DE69922003T2

DE69922003T2 - Mit PEG konjugierte divalente Antikörperfragmente

Info

Publication number: DE69922003T2
Application number: DE69922003T
Authority: DE
Inventors: Andrew Paul Chapman; David John King
Original assignee: Celltech R&D Ltd
Current assignee: UCB Celltech Ltd
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: EP1090037B1; GB9812545D0; GB2354242B; GB2354242A; CA2330186C; GB0030176D0; ATE282637T1; WO1999064460A1; AU763246B2; DE69922003D1; US8067005B1; AU4278399A; EP1090037A1; JP4456758B2; PT1090037E; JP2002517515A; DE19983347T1; ES2232185T3; CA2330186A1

Description

Diese Erfindung betrifft modifizierte divalente Antikörperfragmente, Verfahren zu ihrer Herstellung, Zusammensetzungen, die sie enthalten und ihre Verwendung in der Medizin.
Antikörper werden zunehmend in der Klinik für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet. Das Ziel in jedem Fall ist es, die Kombination von hoher Spezifität und Affinität der Antikörper-Antigen Wechselwirkung auszunutzen, um den Nachweis und/oder die Behandlung einer bestimmten Läsion zu ermöglichen. Der Antikörper wird alleine verwendet, oder er wird mit einem anderen Atom oder Molekül, wie einem Radioisotop oder einem zytotoxischen Arzneimittel, beladen.
Die Pharmakokinetik und Bioverteilung eines Antikörpers spielt eine wichtige Rolle bei der Bestimmung, ob seine Verwendung in der Klinik erfolgreich sein wird. So muss der Antikörper in der Lage sein, an den Wirkort transportiert zu werden und dort für einen Zeitraum zu verbleiben, um seinen Zweck zu erfüllen. Er sollte außerdem nur in subtoxischen Mengen außerhalb seines Zieles vorliegen, und er muss in einer gut definierten Weise abgebaut werden.
Für viele Verwendungen ist die Pharmakokinetik von Antikörpern nicht ideal. Dies trifft insbesondere für die Tumordiagnose und die Therapie mit Antikörper-Radioisotop- oder Arzneimittelkonjugaten zu. Für die Diagnose mit solchen Konjugaten beschränken Halbwertszeiten das Tumor-Hintergrund Verhältnis und damit die Sensitivität des Nachweises der Läsion. Für die Therapie führt eine lange Halbwertszeit zu einer Langzeitexposition von normalem Gewebe gegenüber dem Antikörperkonjugat und damit zu Dosis limitierter Toxizität.
Eine Anzahl von Ansätzen stehen zur Verfügung, um die Pharmakokinetik von Antikörpern zu manipulieren, und diese beeinflussen für gewöhnlich auch ihre Bioverteilung. Der einfachste und am häufigsten verwendete Ansatz ist die Verwendung von Antikörperfragmenten. Diese sind eindeutig schneller in der Zirkulation als gesamte Antikörper und verteilen sich schneller von dem Blut in die Gewebe, was ein besonderer Vorteil in manchen Anwendungen, zum Beispiel für die Tumordarstellung und -therapie, ist.
Um die Pharmakokinetik von Antikörperfragmenten noch weiter zu verbessern, haben wir die Verwendung von Polymeren untersucht. Die Anheftung von polymeren Materialien, wie Polyethylenglykol (PEG) an Proteinmoleküle ist gut etabliert, und es wurde gezeigt, dass die Anheftung eines Polymers die pharmakologischen Eigenschaften eines Proteinmoleküls wesentlich verändern kann. Beispielsweise kann eine PEG Modifikation von Proteinen die in vivo Zirkulationshalbwertszeit des Proteins, die Antigenität und Immunogenität, Löslichkeit, mechanische Stabilität und Resistenz gegenüber Proteolyse verändern [Abuchowski, A. et al. J. Biol. Chem. (1977) 252, 3578–3581 und 3582–3586; Nucci, M. L. et al., Adv. Drug Delivery Reviews (1991) 6, 133–151; Francis, G. et al. Pharmaceutical Biotechnology Band 3 (Borchardt, R. T. Hrsg.), und Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization (1991) S. 235–263 (Ahern, T. J. und Manning, M. Hrsg.) Plenum, New York].
Die Anheftung von PEG an Proteinmoleküle wurde unter Verwendung einer Anzahl von verschiedenen chemischen Verfahren erreicht, von denen die meisten PEG an Lysinreste oder andere Aminosäurereste auf der Oberfläche des Proteins in einer zufälligen Weise anheften [Zalipsky, S. & Lee, C. Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (1992) S. 347–370 (Harris, J. M., Hrsg.), Plenum New York]. Dies führt oft zur teilweisen Beeinflussung der Funktion des Proteins, beispielsweise besitzen Enzyme eine verringerte katalytische Aktivität [Nucci, M. L. et al. ibid].
Es wurde über ortsspezifische Modifikation von Proteinen, um Stellen für die PEG Anheftung einzuführen, berichtet. Beispielsweise wurde Interleukin-2 durch Mutagene modifiziert, um einen Threoninrest, der normalerweise glykosyliert wird, gegen ein Cystein auszutauschen, um die Anheftung von PEG zu erlauben [Goodson, R. J. & Katre, N. V. Bio/Technology (1990) 8, 343–346]. Eine Stelle, die normalerweise glykosyliert ist, wurde ausgewählt, weil man annahm, dass diese in der Lage war, die PEG Modifikation ohne Störung der Proteinstruktur zu tolerieren. In einem anderen Beispiel wurde das Enzym Purin-Nukleosid-Phosphorylase modifiziert, um selektiv Argininreste gegen Lysine auszutauschen, um in diesem Fall bis zu 18 zusätzliche potenzielle PEG Anheftungsstellen pro Enzymmolekül zur Verfügung zu stellen [Hershfield, M. S. et al. P.N.A.S. (1991), 88, 7185–7189].
Frühere Studien mit Antikörpern und Antikörperfragmenten haben zufällige PEG Anheftung über Lysinreste [z.B. Ling, T. G. I. & Mattiasson, B. J. Immunol. Methods (1983), 59, 327–337; Wilkinson, I. et al. Immunol. Letters (1987) 15, 17–22; Kitamura, K. et al. Cancer Res. (1991), 51, 4310–4315; Delgado, C. et al. Br. J. Cancer (1996), 73, 175–182] und thiolierte Derivate [Pedley, R. B. et al. Br. J. Cancer (1994), 70, 1126–1130] verwendet. Zufällige Anheftung hat häufig zu modifizierten Antikörpern geführt, die nur in der Lage sind, ihr Zielantigen mit verringerter Affinität, Bindungsfestigkeit oder Spezifität zu binden. In einem Versuch, dies zu überwinden, wurden kritische Lysinreste in Antigen bindenden (CDR) Schleifen gegen Arginine ausgetauscht, um eine Modifikation mit weniger Verlust an Immunreaktivität zu erlauben [Benhar, I. et al. Bioconjugate Chemistry (1994) 5, 321–326].
Spezifische Stellen in den Konstanten- und den Gelenkbereichen der Antikörper können verändert werden, um eine ortsspezifische Verknüpfung einer Anzahl von Effektor- und Reportermolekülen zu erlauben [Lyons, A. et al. Prot. Eng. (1990), 3, 703–709; und europäische Patentbeschreibungen Nr. 348442 und 347433]. Wir haben jetzt festgestellt, dass die ortsspezifische Anheftung von Polymeren an divalente Antikörperfragmente verwendet werden kann, um den Verlust an Immunreaktivität, der zuvor mit zufälligen Anheftungsverfahren verbunden war, zu ver meiden. Darüber hinaus besitzen Fragmente, die auf diese Weise modifiziert sind, merklich verbesserte Bindungs- und/oder pharmakokinetische Eigenschaften, wenn sie mit Fragmenten verglichen werden, die zufällig mit derselben Zahl und Art von Polymermolekülen modifiziert wurden.
So stellen wir gemäß einem Aspekt der Erfindung ein divalentes Antikörperfragment bereit, welches zwei schwere Antikörperketten und mindestens ein Polymermolekül in kovalenter Verknüpfung umfasst, wobei jede schwere Kette mit der anderen durch mindestens eine Nicht-Disulfid Zwischenketten-Brücke, welche das Schwefelatom eines Cysteinrestes in einer Kette mit dem Schwefelatom eines Cysteinrestes in der anderen Kette verknüpft, kovalent verknüpft ist, wobei die Cysteinreste außerhalb der Domäne mit variablem Bereich jeder Kette lokalisiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Nicht-Disulfidbrücke ein kovalent verknüpftes Polymermolekül enthält, und wobei das Polymer ein gegebenenfalls substituiertes gerad- oder verzweigtkettiges Polyalkylen-, Polyalkenylen- oder Polyoxyalkylenpolymer oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Polysaccharid ist.
Der Begriff "Nicht-Disulfid", so wie er hier verwendet wird, soll bedeuten, dass S-S Brücken, z.B. der Art, die normalerweise in Antikörpern gefunden wird, ausgeschlossen sind. Eine Zwischenketten-Brücke der Art, die in einem erfindungsgemäßen Fragment vorliegt, kann jedoch dennoch mit einer schweren Kette über eine -S-S-Bindung, wie nachfolgend hier beschrieben, verbunden sein.
Das erfindungsgemäße Antikörperfragment wird im Allgemeinen in der Lage sein, selektiv an ein Antigen zu binden. Das Antigen kann irgendein zellassoziiertes Antigen sein, beispielsweise ein Zelloberflächenantigen, wie ein T-Zell-, Endothelzell- oder Tumorzellmarker, oder es kann ein lösliches Antigen sein. Besondere Beispiele von Zelloberflächenantigenen schließen Adhäsionsmoleküle, beispielsweise Integrine wie β1 Integrine, z.B. VLA-4, E-Selectin, P-Selectin oder L-Selectin, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52, CD69, carcinoembryonisches Antigen (CEA), humanes Milchfettglobulin (HMFG1 und 2), MHC Klasse I und MHC Klasse II Antigene und VEGF, und wo es angemessen ist, Rezeptoren davon, ein. Lösliche Antigene schließen Interleukine, wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 oder IL-12, virale Antigene, beispielsweise respiratorisches Syncytialvirus oder Cytomegalovirus Antigene, Immunglobuline, wie IgE, Interferone, wie Interferon-α, Interferon-β oder Interferon-γ, Tumor-Nekrose-Faktor-α, Tumor-Nekrose-Faktor-β, Kolonie-stimulierende Faktoren, wie G-CSF oder GM-CSF und Thrombozytenwachstumsfaktoren, wie PDGF-α und PDGF-β, und wo es angemessen ist, Rezeptoren davon, ein. Jedes Antigen kann beispielsweise ein humanes Antigen sein.
Besondere erfindungsgemäße Antikörperfragmente schließen solche ein, die selektiv an Tumor-Nekrose-Faktor-α und Thrombozytenwachstumsfaktoren und Rezeptoren davon, binden, insbesondere jene, die in den hier folgenden Beispielen beschrieben sind.
Um nützliche Antigen bindende Eigenschaften zu erhalten, kann jede schwere Kette in einem erfindungsgemäßen Fragment mit einer komplementären leichten Kette eines Antikörpers oder eines Fragments davon gepaart sein, und die Erfindung erstreckt sich auf solche Konstrukte. Wo es gewünscht ist, kann ein schweres-leichtes Kettenpaar in einer kovalenten Verknüpfung vorliegen, beispielsweise einer Disulfidverknüpfung, wie sie in natürlich vorkommenden Antikörpern vorkommt und/oder einer Peptidverknüpfung, wie sie beispielsweise in rekombinanten Einzelketten Antikörpern gefunden wird.
Im Allgemeinen wird jede schwere Kette und, wenn anwesend, jede leichte Kette einen variablen Domänenbereich aufweisen. Der Begriff variabler Domänenbereich, so wie er hier verwendet wird, soll den Teil einer schweren oder leichten Kette bedeuten, der eine Antigenbindungsstelle (im Folgenden eine V_H oder V_L Domäne) enthält. Die V_H oder V_L Domäne kann irgendeine Größe oder Aminosäurenzusammensetzung aufweisen, und sie wird im Allgemeinen mindestens eine hypervariable Aminosäuresequenz aufweisen, die für die Antigenbindung, die in eine Netzwerksequenz eingebettet ist, verantwortlich ist.
Jede V_H oder V_L Domäne kann irgendeine natürlich vorkommende variable Domäne oder eine veränderte Version davon sein. Unter veränderter Version wird ein variabler Domänenbereich verstanden, der unter Verwendung von rekombinanten DNA Veränderungstechniken gebildet wurde. Solche veränderten Versionen schließen solche ein, die beispielsweise aus natürlichen Antikörper variablen Bereichen durch Insertionen, Deletionen oder Veränderungen in oder an den Aminosäuresequenzen der natürlichen Antikörper gebildet werden. Besondere Beispiele dieses Typs schließen solche veränderten V_H oder V_L Domänen ein, die mindestens einen CDR und gegebenenfalls eine oder mehrere Netzwerkaminosäuren von einem Antikörper und das Verbleibende des variablen Domänenbereichs eines zweiten Antikörpers enthalten.
Jede V_H Domäne wird im Allgemeinen kovalent mit mindestens einem Cysteinrest verknüpft sein. Die Lage jedes Cysteinrestes kann mit der Größe und Natur des benötigten Antikörperfragments variieren. So kann in einem extremen Beispiel ein Cysteinrest direkt mit der C-terminalen Aminosäure der V_H Domäne verknüpft sein. Dies kann anschließend als die Brückenstelle für eine Zwischenketten-Brücke, die ein Polymermolekül enthält, dienen. Zwei V_H Domänen diesen Typs können somit überbrückt werden, um ein erfindungsgemäßes Fragment zu bilden.
In der Praxis ist es jedoch im Allgemeinen bevorzugt, dass die V_H Domäne kovalent an der C-terminalen Aminosäure mit mindestens einer anderen Antikörperdomäne oder einem Fragment davon verknüpft ist, die/das einen Cysteinrest enthält. So kann beispielsweise eine V_H Domäne mit einer Immunglobulin CH1 Domäne oder einem Fragment davon verbunden sind. Die CH1 Domäne kann mit weiteren Aminosäuren verlängert sein, beispielsweise um eine Gelenkbereich-Domäne bereitzustellen, wie sie im Allgemeinen in Immunglobulinen gefunden wird, oder um weitere Domänen bereitzustellen, wie Antikörper CH2 und CH3 Domänen. In jedem der oben genannten Fälle kann mindestens ein Cysteinrest an irgendeinem Punkt innerhalb irgendeiner Domäne angeordnet sein, um eine Überbrückungsstelle für eine Zwischenketten-Brücke, die ein Polymermolekül enthält, zu bilden.
Genauso kann irgendeine V_L Domäne, die in einem erfindungsgemäßen Fragment anwesend ist, mit einer konstanten Domäne einer leichten Kette eines Antikörpers (C_L) oder eines Fragments davon verknüpft sein.
Das Polymermolekül in dem erfindungsgemäßen Fragment kann im Allgemeinen ein synthetisches oder natürlich vorkommendes Polymer sein, beispielsweise ein substituiertes gerad- oder verzweigtkettiges Polyalkylen-, Polyalkenylen- oder Polyoxyalkylenpolymer oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Polysaccharid, z.B. ein Homo- oder Heteropolysaccharid.
Besondere wahlweise Substituenten, die an den oben genannten synthetischen Polymeren vorkommen können, schließen eine oder mehrere Hydroxy-, Methyl- oder Methoxygruppen ein. Besondere Beispiele von synthetischen Polymeren schließen gegebenenfalls substituierte gerad- oder verzweigtkettiges Poly(ethylenglykol), Poly(propylenglykol) oder Poly(vinylalkohol) und Derivate davon, insbesondere gegebenenfalls substituiertes Poly(ethylenglykol), wie Methoxy(polyethylenglykol) und Derivate davon, ein. Besondere natürlich vorkommende Polymere schließen Lactose, Amylose, Dextran, Glykogen und Derivate davon ein. "Derivate", so wie hier verwendet, beabsichtigt, reaktive Derivate einzuschließen, beispielsweise aktive Ester, wie Succinimidylester und ähnliches. Die reaktive Gruppe kann direkt oder über ein Linkersegment mit dem Polymer verbunden sein. Es wird verstanden, dass der Rest einer solchen Gruppe in einigen Fällen einen Teil des erfindungsgemäßen Produkts bildet, wie die Verbindungsgruppe zwischen dem Polymer und der Zwischenketten-Brücke.
Die Größe des Polymers kann wie gewünscht variieren, aber im Allgemeinen wird sie in einem durchschnittlichen Molekulargewichtsbereich von ungefähr 500 Da bis ungefähr 50.000 Da, zum Beispiel von 5.000 bis 40.000 Da und einschließlich 25.000 bis 40.000 Da liegen. Die Polymergröße kann insbesondere auf der Basis der beabsichtigten Verwendung des Produkts ausgewählt werden. Wenn somit beispielsweise beabsichtigt ist, dass das Produkt die Zirkulation verlässt und Gewebe durchdringt, beispielsweise zur Verwendung in der Behandlung eines Tumors, kann es vorteilhaft sein, ein kleines Molekulargewichtspolymer, beispielsweise ungefähr 5.000 Da, zu verwenden. Für Anwendungen, in denen das Produkt in der Zirkulation verbleibt, kann es vorteilhaft sein, ein höheres Molekulargewichtspolymer, beispielsweise im Bereich von 25.000 Da bis 40.000 Da zu verwenden.
Im Allgemeinen bildet jedes Polymermolekül in dem erfindungsgemäßen Antikörperfragment einen Teil einer Zwischenketten-Brücke. Jede Brücke dient dazu, zwei schwere Ketten zu verbinden, und jede Kette wird kovalent mit einem Schwefelatom eines Cysteinrestes verbunden sein. Die kovalente Verknüpfung wird im Allgemeinen eine Disulfidbindung oder insbesondere eine Schwefel-Kohlenstoffbindung sein.
Jede Zwischenketten-Brücke kann im Allgemeinen von irgendeiner gewünschten Länge oder Zusammensetzung sein. Geeignete Brücken schließen Reste von homo- oder heterofunktionalen Vernetzungsreagenzien ein, insbesondere homo- oder heterobifunktionale Vernetzungsreagenzien, die eines oder mehrere kovalent verbundene Polymermoleküle, wie gerade beschrieben, enthalten.
Homo- oder heterofunktionale Vernetzungsreagenzien schließen polyvalente, insbesondere bivalente Radikale von aliphatischen, heteroaliphatischen, cycloaliphatischen, heterocycloaliphatischen, aromatischen oder heteroaromatischen Gruppen ein, die zwei Thiol reaktive funktionale Gruppen enthalten. Jedes erfindungsgemäße Fragment wird eine Zwischenketten-Brücke enthalten, die von einem solchen Reagens abgeleitet ist, in dem sich jede Thiol reaktive funktionale Gruppe in einer kovalenten Verbindung mit einem Schwefelatom eines Cysteinrestes befindet. Besondere Thiol reaktive funktionale Gruppen schließen α-Halocarbonsäuren oder Ester, z.B. Iodacetamid, Imide, z.B. Maleimid, Vinylsulfone oder Disulfide, ein.
Besondere Brücken schließen gegebenenfalls substituierte gerad- oder verzweigtkettige C_4-20 Alkylen-, C_4-20 Alkenylen- oder C_4-20 Alkinylketten, gegebenenfalls unterbrochen durch eines oder mehrere Heteroatome oder Heteroatom enthaltende Gruppen, wie -O-, oder -S- Atome oder -N(R¹)- [worin R¹ ein Wasserstoffatom oder eine C_1-6 Alkylgruppe ist], -CON(R¹)-, -N(R¹)CO-, -SO₂N(R¹)-, -N(R¹)SO₂-, -C(O)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -OCON(R¹)-, -N(R¹)C(O)O-, -C(O)O- Gruppen, oder durch Cyclopentylen, Cyclohexylen, Phenylen oder substituierte Phenylengruppen, ein. Wahlweise Substituenten schließen beispielsweise eine oder mehrere Amino- oder substituierte Aminogruppen, z.B. -N(R¹)₂ Gruppen ein, worin jedes R¹ Atom oder -Gruppe gleich oder verschieden sein kann.
Das Polymer kann kovalent an irgendeiner Stelle in der Zwischenketten-Brücke, im Allgemeinen durch ein Heteroatom oder eine Heteroatom enthaltende Gruppe, wie gerade in Bezug auf bestimmte Zwischenketten-Brücken beschrieben, angeheftet sein.
Besonders nützliche erfindungsgemäße Fragmente sind jene, die eine einzelne Zwischenketten-Brücke enthalten. In diesen besonderen Fragmenten kann das Polymer insbesondere ein synthetisches Polymer, insbesondere ein Polyalkylenpolymer, wie Poly(ethylenglykol) oder insbesondere Methoxypoly(ethylenglykol) oder ein Derivat davon, und insbesondere mit einem Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 25.000 Da bis ungefähr 40.000 Da, sein. Die Brücke kann insbesondere eine gegebenenfalls substituierte gerad- oder verzweigtkettige C_4-20 Alkylenkette, gegebenenfalls unterbrochen durch ein oder mehrere Heteroatome oder Heteroatom enthaltende Gruppen, wie zuvor beschrieben, sein.
Jede schwere Kette in dem erfindungsgemäßen Fragment ist vorzugsweise eine V_H-CH1 Kette, die terminal mit einer Gelenkbereich-Domäne substituiert ist, beispielsweise wie es natürlicherweise in Immunglobulinen gefunden wird. Jede Kette ist vorzugsweise mit einer leichten Kette, insbesondere einer V_H-C_L Kette gepaart, wodurch beispielsweise ein Fab' Fragment gebildet wird. In bevorzugten erfindungsgemäßen Fragmenten, die Paare aus schweren und leichten Ketten dieses Typs enthalten, wird eine einzelne Zwischenketten-Brücke anwesend sein, die insbesondere einen Cysteinrest, der in der Gelenksequenz jeder schweren Kette angeordnet ist, überbrückt. Wünschenswerterweise wird dies der einzige Cysteinrest sein, der in jeder Gelenksequenz anwesend ist.
Wo es gewünscht ist, kann das erfindungsgemäße Antikörperfragment zusätzlich eines oder mehrere daran angeheftete Effektor- oder Reportermoleküle aufweisen, und die Erfindung erstreckt sich auf solche modifizierten Antikörper. Die Effektor- oder Reportermoleküle können an das Antikörperfragment durch irgendeine zur Verfügung stehende Aminosäureseitenkette oder eine funktionale Gruppe einer terminalen Aminosäure, die in dem Fragment angeordnet ist, verknüpft sein, beispielsweise irgendeine freie Amino-, Imino-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe.
Effektormoleküle schließen beispielsweise antineoplastische Agenzien, Toxine (wie enzymatisch aktive Toxine bakteriellen oder pflanzlichen Ursprungs und Fragmente davon, z.B. Rizin und Fragmente davon), biologisch aktive Proteine, beispielsweise Enzyme, Nukleinsäuren und Fragmente davon, z.B. DNA, RNA und Fragmente davon, Radionuklide, insbesondere Radioiodide und Chelatmetalle, ein. Geeignete Reportergruppen schließen Chelatmetalle, Fluoreszenzverbindungen oder Verbindungen, die durch NMR oder ESR Spektroskopie nachgewiesen werden können, ein.
Besondere antineoplastische Agenzien schließen zytotoxische und zytostatische Agenzien, beispielsweise alkylierende Agenzien, wie Stickstoffsenfe (z.B. Chlorambucil, Melphalan, Mechlorethamin, Cyclophosphamid oder Uracilsenf) und Derivate davon, Triethylenphosphoramid, Triethylenthiophosphoramid, Busulfan oder Cisplatin; Antimetabolite, wie Methotrexat, Fluoruracil, Floxuridin, Cytarabin, Mercaptopurin, Thioguanin, Fluoressigsäure oder Fluorzitronensäure, Antibiotika, wie Bleomycine (z.B. Bleomycinsulfat), Doxorubicin, Daunorubicin, Mitomycine (z.B. Mitomycin C), Actinomycine (z.B. Dactinomycin), Plicamycin, Calichaemicin und Derivate davon, oder Esperamicin und Derivate davon; mitotische Inhibitoren, wie Etoposid, Vincristin oder Vinblastin und Derivate davon; Alkaloide, wie Ellipticin, Polyole wie Taxicin-I oder Taxicin-II; Hormone, wie Androgene (z.B. Dromostanolon oder Testolacton), Progestine (z.B. Megestrolacetat oder Medroxyprogesteronacetat), Östrogene (z.B. Dimethylstilbestroldiphosphat, Polyöstradiolphosphat oder Estramustinphosphat) oder Antiöstrogene (z.B. Tamoxifen); Anthrachinone, wie Mitoxantron, Harnstoffe, wie Hydroxyharnstoff; Hydrazine, wie Procarbazin; oder Imidazole, wie Dacarbazin, ein.
Besonders nützliche Effektorgruppen sind Calichaemicin und Derivate davon (siehe beispielsweise südafrikanische Patentbeschreibungen Nr. 85/8794, 88/8127 und 90/2839).
Chelatmetalle schließen Chelate von di- oder tripositiven Metallen mit einer Koordinationszahl von 2 bis einschließlich 8 ein. Besondere Beispiele solcher Metalle schließen Technetium (Tc), Rhenium (Re), Kobalt (Co), Kupfer (Cu), Gold (Au), Silber (Ag), Blei (Pb), Wismuth (Bi), Indium (In), Gallium (Ga), Yttrium (Y), Terbium (Tb), Gadolinium (Gd) und Scandium (Sc) ein. Im Allgemeinen ist das Metall vorzugsweise ein Radionuklid. Besondere Radionuklide schließen ^99mTc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ⁵⁸Co, ⁶⁰Co, ⁶⁷Cu, ¹⁹⁵Au, ¹⁹⁹Au, ¹¹⁰Ag, ²⁰³Pb, ²⁰⁶Bi, ²⁰⁷Bi, ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y, ¹⁶⁰Tb, ¹⁵³Gd und ⁴⁷Sc ein.
Das Chelatmetall kann beispielsweise eines der oben genannten Typen von Metallen sein, die mit irgendeinem geeigneten Polydentatchelatmittel, beispielsweise acyclischen oder cyclischen Polyamiden, Polyethern (z.B. Kronenether und Derivate davon); Polyamiden; Porphyrinen und carbocyclischen Derivaten, chelatiert sind.
Im Allgemeinen wird der Typ des Chelatmittels von dem verwendeten Metall abhängen. Eine besonders nützliche Gruppe von Chelatmitteln in erfindungsgemäßen Konjugaten sind jedoch acyclische und cyclische Polyamide, insbesondere Polyaminocarbonsäuren, beispielsweise Diethylentriaminpentaessigsäure und Derivate davon, und makrocyclische Amine, z.B. cyclische Triaza- und Tetraazaderivate (beispielsweise wie in der internationalen Patentbeschreibung Nr. WO 92/22583 beschrieben); und Polyamide, insbesondere Desferrioxiamine und Derivate davon.
Das erfindungsgemäße Antikörperfragment kann durch Reagieren eines Antikörperfragments enthaltend einen reaktiven Cysteinrest in der schweren Kette, der außerhalb der V_H Domäne angeordnet ist, mit einem Thiol selektiven Vernetzungsreagens, das ein Polymer, wie oben definiert, enthält, hergestellt werden. Die Reaktion kann im Allgemeinen in einem Lösungsmittel, beispielsweise einer wässrigen Pufferlösung, wie einem Acetat- oder Phosphatpuffer, bei ungefähr neutralem pH, beispielsweise ungefähr pH 4,5 bis ungefähr pH 8,0, bei beispielsweise Umgebungstemperatur, durchgeführt werden. Der Antikörper wird im Allgemeinen in überschüssiger Konzentration bezüglich der Konzentration des Vernetzungsreagens eingesetzt werden. In einigen Fällen kann es notwendig sein, das Antikörperausgangsmaterial mit einem Reagens wie β-Mercaptoethylamin (beispielsweise wie in Beispiel 1 im Folgenden beschrieben) zu reduzieren, um einen geeigneten reaktiven Cysteinrest zu bilden. Wo es notwendig ist, kann das gewünschte Produkt von irgendwelchen nicht reagierten Ausgangsmaterialien oder irgendeinem anderen nicht gewünschten Produkt, das während das Herstellungsverfahrens gebildet wird, durch herkömmliche Mittel, beispielsweise durch Chromatographie, getrennt werden.
Das Antikörperfragment-Ausgangsmaterial kann von irgendeinem Gesamtantikörper, insbesondere einem gesamten monoklonalen Antikörper [hergestellt durch herkömmliche Immunisierung und Zellfusionsverfahren], unter Verwendung irgendwelcher geeigneter Standard enzymatischer Spaltungs- und/oder Verdauungstechniken, beispielsweise durch Behandlung mit Pepsin, erhalten werden. Alternativ dazu kann das Antikörperausgangsmaterial durch die Verwendung von rekombinanten DNA Techniken, einschließlich der Manipulation und Reexpression von DNA, die Antikörper variable und/oder konstante Regionen kodiert, hergestellt werden. Solche DNA ist bekannt und/oder ist einfach erhältlich von DNA Bibliotheken, einschließlich beispielsweise Phagen-Antikörper Bibliotheken [siehe Chiswell, D J und McCafferty, J. Tibtech. 10 80–84 (1992)], oder sie kann, wo gewünscht, synthetisiert werden. Standard Molekularbiologie- und/oder Chemieverfahren können verwendet werden, um die DNA zu sequenzieren und zu manipulieren, beispielsweise um Codons einzuführen, die Cysteinreste bilden, um andere Aminosäuren oder Domänen, wie gewünscht zu modifizieren, hinzuzufügen oder zu deletieren.
Ausgehend davon kann/können einer oder mehrere replikative Expressionsvektoren, der/die die DNA enthält/enthalten, hergestellt und verwendet werden, um eine geeignete Zelllinie, z.B. eine nicht produktive Myeloma Zelllinie, wie eine Maus NSO Linie oder eine bakterielle, z.B. E. coli Linie, in der die Herstellung des Antikörperfragments stattfinden wird, zu transformieren. Um effiziente Transkription und Translation zu erhalten, sollte die DNA Sequenz in jedem Vektor geeignete regulatorische Sequenzen, insbesondere einen Promotor und eine Leadersequenz, die operativ mit der Sequenz der variablen Domäne verknüpft ist, einschließen. Besondere Verfahren zur Herstellung von Antikörperfragmenten auf diese Weise sind im Allgemeinen bekannt und werden routinemäßig verwendet. Beispielsweise sind grundlegende molekularbiologische Verfahren beschrieben in Maniatis et al. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989]; DNA Sequenzierung kann durchgeführt werden wie beschrieben in Sangen et al. [PNAS 74, 5463, (1977)] und dem Amersham International plc Sequenzierhandbuch; und seitengerichtete Mutagenese kann durchgeführt werden gemäß dem Verfahren von Kramer et al. [Nucl. Acids Res. 12, 9441, (1984)] und dem Anglian Biotechnology Ltd. Handbuch. Darüber hinaus gibt es zahlreiche Veröffentlichungen, einschließlich Patentbeschreibungen, die Techniken ausführen, die für die Herstellung von Antikörpern durch Manipulation von DNA, Herstellung von Expressionsvektoren und Transformation von geeigneten Zellen geeignet sind, beispielsweise wie in einem Übersichtsartikel von Moutan A und Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews [Hrsg. Tombs, M P, 10, Kapitel 1, 1992, Intercept, Andover, UK] und in der internationalen Patentbeschreibung Nr. WO 91/09967 dargestellt.
Das Thiol selektive Vernetzungsreagens zur Verwendung in der Herstellung von erfindungsgemäßen Antikörperfragmenten kann durch Reaktion irgendeines Thiol reaktiven Vernetzungsmittels (das beispielsweise Thiol reaktive Gruppen, wie eine α-Halocarbonsäure oder -ester, z.B. Iodacetamid, ein Imid, z.B. Maleimid, ein Vinylsulfon oder ein Disulfid enthält) mit einem in geeigneter Weise funktionalisierten Polymer, erhalten werden. Geeignete Polymerausgangsmaterialien sind kommerziell erhältlich (beispielsweise von Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA), oder sie können aus kommerziell erhältlichen Ausgangsmaterialien unter Verwendung herkömmlicher chemischer Verfahren erhalten werden, die beispielsweise beschrieben sind in Zalipsky, S & Lee, C, ibid. Die Reaktion kann im Allgemeinen eine herkömmliche Kopplungsreaktion zwischen dem funktionalisierten Polymer, beispielsweise einem aktiven Ester des Polymers, und einer geeigneten funktionalen Gruppe, beispielsweise einem Amin, das in dem Vernetzungsreagens anwesend ist, sein. Es können Standardreaktionsbedingungen verwendet werden, wie beispielsweise im Folgenden in dem experimentellen Abschnitt zur Kopplung eines aktiven Esters mit einem Amin beschrieben ist. Geeignete Vernetzungsreagenzien sind einfach von kommerziell verfügbaren Quellen erhältlich oder können einfach unter Verwendung herkömmlicher Verfahren von kommerziell erhältlichen Materialien synthetisiert werden, beispielsweise wie beschrieben in der europäischen Patentbeschreibung Nr. 384624 und der internationalen Patentbeschreibung Nr. WO 92/22583 und dem experimentellen Abschnitt im Folgenden.
Wo es wünschenswert ist, ein erfindungsgemäßes Antikörperfragment zu erhalten, das mit einem Effektor- oder Reportermolekül verbunden ist, kann dies durch Standard chemische oder rekombinante DNA Verfahren hergestellt werden, in denen das Antikörperfragment entweder direkt oder über ein Kopplungsreagens mit dem Effektor- oder Reportermolekül entweder vor oder nach Reaktion mit dem aktivierten Polymer, je nachdem, verbunden wird. Besondere chemische Verfahren schließen beispielsweise jene ein, die in den internationalen Patentbeschreibungen Nr. WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 und WO 89/01476 beschrieben sind. Alternativ dazu, wo das Effektor- oder Reportermolekül ein Protein oder Polypeptid ist, kann die Verbindung unter Verwendung rekombinanter DNA Verfahren erreicht werden, beispielsweise wie in der internationalen Patentbeschreibung Nr. WO 86/01533 und der europäischen Patentbeschreibung Nr. 392745 beschrieben.
Das erfindungsgemäße Antikörperfragment kann nützlich sein im Nachweis oder der Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen oder Störungen. Solche Erkrankungen oder Störungen können solche einschließen, die unter der allgemeinen Überschrift von infektiösen Erkrankungen beschrieben sind, z.B. viraler Infektion; Entzündungserkrankung/Autoimmunität, z.B. rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, entzündliche Bowel Erkrankung; Krebs; allergische/atopische Erkrankung, z.B. Asthma, Ekzeme; kongenitale Erkrankung, z.B. cystische Fibrose, Sichelzellanämie; dermatologische Erkrankung, z.B. Psoriasis; neurologische Erkrankung, z.B. Multiple Sklerose; Transplantate, z.B. Organtransplantatabstoßung, Graft versus Host Erkrankung; und metabolische/idiopathische Erkrankung, z.B. Diabetes.
Die erfindungsgemäßen Antikörperfragmente können zur Verwendung in der Therapie und/oder Diagnose formuliert werden, und gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung stellen wir eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein modifiziertes divalentes Antikörperfragment aufweist, das ein divalentes Antikörperfragment und mindestens ein Polymermolekül in kovalenter Verknüpfung aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass jede kovalente Verknüpfung durch ein Schwefelatom eines Cysteinrestes stattfindet, der in dem Antikörperfragment außerhalb der Domäne mit variablem Bereich des Fragments angeordnet ist, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern, Verdünnungsmitteln oder Trägern.
Wie oben erklärt, kann das Antikörperfragment in diesem Aspekt der Erfindung gegebenenfalls mit einem oder mehreren Effektor- oder Reportergruppen verknüpft sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann jede geeignete Form zur Verabreichung annehmen, und vorzugsweise ist sie in einer Form, die für die parenterale Verabreichung, z.B. durch Injektion oder Infusion, beispielsweise durch Bolus Injektion oder kontinuierliche Infusion, geeignet ist. Wo die Zusammensetzung für die Injektion oder Infusion vorliegt, kann sie die Form einer Suspension, Lösung oder Emulsion in einem öligen oder wässrigen Vehikel annehmen, und sie kann Formulierungsmittel, wie suspendierende, konservierende, stabilisierende und/oder dispergierende Mittel enthalten.
Alternativ dazu kann die Antikörperzusammensetzung in trockener Form zur Rekonstitution vor der Verwendung mit einer geeigneten sterilen Flüssigkeit vorliegen.
Wenn die Antikörperzusammensetzung für die orale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung zusätzlich zu dem aktiven Bestandteil Zusatzstoffe enthalten wie: Stärke, z.B. Kartoffel-, Mais- oder Weizenstärke oder Cellulose oder Stärkederivate, wie mikrokristalline Cellulose; Silica; verschiedene Zucker, wie Lactose; Magnesiumcarbonat und/oder Calciumphosphat. Es ist wünschenswert dass, falls die Formulierung für die orale Verabreichung bestimmt ist, sie durch das Verdauungssystem des Patienten gut toleriert wird. Hierzu kann es wünschenswert sein, in die Formulierung Schleimbildner und Harze einzuschließen. Es kann außerdem wünschenswert sein, die Toleranz durch Formulieren des Antikörpers in einer Kapsel, die unlöslich in den Verdauungssäften ist, zu verbessern. Es kann außerdem bevorzugt sein, den Antikörper oder die Zusammensetzung in eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung einzuschließen.
Wenn die Antikörperzusammensetzung für die rektale Verabreichung geeignet ist, kann die Formulierung ein Binde- und/oder Gleitmittel enthalten; beispielsweise polymere Glykole, Gelatine, Kakaobutter oder andere pflanzliche Wachse oder Fette.
Die therapeutischen und diagnostischen Verwendungen der erfindungsgemäßen Fragmente umfassen typischerweise Verabreichen einer wirksamen Menge des Antikörperfragments an ein menschliches Subjekt. Die exakte, zu verabreichende Menge wird abhängig von der Verwendung des Antikörpers und des Alters, Geschlechts und Zustands des Patienten variieren, aber kann typischerweise von ungefähr 0,1 mg bis 1000 mg, beispielsweise von ungefähr 1 mg bis 500 mg variiert werden. Der Antikörper kann als eine einzelne Dosis oder in einer kontinuierlichen Weise über einen Zeitraum verabreicht werden. Die Dosierungen können je nachdem wiederholt werden. Typische Dosierungen können beispielsweise zwischen 0,1–50 mg/kg Körpergewicht pro einzelner therapeutischer Dosis, insbesondere zwischen 0,1–20 mg/kg Körpergewicht für eine einzelne therapeutische Dosis reichen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 SDS-PAGE Analyse unter nicht reduzierenden (Spuren 1–5) und reduzierenden (Spuren 6–9) Bedingungen.
2 Pharmakokinetik von ¹²⁵I-markiertem anti-PDGFβR DFM-PEG (40 kDa, ortsspezifisch) verglichen mit DFM und IgG in Ratten.
3 Inhibierung von SK-5 Proliferationsantwort gegenüber 10 ng/ml PDGF BB durch anti-PDGFβR DFM-PEG (40 kDa zufällig), DFM-PEG (40 kDa ortsspezifisch), DFM-PEG (10 kDa SS Linker, ortsspezifisch), DFM und IgG.
4 Inhibierung von SK-5 Proliferationsantwort gegenüber 10 ng/ml oder 20 ng/ml PDGF BB durch 1 Mikrogramm/ml anti-PDGFβR DFM-PEG (40 kDa zufällig), DFM-PEG (40 kDa ortsspezifisch), DFM-PEG (10 kDa SS Linker, ortsspezifisch), DFM und IgG.
5 Pharmakokinetik von ¹²⁵I-markiertem anti-PDGFβR DFM-PEG (10 kDa, SS Linker) und DFM-PEG (20 kDa, SS Linker) verglichen mit DFM in Ratten.
6 SDS-PAGE Analyse unter nicht reduzierenden (Spuren 1–7) und reduzierenden (Spuren 8–13) Bedingungen.
7 Pharmakokinetik von ¹²⁵I-markiertem anti-PDGFβR DFM-PEG (ortsspezifisch) von verschiedenen Typen verglichen mit unmodifiziertem DFM in Ratten.
8 SDS-PAGE Analyse unter nicht reduzierenden (Spuren 2–3) und reduzierenden (Spuren 4–5) Bedingungen.
9 Pharmakokinetik von ¹²⁵I-markiertem hTNF40 DFM-PEG (40 kDa, ortsspezifisch) verglichen mit DFM und IgG in Ratten.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung.
Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:

PEG: – CH₃O(CH₂CH₂O)_n(CH₂)₂NHCO(CH₂)₂-
DFM-PEG: – ein erfindungsgemäßes Antikörperfragment, in dem zwei Fab' Fragmente mit einer PEGylierten Dimaleimidbrücke vernetzt sind.
DTDP: – 4,4'-Dithiodipyridin
AUC: – Bereich unter der Kurve
RT: – Raumtemperatur
TFA: – Trifluoressigsäure
BOC: – tert-Butoxycarbonyl
CBZ: – Carbobenzyloxy
DMF: – N,N-Dimethylformamid
EDC: – 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid
BMH: – Bismaleimidhexan
PBS: – Phosphat gepufferte Salzlösung

HERSTELLUNG VON ZWISCHENBRÜCKENGRUPPEN
ZWISCHENPRODUKT 1
N(α)N(ε)Di-CBZ-(L)-Lysin (18,0 g, 43,3 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (80 ml) gelöst. N-BOC-1,6-Diaminohexanhydrochlorid (11,06 g, 43,75 mmol), Hydroxybenzotriazolhydrat (6,43 g, 47,63 mmol), 4-Methylmorpholin (5,2 ml, 47,63 mmol) und EDC (9,13 g, 47,63 mmol) wurden hinzugefügt, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 5 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde in Wasser gegossen und mit Ethylacetat (4 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit 10 % Zitronensäure (2 × 50 ml), gesättigter NaHCO₃ (2 × 50 ml), Salzlösung (1 × 50 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Entfernen des Lösungsmittels in vacuo ergab das Zwischenprodukt 1 (26,15 g, 100 %) als einen weißen Feststoff. ¹H NMR ((CD₃)₂SO) δ 7,79 (1H, t), 7-38–7,19 (11H, m), 6,72 (1H, t), 5,00–4,99 (4H, m), 3,95–3,90 (1H, m), 3,08-2,87 (6H, m) und 1,60–1,05 (23H, m einschließlich 9H, s).
ZWISCHENPRODUKT 2
Zwischenprodukt 1 (26,15 g, 42,7 mmol) wurde (unter Erwärmen) in Ethanol (700 ml) gelöst und mit 10 % Pd/C (4,2 g) behandelt. Die Reaktion wurde unter H₂ Gas in einem warmen Wasserbad (~ 30°) für 4 h gerührt und anschließend abgekühlt. CH₂Cl₂ (20 ml) wurde hinzugefügt, und die Mischung wurde filtriert und gut mit CH₂Cl₂ und Ethanol gewaschen. Das Entfernen des Lösungsmittels in vacuo ergab das Zwischenprodukt 2 als einen öligen Schaum (13,8 g, 94 %). ¹H NMR ((CH₃)₂SO) δ 7,78 (1H, t), 3,06–2,91 (3H, m), 2,89–2,84 (4H, m), 2,52–2,43 (4H, bs) und 1,57–1,15 (23H, m einschließlich 9H, s).
ZWISCHENPRODUKT 3
Zwischenprodukt 2 (1,47 g, 4,47 mmol) wurde in wasserfreiem DMF (25 ml) gelöst, und N-Succinimidyl-3-maleimidopropionat (22,38 g, 8,97 mmol) wurde hinzu gefügt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 3 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt, und CH₂Cl₂ (50 ml) wurde gefolgt von gesättigter NaHCO₃ (50 ml) hinzugefügt. Die Schichten wurden getrennt, und die wässrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ (2 × 50 ml) gewaschen. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit gesättigter NaHCO₃ (2 × 50 ml) gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt, der Rückstand wurde mit Diethylether behandelt und der resultierende Feststoff gefiltert, gut mit Diethylether gewaschen und getrocknet, um das Zwischenprodukt 3 (2,05 g, 75 %) als einen weißen Feststoff zu ergeben. ¹H NMR ((CD₃)₂SO) δ 8,05 (1H, d), 7,75 (1H, t), 6,98 (4H, s), 6,72 (1H, b t), 4,21–4,07 (1H, m), 3,62 (4H, t), 3,12–2,81 (8H, m), 2,41 (2H, t) und 1,55–1,05 (23H, m einschließlich 9H, s). Mass.-Spek. ES+ve 669 (MNa⁺, 100 %), 6,47 (MH⁺, 20 %), 547 (MH⁺, -C₅H₈O₂, 15 %).
ZWISCHENPRODUKT 4
Zwischenprodukt 3 (0,3 g, 0,46 mmol) wurde in einer 1:1 Mischung aus CH₂Cl₂/TFA (10 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 345 min. gerührt. Das Lösungsmittel wurde in vacuo entfernt und der Rückstand mit Toluol (3 × 5 ml) azeotropisch gemacht. Ethylacetat wurde hinzugefügt, um einen Feststoff zu ergeben, der gefiltert, gut mit Ethylacetat, anschließend Diethylether gewaschen und anschließend in vacuo getrocknet wurde, um das Zwischenprodukt 4 als einen weißen Feststoff zu ergeben (0,21 g, 68 %).¹H NMR ((CD₃)₂SO) δ 8,03 (1H, d0), 7,90 (1H, t), 7,80 (1H, t), 7,69 (2H, b s), 6,99 (4H, s), 4,09 (1H, m), 3,58 (4H, t), 3,33 (HOD), 3,10–2,93 (4H, m), 2,76 (2H, b m), 2,41–2,27 (4H, m) und 1,51–1,00 (14N, m).
BEISPIEL 1
Herstellung von PEGylierter (40 kDa) Brückengruppe
Zu Zwischenprodukt 4 in DMF wurde ein molares Äquivalent von N-Methylmorpholin und ein fünffach molarer Überschuss von Amin-reaktivem PEG (40 kDa PEG-NHS Ester; Shearwater Polymers Inc. Huntsville, AL, USA) hinzugefügt. Die Mischung wurde bei RT für 2 Stunden mit gelegentlicher Bewegung inkubiert. Unreagiertes PEG wurde mit einem 100-fach molaren Überschuss von Glycin über PEG gequenscht, das von einer Stocklösung von 1 M Glycin in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0 enthaltend 2 mM EDTA hinzugefügt wurde, und die Mischung wurde für ein Minimum von weiteren 10 Minuten inkubiert, um die gewünschte PEGylierte Brückengruppe zu erhalten.
Herstellung von Fab'
Fab' von dem veränderten humanen Antikörper g162, der den humanen PDGF β Rezeptor (im Folgenden PDGFβR) erkennt, wurde in E. coli wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB97/03400 beschrieben, exprimiert. Das Fab' Fragment besitzt einen einzelnen Cysteinrest, der in seiner Gelenkregion vorliegt, und zur Kreuzvernetzung zur Verfügung steht. Die Zellen wurden aus der Fermentationskultur durch Zentrifugation geerntet, und Fab' wurde durch Resuspendieren der Zellen in 100 mM Tris pH 7,4 enthaltend 10 mM EDTA und Inkubieren bei 60°C über Nacht extrahiert. Fab' wurde anschließend durch erweiterte Bettchromatographie unter Verwendung einer Säule von Streamline ATM (Pharmacia), die mit 1 M Glycin/Glycinat pH 8,0 prääquilibriert worden war, gereinigt. Die Probe wurde 1 M bezüglich Glycin hergestellt, und der pH wurde bei 7,5 mit 50 % (w/v) Natriumglycinat vor dem Auftragen auf die Säule im erweiterten Bettmodus eingestellt. Nach dem Waschen mit Äquilibrierungspuffer wurde das Säulenmaterial in ein gepacktes Bett gegeben, und Fab' wurde mit 0,1 M Citrat pH 3,0 eluiert.
Eine weitere Reinigung wurde durch Einstellen des pH des Eluats auf 7,5 mit 2 M Tris und Auftragen auf eine Säule aus Protein G Sepharose, die mit Phosphat gepufferter Salzlösung pH 7,4 prääquilibriert worden war, erreicht. Nach Waschen mit Äquilibrierungspuffer wurde Fab' mit 0,1 M Glycin-HCl pH 2,7 eluiert. Der pH des eluierten Fab' wurde anschließend auf 6,0 mit 2 M Tris eingestellt.
Herstellung von anti-PDGFβR DFM-PEG (ortsspezifisch)
Gereinigtes anti-PDGFβR Fab' wurde in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0 enthaltend 2 mM EDTA, diafiltriert. Das Gelenkthiol wurde durch Reduktion mit β-Mercaptoethylamin aktiviert. Das Fab' wurde mit 5 mM β-Mercaptoethylamin in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0 enthaltend 2 mM EDTA für 30 Minuten bei 37° inkubiert. Die Probe wurde anschließend in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0 enthaltend 2 mM EDTA unter Verwendung von Sephadex G-25 (PD10) Säulen entsalzt. Die Anzahl der Thiolgruppen pro Fab' Molekül wurde durch Titration mit DTDP, wie zuvor beschrieben [Lyons et al. (1990), ibid], gemessen. Das Fab' wurde mit dem PEGylierten Vernetzen, der aus Zwischenprodukt 4 mit einem Fab':Linker molaren Verhältnis von 2,2:1 bei 37°C hergestellt worden war, vernetzt. Der Vernetzer wurde in 5 Aliquots in 5-minütigen Intervallen hinzufügt, und die Probe wurde für > 1 h inkubiert.
Das gewünschte DFM-PEG wurde durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-400 HR (um unreagiertes Fab' zu entfernen) in 50 mM Acetatpuffer pH 4,5, gefolgt von Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Mono S, um DFM-PEG von DMF und Fab'-PEG zu trennen, gereinigt. Die Mono S Chromatographie wurde unter Verwendung einer Säule durchgeführt, die mit 50 mM Acetat pH 4,5 äquilibriert wurde, nachdem die Probe aufgetragen wurde und mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, gebundenes Material wurde unter Verwendung eines linearen Natriumchloridgradienten eluiert. Das gereinigte Material wurde auf SDS-PAGE untersucht, und es zeigte sich, dass es eine langsamere Mobilität als unmodifiziertes DFM oder Fab' aufwies, was die erfolgreiche Konjugation von PEG (1) zeigt.
Herstellung von zufällig PEGyliertem anti-PDGFβR DFM-PEG
Für vergleichende Zwecke wurde anti-PDGFβR DFM hergestellt und mit PEG zufällig derivatisiert. Anti-PDGFβR Fab' wurde wie oben beschrieben reduziert. Das Fab' wurde mit BMH, gelöst in DMF, mit einem Fab':BMH molaren Verhältnis von 2,2:1 bei 37°C vernetzt. Der Vernetzer wurde in 5 Aliquots in 5-minütigen Intervallen hinzugefügt, und die Probe wurde für > 1 h inkubiert. Das resultierende DFM (diFab' vernetzt mit BMH) wurde aus unreagiertem Fab' durch hydrophobische Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung von Phenyl Sepharose HP gereinigt.
Das gereinigte DFM wurde in 0,1 M Phosphat pH 8,0 enthaltend 2 mM EDTA Puffer ausgetauscht. Thiole wurden zufällig an Lysinreste durch Reaktion mit einem 4-fachen molaren Überschuss an 2-Iminothiolan (Traut's Reagens) für 1 h bei RT eingeführt. Nach dem Entsalzen in 0,1 M Phosphat pH 6,0 enthaltend 2 mM EDTA unter Verwendung einer PD10 Säule wurde die Zahl der eingeführten Thiolgruppen unter Verwendung von Titration mit DTDP bestimmt. Das thiolierte DFM wurde anschließend mit einem 3,5-fachen molaren Überschuss an PEG-Maleimid (Sheannrater Polymers Inc., ibid) über Thiolen für drei Stunden reagiert. Ein Durchschnitt von 1,3 PEG Molekülen wurde pro DFM angeheftet, wie durch Gelfiltrations HPLC Analyse quantifiziert wurde. Das PEG-DFM wurde durch Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Mono S gereinigt. Die Mono S Chromatographie wurde unter Verwendung einer Säule durchgeführt, die mit 50 mM Acetat pH 4,5, äquilibriert worden war, gebundenes Material wurde nach Auftragen der Probe und Waschen mit Äquilibrierungspuffer unter Verwendung eines linearen Natriumchloridgradienten eluiert.
Antigenbindungsanalyse durch BIAcore
Es wurde eine kinetische Analyse durchgeführt, um die "an" und "aus" Geschwindigkeiten für anti-PDGFβR DFM-PEG Bindung an PDGFβR, unter Verwendung eines BIACORE 2000 (Biacore AB), zu bestimmen. Der Assay schließt Einfangen eines mlgG Fc-PDGFβR Fusionsmoleküls durch ein anti-Maus IgG, das auf einer Sensorchipoberfläche immobilisiert ist, gefolgt von einer Injektion eines anti-PDGFβR DFM-PEG ein. Affinitätsreines F(ab')2 Fragment aus Ziege anti-Maus Ig, Fc Fragment spezifisch (Jackson ImmunoResearch) wurde auf einem Sensorchip CM5 über Aminkopplungschemie in einer Menge von 11.500 RU immobilisiert. Eine saubere Oberfläche wurde nach dem Immobilisierungsverfahren, aber ohne Injektion des Fängermoleküls hergestellt. HBS Puffer (10 mM HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % Surfactant P20, Biacore AB) wurde als Laufpuffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min verwendet. Eine Injektion von mlgG Fc-PDGFβR aus COS Zell Überstand wurde durch das immobilisierte anti-Maus IgG in einer Menge zwischen 200–250 RU gefangen. Anti-PDGFβR DFM-PEG Moleküle wurden über der gefangenen mlgG Fc-PDGFβR Oberfläche von 2 mg/ml bis 0,52 mg/ml titriert. Die Oberflächen wurden durch Injizieren von 10 ml 30 mM Salzsäure regeneriert. Die Injektionen von mlgG Fc-PDGFβR und jeder Konzentration von anti-PDGFβR DFM-PEG wurde. über den gereinigten Oberflächen als Kontrollen wiederholt. Das Sensorgramm für jede anti-PDGFβR DFM-PEG Konzentration wurde mit dem korrespondierenden Sensorgramm für die gereinigte Oberfläche nach Deletion der mlgG Fc-PDGFβR Injektion und dem Regenerationsschritt korrigiert. Die kinetischen Parameter wurden unter Verwendung der BIAevaluation 2.1 Software berechnet.
Die Ergebnisse für anti-PDGFβR DFM-PEG, beide hergestellt aus PEGyliertem Zwischenprodukt 4 (ortsspezifisch) und zufällig derivatisiertem anti-PDGFβR DFM-PEG sind in Tabelle 1 gezeigt. Unmodifiziertes DFM, das mit BMH als Vernetzen hergestellt wurde, und IgG wurden verwendet, um die Bindungsparameter zu vergleichen. Die Bindungsaffinität wurde quantifiziert durch den Kd Wert und war je weils gleich zwischen dem IgG und unmodifiziertem DFM bei 1,07 × 10^-10 M und 1,27 × 10^-10 M. Die zufällige Modifizierung mit PEG (1,3 pro di-Fab') führte zu einem substanziellen Verlust der Bindungsaffinität bei 8,97 × 10^-10 M. Die ortsspezifische PEGylierung mit derselben Größe an PEG Molekül führte zu einer stark verbesserten Bindungsaffinität mit einem Kd Wert von 2,10 × 10^-10 M.
Tabelle 1: BIAcore Analyse von DFM-PEG 40 kDa im Vergleich zu IgG und unmodifiziertem DFM
Pharmakokinetik
Für die pharmakokinetische Analyse wurden die Proben mit ¹²⁵I unter Verwendung von Bolton-Hunter Reagens durch Standardverfahren radioaktiv markiert und in Phosphat gepufferter Salzlösung bei pH 6,8 entsalzt, um unreagiertes ¹²⁵I zu entfernen. Gruppen von sechs männlichen Wistar Ratten wurden i.v. in die Schwanzvene mit 20 mg markiertem Material injiziert. An ausgewählten Zeitpunkten wurden Blutproben entnommen, in einem Gammazähler gezählt, und die prozentuale, injizierte Dosis pro Gramm des Blutes berechnet. Die Abbaugeschwindigkeiten und der Bereich unter den Kurvenwerten wurde unter Verwendung des SIPHAR Software Pakets bestimmt.
Die Ergebnisse (2) zeigen langsameren Abbau im Blut für DFM-PEG Konjugat im Vergleich zu unmodifiziertem DFM. Dies wurde auch in der Berechnung der pharmakokinetischen Parameter wiedergespiegelt. Die Pharmakokinetik von IgG und DFM wurden bestmöglich in ein Zwei Kompartiment Modell angepasst, wobei DFM-PEG am besten in ein Einzel Kompartiment Modell eingepasst wurde. Die Ergebnisse zeigten eine signifikant längere Halbwertszeit und einen gesteigerten "Bereich unter der Kurve" für DFM-PEG im Vergleich zu DFM (Tabelle 2).
Tabelle 2 Pharmakokinetische Parameter von anti-PDGFβR IgG, DFM und DFM-PEG (40 kDa), ortsspezifisch
Bioassay
Die Wirksamkeit von anti-PDGFβR DFM und DFM-PEG Proben wurde durch ihre Fähigkeit, den 3H Thymidineinbau durch SK-5 dermale Fibroblasten als Antwort auf PDGF BB zu verhindern, getestet. SK-5 Zellen (gewachsen in DMEM + 10 hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum, 1 % Glutamin, 1 % Natriumpyruvat und 0,025 M HEPES Puffer) wurden bei 80 % Konfluenz trypsiniert und zu 500 Zellen/0,1 ml pro Vertiefung in einer 96 Vertiefungs Gewebekultur Platte in serumfreien Medium (1:1 DMEM:HAM's F12 + 5 μg/ml Insulin, 16 ng/ml Selen, 20 μg/ml Transferrin, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 1 % Glutamin, 0,026 M HEPES Puffer und Pen. Strep.) ausgesät. Die Zellen wurden in einem 37°, 5 % CO₂, 95 % Luftfeuchtigkeit Inkubator für 24 h gegeben, um zu ruhen. Medium alleine, Antikörper alleine, PDGF BB bei 10 ng/ml oder 20 ng/ml Endkonzentration oder PDGF BB zusammen mit verschiedenen Konzentrationen an Antikörper wurden zu den Vertiefungen in einem Endvolumen von 0,2 ml gegeben. Zwischen 5 und 10 Vertiefungen wurden für jede Bedingung verwendet. 6 – 8 h später wurde 3H Thymidin (0,5 mCi pro Vertiefung) hinzugefügt, und die Zellen wurden über Nacht stehen gelassen. Die Platten wurden aus dem Inkubator entfernt und bei –20° für 24 h, um das Ernten zu erleichtern, angeordnet. Die Platten wurden aufgetaut, und DNA wurde auf Filtermatten unter Verwendung eines Skatron Micro96 Harvesters geerntet. Die Matten wurden 67° für 90 min getrocknet, Betaplate Scint (Wallac) wurde hinzugefügt, und die Matten wurden in einem LKB Wallac 1205 BETAPLATER Flüssigszintillationszähler gezählt.
Bei 10 ng/ml PDGF BB und 10 mg/ml anti-PDGFβR DFM oder DFM-PEG ist der Einbau von 3 H Thymidin um 85–92 % durch alle Formen des Antikörpers inhibiert. Wenn die Konzentration des Antikörpers abnimmt, wird der Unterschied zwischen zufälliger PEG Anheftung und ortsspezifischer Anheftung deutlich (3). Dies wird ebenfalls durch das Ansteigen der Konzentration von PDGF BB auf 20 ng/ml (4) gezeigt. Es gibt einen mindestens zweifachen Abfall in der Wirksamkeit zwischen dem zufällig PEG modifizierten 40 kDa DFM und dem ortsspezifischen 40 kDa DFM.
Beispiel 2
Ortsspezifische Anheftung von 10 kDa und 20 kDa PEG Succinimidylsuccinat Derivaten
Zwischenprodukt 4 wurde mit 20 kDa PEG-Succinimidylsuccinat (Polymer Labs) oder 10 kDa PEG-Succinimidylsuccinat (Polymer Labs) derivatisiert und verwendet, um anti-PDGFβR DFM-PEG, wie in Beispiel 1 beschrieben, herzustellen. In diesem Fall wurde die Reinigung der DFM-PEG Konjugate unter Verwendung einer Ionenaustauschchromatographie auf Mono S erreicht. Die Mono S Chromatographie wurde unter Verwendung einer Säule durchgeführt, die mit 50 mM Acetat pH 4,5 äquilibriert wurde, nach dem Auftragen der Probe und Wachen mit Äquilibrierungspuffer wurde gebundenes Material unter Verwendung eines linearen Natriumchlorid Gradienten eluiert. Anschließend an diesen Schritt wurde das DFM-PEG unter Verwendung von Gelfiltration auf Sephacryl S-200 in Phosphat gepufferter Salzlösung, verdünnt 1:1 mit Wasser, weiter gereinigt. Die SDS-PAGE Analyse zeigte, dass eine erfolgreiche Anheftung von PEG stattgefunden hatte (1).
Die Analyse von Antigenbindung wurde durch BIAcore Analyse, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse zeigen, dass diese PEG Derivate mit geringem Verlust in der Antigenbindungsaffinität angeheftet werden können.
Tabelle 3 BIAcore Analyse von DFM-PEG, das mit Succinimidylsuccinat (SS) Verknüpfung hergestellt wurde
Diese DFM-PEG Konjugate wurden anschließend in einer pharmakokinetischen Studie in Ratten unter Verwendung des Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, untersucht. Die Ergebnisse (5) zeigen einen signifikant niedrigeren Abbau im Blut, (längerer in vivo Halbwertszeit) für die DFM-PEG Konjugate im Vergleich zu unmodifiziertem DFM.
BEISPIEL 3
Herstellung von DFM-PEG Konjugaten unter Verwendung von 5 kDa PEG-SCM, 20 kDa PEG-SPA. 10 K PEG2-NHS und 20 K PEG2-NHS Derivaten
Zwischenprodukt 4 wurde mit 20 kDa PEG-Succinimidylpropionat (Shearwater Polymers Inc. ibid) oder 5 kDa PEG-Succinimidylester von Carboxy-methyliertem PEG (Shearwater Polymers Inc.) oder 10 kDa PEG2-Succinimid (2 × 5 kDa, Polymer Labs) oder 20 kDa PEG2-Succinimid (2 × 10 kDa, Polymer Labs) derivatisiert und verwendet, um anti-PDGFβR DFM-PEG Konjugate, wie in den Beispielen 1 & 2 beschrieben, herzustellen. Diese DFM-PEG Derivate wurden unter Verwendung einer Ionenaustauschchromatographie, gefolgt durch Gelfiltration, wie in Beispiel 2 beschrieben, gereinigt. Die SDS-PAGE Analyse zeigte, dass die Konjugation an PEG in allen Fällen erfolgreich war (6). Die BIAcore Analyse wurde ebenfalls durchgeführt, um die Antigenbindungsaffinität zu bestimmen. Die in Tabelle 4 ge zeigten Ergebnisse zeigen, dass diese PEG Derivate mit geringem Verlust in der Antigenbindungsaffinität angeheftet werden können.
Tabelle 4 BIAcore Analyse von DFM-PEG Derivaten
Diese DFM-PEG Konjugate wurden anschließend in einer pharmakokinetischen Studie in Ratten unter Verwendung des Verfahrens, das in Beispiel 1 beschrieben ist, untersucht. Die Ergebnisse (7) zeigen einen signifikant geringeren Abbau im Blut (längere in vivo Halbwertszeit) für die DFM-PEG Konjugate im Vergleich zu unmodifiziertem DFM.
BEISPIEL 4
Herstellung von Fab'
hTNF40 Fab' (erkennt humanes TNFα) wurde in E. coli W3110 Zellen, die in einem 10 Liter Fermenter wuchsen, exprimiert. Das Fab' Fragment besitzt einen einzelnen Cysteinrest, der in seiner Gelenkregion anwesend ist und zur Vernetzung zur Verfügung steht. Ein Zellextrakt wurde wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Der Zellextrakt wurde auf eine Leitfähigkeit von 3,5 mS/cm verdünnt, auf pH 4,5 eingestellt und auf eine Säule aus Streamline^TM SP (Pharmacia), die mit 50 mM Acetatpuffer pH 4,5 äquilibriert wurde, aufgetragen. Nach Waschen mit Äquilibrierungspuffer wurde das Fab' mit 200 mM Natriumchlorid in 50 mM Acetatpuffer pH 4,5 eluiert. Der pH des eluierten Materials wurde auf 7,5 mit 2 M Tris eingestellt und auf eine Säule aus Protein G Sepharose, die mit PBS äquilibriert wurde, aufgetragen. Nach Waschen mit PBS wurde das Fab' mit 0,1 M Glycin-Salzsäure pH 2,7 eluiert, und der pH wurde sofort erneut auf 6 eingestellt. Das gereinigte Fab' wurde anschließend in 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 enthaltend 2 mM EDTA diafiltriert.
Herstellung von hTNF40 DFM-PEG (40 kDa, ortsspezifisch)
Die Gelenkthiolgruppe des Fab' wurde durch Reduzieren mit β-Mercaptoethylamin, wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert. Die Probe wurde anschließend in 0,1 M Phosphat pH 6 enthaltend 2 mM EDTA entsalzt. Die Zahl der Thiolgruppen pro Fab' Molekül wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gemessen. Das Fab' wurde mit dem PEGylierten Vernetzer, der aus Zwischenprodukt 4 (40 kDa PEG bis-Maleimid, Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) bei einem 2,2:1 Fab':Linker Verhältnis bei Umgebungstemperatur hergestellt wurde, vernetzt.
Das gewünschte DFM-PEG wurde durch Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von Sephacryl S-200 HR (um unreagiertes Fab' und DFM zu entfernen) in 50 mM Acetatpuffer pH 4,5, gefolgt von Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von SP Sepharose HP, um DFM-PEG von Fab'-PEG zu trennen, gereinigt. SP Sepharose HP Chromatographie wurde unter Verwendung einer Säule, die mit 50 mM Acetatpuffer pH 4,5 äquilibriert wurde, durchgeführt. Nach Auftragen der Probe und Waschen mit Äquilibrierungspuffer wurde das gebundene Material mit einem linearen Gradienten aus Natriumchlorid eluiert. Das gereinigte Material wurde auf einer SDS-PAGE untersucht, und es wurde gezeigt, dass es eine langsamere Bewegung als unmodifiziertes DFM besitzt, was die erfolgreiche Konjugation von PEG (8) zeigt.
Antigenbindungsanalyse durch BIAcore
Die Antigenbindungsaktivität wurde durch einen BIAcore Assay bestimt, der die Affinität hinsichtlich TNF Bindung misst. Fab', DFM, IgG oder PEG-DFM wurden mit einem immobilisierten anti-Fab' Antikörper gefangen, und humanes TNF lief über die Oberfläche. Die Kinetik der TNF Bindung wurde anschließend analysiert. Die Ergebnisse aus dieser Analyse sind in Tabelle 5 gezeigt. Unmodifiziertes DFM, das mit BMH als Vernetzer hergestellt wurde, und IgG wurden verwendet, um Bindungsparameter zu vergleichen. Die Bindungsaffinität, wie durch die Kd Werte quantifiziert, war gleich zwischen IgG und DFM (jeweils 1,79 × 10^-10 M und 1,07 × 10^-10 M). Ortsspezifische PEGylierung von DFM führte zu einer fast identischen Bindungsaffinität von 1,82 × 10^-10 M, was keinen Verlust an Antigenbindungsfunktion nach PEG Modifikation vorschlägt.
Tabelle 5: BIAcore Analyse von DFM-PEG 40 kDa verglichen mit IgG, Fab' und unmodifiziertem DFM
Pharmakokinetik
Für die pharmakokinetische Analyse wurden diese Proben in Ratten unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens untersucht. Die Abbaugeschwindigkeiten und AUC Werte wurden unter Verwendung entweder der SIPHAR oder der WINNONLIN Software Pakete bestimmt.
Die Ergebnisse (9) zeigten einen signifikant langsameren Abbau im Blut (längere in vivo Halbwertszeit) für das DFM-PEG Konjugat im Vergleich zu unmodifiziertem DFM. Dies wurde ebenfalls in der Berechnung der pharmakokinetischen Parameter wiedergespiegelt, die bei Verwendung eines Zwei Kompartiment Modells passten. Die Ergebnisse zeigten eine signifikant längere Halbwertszeit und gesteigerte Bereiche unter der Kurve für DFM-PEG im Vergleich zu DFM (Tabelle 6).
Tabelle 6 Pharmakokinetische Parameter von hTNF40 IgG, DFM und DFM-PEG (40 kDa), ortsspezifisch

Claims

Divalentes Antikörperfragment, welches zwei schwere Antikörperketten und mindestens ein Polymermolekül in kovalenter Verknüpfung umfaßt, wobei jede schwere Kette mit der anderen durch mindestens eine Nicht-Disulfidbrücke, welche das Schwefelatom eines Cysteinrestes in einer Kette mit dem Schwefelatom eines Cysteinrestes in der anderen Kette verknüpft, kovalent verknüpft ist, wobei die Cysteinreste außerhalb der Domäne mit variablem Bereich jeder Kette lokalisiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Nicht-Disulfidbrücke ein kovalent verknüpftes Polymermolekül enthält, und wobei das Polymer ein gegebenenfalls substituiertes gerad- oder verzweigtkettiges Polyalkylen-, Polyalkenylen- oder Polyoxyalkylenpolymer oder ein verzweigtes oder unverzweigtes Polysaccharid ist.
Antikörperfragment nach Anspruch 1, in welchem jede schwere Kette mit der anderen durch eine einzelne Nicht-Disulfidbrücke kovalent verknüpft ist, wobei die Brücke ein kovalent verknüpftes Polymermolekül enthält.
Antikörperfragment nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei jede schwere Kette mit einer leichten Kette gepaart ist.
Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei jede schwere Kette eine VH-CH1-Kette ist, welche am Ende durch eine Gelenkbereich-Domäne substituiert ist.
Antikörperfragment nach Anspruch 4, wobei jede vorhandene Nicht-Disulfidbrücke das Schwefelatom eines Cysteinrestes, welcher in der Gelenkbereich-Domäne einer schweren Kette lokalisiert ist, mit dem Schwefelatom eines Cysteinrestes in der Gelenkbereich-Domäne der anderen Kette verknüpft.
Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Polymer ein gegebenenfalls substituiertes, gerad- oder verzweigtkettiges Poly(ethylenglykol) oder ein Derivat davon ist.
Antikörperfragment nach Anspruch 6, wobei das Polymer Methoxy(polyethylenglykol) oder ein Derivat davon ist.
Antikörperfragment nach Anspruch 7, wobei das Polymer ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 25.000 Da bis etwa 40.000 Da aufweist.
Antikörperfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede Brücke der Rest eines homo- oder heterobifunktionalen Vernetzungsreagenzes ist.
Antikörperfragment nach Anspruch 9, wobei jede Brücke eine gegebenenfalls substituierte C4-20 Alkylenkette ist, welche gegebenenfalls durch eines oder mehrere Heteroatome oder Heteroatom-enthaltende Gruppen unterbrochen ist.
Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welches an einen oder mehrere Effektoren oder Reportermoleküle kovalent gebunden ist.
Antikörperfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dem es möglich ist, an eine Zelloberfläche oder ein lösliches Antigen selektiv zu binden.
Antikörperfragment nach Anspruch 13, wobei das Antigen menschlicher Tumor-Nekrose-Faktor a oder ein Thrombozytenwachstumsfaktor oder ein Rezeptor davon ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Antikörperfragment nach einem der vorhergehenden Ansprüche zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Arzneimittelträgern, Verdünnungsmitteln oder Trägern umfaßt.