ES2232185T3 - Fragmentos divalentes de anticuerpos conjugados a peg. - Google Patents
Fragmentos divalentes de anticuerpos conjugados a peg.Info
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Abstract
Máquina para el tratamiento de la colada con un tambor (3) apoyado en voladizo, que se apoya en un eje horizontal o inclinado de manera que puede girar, estando dispuestos en una carcasa del cojinete (7) dos cojinetes de bolas radiales (9, 10) con sus anillos exteriores (9b, 10b) sin asiento libre y con una cierta distancia axial uno de otro y alojando con sus anillos interiores (9a, 10a) un gorrón de eje (1) unido con el tambor, caracterizado porque los anillos interiores (9a, 10a) de ambos cojinetes de bolas radiales (9, 10) están dispuestos, cuando están montados, sin asiento libre en relación al gorrón del eje (1) y pretensados de manera definida axialmente en relación con los anillos exteriores (9b, 10b).
Description
Fragmentos divalentes de anticuerpos conjugados a
PEG.
La invención se refiere a fragmentos divalentes y
modificados de anticuerpos, a los procedimientos para su
preparación, a las composiciones que los contienen y a su uso en
medicina.
Los anticuerpos han sido usados cada vez más en
la clínica con fines diagnósticos y terapéuticos. El fin en cada
caso es explotar la combinación de la alta especificidad y afinidad
de la interacción anticuerpo-antígeno, para permitir
la detección y/o tratamiento de una lesión particular. El anticuerpo
se usa solo o se carga con otro átomo o molécula tal como un
radioisótopo o un fármaco citotóxico.
La farmacocinética y la distribución biológica de
un anticuerpo juegan un papel principal a la hora de determinar si
su uso en la clínica será exitoso. De este modo, el anticuerpo debe
ser capaz de ser liberado en el sitio de acción y ser retenido ahí
durante un tiempo adecuado para conseguir su fin. También debe estar
presente sólo en concentraciones sub-tóxicas fuera
de la diana y debe catabolizarse de una manera bien definida.
Para muchos usos la farmacocinética de los
anticuerpos no es ideal. Esto es especialmente verdad para el
diagnóstico y terapia de los tumores con conjugados
anticuerpo-radioisótopo o fármaco. Para el
diagnóstico con tales conjugados las largas semividas limitan la
relación del tumor respecto al fondo y, por lo tanto, la
sensibilidad de la detección de la lesión. Para la terapia, una
larga semivida conduce a una exposición a largo plazo al conjugado
de anticuerpo de los tejidos normales y, por lo tanto, a una
toxicidad limitada por dosis.
Están disponibles varios abordajes para manipular
la farmacocinética de los anticuerpos y, normalmente, éstos también
afectan a su distribución biológica. El abordaje más simple y más
generalmente aplicado es el uso de fragmentos de anticuerpo. Éstos
son eliminados más rápidamente de la circulación que los anticuerpos
enteros y se distribuyen más rápidamente desde la sangre a los
tejidos, lo que es una ventaja particular en algunas aplicaciones,
por ejemplo, para el diagnóstico por imagen y la terapia de los
tumores.
Para mejorar la farmacocinética de los fragmentos
de anticuerpo aún más allá los autores de la invención han
investigado el uso de polímeros. La unión de sustancias poliméricas
tales como polietilenglicol (PEG) a las moléculas de proteína está
bien establecida y se ha demostrado que la unión de un polímero
puede alterar sustancialmente las propiedades farmacológicas de una
molécula de proteína. Por ejemplo, la modificación de proteínas con
PEG puede alterar la semivida de la proteína de circulación in
vivo, la antigenia y la inmunogenia, la solubilidad, la
estabilidad mecánica y la resistencia a la proteólisis [Abuchowski,
A. y col., J. Biol. Chem. (1977) 252, 3578-3581 y
3582-3586; Nucci, M. L. y col., Adv. Drug Delivery
Reviews (1991) 6, 133-151; Francis, G. y col.,
Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R.T. ed.); y
Stability of Proteins Pharmaceuticals: in vivo Pathways of
Degradation and Strategies for Protein Stabilization (1991) págs.
235-263 (Ahern, T.J. y Manning, M., eds.) Plenum,
Nueva York].
La unión de PEG a las moléculas de proteína se ha
conseguido usando varios métodos químicos diferentes, la mayoría de
los cuales, unen el PEG a los restos de lisina o a otros restos de
aminoácidos de la superficie de la proteína de una manera aleatoria
[Zalipsky, S. y Lee, C. Poly(ethylene glycol) Chemistry:
Biotechnical and Biomedical Applications (1992) págs.
347-370 (Harris, J.M., ed.), Plenum, Nueva York].
Frecuentemente, esto conduce a la alteración parcial de la función
de la proteína, por ejemplo, en las enzimas se reduce la actividad
catalítica [Nucci, M.L. y col., ibid].
Se ha publicado la modificación específica de
sitio de las proteínas para introducir sitios para la unión del PEG.
Por ejemplo, la interleuquina 2 se ha modificado mediante
mutagénesis para sustituir un resto de treonina que normalmente esta
glucosilado por una cisteína para permitir la unión del PEG
[Goodson, R.J. y Katre, N.V. Bio/Technology (1990) 8,
343-346]. Se elige un sitio que normalmente está
glucosilado y se piensa que será capaz de tolerar la modificación
con PEG sin perturbación de la estructura de la proteína. En otro
ejemplo, se ha modificado la enzima fosforilasa de nucleósidos de
purina para sustituir selectivamente los restos de arginina con
lisina para proporcionar de este modo hasta 18 sitios adicionales y
potenciales de unión del PEG por molécula de encima [Hershfield,
M.S. y col., P.N.A.S. (1991), 88, 7185-7189].
Los estudios previos con anticuerpos y fragmentos
de anticuerpos han usado la unión aleatoria de PEG a través de
restos de lisina [por ejemplo, Ling, T.G.I. y Mattiasson, B. J.
Immunol. Methods (1983), 59, 327-337; Wilkinson, I.
y col., Immunol. Letters (1987) 15, 17-22; Kitamura,
K. y col., Cancer Res. (1991), 51, 4310-4315;
Delgado, C. y col., Br. J. Cancer (1996), 73,
175-182] y derivados tiolados [Pedley, R.B. y col.,
Br. J. Cancer (1994), 70, 1126-1130].
Frecuentemente, la unión aleatoria ha dado como resultado
anticuerpos modificados que son sólo capaces de unirse a su antígeno
diana con una afinidad, avidez o especificidad reducidas. En una
tentativa para superar esto, se han sustituido restos de lisina
críticos de los bucles de unión al antígeno (CDR) con argininas para
permitir la modificación con una menor pérdida de inmunorreactividad
[Benhar, I. y col., Bioconjugate Chemistry (1994), 5,
321-326].
Pueden modificarse sitios específicos en las
regiones constante y bisagra de los anticuerpos para permitir el
enlace específico de sitio de una serie de moléculas efectoras y
testigo [Lyons, A. y col., Prot. Eng. (1990), 3,
703-709; y las memorias descriptivas de las patentes
europeas Nº 348.442 y 347.433]. Los autores de la invención han
determinado ahora que la unión específica de sitio de polímeros a
fragmentos divalentes de anticuerpos puede usarse para evitar la
pérdida de inmunorreactividad asociada previamente con los
procedimientos de unión aleatoria. Además, los fragmentos
modificados de este modo han mejorado significativamente las
propiedades de unión y/o farmacocinéticas cuando se comparan con los
fragmentos que han sido modificados aleatoriamente con el mismo
número y tipo de moléculas de polímero.
De este modo, de acuerdo con un aspecto de la
invención, los autores de la invención proporcionan un fragmento
divalente de anticuerpo que comprende dos cadenas pesadas de
anticuerpo y, al menos, una molécula de polímero en enlace
covalente, estando, cada cadena pesada, unida covalentemente a la
otra a través de, al menos, un puente intercatenario no disulfuro
que une el átomo de azufre de un resto de cisteína en una cadena al
átomo de azufre de un resto de cisteína en la otra cadena, estando,
dichos restos de cisteína, localizados fuera del dominio de la
región variable de cada cadena, caracterizado porque, al menos, un
puente intercatenario no disulfuro contiene una molécula de polímero
unida covalentemente y en el que dicho polímero es un polímero
polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o
ramificada y opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o
sin ramificar.
El término "no disulfuro", tal como se usa
en el presente documento, quiere decir que los puentes
S-S, por ejemplo, los del tipo encontrado
normalmente en los anticuerpos, están excluidos. Sin embargo, un
puente intercatenario del tipo presente en un fragmento de acuerdo
con la invención aún puede estar unido a una cadena pesada a través
de un enlace -S-S- tal como se describe de aquí en
adelante.
En general, el fragmento de anticuerpo de la
invención será capaz de unirse selectivamente a un antígeno. El
antígeno puede ser cualquier antígeno asociado a células, por
ejemplo, un antígeno de superficie celular tal como un marcador de
linfocitos T, de células endoteliales o de células tumorales, o
puede ser un antígeno soluble. Los ejemplos particulares de
antígenos de superficie celular incluyen moléculas de adhesión, por
ejemplo, integrinas tales como integrinas \beta1, por ejemplo,
VLA-4, selectina E, selectina P o selectina L, CD2,
CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25,
CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, antígeno carcinoembriónico
(CEA), lactoglobulina grasa humana (HMFG 1 y 2), antígenos MHC de la
clase I y MHC de la clase II, y VEGF y, cuando sea apropiado, los
receptores de los mismos. Los antígenos solubles incluyen
interleuquinas tales como IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-8 o
IL-12, antígenos víricos, por ejemplo, antígenos del
virus sincitial respiratorio o del citomegalovirus,
inmunoglobulinas, tales como IgE, interferones tales como
interferón-\alpha,
interferón-\beta o
interferón-\gamma, factor \alpha de necrosis
tumoral, factor \beta de necrosis tumoral, factores estimuladores
de colonias tales como G-CSF o
GM-CSF, factores de crecimiento derivados de
plaquetas tales como PDGF-\alpha y
PDGF-\beta y, cuando sea apropiado, los receptores
de los mismos. Cada antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno
humano.
Los fragmentos de anticuerpo particulares de
acuerdo con la invención incluyen los que se unen selectivamente al
factor \alpha de necrosis tumoral y a los factores decrecimiento
derivados de plaquetas y receptores de los mismos, especialmente los
descritos en los ejemplos de aquí en adelante.
Para conseguir propiedades de unión al antígeno
útiles cada cadena pesada de un fragmento de acuerdo con la
invención puede emparejarse con una cadena ligera de anticuerpo
complementaria o con un fragmento de la misma y la invención se
extiende a tales construcciones. Cuando se desee, un par de cadenas
pesada-ligera puede unirse covalentemente, por
ejemplo, un enlace disulfuro tal como se encuentra en los
anticuerpos que se presentan de un modo natural y/o un enlace
peptídico tal como se encuentra, por ejemplo, en los anticuerpos
recombinantes de cadena única.
En general, cada cadena pesada y, cuando estén
presentes, cada cadena ligera, tendrán un dominio de región
variable. El término dominio de la región variable, tal como se usa
en el presente documento, quiere decir esa parte de una cadena
pesada o ligera que contiene el sitio de unión al antígeno (de aquí
en adelante, dominio V_{H} o V_{L}). El dominio V_{H} o
V_{L} puede tener cualquier tamaño o composición de aminoácidos y,
generalmente, comprenderá, al menos, una secuencia de aminoácidos
hipervariable responsable de la unión al antígeno incluida en una
secuencia de armazón.
Cada dominio V_{H} o V_{L} puede ser
cualquier dominio variable que se presente naturalmente o una
versión modificada del mismo. Con versión modificada se quiere decir
una región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería
del ADN recombinante. Tales versiones modificadas incluyen las
creadas, por ejemplo, a partir de regiones variables de anticuerpos
naturales mediante inserciones, deleciones o cambios en o a las
secuencias de aminoácidos de los anticuerpos naturales. Los ejemplos
particulares de este tipo incluyen los dominios V_{H} o V_{L}
modificados que contienen, al menos, un CDR y, opcionalmente, uno o
más aminoácidos de armazón de un anticuerpo y el resto del dominio
de la región variable de un segundo anticuerpo.
Generalmente, cada dominio V_{H} estará
covalentemente unido, al menos, a un resto de cisteína. La
localización de cada resto de cisteína puede variar de acuerdo con
el tamaño y naturaleza del fragmento de anticuerpo requerido. De
este modo, en un ejemplo extremo, un resto de cisteína puede estar
unido directamente al aminoácido C-terminal del
dominio V_{H}. En ese caso, puede funcionar como el sitio de
puente para un puente intercatenario que contiene una molécula de
polímero. De este modo, dos dominios V_{H} de este tipo pueden
conectarse en forma de puente para formar un fragmento de acuerdo
con la invención.
Sin embargo, en la práctica, es generalmente
preferible que el dominio V_{H} esté covalentemente unido en el
aminoácido C-terminal, al menos, a otro dominio de
anticuerpo o a un fragmento del mismo que contenga un resto de
cisteína. De este modo, por ejemplo, un dominio V_{H} puede estar
unido a un dominio CH1 de inmunoglobulina o a un fragmento del
mismo. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales,
por ejemplo, para proporcionar un dominio de la región bisagra como
se encuentra generalmente en las inmunoglobulinas o para
proporcionar dominios adicionales tales como los dominios CH2 y CH3
de los anticuerpos. En cada uno de los casos anteriores, al menos,
un resto de cisteína puede localizarse en cualquier punto a lo largo
de cualquier dominio para formar un sitio de puente para un puente
intercatenario que contenga una molécula de polímero.
De un modo similar, cualquier dominio V_{L}
presente en un fragmento de acuerdo con la invención puede unirse a
un dominio constante de la cadena ligera de anticuerpos (C_{L}) o
a un fragmento del mismo.
En general, la molécula de polímero en el
fragmento de acuerdo con la invención puede ser un polímero que se
presente naturalmente o uno sintético, por ejemplo, un polímero de
polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o
ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o
sin ramificar, por ejemplo, un homo o heteropolisacárido.
Los sustituyentes opcionales particulares que
pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados
anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxilo, metilo o metoxi.
Los ejemplos particulares de polímeros sintéticos incluyen
poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o
poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada
opcionalmente sustituidos y derivados de los mismos, especialmente,
poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como
metoxi(polietilenglicol) y derivados del mismo. Los polímeros
que se presentan naturalmente particulares incluyen lactosa,
amilosa, dextrano o glucógeno y derivados de los mismos. Los
"derivados", tal como se usa en el presente documento, tienen
la intención de incluir derivados reactivos, por ejemplo, ésteres
activos tales como ésteres de succinimidilo y similares. El grupo
reactivo puede estar unido directamente o a través de un segmento de
engarce al polímero. Se apreciará que el resto de tal grupo, en
algunos casos, formará parte del producto de la invención como el
grupo de unión entre el polímero y el puente intercatenario.
El tamaño del polímero puede variar como se desee
pero, generalmente, estará en un intervalo de peso molecular medio
de, aproximadamente, 500 Da a, aproximadamente, 50.000 Da, por
ejemplo, de 5000 a 40.000 Da e incluyendo 25.000 a 40.000 Da. En
particular, el tamaño del polímero puede seleccionarse en base al
uso destinado del producto. De este modo, por ejemplo, cuando el
producto esté destinado a dejar la circulación y penetrar en los
tejidos, por ejemplo, para el uso en el tratamiento de un tumor,
puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por
ejemplo, aproximadamente, 5000 Da. Para las aplicaciones en las que
el producto permanezca en la circulación puede ser ventajoso usar un
polímero de peso molecular mayor, por ejemplo, en el intervalo de
25.000 Da a 40.000 Da.
En general, cada molécula de polímero en el
fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención forma parte de
un puente intercatenario. Cada puente sirve para unir dos cadenas
pesadas y en cada cadena estará unido covalentemente a un átomo de
azufre de un resto de cisteína. Generalmente, el enlace covalente
será un enlace disulfuro o, en particular, un enlace
azufre-carbono.
En general, cada puente intercatenario puede
tener cualquier longitud o composición deseadas. Los puentes
adecuados incluyen restos de reactivos de reticulación homo o
heterofuncionales, particularmente reactivos de reticulación homo o
heterobifuncionales que contienen una o más moléculas de polímero
unidas covalentemente como se acaba de describir.
Los reactivos de reticulación homo o
heterofuncionales incluyen radicales polivalentes, especialmente,
divalentes de grupos alifáticos, heteroalifáticos, cicloalifáticos,
heterocicloalifáticos, aromáticos o heteroaromáticos que contienen
dos grupos tiol funcionales reactivos. Cada fragmento de acuerdo con
la invención tendrá un puente intercatenario que derive de tal
reactivo en el que cada grupo tiol funcional reactivo está en enlace
covalente con un átomo de azufre de un resto de cisteína. Los grupos
tiol funcionales reactivos particulares incluyen ácidos o ésteres
\alpha-halocarboxílicos, por ejemplo,
yodoacetamida, imidas, por ejemplo, maleimida, sulfonas vinílicas o
disulfuros.
Los puentes particulares incluyen cadenas de
alquileno C_{4-20}, alquenileno
C_{4-20} o alquinileno C_{4-20}
lineales o ramificadas opcionalmente sustituidas y opcionalmente
interrumpidas por uno o más heteroátomos o grupos que contengan
heteroátomos tales como átomos de -O- o -S- o grupos
-N(R^{1})- [en el que R^{1} es un átomo de hidrógeno o un
grupo alquilo C_{1-6}], -CON(R^{1})-,
-N(R^{1})CO-, -SO_{2}N(R^{1})-,
-N(R^{1})SO_{2}-, -C(O)-, -S(O)-,
-S(O)_{2}-, -OCON(R^{1})-,
-N(R^{1})C(O)O-,
-C(O)O-, o por grupos ciclopentileno, ciclohexileno,
fenileno o fenileno sustituido. Los sustituyentes opcionales
incluyen, por ejemplo, uno o más grupos amino o amino sustituido,
por ejemplo, grupos -N(R^{1})_{2} en los que cada
átomo o grupo R^{1} puede ser el mismo o diferente.
El polímero puede estar covalentemente unido en
cualquier localización del puente intercatenario, generalmente, a
través de un heteroátomo o un grupo que contenga heteroátomos como
se acaba de describir en relación a los puentes intercatenarios
particulares.
Los fragmentos particularmente útiles de acuerdo
con la invención son los que contienen un puente intercatenario
único. En estos fragmentos particulares, el polímero puede ser
especialmente un polímero sintético, particularmente, un polímero de
polialquileno tal como poli(etilenglicol) o especialmente
metoxipoli(etilenglicol) o un derivado del mismo y,
especialmente, con un peso molecular en el intervalo de,
aproximadamente, 25.000 Da a, aproximadamente, 40.000 Da. En
particular, el puente puede ser una cadena de alquileno
C_{4-20} lineal o ramificada opcionalmente
sustituida y opcionalmente interrumpida por uno o más heteroátomos o
grupos que contienen heteroátomos tal como se describe
previamente.
Preferentemente, cada cadena pesada en los
fragmentos de acuerdo con la invención es una cadena
V_{H}-CH1 sustituida terminalmente por un dominio
de región bisagra, por ejemplo, como se encuentran naturalmente en
las inmunoglobulinas. Preferentemente, cada cadena está emparejada
con una cadena ligera, particularmente, una cadena
V_{H}-C_{L}, formándose, de este modo, por
ejemplo, un fragmento Fab'. En los fragmentos preferidos de la
invención que contienen pares de cadenas pesadas o pesadas y ligeras
de estos tipos estará presente un puente intercatenario único,
particularmente, enlazando un resto de cisteína localizado en la
secuencia bisagra de cada cadena pesada. De un modo deseable, éste
será el único resto de cisteína presente en cada secuencia
bisagra.
Cuando se desee, el fragmento de anticuerpo de
acuerdo con la invención podrá tener, adicionalmente, una o más
moléculas efectoras o testigo unidas a él y la invención se extiende
a tales anticuerpos modificados. Las moléculas efectoras o testigo
pueden estar unidas al fragmento de anticuerpo a través de cualquier
grupo funcional disponible de un aminoácido terminal o un aminoácido
lateral localizado en el fragmento, por ejemplo, cualquier grupo
libre amino, imino, hidroxilo o carboxilo.
Las moléculas efectoras incluyen, por ejemplo,
agentes antineoplásicos, toxinas (tales como toxinas enzimáticamente
activas de origen bacteriano o vegetal y fragmentos de las mismas,
por ejemplo, ricina y fragmentos de la misma), proteínas
biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, ácidos nucleicos y
fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN y fragmentos de los
mismos, radionúclidos, particularmente, yodo radiactivo y metales
quelados. Los grupos testigo adecuados incluyen metales quelados,
compuestos fluorescentes o compuestos que puedan detectarse mediante
RMN o espectroscopía ESR.
Los agentes antineoplásicos particulares incluyen
agentes citotóxicos y citoestáticos, por ejemplo, agentes de
alquilación, tales como mostazas nitrogenadas (por ejemplo,
clorambucilo, melfalán, mecloretamina, ciclofosfamida, o mostaza de
uracilo) y derivados de las mismas, trietilenfosforamida,
trietilentiofosforamida, busulfano, o cisplatino; antimetabolitos,
tales como metotrexato, fluorouracilo, floxuridina, citarabina,
mercaptopurina, tioguanina, ácido fluoroacético o ácido
fluorocítrico, antibióticos, tales como las bleomicinas (por
ejemplo, sulfato de bleomicina), doxorubicina, daunorubicina,
mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C), actinomicinas (por ejemplo,
dactinomicina), plicamicina, calichaemicina y derivados de la misma,
o esperamicina y derivados de la misma; inhibidores mitóticos, tales
como etopósido, vincristina o vinblastina y derivados de los mismos;
alcaloides, tales como elipticina; polialcoholes tales como taxicina
I o taxicina II; hormonas, tales como andrógenos (por ejemplo,
dromostanolona o testolactona), progestinas (por ejemplo, acetato de
megestrol o acetato de medroxiprogesterona), estrógenos (por
ejemplo, difosfato de dimetilestilbestrol, fosfato de poliestradiol
o fosfato de estramustina) o antiestrógenos (por ejemplo,
tamoxifeno); antraquinonas, tales como mitoxantrona, carbamidas,
tales como hidroxicarbamida; hidracinas, tales como procarbacina; o
imidazoles, tales como dacarbacina.
Los grupos efectores particularmente útiles son
calichaemicina y derivados de la misma (véase, por ejemplo, las
memorias descriptivas de las patentes surafricanas Nº 85/8794,
88/8127 y 90/2839).
Los metales quelados incluyen quelatos de metales
di o tripositivos que tienen un número de coordinación de 2 a 8,
ambos inclusive. Los ejemplos particulares de tales metales incluyen
tecnecio (Tc), renio (Re), cobalto (Co), cobre (Cu), oro (Au), plata
(Ag), plomo (Pb), bismuto (Bi), indio (In), galio (Ga), itrio (Y),
terbio (Tb), gadolinio (Gd) y escandio (Sc). En general, el metal es
preferentemente un radionúclido. Los radionúclidos particulares
incluyen ^{99m}Tc, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{58}Co, ^{60}Co,
^{67}Cu, ^{195}Au, ^{199}Au, ^{110}Ag, ^{203}Pb,
^{206}Bi, ^{207}Bi, ^{111}In, ^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{88}Y,
^{90}Y, ^{160}Tb, ^{153}Gd y ^{47}Sc.
El metal quelado puede ser, por ejemplo, uno de
los tipos anteriores de metal quelado con cualquier agente de
quelación polidentado adecuado, por ejemplo, poliaminas acíclicas o
cíclicas, poliéteres (por ejemplo, éteres en corona y derivados de
los mismos); poliamidas; porfirinas y derivados carbocíclicos.
En general, el tipo de agente de quelación
dependerá del metal en uso. Sin embargo, un grupo particularmente
útil de agentes de quelación en los conjugados de acuerdo con la
invención son las poliaminas acíclicas y cíclicas, especialmente,
los ácidos poliaminocarboxílicos, por ejemplo, ácido
dietilentriaminapentacético y derivados del mismo, y aminas
macrocíclicas, por ejemplo, derivados tri-aza y
tetra-aza cíclicos (por ejemplo, como se describe en
la memoria descriptiva de la patente internacional Nº WO 92/22583);
y poliamidas, especialmente, desferrioxamina y derivados de la
misma.
El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
invención puede prepararse haciendo reaccionar un fragmento de
anticuerpo que contiene un resto de cisteína reactivo en la cadena
pesada fuera del dominio V_{H} con un reactivo de reticulación
selectivo de tiol que contiene un polímero como se define en el
presente documento. Generalmente, la reacción puede realizarse en un
disolvente, por ejemplo, una solución tamponada acuosa tal como un
tampón de acetato o fosfato a, aproximadamente, pH neutro, por
ejemplo, aproximadamente, de pH 4,5 a, aproximadamente, pH 8,0, a,
por ejemplo, temperatura ambiente. Generalmente, el anticuerpo se
empleará en una concentración en exceso con respecto a la
concentración del reactivo de reticulación. En algunos casos, puede
ser necesario reducir la sustancia de partida del anticuerpo con un
reactivo tal como \beta-mercaptoetilamina (por
ejemplo, como se describe en el ejemplo 1 de aquí en adelante) para
generar un resto de cisteína apropiadamente reactivo. Cuando sea
necesario, el producto deseado puede separarse de cualquier
sustancia de partida sin reaccionar o de cualquier otro producto no
deseado generado durante el procedimiento de producción mediante
medios ordinarios, por ejemplo, mediante cromatografía.
La sustancia de partida del fragmento de
anticuerpo puede obtenerse a partir de cualquier anticuerpo entero,
especialmente, un anticuerpo monoclonal entero [preparado mediante
procedimientos de inmunización y fusión celular ordinarios], usando
cualquier técnica adecuada estándar de corte enzimático y/o
digestión, por ejemplo, mediante tratamiento con pepsina. De un modo
alternativo, la sustancia de partida del anticuerpo puede prepararse
mediante el uso de técnicas del ADN recombinante que implican la
manipulación y la re-expresión del ADN que codifica
las regiones variable y/o constante del anticuerpo. Tal ADN es
conocido y/o está fácilmente disponible a partir de genotecas de ADN
que incluyen, por ejemplo, las genotecas fágicas de anticuerpos
[véase Chiswell, D.J. y McCafferty, J. Tibtech. 10,
80-84 (1992)] o cuando se desee puede ser
sintetizado. Pueden usarse procedimientos estándar de biología
molecular y/o química para secuenciar y manipular el ADN, por
ejemplo, para introducir codones para crear restos de cisteína, y
para modificar, añadir o eliminar otros aminoácidos o dominios como
se desee.
A partir de aquí, pueden prepararse uno o más
vectores de expresión replicantes que contengan el ADN y usarse para
transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea
celular de mieloma improductiva, tal como una línea NSO de ratón o
una línea bacteriana, por ejemplo, de E. coli, en la que
pueda suceder la producción del fragmento de anticuerpo. Para
obtener una transcripción y traducción eficaces, la secuencia de ADN
de cada vector debe incluir las secuencias reguladoras apropiadas,
particularmente, un promotor y una secuencia líder unidos
operativamente a la secuencia del dominio variable. Los métodos
particulares para producir los fragmentos de anticuerpo de este modo
son, generalmente, bien conocidos y usados de un modo ordinario. Por
ejemplo, se describen los procedimientos básicos de biología
molecular en Maniatis y col. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory, Nueva York, 1989]; la secuenciación del ADN puede
realizarse como se describe en Sanger y col. [PNAS 74, 5463, (1977)]
y en el libro de consulta para la secuenciación de Amersham
International plc; y la mutagénesis dirigida puede llevarse a cabo
de acuerdo con el método de Kramer y col. [Nucl. Acids Res. 12,
9441, (1984)] y con el libro de consulta de Anglian Biotechnology
Ltd. De un modo adicional, hay numerosas publicaciones, incluyendo
memorias descriptivas de patentes, que detallan las técnicas
adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación
del ADN, para la creación de vectores de expresión y la
transformación de las células apropiadas, por ejemplo, como revisa
Mountain A y Adair, J.R. en Biotechnology and Genetic Engineering
Reviews [ed. Tombs, MP, 10, capítulo 1,1992, Intercept, Andover,
Reino Unido] y en la memoria descriptiva de la patente internacional
Nº WO 91/09967.
El reactivo de reticulación selectivo de tiol
para el uso en la preparación de fragmentos de anticuerpo de acuerdo
con la invención puede obtenerse mediante reacción de cualquier
agente de reticulación reactivo de tiol (que contienen, por ejemplo,
grupos tiol reactivos tales como un ácido o éster
\alpha-halocarboxílico, por ejemplo,
yodoacetamida, una imida, por ejemplo, maleimida, una sulfona
vinílica o un disulfuro) con un polímero apropiadamente
funcionalizado. Las sustancias de partida del polímero adecuadas
pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Shearwater Polymers
Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos) o pueden prepararse a partir
de sustancias de partida disponibles comercialmente usando
procedimientos químicos ordinarios, por ejemplo, como describe
Zalipsky, S y Lee C, ibid. En general, la reacción puede ser
una reacción de acoplamiento ordinaria entre el polímero
funcionalizado, por ejemplo, un éster activo del polímero y un grupo
funcional apropiado, por ejemplo, una amina, presente en el reactivo
de reticulación. Pueden usarse las condiciones estándar de reacción,
por ejemplo, como se describe en la sección experimental de aquí en
adelante para el acoplamiento de un éster activo con una amina. Los
reactivos de reticulación adecuados están fácilmente disponibles a
partir de fuentes disponibles comercialmente o pueden, simplemente,
sintetizarse usando procedimientos ordinarios a partir de sustancias
disponibles comercialmente, por ejemplo, como se describe en la
memoria descriptiva de la patente europea Nº 384.624 y en la memoria
descriptiva de la patente internacional Nº WO 92/22583 y en la
sección experimental de aquí en adelante.
Cuando se desee obtener un fragmento de
anticuerpo de acuerdo con la invención unido a una molécula efectora
o testigo, éste puede prepararse mediante procedimientos estándar
químicos o del ADN recombinante en los que el fragmento de
anticuerpo se une o bien directamente o bien a través de un agente
de acoplamiento a la molécula efectora o testigo o bien antes o bien
después de la reacción con el polímero activado según sea lo
apropiado. Los procedimientos químicos particulares incluyen, por
ejemplo, los descritos en las memorias descriptivas de las patentes
internacionales Nº WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 y WO
89/01476. De un modo alternativo, cuando la molécula efectora o
testigo sea una proteína o polipéptido el enlace puede conseguirse
usando procedimientos del ADN recombinante, por ejemplo, como se
describe en la memoria descriptiva de la patente internacional Nº WO
86/01533 y en la memoria descriptiva de la patente europea Nº
392.745.
El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
invención puede ser útil en la detección o tratamiento de varias
enfermedades o trastornos. Tales enfermedades o trastornos pueden
incluir las descritas con el encabezamiento general de enfermedad
infecciosa, por ejemplo, infección vírica; enfermedad
inflamatoria/autoinmunidad, por ejemplo, artritis reumatoide,
osteoartritis, enfermedad intestinal inflamatoria; cáncer,
enfermedad alérgica/atópica, por ejemplo, asma, eccema; enfermedad
congénita, por ejemplo, fibrosis quística, anemia drepanocítica;
enfermedad dermatológica, por ejemplo, soriasis; enfermedad
neurológica, por ejemplo, esclerosis múltiple; trasplantes, por
ejemplo, rechazo de órganos trasplantados, enfermedad del injerto
contra el hospedador; y enfermedad metabólica/idiopática, por
ejemplo, diabetes.
Los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la
invención pueden formularse para el uso en terapia y/o diagnosis y
de acuerdo con un aspecto adicional de la invención los autores
proporcionan una composición farmacéutica que comprende un fragmento
de anticuerpo divalente modificado que comprende un fragmento de
anticuerpo divalente y, al menos, una molécula de polímero en enlace
covalente caracterizado porque cada enlace covalente se establece a
través de un átomo de azufre de un resto de cisteína localizado en
el fragmento del anticuerpo fuera del dominio de la región variable
del fragmento, junto con uno o más excipientes, diluyentes o
vehículos farmacéuticamente aceptables.
Como se explica anteriormente, el fragmento de
anticuerpo en este aspecto de la invención puede estar unido
opcionalmente a uno o más grupos efectores o testigo.
La composición farmacéutica puede tomar cualquier
forma adecuada para la administración y, preferentemente, está en
una forma adecuada para la administración parenteral, por ejemplo,
mediante inyección o infusión intravenosa, por ejemplo, mediante una
inyección de una dosis rápida o mediante infusión intravenosa
continua. Cuando la composición es para la inyección o infusión
intravenosa, puede tomar la forma de una suspensión, solución o
emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes
de formulación tales como agentes de suspensión, conservantes,
estabilizantes y/o dispersantes.
De un modo alternativo, la composición del
anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstituirse antes de
usar con un líquido estéril apropiado.
Si la composición del anticuerpo es adecuada para
la administración oral la formulación puede contener, además del
ingrediente activo, aditivos tales como: almidón, por ejemplo,
almidón o celulosa de patata, maíz o trigo o derivados de almidón
tales como celulosa microcristalina; sílice; diversos azúcares tales
como lactosa; carbonato magnésico y/o fosfato cálcico. Si la
formulación es para la administración oral es deseable que sea bien
tolerada por el sistema digestivo del paciente. Con este fin, puede
ser deseable incluir en la formulación formadores de mucus y
resinas. También puede ser deseable mejorar la tolerancia mediante
la formulación del anticuerpo en una cápsula que sea insoluble en
los jugos gástricos. También puede ser preferible incluir el
anticuerpo o composición en una formulación de liberación
controlada.
Si la composición del anticuerpo es adecuada para
la administración rectal la formulación puede contener una gente
aglutinante y/o lubricante; por ejemplo, glicoles poliméricos,
gelatinas, manteca de cacao u otras ceras o grasas vegetales.
Típicamente, los usos terapéuticos y diagnósticos
de los fragmentos de acuerdo con la invención comprenden administrar
una cantidad eficaz del fragmento del anticuerpo a un sujeto humano.
La cantidad exacta a ser administrada variará de acuerdo con el uso
del anticuerpo y con la edad, sexo y estado del paciente pero,
típicamente, puede variar de, aproximadamente, 0,1 mg a 1000 mg, por
ejemplo, de, aproximadamente, 1 mg a 500 mg. El anticuerpo puede
administrarse en forma de una dosis única o de una manera continua a
lo largo de un periodo de tiempo. Las dosis pueden repetirse según
sea apropiado. Las dosis típicas pueden estar, por ejemplo, entre
0,1-50 mg/kg de peso corporal por dosis terapéutica
única, particularmente, entre 0,1-20 mg/kg de peso
corporal para una dosis terapéutica única.
Figura 1. Análisis de SDS-PAGE en
condiciones no reductoras (líneas 1-5) y reductoras
(líneas 6-9).
Figura 2. Farmacocinética en las ratas del
anti-PDGF\betaR DFM-PEG (40 kDa,
específico de sitio) marcado con ^{125}I en comparación con DFM e
IgG.
Figura 3. Inhibición de la respuesta de
proliferación de las SK-5 a PDGF BB 10 ng/ml por el
anti-PDGF\betaR DFM-PEG (40 kDa,
aleatorio), DFM-PEG (40 kDa, específico de sitio),
DFM-PEG (10 kDa, engarce SS, específico de sitio),
DFM e IgG.
Figura 4. Inhibición de la respuesta de
proliferación de las SK-5 a PDGF BB 10 ng/ml o 20
ng/ml por 1 \mug/ml de anti-PDGF\betaR
DFM-PEG (40 kDa, aleatorio), DFM-PEG
(40 kDa, específico de sitio), DFM-PEG (10 kDa,
engarce SS, específico de sitio), DFM e IgG.
Figura 5. Farmacocinética en las ratas del
anti-PDGF\betaR DFM-PEG (10 kDa,
engarce SS) y DFM-PEG (20 kDa, engarce SS) marcados
con ^{125}I en comparación con DFM.
Figura 6. Análisis de SDS-PAGE en
condiciones no reductoras (líneas 1-7) y reductoras
(líneas 8-13).
Figura 7. Farmacocinética en las ratas del
anti-PDGF\betaR DFM-PEG
(específico de sitio) marcado con ^{125}I de diferentes tipos en
comparación con DFM sin modificar.
Figura 8. Análisis de SDS-PAGE en
condiciones no reductoras (líneas 2-3) y reductoras
(líneas 4-5).
Figura 9. Farmacocinética en las ratas del hTNF40
DFM-PEG (40 kDa, específico de sitio) marcado con
^{125}I en comparación con DFM e IgG.
Los siguientes ejemplos ilustran la
invención.
Se usan las siguientes abreviaturas:
| PEG | - CH_{3}O(CH_{2}CH_{2}O)_{n}(CH_{2})_{2}NHCO(CH_{2})_{2}- |
| DFM-PEG | - \begin{minipage}[t]{135mm} un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la invención en el que dos fragmentos Fab' están reticulados con un puente dimaleimida pegilado\end{minipage} |
| DTDP | - 4,4'-ditiodipiridina |
| AUC | - área debajo de la curva |
| RT | - temperatura ambiente |
| TFA | - ácido trifluoroacético |
| BOC | - tert-butoxicarbonilo |
| CBZ | - carbobenciloxi |
| DMF | - N,N-dimetilformamida |
| EDC | - 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida |
| BMH | - bismaleimidohexano |
| PBS | - solución salina tamponada con fosfato |
Sustancia intermedia
1
Se disolvió
N(\alpha)N(\varepsilon)Di-CBZ-(L)-lisina
(18,0 g, 43,3 mmoles) en DMF anhidro (80 ml). Se añadieron
clorhidrato de
N-BOC-1,6-diaminohexano
(11,06, 43,75 mmoles), hidrato de hidroxibenzotriazol (6,43 g, 47,63
mmoles), 4-metilmorfolina (5,2 ml, 47,63 mmoles) y
EDC (9,13 g, 47,63 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 5 horas. Se vertió la mezcla de reacción en
H_{2}O y se extrajo con acetato de etilo (4 x 100 ml). Las fases
orgánicas combinadas se lavaron con ácido cítrico 10% (2 x 50 ml),
NaHCO_{3} saturado (2 x 50 ml), salmuera (1 x 50 ml) y se secaron
sobre MgSO_{4}. La eliminación del disolvente al vacío proporcionó
la sustancia intermedia 1 (26,15 g, 100%) en forma de un
sólido blanco.
^{1}H RMN ((CD_{3})_{2}SO) 67,79
(1H, t), 7,38-7,19 (11H, m), 6,72 (11H, t),
5,00-4,99 (4H, m), 3,95-3,90 (1H,
m), 3,08-2,87 (6H, m) y 1,60-1,05
(23H, m incluyendo 9H, s).
Sustancia intermedia
2
Se disolvió (calentando) la sustancia intermedia
1 (26,15 g, 42,7 mmoles) en etanol (700 ml) y se trató con Pd/C 10%
(4,2 g). La reacción se agitó en H_{2} gaseoso en un baño de agua
caliente (\sim30ºC) durante 4 horas y, seguidamente, se permitió
que se enfriara. Se añadió CH_{2}Cl_{2} (20 ml), se filtró la
mezcla y se lavó bien con CH_{2}Cl_{2} y etanol. La eliminación
del disolvente al vacío proporcionó la sustancia intermedia 2
en forma de una espuma aceitosa (13,8 g, 94%).
^{1}H RMN ((CH_{3})_{2}SO) \delta
7,78 (1H, t), 3,06-2,91 (3H, m),
2,89-2,84 (4H, m), 2,52-2,43 (4H,
bs) y 1,57-1,15 (23H, m incluyendo 9H, s).
Sustancia intermedia
3
Se disolvió la sustancia intermedia 2 (1,47 g,
4,47 mmoles) en DMF anhidro (25 ml) y se añadió
3-maleimidopropionato de
N-succinimidilo (22,38 g, 8,97 mmoles). Se agitó la
mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 3 horas. Se
eliminó el disolvente al vacío y se añadió CH_{2}Cl_{2} (50 ml)
seguido de NaHCO_{3} saturado (50 ml). Se separaron las fases y se
lavó la fase acuosa con CH_{2}Cl_{2} (2 x 50 ml). Se combinaron
las fases orgánicas, se lavaron con NaHCO_{3} saturado (2 x 50 ml)
y se secaron sobre MgSO_{4}. Se eliminó el disolvente al vacío, se
trató el residuo con éter dietílico y se filtró el sólido
resultante, se lavó bien con éter dietílico y se secó para
proporcionar la sustancia intermedia 3 (2,05 g, 74%) en forma
de un sólido blanco.
^{1}H RMN ((CD_{3})_{2}SO) \delta
8,05 (1H, d), 7,75 (1H, t), 6,98 (4H, s), 6,72 (1H, b t),
4,21-4,07 (1H, m), 3,62 (4H, t),
3,12-2,81 (8H, m), 2,41 (2H, t) y
1,55-1,05 (23H, m, incluyendo 9H, s). Espectro de
masas ES+ve 669 (MNa^{+}, 100%), 6,47 (MH^{+}, 20%), 547
(MH^{+}, -C_{5}H_{8}O_{2}, 15%.
Sustancia intermedia
4
Se disolvió la sustancia intermedia 3 (0,3 g,
0,46 mmoles) en una mezcla 1:1 de CH_{2}Cl_{2}/TFA (10 ml) y se
agitó a temperatura ambiente durante 345 minutos. Se eliminó el
disolvente al vacío y el residuo se volvió aceotrópico con tolueno
(3 x 5 ml). Se añadió acetato de etilo para proporcionar un sólido
que se filtró, se lavó bien con acetato de etilo y, seguidamente,
con éter dietílico y se secó al vacío para proporcionar la sustancia
intermedia 4 en forma de un sólido blanco (0,21 g, 68%).
^{1}H RMN (CD_{3})_{2}SO) \delta
8,03 (1H, d), 7,90 (1H, t), 7,80 (1H, t), 7,69 (2H, b s), 6,99 (4H,
s), 4,09 (1H, m), 3,58 (4H, t), 3,33 (HOD),
3,10-2,93 (4H, m), 2,76 (2H, b m),
2,41-2,27 (4H, m) y 1,51-1,00 (14H,
m).
Se añadió un equivalente molar de
N-metilmorfolina y un exceso molar de cinco veces de
PEG con amina reactiva (40 kDa, éster PEG-NHS;
Shearwater Polymers Inc. Huntsville, AL, Estados Unidos) a la
sustancia intermedia 4 en DMF. Se incubó la mezcla a temperatura
ambiente durante 2 horas con agitación ocasional. El PEG sin
reaccionar se inactivó con un exceso molar de 100 veces de glicina
sobre el PEG, añadida a partir de una solución madre de glicina 1 M
en tampón fosfato 0,1 M, pH 6,0, que contenía EDTA 2 mM, y la mezcla
se incubó durante un mínimo de 10 minutos adicionales para obtener
el grupo con puente pegilado deseado.
Se expresó Fab' del anticuerpo humano modificado
g162, que reconoce al receptor PDGF \beta humano (de aquí en
adelante, PDGF\betaR) en E. coli tal como se describe en la
solicitud de patente internacional Nº PCT/GB97/03400. El fragmento
Fab' tiene un resto de cisteína único presente en su región bisagra
disponible para la reticulación. Se recogieron las células a partir
del cultivo de fermentación mediante centrifugación y el Fab' se
extrajo suspendiendo de nuevo las células en Tris 100 mM, pH 7,4,
que contenía EDTA 10 mM e incubando a 60ºC toda una noche.
Seguidamente, el Fab' se purificó mediante cromatografía en lecho
aumentado usando una columna de Streamline ATM (Pharmacia) que se
equilibró previamente con glicina/glicinato 1 M, pH 8,0. La muestra
se hizo 1 M con respecto a la glicina y el pH se ajustó a 7,5 con
glicinato sódico 50% (peso/vol.) antes de la aplicación a la columna
en el modo de lecho aumentado. Después de lavar con el tampón de
equilibrado, se compactó el material de la columna hasta formar un
lecho compacto y se eluyó el Fab' con citrato 0,1 M, pH 3,0.
Se consiguió una purificación adicional ajustando
el pH del eluido hasta 7,5 con Tris 2 M y aplicándolo a una columna
de sefarosa con proteína G equilibrada previamente con solución
salina tamponada con fosfato pH 7,4. Después de lavar con el tampón
de equilibrado, se eluyó el Fab' con glicina 0,1
M-HCl, pH 2,7. Seguidamente, se ajustó el pH del
Fab' eluido hasta 6,0 con Tris 2 M.
El Fab' anti-PDGF\betaR
purificado se dializó mediante filtración en tampón de fosfato 0,1
M, pH 6,0, que contenía EDTA 2 mM. El tiol de la bisagra se activó
mediante reducción con \beta-mercaptoetilamina. Se
incubó el Fab' con \beta-mercaptoetilamina 5 mM en
tampón de fosfato 0,1 M, pH 6,0, que contenía EDTA 2 mM durante 30
minutos a 37ºC. Seguidamente, se desaló la muestra en tampón de
fosfato 0,1 M, pH 6,0, que contenía EDTA 2 mM, usando columnas de
Sephadex G-25 (PD10). El número de grupos tiol por
molécula de Fab' se midió mediante valoración con DTDP como se
describe previamente [Lyons y col., (1990), ibid]. Se
reticuló el Fab' con el reticulador pegilado preparado a partir de
la sustancia intermedia 4 a una relación molar de Fab':reticulador
de 2,2:1, a 37ºC. Se añadió el reticulador en 5 partes alícuotas en
intervalos de 5 minutos y se incubó la muestra durante más de 1
hora.
El DFM-PEG deseado se purificó
mediante cromatografía de filtración en gel usando Sephacryl
S-400 HR (para eliminar el Fab' sin reaccionar) en
tampón de acetato 50 mM, pH 4,5, seguido de cromatografía de
intercambio catiónico usando Mono S para separar el
DFM-PEG del DFM y del Fab'-PEG. La
cromatografía en Mono S se llevó a cabo usando una columna
equilibrada con acetato 50 mM, pH 4,5, y después de aplicar la
muestra y lavar con tampón de equilibrado el material unido se eluyó
usando un gradiente lineal de cloruro sódico. El material purificado
se examinó en SDS-PAGE y se mostró que tenía una
movilidad menor que el DFM sin modificar o el Fab', lo que demuestra
la conjugación exitosa del PEG (figura 1).
Con fines comparativos, se preparó
anti-PDGF\betaR DFM y se formó un derivado con PEG
aleatoriamente. El Fab' anti-PDGF\betaR se redujo
como se describe anteriormente. Se reticuló el Fab' con BMH disuelto
en DMF a una relación molar de Fab':BMH de 2,2:1, a 37ºC. Se añadió
el reticulador en 5 partes alícuotas en intervalos de 5 minutos y la
muestra se incubó durante más de 1 hora. El DFM resultante
(di-Fab' reticulado con BMH) se purificó a partir
del Fab' sin reaccionar mediante cromatografía de interacción
hidrófoba usando fenilsefarosa HP.
Se cambió el tampón del DFM purificado a fosfato
0,1 M, pH 8,0, que contenía EDTA 2 mM. Se introdujeron
aleatoriamente grupos tiol en los restos de lisina mediante reacción
con un exceso molar de 4 veces de 2-iminotiolano
(reactivo de Traut) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después
de desalar en fosfato 0,1 M, pH 6,0, que contenía EDTA 2 mM usando
una columna PD10, se determinó el número de grupos tiol introducidos
usando la valoración con DTDP. Seguidamente, el DFM tiolado se hizo
reaccionar con un exceso molar de 3,5 veces de
PEG-maleimida (Shearwater Polymers Inc, ibid)
sobre los grupos tiol durante tres horas. Se unieron una media de
1,3 moléculas de PEG por DFM tal como se cuantificó mediante
análisis HPLC de filtración en gel. Se purificó el
PEG-DFM mediante cromatografía de intercambio
catiónico usando Mono S. La cromatografía en Mono S se llevó a cabo
usando una columna equilibrada con acetato 50 mM, pH 4,5, y después
de aplicar la muestra y lavar con tampón de equilibrado el material
unido se eluyó usando un gradiente lineal de cloruro sódico.
Se realizó el análisis cinético para determinar
los índices de asociación y disociación de la unión del
anti-PDGF\betaR DFM-PEG al
PDGF\betaR usando un BIACORE 2000 (Biacore AB). El ensayo implica
la captura de una molécula de fusión del Fc de mIgG y PDGF\betaR
por una IgG anti-ratón, que está inmovilizada en la
superficie del chip sensor, seguido de una inyección de
anti-PDGF\betaR DFM-PEG. Se
inmovilizó el fragmento F(ab')2 purificado por afinidad de la
Ig de cabra anti-ratón, específica del fragmento Fc
(Jackson ImmunoResearch) en un chip sensor CM5 por medio de química
de acoplamiento a través de amina hasta un nivel de 11.500RU. Se
preparó una superficie blanco siguiendo el procedimiento de
inmovilización pero omitiendo la inyección de la molécula de
captura. Se usó el tampón HBS (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M,
EDTA 3 mM, tensioactivo P20 0,005%, Biacore AB) como tampón de
desarrollo a una velocidad de flujo de 10 ml/minuto. Se capturó una
inyección de Fc de mIgG-PDGF\betaR del
sobrenadante de células COS mediante la IgG
anti-ratón inmovilizada hasta un nivel entre 200 y
250RU. Se valoraron las moléculas anti-PDGF\betaR
DFM-PEG por encima de la superficie de Fc de
mIgG-PDGF\betaR capturada de 2 mg/ml a 0,52 mg/ml.
Se regeneraron las superficies mediante inyección de 10 ml de ácido
clorhídrico 30 mM. Se repitieron sobre la superficie blanco las
inyecciones de Fc de mIgG-PDGF\betaR y cada
concentración de anti-PDGF\betaR
DFM-PEG como controles. Se corrigió el sensograma de
cada concentración de anti-PDGF\betaR
DFM-PEG con el correspondiente sensograma de la
superficie blanco después de la eliminación de la inyección de Fc de
mIgG-PDGF\betaR y la etapa de regeneración. Los
parámetros cinéticos se calcularon usando el programa BIAevaluation
2.1.
Se muestran en la tabla 1 los resultados para
anti-PDGF\betaR DFM-PEG, preparado
a partir de la sustancia intermedia 4 pegilada (específico de sitio)
y anti-PDGF\betaR DFM-PEG derivado
aleatoriamente. Se usaron DFM sin modificar preparado con BMH como
reticulador e IgG para comparar los parámetros de unión. La afinidad
de unión según se cuantifica mediante el valor Kd fue similar entre
la IgG y el DFM sin modificar y fue 1,07 x 10^{-10} M y 1,27 x
10^{-10} M, respectivamente. La modificación aleatoria con PEG
(1,3 por di-Fab') dio como resultado una pérdida
sustancial de la afinidad de unión hasta 8,97 x 10^{-10} M. La
pegilación específica de sitio con el mismo tamaño de molécula de
PEG dio como resultado una afinidad de unión muy mejorada con un
valor de Kd de 2,10 x 10^{-10} M.
\vskip1.000000\baselineskip
Para los análisis de farmacocinética, se marcaron
radiactivamente las muestras con ^{125}I usando reactivo de
Bolton-Hunter mediante la metodología estándar y se
desalaron en solución salina tamponada con fosfato a pH 6,8 para
eliminar el ^{125}I sin reaccionar. Se inyectaron intravenosamente
20 mg de sustancia marcada en la vena de la cola de grupos de seis
ratas machos winstar. En momentos seleccionados, se tomaron muestras
de sangre, se contaron en un gammacontador y se calculó el
porcentaje de la dosis inyectada por gramo de sangre. Se
determinaron los valores de las velocidades de eliminación y el área
debajo de la curva usando el paquete de programas SIPHAR.
Los resultados (figura 2) muestran una
eliminación más lenta de la sangre para el conjugado
DFM-PEG en comparación con el DFM sin modificar.
Esto también repercutió en el cálculo de los parámetros
farmacocinéticos. La farmacocinética de la IgG y del DFM se ajustaba
mejor a un modelo de dos compartimentos, mientras que la de
DFM-PEG se ajustaba mejor a un modelo de
compartimento único. Los resultados muestran una semivida
significativamente mayor y un área debajo de la curva aumentada para
DFM-PEG en comparación con el DFM (tabla 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizó la potencia de las muestras de
anti-PDGF\betaR DFM y DFM-PEG
mediante su capacidad de bloquear la incorporación de
^{3}H-timidina por los fibroblastos dérmicos
SK-5 en respuesta a PDGF BB. Se trataron con
tripsina células SK-5 (que se dejaron crecer en DMEM
+ suero fetal de ternera inactivado térmicamente 10%, glutamina 1%,
piruvato sódico 1% y tampón HEPES 0,025 M) en confluencia al 80% y
se sembraron 5000 células/0,1 ml por pocillo en una placa de
histocultivo de 96 pocillos, en medio sin suero (1:1 DMEM:HAM's F12
+ insulina 5 \mug/ml, selenio 16 ng/ml, transferrina 20 \mug/ml,
seroalbúmina bovina 1 mg/ml, glutamina 1%, tampón de HEPES 0,025 M y
pen. strep.). Se colocaron las células en un incubador durante 24
horas en reposo a 37ºC, CO_{2} 5% y humedad del 95%. Se añadieron
a los pocillos medio solo, anticuerpo solo, PDGF BB a una
concentración final de 10 ng/ml o 20 ng/ml, o PDGF BB junto con
concentraciones variables del anticuerpo, hasta un volumen final de
0,2 ml. Se usaron entre 5 y 10 pocillos para cada estado. Se añadió
^{3}H-timidina (0,5 mCi por pocillos) de 6 a 8
horas después y las células se dejaron toda una noche. Se sacaron
las placas del incubador y se colocaron a -20ºC durante 24 horas
para facilitar la recolección. Se descongelaron las placas y el ADN
se recogió en matrices de filtro usando un recolector Skatron
Micro96. Se secaron las matrices a 67ºC durante 90 minutos, se
añadió Betaplate Scint (Wallac) y las matrices se contaron en un
contador de centelleo líquido LKB Wallac 1205 BETAPLATER.
La incorporación de
^{3}H-timidina se inhibió en el
85-92% mediante todas las formas del anticuerpo a
PDGF BB 10 ng/ml y 10 mg/ml de anti-PDGF\betaR o
DFM-PEG. Como la concentración del anticuerpo
extiende, la diferencia entre la unión de PEG aleatoriamente y la
unión específica de sitio se hace clara (figura 3). Igualmente, esto
se muestra incrementando la concentración de PDGF BB hasta 20 ng/ml
(figura 4). Al menos, hay un descenso de dos veces en la potencia
entre el DFM 40 kDa modificado con PEG aleatoriamente y el DFM 40
kDa específico de sitio.
Se hizo un derivado de la sustancia intermedia 4
con succinato de succinimidilo con PEG de 20 kDa (Polymer Labs), o
con succinato de succinimidilo con PEG de 10 kDa (Polymer Labs) y se
usó para preparar anti-PDGF\betaR
DFM-PEG como se describe en el ejemplo 1. En este
caso, la purificación de los conjugados DFM-PEG se
consiguió usando una cromatografía de intercambio iónico en Mono S.
La cromatografía en Mono S se llevó a cabo usando una columna
equilibrada con acetato 50 mM, pH 4,5 y después de la aplicación de
la muestra y del lavado con tampón de equilibrado el material unido
se eluyó usando un gradiente lineal de cloruro sódico. Después de
esta etapa, el DFM-PEG se purificó adicionalmente
usando filtración en gel en Sephacryl S-200
desarrollada en solución salina tamponada con fosfato diluida 1:1
con agua. El análisis de SDS-PAGE puso de manifiesto
exitosamente que la unión del PEG había tenido lugar (figura 1).
El análisis de unión al antígeno se llevó a cabo
mediante análisis BIAcore tal como se describe en el ejemplo 1. Los
resultados mostrados en la tabla 3, muestran que estos derivados de
PEG pueden unirse con menor pérdida de la afinidad de unión al
antígeno.
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\vskip1.000000\baselineskip
Seguidamente, se examinaron estos conjugados
DFM-PEG en un estudio farmacocinético con ratas
usando el método descrito en el ejemplo 1. Los resultados (figura 5)
muestran una eliminación significativamente más lenta de la sangre
(una semivida in vivo mayor) para los conjugados
DFM-PEG en comparación con el DFM sin
modifi-
car.
car.
Se hizo un derivado de la sustancia intermedia 4
con propionato de succinimidilo con PEG de 20 kDa (Shearwater
Polymers Inc, ibid), o con PEG 5
kDa-succinimidiléster de PEG
carboxi-metilado (Shearwater Polymers Inc.) o con
PEG2 10 kDa-succinimida (2 x 5 kDa, Polymer Labs) o
con PEG2 20 kDa-succinimida (2 x 10 kDa, Polymer
Labs), y se usó para preparar conjugados
anti-PDGF\betaR DFM-PEG como se
describe en los ejemplos 1 y 2. Estos derivados de
DFM-PEG se purificaron usando una cromatografía de
intercambio iónico seguido de filtración en gel como se describe en
el ejemplo 2. El análisis de SDS-PAGE puso de
manifiesto que la conjugación al PEG fue exitosa en todos los casos
(figura 6). También se llevó a cabo análisis BIAcore para determinar
la afinidad de unión al antígeno. Los resultados, que se muestran en
la tabla 4, muestran que estos derivados de PEG pueden unirse con
poca pérdida en la afinidad de unión al antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Seguidamente, se examinaron estos conjugados
DFM-PEG en un estudio farmacocinético con ratas
usando el método descrito en el ejemplo 1. Los resultados (figura 7)
muestran una eliminación significativamente más lenta de la sangre
(una semivida in vivo mayor) para los conjugados
DFM-PEG en comparación con el DFM sin
modifi-
car.
car.
Se expresó el Fab' hTNF40 (que reconoce al
TNF\alpha humano) en células W3110 de E. coli que se
dejaron crecer en un fermentador de 10 litros. El fragmento Fab'
tiene un resto de cisteína único presente en su región bisagra
disponible para reticulación. Se preparó un extracto celular tal
como se describe en el ejemplo 1. Se diluyó el extracto celular
hasta una conductividad de 3,5 mS/cm, se ajustó el pH a 4,5 y se
aplicó en una columna de Streamline^{TM} SP (Pharmacia)
equilibrada con tampón de acetato 50 mM, pH 4,5. Después de lavar
con tampón de equilibrado, se eluyó el Fab' con cloruro sódico 200
mM en tampón de acetato 50 mM, pH 4,5. Se ajustó el pH del material
eluido hasta 7,5 con Tris 2 M y se aplicó a una columna de sefarosa
con proteína G equilibrada con PBS. Después de lavar con PBS, se
eluyó el Fab' con glicina 0,1 M-ácido clorhídrico pH 2,7 e,
inmediatamente, se ajustó de nuevo el pH a 6. Seguidamente, el Fab'
purificado se dializó mediante filtración en tampón de fosfato 0,1
M, pH 6, que contenía EDTA
2 mM.
2 mM.
Se activó el grupo tiol de la bisagra del Fab'
mediante reducción con \beta-mercaptoetilamina tal
como se describe en el ejemplo 1. Seguidamente, se desaló la muestra
en fosfato 0,1 M, pH 6, que contenía EDTA 2 mM. Se midió el número
de grupos tiol por molécula de Fab' tal como se describe en el
ejemplo 1. Se reticuló el Fab' con el reticulador pegilado preparado
a partir de la sustancia intermedia 4 (40 kDa PEG
bis-maleimida, Shearwater Polymers Inc., Huntsville,
AL, Estados Unidos) a una relación de Fab':reticulador de 2,2:1 a
temperatura ambiente.
Se purificó el DFM-PEG deseado
mediante cromatografía de filtración en gel usando Sephacryl
S-200 HR (para eliminar el Fab' y el DFM sin
reaccionar) en tampón de acetato 50 mM, pH 4,5, seguido de
cromatografía de intercambio catiónico usando SP Sefarosa HP para
separar el DFM-PEG del Fab'-PEG. La
cromatografía en SP sefarosa HP se llevó a cabo usando una columna
equilibrada con tampón de acetato 50 mM, pH 4,5. Después de la
aplicación de la muestra y de lavar con tampón de equilibrado el
material unido se eluyó con un gradiente lineal de cloruro sódico.
Se examinó el material purificado en SDS-PAGE y se
mostró que tenía una movilidad menor que la del DFM sin modificar
demostrándose la conjugación exitosa de PEG (figura 8).
Se valoró la actividad de unión al antígeno
mediante análisis BIAcore que mide la afinidad de la unión al TNF.
Se capturaron Fab', DFM, IgG o PEG-DFM con un
anticuerpo anti-Fab' inmobilizado y se hizo pasar
sobre la superficie el TNF humano. Seguidamente, se analizó la
cinética de la unión al TNF. Los resultados de este análisis se
muestran en la tabla 5. Se usó DFM sin modificar preparado con BMH
como reticulador e IgG para comparar los parámetros de unión. La
afinidad de unión tal como se cuantifica mediante el valor Kd fue
similar entre la IgG y el DFM (1,79 x 10^{-10} M y 1,07 x
10^{-10} M, respectivamente). La pegilación específica de sitio
del DFM dio como resultado una afinidad de unión casi idéntica de
1,82 x 10^{-10} M, lo que sugiere que no hay pérdida de la función
de unión al antígeno después de la modificación con PEG.
\vskip1.000000\baselineskip
Para el análisis de farmacocinética, se
estudiaron estas muestras en ratas usando el método descrito en el
ejemplo 1. La velocidad de eliminación y los valores AUC se
determinaron usando el paquete de programas SIPHAR o bien el
WINNONLIN.
Los resultados (figura 9) muestran una
eliminación significativamente más lenta de la sangre (una semivida
in vivo mayor) para el conjugado DFM-PEG en
comparación con el DFM sin modificar. Esto también repercutió en el
cálculo de los parámetros farmacocinéticos, que encajaban en un
modelo de dos compartimentos. Los resultados mostraron una semivida
significativamente mayor y un área bajo la curva aumentada para el
DFM-PEG en comparación con el DFM (tabla 6).
Claims (14)
1. Un fragmento divalente de anticuerpo que
comprende dos cadenas pesadas de anticuerpos y, al menos, una
molécula de polímero en enlace covalente, estando, cada cadena
pesada, unida covalentemente a la otra mediante, al menos, un puente
intercatenario no disulfuro que une el átomo de azufre de un resto
de cisteína en una cadena al átomo de azufre de un resto de cisteína
en la otra cadena, estando, dichos restos de cisteína, localizados
fuera del dominio de la región variable de cada cadena,
caracterizado porque, al menos, un puente intercatenario no
disulfuro contiene una molécula de polímero covalentemente unida y
en el que dicho polímero es un polímero de polialquileno,
polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada y
opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o sin
ramificar.
2. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que cada cadena pesada está covalentemente
unida a la otra mediante un puente no disulfuro único, conteniendo,
dicho puente, una molécula de polímero covalentemente unida.
3. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que cada cadena pesada
está emparejada con una cadena ligera.
4. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 3, en el que
cada cadena pesada es una cadena V_{H}-CH1
sustituida terminalmente por un dominio de la región bisagra.
5. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que cada puente no disulfuro presente une el
átomo de azufre de un resto de cisteína localizado en el dominio de
la región bisagra de una cadena pesada al átomo de azufre de un
resto de cisteína en el dominio de la región bisagra de la otra
cadena.
6. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el polímero es
un poli(etilenglicol) de cadena lineal o ramificada y
opcionalmente sustituido o un derivado del mismo.
7. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que el polímero es
metoxi(polietilenglicol) o un derivado del mismo.
8. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que el polímero tiene un peso molecular en
el intervalo de, aproximadamente, 25.000 Da a, aproximadamente,
40.000 Da.
9. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cada
puente intercatenario es el resto de un reactivo de reticulación
homo o heterobifuncional.
10. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 9, en el que cada puente es una cadena de alquileno
C_{4-20} opcionalmente sustituida y opcionalmente
interrumpida por uno o más heteroátomos o grupos que contengan
heteroátomos.
11. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de la reivindicación 1 a la reivindicación 10, que está
unido covalentemente a una o más moléculas efectoras o testigo.
12. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es capaz de
unirse selectivamente a un antígeno de superficie celular o
soluble.
13. Un fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que el antígeno es el factor \alpha
humano de necrosis tumoral o un factor de crecimiento derivado de
plaquetas o un receptor del mismo.
14. Una composición farmacéutica que comprende un
fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, junto con uno o más excipientes,
diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
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