄの
分画を試験管に分取した。試験管番号６０−７５および
８］−９５をそれぞれ集め分画１と分画２とした。

分画１を約１ｗＬｌに濃縮し、セファデックスＧ−２０
０（１００ｍＪ）のカラムに負荷し、前記と同様のリン
酸塩緩衝液で溶出し、各１１の分画を試験管に分取した
。精製ＮＦＡ　−２を含む試験管番号３０−４０を集め
濃縮した。この濃縮液自体を精製ＮＦＡ　−２の標品と
してそのまま用いることができる。こうして得られだＮ
ＦＡ　−２は一種の糖蛋白質であって、分子量約２万±
３万、糖と蛋白質との比的１：１、紫外線吸収スペクト
ルにおいて極大吸収は２７７　ｎｍＫある。本品のアミ
ノ酸組成はＣＩＡのものと極めて類似し、ＮＦＡ−２の
ＮＨＩＩ末端ア末端酸配列は少なくとも１１位まではＣ
ＦＩＡのものと同一である。

ジエチルアεノエチル・セルロース・クロマトグラフィ
ーによって、分画２から褐色色素を除き［Ｃａｎｃｅｒ
　Ｒｅｓ、、　４１．７１Ｌ　（１９８１）参照］、残
りの溶液Ｋ、後記の抗ＮＣＡ抗体吸着剤３．５ｍＪを加
えた。混合物を４°Ｃで２日間反応させた。吸着剤を回
収し、よく洗浄し、次にグリシン塩酸緩衝液（０，１７
５Ｍ　ＩｐＨ＝　２．３１２０１１Ｌｌ）で溶出し、次
にグリシンＮａＯＨ緩衝液（ＩＭ＋ｐＨ＝９）で中和し
、その後Ｂ、　Ｂ、８．に対して透析し、透析内液を風
乾法で濃縮した。この濃縮液は精製ＮＣＡ　（乾燥重量
ＩＴＩＩｇ）を含み、それ以上精製しなくても、本発明
の目的に用いられる。こうして得られたｆ−ＮＣＡは一
種の糖蛋白質で、分子量約８万±３万、糖含量約加チで
ある。本品のＮ１（−末端アミノ酸配列のうち、少なく
とも側位まではＣＦＩＡと同一である。ｆ　−ＮＣＡの
理化学的性状は、たとえば肺や牌に存在するＮｃＡのも
のと実質的に同一である。

上記の抗ＮＣＡ抗体吸着剤に吸着されなかった物質を含
む溶液を０．５＃Ｉ／に濃縮し、セファデックスＧ　−
１００スーパーファイン（スエーデン国、ファルマシア
・ファイン・ケミカルズ製）のカラム（１，３ｘ　４３
．４　ｃｍ）に負荷し、前記と同様のリン酸塩緩衝液（
０，０１Ｍ　１ｐＨ５，Ｏｉ　Ｏ，１５Ｍ　ＮａＣｔを
含む）で溶出し、試験管に各１　ｍｌずつ分取した。試
験管番号４５−５５（分画ａ）および６５−６　（分画
ｂ）をそれぞれ回収して集めた。セファデックスＧ　−
１００スーパーフアインの同じカラム（１，３ｘ　４３
．４ｍ　）を用いて、分画ａおよびｂをそれぞれ再度ク
ロマトグラフ処理した。このようにして、分画ａから精
製ＮＦＣＡ、分画すから精製ＮＦＡ−１（各乾燥重量０
．５ｍｑ）が得られた。これらはさらに精製することな
く、本発明の目的に用いることができた。こうして得ら
れたＮＦＡ　−１は一種の糖蛋白質で、分子量約２万な
いし３万、糖含量約１３チである。

ＮＦＡ−１のアミノ酸組成はＣＥＡのものに類似である
が、しかしフェニルアラニン、リジンおよびゾロリンの
ようないくつかのアミノ酸ではわずかではあるが有意な
差違が見られた。しかし、ＮＦＡ−１のＮＨ１１末端ア
ミノ酸配列Ｆｉｃ］ｌ！ｉＡ、　ＮＦＡ−２またけＮＣ
Ａのものと全く異なっている。。

前述の抗ＣＫＡ抗体吸着剤および抗ＮＣＡ抗体吸着剤は
次の方法で得られたものである。

参考例１の方法で得られたＣＥＡ標品（乾燥重量１０町
）を常法眞よりＣＮＢＲセファロース４Ｂ（乾燥ゲル１
９＋ス工−デン国、ファルマシア・ファイン・ケミカル
ズ製）と結合させてＣ１！；Ａ吸着剤を得た。これを抗
ＣＦｉＡ血清（５ｏｙ）ト４°ｃで３日間反応させた。

この抗血清をつくるために、任意のＣＦｔＡを用いるこ
とができる。抗ＣＥＡ抗体を結合したｉＡ吸着剤を回収
し、蛋白質の出現を認めなくなるオで冷Ｂ、　Ｂ、Ｓ、
で洗浄し、次にグリシン塩酸緩衝液（各１０ｍ／　＋　
０．１７５　Ｍ　＄　１）Ｈ＝　２．３　）で５回溶出
した。溶出された液を集めてグリシンＮａＯＨ緩衝液（
ＩＭ；ｐＨ＝９）で中和し、次にＢ、　Ｂ、　８．に対
して４°ＣＣ−夜透析した。透析内液を１０ｄまで濃縮
した。この液は特異的多クローン性抗ＣＢＡ抗体！５０
ｍＶを含んでいた。上記の方法を２回くシ返すことによ
って得られた濃縮液２０　ｗｅは、特異的に精製された
多クローン性抗ＣＫＡ抗体１００■を含んでいた。こう
して得られた多クローン性抗ＣＫＡ抗体１００■をＣＮ
ＢＲセファロース４Ｂ（Ｌｏｆ＋スエーデン国、ファル
マシア・ファイン・ケミカルズ製）と常法によって結合
した。これによって、特異的に精製された抗ＣＥＡ抗体
１００〜と結合された所望の抗ＣＢＡ抗体吸着剤が得ら
れた。

抗ＣＥＡ抗体の代わりに抗ＮＣＡ抗体を用いて、上記の
方法をくり返すことによって、セファロース４Ｂと結合
されだ抗ＮＣＡ抗体吸着剤が得られる。

特許出願人　松　　岡　　雄　　治

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　単クローン性抗ＣＥＡ抗体。 （２１ＣＦ２Ａ個体特異的抗原決定基に向けられた特許
   請求の範囲第１項記載の単クローン性抗ＣＥＡ抗体。 （３１ＣＩＡ特異決定基に向けられた特許請求の範囲第
   １項記載の単クローン性抗ＣＥＡ抗体。 （４）ＣＥＡのＮＦＡ−１共通決定基に向けられた特許
   請求の範囲第１項記載の単りローン性抗ＣｇＡ抗体。 （５）ＣｇＡのＮＦＣ’Ａ共通決定基に向けられた特許
   請求の範囲第１項記載の単クローン性抗ＣＥＡ抗体。 （６）　ＣＥＡのＮＣＡ共通決定基に向けられた特許請
   求の範囲第１項記載の単クローン性抗ＣＥＡ抗体。 （７）単クローン性抗ＣＥＡ抗体産生融合細胞。 （８）ＣＩＡで免疫された動物の牌またはリンパ節より
   得られる抗体産生細胞とアザグアニン耐性腫瘍細胞とを
   ポリエチレングリコールの存在下に融合させることを特
   徴とする単クローン性抗ＣＥＡ抗体産生融合細胞の製造
   法。 （９）特許請求の範囲１＋−２ｔ　　３＋　　４＊　　
   ５または６項記載の抗ＣＥＡ抗体を用いる悪性腫瘍の検
   出法。 （１１ＮＦＡ−２ｔ　　ＮＦＡ−ｉ、ｆ−ＮＣＡ＞よび
   ＣＥＡを用い単クローン性抗ＣＥＡ抗体を同定する方法
   。 （１１）　　％許請求の範囲第７項記載の融合細胞をマ
   ウスの腹腔内に移植し、腹腔および血液中に単りローン
   性抗ＣＩＡ抗体を生成蓄積させ、腹腔浸出液および血液
   から単クローン性抗ＣＥＡ抗体を採取することを特徴と
   する単りローン性抗ＣＩＡ抗体の製造法。