CN114585651A - 新型抗原结合分子形式 - Google Patents

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E.派尔斯
M.罗斯科尼
N.刘
S.帕特尔
E.史密斯
A.墨菲
C.林
S.戴维斯
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Abstract

包括非天然构型的Fab结构域的抗原结合分子(ABM)、包括所述ABM和细胞毒性剂或细胞抑制剂的ABM缀合物、含有所述ABM和ABM缀合物的药物组合物、使用所述ABM的方法、用于治疗癌症的ABM缀合物和药物组合物、编码所述ABM的核酸、经工程改造以表达所述ABM的细胞以及产生ABM的方法。

Description

新型抗原结合分子形式
1.相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年8月8日提交的美国临时申请第62/884,496号和于2020年7月10日提交的美国临时申请第63/050,483号的优先权，所述美国临时申请中的每一个的内容均通过引用整体并入本文。
2.序列表
本申请含有序列表，所述序列表已经以ASCII格式电子提交，并且在此通过引用整体并入。创建于2020年8月6日的所述ASCII副本命名为RGN-001WO_SL.txt并且大小为25,358字节。
3.背景技术
大多数天然存在的抗体分子通常包括两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。重链和轻链多肽中的每一个都含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分)，其包括能够与抗原相互作用的结合区。重链和轻链多肽中的每一个都包括恒定区(通常是羧基末端部分)。
由细胞或细胞系的单个克隆产生的重组单克隆抗体在过去的二十年中已成为治疗多种不同疾病的非常成功的一类生物药物。单克隆抗体(mAb)是一类重要的生物治疗产品，并且在治疗许多危及生命的慢性疾病方面取得了显著成功。
当抗体的抗原结合部分(例如Fab结构域)可接近表位时，发生亲和力和/或亲合力的增加。然而，常规抗体形式的几何形状限制了抗体识别单个靶分子上的多个表位的能力，特别是当靶标尺寸较小时，或者当期望的表位(包含多个靶分子上的表位)在物理上相对接近，或期望变得在物理上接近时。因此，通过替代性抗体-抗原结合几何形状来生成可能提高亲和力、亲合力或抗体功能的结合分子的有效平台将是有用的。
4.发明内容
本公开提供了含有至少两个非天然构型的Fab结构域的抗原结合分子(“ABM”)。所述ABM包括至少两个多肽链，每个多肽链包括Fc结构域和所述至少两个Fab结构域的一个组分。本公开的示例性ABM在图1B、2B和3A到3D中示出。
包括Fc结构域和任何相关多肽链的每个多肽链在本文中被称为“半抗体”。本公开的典型ABM包括通过其Fc结构域缔合的两个半抗体。所述缔合的Fc结构域一起形成Fc区。除了所述Fc区之外，本公开的典型ABM在每个半抗体中包括至少一个非天然构型的Fab结构域。呈所述非天然构型的至少一个Fab结构域或两个这样的Fab结构域与靶分子结合。“天然构型”或“天然免疫球蛋白构型”是指天然存在的IgG抗体中抗体结构域的构型。在所附的示意图中，VH结构域用数字(1)标记，CH1结构域用数字(2)标记，铰链结构域用数字(3)标记，CH2结构域用数字(4)标记，CH3结构域用数字(5)标记，VL结构域用数字(6)标记，CL结构域用数字(7)标记，并且非铰链结构域的接头用数字(8)标记。因此，通过参考附图中的标记，天然免疫球蛋白构型主要有以下组成：
·第一(重链)多肽，其在N到C端取向上基本上由以下组成：VH结构域(1)、CH1结构域(2)、铰链区(3)组成，所述铰链区通过二硫键与第二(重链)多肽的铰链区连接；CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；
·第二(重链)多肽，其在N到C端取向上基本上由以下组成：VH结构域(1)、CH1结构域(2)、铰链区(3)组成，所述铰链区通过二硫键与第一(重链)多肽的铰链区连接；CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；
·第三(轻链)多肽，其在N到C端取向上基本上由以下组成：VL结构域(6)和CL结构域(7)，二者与第一(重链)多肽缔合；以及
·第四(轻链)多肽，其在N到C端取向上基本上由以下组成：VL结构域(6)和CL结构域(7)，二者与第二(重链)多肽缔合。
提及“天然构型”或“天然免疫球蛋白构型”并不旨在将该术语限制为野生型抗体序列或仅单特异性抗体。相反，如图1A和图2A所示，该形式可以适用于单特异性抗体(图1A)或具有变体序列的传统双特异性抗体(图2B)。图1A的单特异性抗体形式和图2A的双特异性抗体形式之间的根本区别不是它们的构型，而是Fc异二聚体的使用(例如，如第6.2.7.2节所述)，其中每个Fc区连接到不同的VH结构域，从而允许结合至不同的表位。为清楚起见，如本文所使用的，术语“双特异性”是指结合任何两个不同的表位，无论是在相同抗原或靶分子上还是在不同抗原或靶分子上。
本公开的ABM特别可用于结合小的可溶性靶分子，例如细胞因子或趋化因子，并在拮抗靶分子的活性中找到应用，例如通过阻断靶分子与结合配偶体(如受体)的结合。不受理论束缚，据信本公开的结合形式允许以比包括相同的至少两个Fab结构域的天然免疫球蛋白的亲和力和/或亲合力更大的亲和力和/或亲合力结合靶分子。
Figure BDA0003577521890000031
下面更详细地描述这些ABM形式。
在第一方面，本公开的ABM包括：
·第一半抗体，所述第一半抗体在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域；
-第一Fc结构域；以及
-第一Fab(Fab1)结构域，所述第一Fab结构域包括与第一轻链可变区(VL)缔合的第一重链可变区(VH)；以及
·第二半抗体，所述第二半抗体在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域；
-第二Fc结构域；以及
-第二Fab(“Fab2”)结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH，
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区，并且其中所述任选的铰链结构域，如果存在的话，可以通过二硫键彼此缔合。
图1B和图2B中展示了这种类型的ABM的两个实施例，在本文中通常被称为ABM形式“A”(“A型”)并且有时在本文中被称为“Fc-Fab”形式，以及描绘于图13A、图13B和图13C中的其变体。因此，本公开提供了描绘于图1B和图2B中的A型ABM，其包括：
·第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域(3)，所述任选的铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；
-Fc结构域，所述Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；
-任选的铰链结构域(3)，所述任选的铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；
-接头(8)；以及
-Fab1结构域的重链组分，其包括与Fab1结构域的轻链组分缔合的Fab1VH结构域(1)和Fab1 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab1 VL结构域(6)和Fab1 CL结构域(7)；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第一多肽中的铰链结构域连接；
-第二Fc结构域，所述第二Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；
-任选的铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第一多肽中的铰链结构域连接；
-接头(8)；以及
-Fab2结构域的重链组分，其包括与Fab2结构域的轻链组分缔合的Fab2VH结构域(1)和Fab2 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab2 VL结构域(6)和Fab2 CL结构域(7)；
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区。
在图1B的实施例中，两个半抗体是相同的，包含形成Fc同二聚体的Fc结构域，并且所得的ABM是单特异性的。在图2B的实施例中，ABM包括Fc异二聚体，从而允许使用不同的Fab1和Fab2 VH结构域并产生多特异性，例如双特异性，分子。虽然图1B、图2B和13A展示了其中ABM具有由Fc结构域N端的铰链结构域构成的铰链区的实施例，但A型ABM可以没有铰链区(未示出)、具有Fc区C端的铰链区(图13C)或具有Fc区N端和C端的铰链区(图13B)。如图13A-13C中所描绘的，可用于Fc区N端和/或C端的示例性铰链结构域包括氨基酸序列GGGGSCPPC(SEQ ID NO:1)和ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2)，但A型ABM也可以具有替代的铰链区序列。同样，尽管图13A-13C描绘了(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ ID NO:3)，但可以使用其它接头序列。
虽然图1B和图2B展示了仅含有两个结合结构域(Fab1和Fab2)的A型ABM的实施例，但本公开的ABM可以含有额外的结合结构域，例如scFv或Fab结构域。然而，在某些方面，Fab1和Fab2是A型ABM的唯一结合结构域。
在第二方面，本公开的ABM包括：
·第一半抗体，所述第一半抗体在N到C端取向上包括：
-第一Fab(Fab1)结构域，所述第一Fab结构域包括与第一VL缔合的第一VH；
-第一间隔结构域；以及
-第一Fc结构域；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-第二Fab(Fab2)结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH；
-第二间隔结构域；以及
-第二Fc结构域；并且
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区。
不受理论束缚，据信在Fc结构域和Fab结构域之间包含间隔结构域会导致Fc区和Fab的抗原结合位点之间具有更大的灵活性，并因此产生更高的ABM与其抗原或靶分子结合的亲和力和/或亲合力。术语“抗原”和“靶分子”在本文中可互换使用。
在某些实施例中，间隔结构域是延伸接头。图3A中展示了这种ABM形式，在本文中通常被称为形式“B”(“B型”)并且有时在本文中被称为“延伸型”形式。因此，本公开提供了描绘于图3A中的B型ABM的实施例，其包括：
·第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
-Fab1结构域的重链组分，其包括与Fab1结构域的轻链组分缔合的Fab1VH结构域(1)和Fab1 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab1 VL结构域(6)和Fab1 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)，所述接头结构域是延伸接头；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第一Fc结构域，所述第一Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-Fab2结构域的重链组分，其包括与Fab2结构域的轻链组分缔合的Fab2VH结构域(1)和Fab2 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab2 VL结构域(6)和Fab2 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)，所述接头结构域是延伸接头；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第二Fc结构域，所述第二Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)。
虽然图3A中描绘的B型ABM的实施例仅含有两个结合结构域(Fab1和Fab2)，但本公开的B型ABM可以含有额外的结合结构域，例如scFv或Fab结构域。然而，在某些方面，Fab1和Fab2是本公开的B型ABM的唯一结合结构域。
在其它实施例中，间隔结构域是Fab结构域。图3B-3D中展示了这种ABM形式的不同变体，在本文中被称为形式“C”(“C型”)。因此，C型ABM包括第三Fab(Fab3)结构域和第四Fab(Fab4)结构域，其构型如下：
·第一半抗体，所述第一半抗体在N到C端取向上包括
-第一Fab(Fab1)结构域，所述第一Fab结构域包括与第一VL缔合的第一VH；
-第三Fab(Fab3)结构域，所述第三Fab结构域包括与第三VL缔合的第三VH；以及
-第一Fc结构域；以及
·第二半抗体，所述第二半抗体在N到C端取向上包括：
-第二Fab(Fab2)结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH；
-第四Fab(Fab4)结构域，所述第四Fab结构域包括与第四VL缔合的第四VH；以及
-第二Fc结构域。
因此，本公开提供了描绘于图3B-3D中的C型ABM的实施例，其包括：
·第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
-Fab1结构域的重链组分，其包括与Fab1结构域的轻链组分缔合的Fab1VH结构域(1)和Fab1 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab1 VL结构域(6)和Fab1 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)；
-Fab3结构域的重链组分，其包括与Fab3结构域的轻链组分缔合的Fab3VH结构域(1)和Fab3 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab3 VL结构域(6)和Fab3 CL结构域(7)；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第一Fc结构域，所述第一Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-Fab2结构域的重链组分，其包括与Fab2结构域的轻链组分缔合的Fab2VH结构域(1)和Fab2 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab2 VL结构域(6)和Fab2 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)；
-Fab4结构域的重链组分，其包括与Fab4结构域的轻链组分缔合的Fab4VH结构域(1)和Fab4 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab4 VL结构域(6)和Fab4 CL结构域(7)；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第二Fc结构域，所述第二Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区。
虽然图3B-3D中描绘的C型ABM的实施例含有四个结合结构域(Fab1、Fab2、Fab3和Fab4)，但本公开的C型ABM可以含有额外的结合结构域，例如scFv或Fab结构域。然而，在某些方面，Fab1、Fab2、Fab3和Fab4是本公开的C型ABM的唯一结合结构域。
C型ABM的Fab3和Fab4结构域可以是非结合的(如图3B所示)或结合的(如图3C和图3D所示)。其中Fab3和Fab4是非结合的那些实施例在本文中通常被称为C1型ABM，并且此形式有时在本文中被称为“钳型”形式。其中Fab3和Fab4是结合的那些实施例在本文中通常被称为C2型ABM，并且此形式有时在本文中被称为“串联Fab”形式。术语“2+2串联Fab”是指图3C和图3D所示的实施例，其中Fab1、Fab2、Fab3和Fab4是串联Fab中唯一的结合结构域。C1型和C2型ABM中的每一个都可以是同二聚体或异二聚体。
在C1型ABM的某些实施例中，Fab1和Fab2结构域是不相同的(例如，结合不同的表位，无论是在相同的靶分子上还是在不同的靶分子上)，并且Fab3和Fab4结构域是相同的非结合结构域。在其它实施例中，Fab3和Fab4结构域是不同的非结合结构域。
在C2型ABM的某些实施例中，Fab1和Fab3结构域包括相同的VH结构域，并且Fab2和Fab4结构域包括相同的VH结构域，如图3C所示。这种构型被称为构型1，或1-1-2-2构型。在C2型ABM的替代实施例中，Fab1和Fab2结构域包括相同的VH结构域，并且Fab3和Fab4结构域包括相同的VH结构域，如图3D所示。这种构型被称为构型2，或1-2-1-2构型。
完整的ABM是通过以下形成的：两个半抗体通过两个Fc结构域缔合形成Fc区。当两个半抗体不相同时，例如当Fab1和Fab2包含不同的VH结构域时，可以使用Fc异二聚化方法(例如，如第6.2.7.2节中所述)来促进正确的半抗体配对和/或它们的纯化。异二聚化方法的实例是星形突变(如第6.2.7.2节所述)或孔内旋钮突变。
虽然图2B、3A、3B和3C示出了在通过Fc异二聚体配对的每个半抗体中包括不相同VH结构域的ABM，但这种形式也可用于Fc同二聚体。例如，虽然图2B和图3A分别示出了包括Fc异二聚体，从而允许在Fab1和Fab2中并入不同的VH结构域并产生多特异性(例如，双特异性)结合分子的A型ABM和B型ABM，但这种形式也可以用于具有Fc同二聚体和相同VH结构域的单特异性A型和B型ABM。类似地，Fc同二聚体可用于产生具有相同Fab1、Fab2、Fab3和Fab4VH结构域或相同Fab1和Fab2 VH结构域以及非结合Fab3和Fab4VH结构域的单特异性C型ABM。
进一步地，当第一和第二多肽包含不同的VH结构域时，可以使用不同的策略来允许多特异性结合分子中的正确VH-VL配对。例如，可以使用能够与ABM中多于一种类型的VH结构域有效配对的共同轻链。在此类实施例中，轻链多肽(例如，与Fab1和Fab2以及如果存在的话，Fab3和Fab4缔合的轻链)可以是相同的。可替代地，可以使用单结构域Fab，其中重链组分((1)和(2))可以与轻链组分((6)和(7))融合表达。
图1-3中所示的本公开的ABM的变体并非旨在限制；处其它外，本公开的ABM可以包含图1-3和下文第6.2节中展示的修饰的任何组合。此外，提及第一或第二多肽链或左或右半抗体仅是为了方便，并且并不旨在传达多肽链或半抗体以任何特定顺序产生或组装。
在一些实施例中，本公开的ABM的第一Fab(Fab1)结构域和第二Fab(Fab2)结构域可以各自结合相同的靶分子，例如小的可溶性分子。第一Fab(Fab1)结构域和第二Fab(Fab2)结构域可以结合相同的表位(例如，在图1B和图3D中描绘的实施例中，或在图3A或图3B的变体中，其中Fab1和Fab2两者具有相同的VH结构域(未示出))或者它们可以结合不同的表位(例如，在图2B、图3A、图3B和图3C中描绘的实施例中)，无论是在相同的靶分子上或在不同的靶分子上。在第一Fab(Fab1)结构域和第二Fab(Fab2)结构域结合不同表位(例如，同一靶分子上或不同靶分子上的两个不同表位)的情况下，可以选择它们使得Fab能够同时与其表位结合。
在一些实施例中，例如在C型ABM的实施例中，本公开的ABM可以包含第三Fab(Fab3)结构域和第四Fab(Fab4)结构域，如图3B、图3C和图3D所描绘的。第三和第四Fab结构域可以是非结合的，如图3B所描绘，或者它们可以是结合的，如图3C和图3D所描绘。当存在Fab3和Fab4时，它们可以分别结合与Fab1和Fab2结构域所结合的表位相同或不同的表位。例如，Fab1和Fab3可以共享一个表位，并且Fab2和Fab4可以共享一个表位，如图3C的实施例中所示。可替代地，例如，Fab1和Fab2可以共享一个表位，并且Fab3和Fab4可以共享一个表位，如图3D的实施例中所示。如本文所使用的，关于C型ABM，术语“第一和第二Fab结构域”和“Fab1和Fab2结构域”通常是指最N端的Fab结构域，并且提及“第三和第四Fab结构域”和“Fab3和Fab4结构域”通常是指内部Fab结构域。
本公开的示例性抗原结合分子，包含其组分和构型，以及其靶分子，描述于下文第6.2节和第6.3节，以及“A”具体实施例1到138和“B”具体实施例1到72中。
本公开进一步提供了缀合物，例如，药物缀合物，其包括本公开的ABM(为方便起见，药物缀合物在本文中被称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”)。缀合物的示例性特征在下文第6.4节以及“A”具体实施例139和“B”具体实施例73中进行了描述。
本公开进一步提供了编码本公开的ABM的核酸。编码ABM的核酸可以是单个核酸(例如，编码ABM的所有多肽链的载体)或多个核酸(例如，编码ABM的不同多肽链的两个或更多个载体)。本公开进一步提供了经工程改造以表达本公开的核酸和ABM的宿主细胞和细胞系。本公开进一步提供了产生本公开的ABM的方法。示例性核酸、宿主细胞、细胞系和产生ABM的方法描述于下文第6.5节、“A”具体实施例144-145和“B”具体实施例75-81中。
本公开进一步提供了包括本公开的ABM和ADC的药物组合物。示例性药物组合物在下文第6.6节、“A”具体实施例140和“B”具体实施例74中进行了描述。
本文进一步提供了使用本公开的ABM、缀合物和药物组合物的方法，例如，用于治疗与它们所结合的靶分子的异常表达或活性相关的病状。示例性方法在下文第6.7节、“A”具体实施例141-143和“B”具体实施例82-85中进行了描述。
5.附图说明
图1A-1B：本公开的示例性同二聚体(单特异性二价)A型ABM(图1B)和对应的天然抗体形式(图1A)的示意图。图例：(1)＝VH；(2)＝CH1；(3)＝铰链；(4)＝CH2；(5)＝CH3；(6)＝VL；(7)＝CL；(8)＝接头。
图2A-2B：本公开的异二聚体双特异性A型ABM(图2B)和对应的传统双特异性抗体形式(图2A)的示意图。示出了小抗原(Ag)以表明双特异性ABM与小抗原相互作用的潜在方式。图例：(1)＝VH；(2)＝CH1；(3)＝铰链；(4)＝CH2；(5)＝CH3；(6)＝VL；(7)＝CL；(8)＝接头。CH3结构域之一中的星号表明两个CH3不相同并且含有一个或多个允许异二聚化的突变(例如，孔内旋钮突变、星形突变等)。
图3A-3D：本公开的示例性B型ABM(图3A)和本公开的示例性C型ABM(图3B-3D)的示意图。所示的C型ABM的特定实施例是示例性异二聚体C1型ABM(图3B)、示例性异二聚体C2型ABM(图3C)和示例性同二聚体C2型ABM(图3D)。在一些实施例中，这些双特异性ABM使用共同轻链VL-CL。在所有形式的一些实施例中，VH1-CH1/VL-CL和VH2-CH1/VL-CL是来自与抗原的非竞争性mAb的Fab片段。在图3B所示的形式(在本文中有时被称为“钳型”形式)中，内部Fab片段VH3-CH1/VL-CL不与靶分子结合。在图3A所示的形式(在本文中有时被称为“延伸型”形式)中，内部Fab被替换为柔性长接头。图例：(1)＝VH；(2)＝CH1；(3)＝铰链；(4)＝CH2；(5)＝CH3；(6)＝VL；(7)＝CL；(8)＝接头。CH3结构域之一中的星号表明两个CH3不相同并且含有一个或多个允许异二聚化的突变(例如，孔内旋钮突变、星形突变等)。
图4A-4B：图4A和4B是示出TSLP亲本抗体在TSLP阻断生物测定中的活性的图。图4A，使用表达hIL7R和hTSLPR的Baf3细胞的STAT3-萤光素酶报告基因测定中hTSLP的剂量反应曲线。图4B，选定的TSLP Ab在TSLP阻断生物测定中的活性。在存在100pM恒定hTSLP的情况下，将TSLP Ab与Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-荧光素酶报告细胞系一起孵育。在孵育5.5小时后测量萤光素酶活性。
图5：图5是证明抗hTSLP双特异性IgG4 Ab显示出与对应的亲本Ab组合类似的TSLP阻断活性的图。比较了抗hTSLP亲本抗体组合和双特异性IgG4 Ab在hTSLP阻断生物测定中的活性。在存在100pM hTSLP的情况下，将TSLP Ab与Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-荧光素酶报告细胞系一起孵育。在孵育5.5小时后测量萤光素酶活性。
图6A-6C：图6A-6C是比较TSLP阻断生物测定中不同形式的双特异性抗hTSLP Ab的图。测试了几个亲本Ab配对：30206x30217(图6A)、30206x30230(图6B)、30217x30230(图6C)。在存在100pM hTSLP的情况下，将TSLP Ab与Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-荧光素酶报告细胞系一起孵育。在孵育5.5小时后测量萤光素酶活性。图6A-6C中公开的“2xG4S”和“4xG4S”分别是SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19。
图7：图7是示出在存在hTSLP(REGN4009)的情况下，单个亲本mAb的分形图的图。通过耦接到多角度光散射(A4F-MALS)的非对称流场-流分级对抗TSLP mAb:hTSLP复合物(实线)进行分析。还叠加了来自H4H30217P2(灰色虚线)和hTSLP(黑色虚线)的单个样品的分形图。示出了每个样品在215nm处的相对UV吸光度随保留时间的变化，并显示了测量的分辨峰的摩尔质量。
图8：图8是示出在存在hTSLP的情况下，亲本mAb组合的分形图的图。通过耦接到多角度光散射(A4F-MALS)的非对称流场-流分级对抗TSLP mAb组合:hTSLP复合物(实线)进行分析。还叠加了来自H4H30217P2(灰色虚线)和hTSLP(黑色虚线)，以及H4H30217P2:hTSLP复合物(黑色虚线)的单个样品的分形图。示出了每个样品在215nm处的相对UV吸光度随保留时间的变化，并显示了测量的分辨峰的摩尔质量。
图9：图9是示出在存在hTSLP的情况下，Fc-Fab双特异性Ab的分形图的图。通过耦接到多角度光散射(A4F-MALS)的非对称流场-流分级对抗TSLP Fc-Fab:hTSLP复合物(实线)进行分析。还叠加了来自TS-FC1-eL1(黑色虚线)、TS-FC6-eL2(灰色虚线)和hTSLP(黑色虚线)的单个样品的分形图。示出了每个样品在215nm处的相对UV吸光度随保留时间的变化，并显示了测量的分辨峰的摩尔质量。
图10：图10是示出在存在hTSLP的情况下，钳型双特异性Ab的分形图的图。通过耦接到多角度光散射(A4F-MALS)的非对称流场-流分级对抗TSLP钳型:hTSLP复合物(实线)进行分析。还叠加了来自TS-CL4-eL1(黑色虚线)、TS-CL6-eL1(灰色虚线)和hTSLP(黑色虚线)的单个样品的分形图。示出了每个样品在215nm处的相对UV吸光度随保留时间的变化，并显示了测量的分辨峰的摩尔质量。
图11：图11是示出在存在hTSLP的情况下，2+2串联Fab双特异性Ab的分形图的图。通过耦接到多角度光散射(A4F-MALS)的非对称流场-流分级对抗TSLP 2+2串联Fab:hTSLP复合物(实线)进行分析。还叠加了来自TS-CL2-eL2(黑色虚线)、TS-CL3-eL2(灰色虚线)和hTSLP(黑色虚线)的单个样品的分形图。示出了每个样品在215nm处的相对UV吸光度随保留时间的变化，并显示了测量的分辨峰的摩尔质量。
图12：图12是比较具有不同接头长度的抗hTSLP 30217x30230双特异性Fc-Fab在TSLP阻断生物测定中的活性的图。在存在120pM恒定hTSLP的情况下，将TSLP Ab与Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-荧光素酶报告细胞系一起孵育。在孵育5.5小时后测量萤光素酶活性。在不存在TSLP阻断性Ab的情况下，将所有值都相对于STAT3-荧光素酶活性归一化，并表示为STAT3-Luc活性的百分比。图12中公开的G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5和(G4S)6接头分别是SEQ ID NO:3、18、4、19、39和38。
图13A-13D：图13A-13C是不同铰链形式的示意图。图13A：铰链形式1，其示出有铰链序列ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2)和(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ ID NO:3)；图13B：铰链形式2，其示出有铰链序列ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2)和(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ IDNO:3)；图13C：铰链形式3，其示出有铰链序列GGGGSCPPC(SEQ ID NO:1)和(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ ID NO:3)。图13D是示出具有不同铰链形式(具有G4S接头(SEQ ID NO:3)的铰链形式1、具有G4S接头(SEQ ID NO:3)的铰链形式2、具有G4S接头(SEQ ID NO:3)的铰链形式3、具有(G4S)4接头(SEQ ID NO:19)的铰链形式1、具有(G4S)4接头(SEQ ID NO:19)的铰链形式2和具有(G4S)4接头(SEQ ID NO:19)的铰链形式3)的30217x30230 Fc-Fab的活性的图。在存在120pM hTSLP的情况下，将TSLP Ab与Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-荧光素酶报告细胞系一起孵育。在孵育5.5小时后测量萤光素酶活性。在不存在TSLP阻断性Ab的情况下，将所有值都相对于STAT3-荧光素酶活性归一化，并表示为STAT3-Luc活性的百分比。
图14：图14示出了WT小鼠中抗TSLP双特异性Fc-Fab分子REGN8759和REGN8760；hIgG4同种型对照REGN1945；常规hIgG4双特异性同种型对照H4H21237D；和hFcγ同二聚体REGN1627的药代动力学曲线。
图15：图15示出了WT小鼠中抗TSLP Fc-Fab抗体REGN8759和REGN8760；hIgG4同种型对照REGN1945；常规hIgG4双特异性同种型对照H4H21237D；和hFcγ同二聚体REGN1627的摩尔当量药代动力学曲线。
图16A-16C：图16A-16C是比较抗配体X亲本mAb mAbX1、mAbX2和双特异性Fc-FabmAbX1 x mAbX2在配体X信号传导生物测定中的抑制活性的图。在存在10pM(图16A)、100pM(图16B)或1nM(图16C)恒定人配体X的情况下，将抗配体X Ab与用于受体X信号传导的工程化萤光素酶报告细胞系一起孵育。孵育5.5小时后测量荧光素酶活性。
图17A-17C：图17A-17C是比较抗配体X亲本mAb mAbX2、mAbX3和双特异性Fc-FabmAbX2 x mAbX3在配体X信号传导生物测定中的抑制活性的图。在存在10pM(图17A)、100pM(图17B)或1nM(图17C)恒定人配体X的情况下，将抗配体X Ab与用于受体X信号传导的工程化萤光素酶报告细胞系一起孵育。孵育5.5小时后测量荧光素酶活性。
图18A-18C：图18A-18C是比较抗配体X亲本mAb mAbX1、mAbX3和双特异性Fc-FabmAbX1 x mAbX3在配体X信号传导生物测定中的抑制活性的图。在存在10pM(图18A)、100pM(图18B)或1nM(图18C)恒定人配体X的情况下，将抗配体X Ab与用于受体X信号传导的工程化萤光素酶报告细胞系一起孵育。孵育5.5小时后测量荧光素酶活性。
图19A-19E：图19A-19E是示出配体X与抗配体X抗体的复合物的分形图的图。通过耦接到多角度光散射(A4F-MALS)的非对称流场-流分级对与配体X组合的抗配体X抗体进行分析。还叠加了来自抗体和配体X的单个样品的分形图。示出了每个样品在215nm处的相对UV吸光度随保留时间的变化，并显示了测量的分辨峰的摩尔质量。图19A和19B示出了亲本抗体mAbX1、mAbX2和配体X的分形图；图19C示出了mAbX1 x mAbX2 Fc-Fab和配体X的分形图；图19D示出了mAbX1 x mAbX2钳型和配体X的分形图；并且图19E示出了mAbX1 x mAbX2 2+2串联Fab异二聚体和配体X的分形图。
图20A-20D：图20A-20D是示出抗原Y Fc-Fab与抗原Y表达细胞的结合的图，如在基于FACS的测定中所测量的。如图20A所示，抗-抗原Y IgG1 mAb mAbY1被克隆为具有不同长度的G4S接头的IgG1 Fc-Fab(G4S被公开为SEQ ID NO:3)。Fc-Fab和亲本IgG1 mAb显示出与细胞表面抗原Y的类似结合。在图20B、20C、20D中，抗-抗原Y IgG4 mAb mAbY2、mAbY3和mAbY4被克隆为具有不同G4S接头的IgG4 Fc-Fab(G4S被公开为SEQ ID NO:3)。所有Fc-Fab在抗原Y FACS结合测定中均显示出强活性。图20A-20D中公开的“1xG4S”、“2xG4S”、“3xG4S”、“4xG4S”和“5xG4S”分别是SEQ ID NO:3、18、4、19和39。
图21A-21B：图21A-21B是示出在基于FACS的测定中抗CD3和抗-抗原Z Fc-Fab与细胞表面表位的结合的图。抗CD3(图21A)和抗-抗原Z(图21B)Ab被克隆为具有不同长度的G4S接头的IgG1 Fc-Fab(G4S被公开为SEQ ID NO:3)。这些Fc-Fab显示出与细胞表面CD3(图21A)和抗原Z(图21B)的特异性结合。图21A-21B中公开的“1xG4S”、“2xG4S”、“3xG4S”、“4xG4S”和“5xG4S”分别是SEQ ID NO:3、18、4、19和39。
图22A-22B：图22A和22B是显示CD3 x抗原Z双特异性Fc-Fab在生物测定中具有活性的图。图22A，CD3 x抗原Z双特异性Fc-Fab在存在抗原Z+细胞的情况下活化Jurkat/NFAT-萤光素酶报告细胞中的TCR信号传导。图22B，CD3 x抗原Z双特异性Fc-Fab在3小时钙黄绿素释放测定中触发了预活化的人供体T细胞对抗原Z+细胞的杀伤。图22A-22B中公开的“1xG4S”、“2xG4S”和“3xG4S”分别是SEQ ID NO:3、18和4。
6.具体实施方式
6.1.定义
如本文中所使用的，以下术语旨在具有以下含义：
抗体：如本文所使用的，术语“抗体”意指包括与特定抗原特异性地结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包含常规形式的免疫球蛋白分子，其包括四个多肽链、通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)。每个重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。
如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术从完整抗体分子衍生，如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。可以通过化学方法或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操作，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包含：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；以及(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补性决定区(CDR)，如CDR3肽)或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。其它工程化分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR嫁接抗体、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)，小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼变异IgNAR结构域也涵盖在本文所使用的表述“抗原结合片段”内。
抗体的抗原结合片段通常包括至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何大小或氨基酸组成，并且将通常包括与一个或多个框架序列相邻或在所述框架内的至少一个CDR。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何合适的排列相对于彼此定位。例如，可变区可以是二聚体并含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。可替代地，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施例中，抗体的抗原结合片段可以含有共价连接到至少一个恒定结构域的至少一个可变结构域。可以在本公开的抗体的抗原结合片段内发现的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包含：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在可变结构域和恒定结构域的任何构型(包含上文所列的任何示例性构型)中，可变结构域和恒定结构域可以彼此直接连接或可以通过完整或部分铰链区或接头区连接。铰链区可以由至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成，所述氨基酸导致单个多肽分子中相邻可变结构域和/或恒定结构域之间的柔性或半柔性连接。此外，本公开的抗体的抗原结合片段可以包括上文所列出的任何可变结构域和恒定结构域构型的同二聚体或异二聚体(或其它多聚体)，其彼此和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价缔合(例如，通过二硫键)。
与完整抗体分子一样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包括至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性结合到单独的抗原或同一抗原上的不同表位。可以使用本领域可用的常规技术，使包含本文公开的示例性双特异性抗体形式的任何多特异性抗体形式适用于本公开的抗体的抗原结合片段的上下文中。
抗原结合分子或ABM：如本文所使用的，术语“抗原结合分子”或“ABM”是指包括两个半抗体的分子(例如，多个多肽链的组装体)。通常，每个半抗体包括至少一个抗原结合位点。本公开的ABM可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。单特异性结合分子中的抗原结合位点均与相同的表位结合，而多特异性结合分子具有至少两个与不同表位结合的抗原结合位点，其可以是相同或不同的靶分子。
缔合：在ABM的上下文中，术语“缔合”是指两个或更多个多肽链之间的功能关系。具体地说，术语“缔合”是指两个或更多个多肽彼此缔合，例如，通过分子相互作用非共价地缔合或通过一个或多个二硫键或化学交联键共价地缔合，从而产生功能性ABM，其中抗原结合位点可以结合其相应的靶标。可能存在于本公开的ABM中的缔合的实例包含(但不限于)Fc区中的同二聚体或异二聚体Fc结构域之间的缔合、Fab结构域中的VH和VL区之间的缔合、Fab结构域中的CH1和CL之间的缔合，以及结构域取代的Fab中CH3和CH3之间的缔合。
二价：如本文所使用的，术语“二价”是指具有两个抗原结合位点的ABM。在一些实施例中，两个抗原结合位点结合相同靶标的相同表位。在其它实施例中，两个抗原结合位点特异性结合不同的表位，无论是相同靶分子还是不同靶分子的表位。
互补决定区或CDR：如本文所使用的，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸序列。一般来说，每个重链可变区有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、HCDR-H3)，并且每个轻链可变区有三个CDR(CDR1-L1、CDR-L2、CDR-L3)。可用于鉴定CDR边界的示例性规约包含例如Kabat定义、Chothia定义、ABS定义和IMGT定义。参见例如，Kabat,1991,“具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)”，马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院(National Institutesof Health,Bethesda,Md.)(Kabat编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273:927-948(Chothia编号方案)；Martin等人,1989,《美国国家科学院院刊(Natl.Acad.Sci.USA)》,86:9268-9272(ABS编号方案)；和Lefranc等人,2003,《发育和比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27:55-77(IMGT编号方案)。公共数据库也可用于鉴定抗体内的CDR序列。
细胞因子：术语“细胞因子”是指一组具有细胞信号传导活性的低分子量细胞外多肽/糖蛋白的成员，包含趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子负责调控免疫反应(例如，细胞和其它细胞因子的活性、分化、增殖和产生)，并且通常由免疫细胞合成，主要由T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞合成，但也可能由非免疫细胞合成。细胞因子以单体、二聚体(同二聚体和异二聚体)、三聚体(包含同三聚体)和四聚体(包含同四聚体)的形式存在。细胞因子的分子量范围为约5到70kDa，尽管大多数范围为约5到约20kDa。许多细胞因子具有四-α-螺旋束结构。其它细胞因子的特征在于半胱氨酸结，其含有由成对的半胱氨酸残基形成的三个二硫键。其它细胞因子的特征在于同三聚体锥体结构，该特征有时存在于细胞表面蛋白中。
EC50：术语“EC50”是指抗体或ABM的半数最大有效浓度，其在指定的暴露时间之后在基线与最大值之间诱导反应的一半。EC50基本上代表抗体或ABM的浓度，其中观察到其最大效应的50％。在某些实施例中，EC50值等于抗体或ABM的浓度，该浓度与表达靶分子的细胞产生半数最大结合，所述靶分子可以被抗体或ABM特异性结合，例如，如通过FACS结合测定法所确定的。因此，随着EC50或半数最大有效浓度值的增加，观察到结合减少或减弱。在一些实施例中，本公开的ABM的EC50值的特征可以在于约10-5M或更小的EC50值(例如，小于10-5M、小于10-6M、小于10-7M、小于10-8M或小于10-9M)。
表位：术语“表位”是指与被称为互补位的抗体或抗原结合分子的可变区中的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单个抗原或靶分子可以具有多于一个表位。因此，不同的抗体或抗原结合分子可以与抗原或靶分子上的不同区域结合，并且可以具有不同的生物学效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位通过来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。在某些情况下，表位可以包含抗原或靶分子上的糖、磷酰基或磺酰基的部分。
Fab：在本公开的ABM的上下文中，术语“Fab”是指一对多肽链，第一个包括抗体的可变重(VH)结构域，其位于第一恒定结构域(在本文中被称为C1)的N端，并且第二个包括抗体的可变轻(VL)结构域，其位于能够与第一恒定结构域配对的第二恒定结构域(在本文中被称为C2)的N端。在天然免疫球蛋白中，VH位于重链的第一个恒定结构域(CH1)的N端，并且VL位于轻链恒定结构域(CL)的N端。本公开的Fab可以根据天然取向排列或包含促进正确VH和VL配对的结构域取代或交换，具体地说，在本公开的ABM包括不相同的Fab的情况下。例如，可以用CH3结构域对替换Fab中的CH1和CL结构域对，以促进异二聚体ABM中正确修饰的Fab链配对。也可以颠倒CH1和CL，使得CH1连接到VL并且CL连接到VH，这种构型通常被称为Crossmab。可替代地，或除了使用取代或交换的恒定结构域之外，正确的链配对可通过使用可与本公开的异二聚体ABM的两个可变区配对的通用轻链来实现。在描述本公开的ABM时，C1结构域在说明书的其它地方被称为CH1结构域，并且C2结构域在本文中被称为CL结构域，用于每个描述；但是，也旨在包含结构域交换形式。第6.2.1节举例说明了其它形式的工程化Fab。
Fc：术语“Fc”是指重链恒定区的一部分，其至少包括通常与Fc受体(例如，FcγR，即FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)，或FcRn，即新生儿Fc受体)结合的CH2和CH3结构域。术语“Fc”还涵盖不同于天然免疫球蛋白的Fc的工程化Fc。例如，CH2和CH3区可以经工程改造以包含缺失、取代和/或插入或使其不能结合任何Fc受体的其它修饰，那么就其典型的生物学功能而言，CH2和CH3区被认为是无功能的。第6.2.7节举例说明了其它形式的工程化Fc。
Fc结构域和Fc区：术语“Fc结构域”是指重链的一部分，其与另一个重链的对应部分配对。术语“Fc区”是指通过缔合两个重链Fc结构域形成的基于抗体的结合分子的区域。Fc区内的两个Fc结构域可以彼此相同或不同。在天然抗体中，Fc结构域通常是相同的，但是出于产生本公开的ABM的目的，一个或两个Fc结构域可以有利地被修饰以允许异二聚化。
半抗体：术语“半抗体”是指至少包括Fc结构域并且可以通过例如二硫键或分子相互作用(例如，Fc异二聚体之间的孔内旋钮相互作用)与包括Fc结构域的另一个分子缔合的分子。半抗体可以由一个多肽链或多于一个多肽链(例如，重链和轻链)构成。
重链：如本文所使用的，术语“重链”或“免疫球蛋白(Ig)重链”包含来自任何生物体的Ig重链恒定区序列，并且除非另有说明，否则包含重链可变结构域。除非另有说明，否则重链可变结构域包含三个重链互补决定区(CDR)和四个框架区(FR)。重链可变结构域的片段包含CDR，或CDR和FR两者。典型的重链恒定区(CH)在可变结构域之后，从N端到C端具有：CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域(参见例如图1A和2A)。非典型重链，如本文关于抗原结合分子和双特异性重抗原结合分子所公开的重链，在任意两个重链恒定区(CH)之间具有可变结构域(VH)，例如从N端到C端：CH2结构域、CH3结构域、VH结构域和CH2结构域(参见例如图1B和图2B)。在一个实施例中，Fc部分至少包括CH2和CH3结构域。
铰链：如本文所使用的，术语“铰链”旨在包含将免疫球蛋白的CH1结构域的C端连接到CH2结构域的N端的连续氨基酸残基的区域。CH2结构域N端的几个由CH2外显子编码氨基酸也被认为是“下铰链”的一部分。不受任何一种理论的束缚，IgG1、IgG2和IgG4的铰链区的氨基酸已被表征为包括由不同的铰链外显子编码的12-15个连续氨基酸，以及CH2结构域的几个N端氨基酸(由CH2外显子编码)(Brekke等人,1995,《今日免疫学(ImmunologyToday)》16(2):85-90)。另一方面，IgG3包括由四个区段组成的铰链区：一个类似于IgG1的铰链区的上部区段，和3个区段，它们是IgG3独有的相同氨基酸重复。
宿主细胞：如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指其中已引入本公开的核酸的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，这类术语是指特定的受试者细胞和这种细胞的子代或潜在子代。由于突变或环境影响可能在后代中发生某些修饰，因此这种子代可能在事实上与亲代细胞不同，但是仍然包含在如本文所用的术语的范围内。典型的宿主细胞是真核宿主细胞，如哺乳动物宿主细胞。示例性真核宿主细胞包含酵母和哺乳动物细胞，例如脊椎动物细胞，如小鼠、大鼠、猴或人细胞系，例如HKB11细胞、PER.C6细胞、HEK细胞或CHO细胞。
免疫球蛋白：术语“免疫球蛋白”(Ig)是指一类结构相关的糖蛋白，其由两对多肽链、一对轻(L)链和一对重(H)链组成，可以通过二硫键使全部四对相互连接。免疫球蛋白的结构已经被很好地表征。例如，参见《基础免疫学(Fundamental Immunology)》第7章(Paul,W.编辑,第2版,雷文出版社(Raven Press),纽约(1989))。每个重链通常包括重链可变区(在本文中缩写为VH或VH)和重链恒定区(CH或CH)。重链恒定区通常包括三个结构域CH1、CH2和CH3。CH1和CH2结构域通过铰链连接。Fc部分至少包括CH2和CH3结构域。
通常，免疫球蛋白的氨基酸残基编号是根据IMGT,“具有免疫学意义的蛋白质序列”,第5版,公共卫生服务,马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院(1991)，或通过Kabat的EU编号系统(也被称为“EU编号”或“EU索引”)进行的，例如，如Kabat等人,“具有免疫学意义的蛋白质序列”,第5版,美国卫生与公共事业部(US Department of Health and HumanServices),NIH公开号91-3242(1991)中所述。
同种型：术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。
可操作地连接：术语“可操作地连接”是指如此描述的组分的允许其以其预期的方式起作用的物理或功能并置。关于多肽，术语“可操作地连接”可以指多肽链的两个或更多个区域之间的功能关系，其中两个或更多个区域连接以产生功能性多肽。关于核酸，如在DNA表达载体构建体的上下文中，术语“可操作地连接”是指例如控制序列，例如启动子或操纵子，被适当地放置在相对于编码序列的位置，使得控制序列指导由编码序列编码的多肽的产生。
多肽和蛋白质：术语“蛋白质”意在包含四级结构、三级结构和由至少一种多肽构成的其它复合物大分子。术语“蛋白质”包含多肽。
术语“多肽”是指通过相邻氨基酸残基的羧基和氨基之间的肽键键合在一起的单个氨基酸线性聚合物链。本公开的多肽包括源自免疫球蛋白结构域的氨基酸序列。“源自”指定蛋白质或多肽的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。
术语“蛋白质”也可用于描述大多肽，如由一种或多种多肽构成的多肽。
单链Fab：如本文所使用的，术语“单链Fab”或“scFab”是指包括抗体的VH、CH1、VL和CL结构域的多肽链，其中这些结构域存在于单个多肽链中。
单链Fv或scFv：如本文所使用的，术语“单链Fv”或“scFv”是指包括抗体的VH和VL结构域的多肽链，其中这些结构域存在于单个多肽链中。
特异性(或选择性)结合：如本文所使用的，术语“特异性(或选择性)结合”是指ABM或其抗原结合位点(“ABS”)与在生理条件下相对稳定的靶分子形成复合物。特异性结合的特征可以在于约5x10-2M或更小的KD(例如，小于5x10-2M、小于10-2M、小于5x10-3M、小于10- 3M、小于5x10-4M、小于10-4M、小于5x10-5M、小于10-5M、小于5x10-6M、小于10-6M、小于5x10-7M、小于10-7M、小于5x10-8M、小于10-8M、小于5x10-9M、小于10-9M或小于10-10M)。用于确定抗体或抗体片段(例如ABM或ABS)对靶分子的结合亲和力的方法在本领域中是众所周知的，并且包含例如平衡透析、表面等离子共振(例如，Biacore测定)、荧光活化细胞分选(FACS)结合测定等。然而，特异性结合来自一个物种的靶分子的ABM或其ABS抗体可以与来自一个或多个其它物种的靶分子具有交叉反应性。
靶分子：如本文所使用的，术语“靶分子”是指可以被ABM的抗原结合位点特异性结合的任何生物分子(例如，蛋白质、碳水化合物、脂质或其组合)。示例性靶分子包含但不限于ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRLI、ADORA2A、聚集蛋白聚糖、AGR2、AICDA、AIF1、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、ART-4、B7、B7.1、B7.2、BAD、BAFF、BAGI、BAIi、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRl(MDRlS)、BlyS、BMPl、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMPS、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(凝集素)、BRCA1、Ba-733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CDI-IA、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、C19orf10(IL27w)、C3、C4A、CS、CSR1、CANT1、CASPI、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCLI(I-309)、CCLII(趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCLIS(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCLIS(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/趋化因子-2)、CCL2S(TECK)、CCL26(趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL2S、CCL3(MIP1a)、CCL4(MIP-1b)、CCLS(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCLS(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM14S)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCRS(CMKBRSI ChemR13)CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EB1)、CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLI(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CDlC、CD200、CD-22、CD24、CD2S、CD3S、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD44、CD4SRB、CD47、CD4S、CDS2、CD69、CD72、CD79A、CD79B、CDSO、CDS1、CDS3、CDS6、CD137、CD13S、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CDH1(E-钙粘蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDHlS、CDH19、CDH20、CDHS、CDH7、CDHS、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDKS、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21 Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSFS、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSFS、CLDN3、CLDN7(封闭素-7)、CLN3、CLU(聚簇蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COLISA1、COLIA1、COL4A3、COL6Al、CR2、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA-4、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CLI(SCYD1)、CX3CR1(V2S)、CXCLI(GRO1)、CXCLIO(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCLS(ENA-7S/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYBS、CYC1、CYSLTR1、HIF-1-a、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAB2IP、DES、DKFZp4S1J011S、DNCLI、DPP4、DAM、EGFR、EGFRvlll、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、EN01、EN02、EN03、EPHB4、EPO、EREG、ERKS、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF1S、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGFS、FGF7(KGF)、FGFS、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILI(EPSILON)、FILI(ZETA)、FLJ12SS4、FLJ2SS30、FLRT1(纤连蛋白)、FOS、FOSLI(FRA-1)、FY(DARC)、Flt-I、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GROB、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GDFS、GFil、GGTl、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPRS1(FKSGSO)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC4、HDACS、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIP1组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HUMCYT2A、HLA-DR、HMI 24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或1a、IGF-IR、IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-1、IL-10、IL-10RA、IL-10RB、IL-11、IL-11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-14、IL-1S、IL-1SRA、IL-16、IL-17、IL-17B、IL-17C、IL-17R、IL-18、IL-18BP、IL-18R1、IL-18RAP、IL-19、IL-IA、IL-1B、IL-1F10、IL-1FS、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1HY1、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAP、IL-1RAPL1、IL-1RAPL2、IL-1RL1、IL-1RL2 IL-1RN、IL-2、IL-20、IL-20RA、IL-21R、IL-22、IL-22R、IL-22RA2、IL-23、IL-24、IL-2S、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-2RA、IL-2RB、IL-2RG、IL-3、IL-30、IL-3RA、IL-4、IL-4R、IL-S、IL-5RA、IL-6、IL-6R、IL-6ST(糖蛋白130)、IL-7、IL-7R、IL-S、IL-SRA、IL-SRB、IL-9、IL-9R、IL-K、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6整合素)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b4整合素)胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4IFNAS、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNW1、JAG1、JAK1、JAK3、JUN、K6HF、KAi1、KDR、KITLG、KLFS(GC盒BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK1S、KLK3、KLK4、KLKS、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS 1-4、Le-Y、LDR/FUT、LAMAS、LEP(瘦素)、Lingo-p7S、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIB1、中期因子、MIF、MIP-2、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫连蛋白-III)、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NCK2、神经能、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Noga)、NgRp7S、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOXS、NPPB、NROB1、NROB2、NR1D1、NR1D2、NRIH2、NRIH3、NRIH4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NRSA1、NRSA2、NR6A1、NRP1、NRP2、NTSE、NTN4、ODZ1、OPRD1、PCSK9、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PD-1、PD-L1、α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDFS、CGRP、Lingo-I、因子IXa、因子X、ICOS、GARP、BTLA、CD160、RORI、2B4、KIR、CD27、OX40、A2aR、PDGFA、PDGFB、PECAM1、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷聚糖、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDC1、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、10PIGF、ILGF、ILGF-IR、IL-6、RS5、RANTES、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFl10(ZNF144)、ROB02、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPINA1、SERPINA3、SERPINBS(乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STAB1、STATE、STEAP、STEAP2、TIOI、SAGE、5100、生存素、生存素-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn-抗原、ThomsonFriedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TB4R2、TBX21、TCP10、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFBlil、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLRS、TLR6、TLR7、TLRS、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)、TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSFS、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSFS、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF1S(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSFS(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSFS(CD30配体)、TNFSF9(4-lBB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TPS3、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAPS、TRAF6、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-IA抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、CS、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、CD19/CD3、BCMA/CD3、EGFR、HER3、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL1/IL-8、IL-6、IL-6R/IL-21、IL-21R、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFR-β、血管内皮生长因子(VEGF)受体2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL CS、VLA-4、c-FMS/CSFIR、RET、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、整合素、MMPs VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF、血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受体l/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、ENDOSIALIN/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-IR、IL 25 17A/F、EGF受体l/CD3和CD19/CD16、KHI、Tn-抗原、TF-抗原、CD44、糖脂、鞘糖脂，如30Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、唾液酸四糖神经酰胺、XCL1(淋巴细胞趋化素)、XCL2(SCM-1b)、XCR1(GPRS/CCXCR1)、YY1和ZFPM2。在一些实施例中，靶分子是小的可溶性(即，非膜结合的)分子。
四价：如本文所使用的，术语“四价”是指具有四个抗原结合位点的ABM。在一些实施例中，抗原结合位点中的两个结合相同的表位，而另外两个结合位点结合不同的表位，无论是相同靶分子还是不同靶分子的表位。
通用重链：如本文在ABM的上下文中所使用的，术语“通用重链”是指具有重排的重链可变区的重链，例如具有重排的Ig重链可变区的人重链。示例性重排的Ig重链可变区在美国专利公开号2014/0245468和美国专利第9,204,624号和第9,930,871号中提供，所述专利中的每一个在此通过引用整体并入本文。通用重链也被称为“共同重链”。
通用轻链：如本文在ABM的上下文中所使用的，术语“通用轻链”是指具有重排的轻链可变区的轻链，例如具有重排的Ig轻链可变区的人重链。通用轻链也被称为“共同重链”。在ABM的上下文中，是指能够与同一ABM中具有不同可变区的两个不同Fab结构域的重链区配对的轻链多肽。通用轻链也被称为“共同轻链”。示例性重排的Ig轻链可变区在例如美国专利第9,969,814号；第10,130,181号和第10,143,186号以及美国专利公开号2012/0021409、2012/0192300、2013/0045492、2013/0185821、2013/0302836和2015/0313193中提供，所述专利中的每一个在此通过引用整体并入本文。
VH：术语“VH”是指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包含Fab的重链。
VL：术语“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包含Fab的轻链。
6.2.抗原结合分子(ABM)
本文公开了抗原结合分子，如单特异性和双特异性抗原结合分子。所公开的抗原结合分子具有不同于典型抗体架构的结合结构域排列。所公开的抗原结合分子可以双特异性地结合单个靶分子或抗原，这可能导致对抗原或靶分子的亲和力和/或亲合力增加。例如，对于其中两个Fab在不同表位处结合相同抗原的双特异性抗原结合分子，相对于仅结合仅一个表位的抗体，预期对抗原的亲和力增加。不受理论束缚，据信本文公开的ABM具有增加的对抗原或靶分子的亲合力，这是由于Fab1和Fab2结构域的接近性增加和/或灵活性更大，相对于常规形式的抗体，这将增加抗原结合位点的局部浓度，其中Fab结构域的结合位点是间隔开的。
在第一方面，本公开的ABM包括：
·第一半抗体，所述第一半抗体在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域；
-第一Fc结构域；以及
-第一Fab(Fab1)结构域，所述第一Fab结构域包括与第一轻链可变区(VL)缔合的第一重链可变区(VH)；以及
·第二半抗体，所述第二半抗体在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域；
-第二Fc结构域；以及
-第二Fab(“Fab2”)结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH，
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区，并且其中所述任选的铰链结构域，如果存在的话，可以通过二硫键彼此缔合。
图1B和图2B中展示了这种类型的ABM的两个实施例，在本文中通常被称为ABM形式“A”(“A型”)并且有时在本文中被称为“Fc-Fab”形式，以及描绘于图13A、图13B和图13C中的其变体。因此，本公开提供了描绘于图1B和图2B中的A型ABM，其包括：
·第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域(3)，所述任选的铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；
-Fc结构域，所述Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；
-任选的铰链结构域(3)，所述任选的铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；
-接头(8)；以及
-Fab1结构域的重链组分，其包括与Fab1结构域的轻链组分缔合的Fab1VH结构域(1)和Fab1 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab1 VL结构域(6)和Fab1 CL结构域(7)；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-任选的铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第一多肽中的铰链结构域连接；
-第二Fc结构域，所述第二Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；
-任选的铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第一多肽中的铰链结构域连接；
-接头(8)；以及
-Fab2结构域的重链组分，其包括与Fab2结构域的轻链组分缔合的Fab2VH结构域(1)和Fab2 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab2 VL结构域(6)和Fab2 CL结构域(7)；
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区。
在图1B的实施例中，两个半抗体是相同的，包含形成Fc同二聚体的Fc结构域，并且所得的ABM是单特异性的。在图2B的实施例中，ABM包括Fc异二聚体，从而允许使用不同的Fab1和Fab2 VH结构域并产生多特异性，例如双特异性，分子。虽然图1B、图2B和13A展示了其中ABM具有由Fc结构域N端的铰链结构域构成的铰链区的实施例，但A型ABM可以没有铰链区(未示出)、具有Fc区C端的铰链区(图13C)或具有Fc区N端和C端的铰链区(图13B)。如图13A-13C中所描绘的，可用于Fc区N端和/或C端的示例性铰链结构域包括氨基酸序列GGGGSCPPC(SEQ ID NO:1)和ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2)，但A型ABM也可以具有替代的铰链区序列。同样，尽管图13A-13C描绘了(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ ID NO:3)，但可以使用其它接头序列。
虽然图1B和图2B展示了仅含有两个结合结构域(Fab1和Fab2)的A型ABM的实施例，但本公开的ABM可以含有额外的结合结构域，例如scFv或Fab结构域。然而，在某些方面，Fab1和Fab2是A型ABM的唯一结合结构域。
在第二方面，本公开的ABM包括：
·第一半抗体，所述第一半抗体在N到C端取向上包括：
-第一Fab(Fab1)结构域，所述第一Fab结构域包括与第一VL缔合的第一VH；
-第一间隔结构域；以及
-第一Fc结构域；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-第二Fab(Fab2)结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH；
-第二间隔结构域；以及
-第二Fc结构域；并且
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区。
不受理论束缚，据信在Fc结构域和Fab结构域之间包含间隔结构域会导致Fc区和Fab的抗原结合位点之间具有更大的灵活性，并因此产生更高的ABM与其靶分子结合的亲和力和/或亲合力。
在某些实施例中，间隔结构域是延伸接头。图3A中展示了这种ABM形式，在本文中通常被称为形式“B”(“B型”)并且有时在本文中被称为“延伸型”形式。因此，本公开提供了描绘于图3A中的B型ABM的实施例，其包括：
·第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
-Fab1结构域的重链组分，其包括与Fab1结构域的轻链组分缔合的Fab1VH结构域(1)和Fab1 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab1 VL结构域(6)和Fab1 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)，所述接头结构域是延伸接头；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第一Fc结构域，所述第一Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-Fab2结构域的重链组分，其包括与Fab2结构域的轻链组分缔合的Fab2VH结构域(1)和Fab2 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab2 VL结构域(6)和Fab2 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)，所述接头结构域是延伸接头；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第二Fc结构域，所述第二Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)。
虽然图3A中描绘的B型ABM的实施例仅含有两个结合结构域(Fab1和Fab2)，但本公开的B型ABM可以含有额外的结合结构域，例如scFv或Fab结构域。然而，在某些方面，Fab1和Fab2是本公开的B型ABM的唯一结合结构域。
在其它实施例中，间隔结构域是Fab结构域。图3B-3D中展示了这种ABM形式的不同变体，在本文中被称为形式“C”(“C型”)。因此，C型ABM包括第三Fab(Fab3)结构域和第四Fab(Fab4)结构域，其构型如下：
·第一半抗体，所述第一半抗体在N到C端取向上包括
-第一Fab(Fab1)结构域，所述第一Fab结构域包括与第一VL缔合的第一VH；
-第三Fab(Fab3)结构域，所述第三Fab结构域包括与第三VL缔合的第三VH；以及
-第一Fc结构域；以及
·第二半抗体，所述第二半抗体在N到C端取向上包括：
-第二Fab(Fab2)结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH；
-第四Fab(Fab4)结构域，所述第四Fab结构域包括与第四VL缔合的第四VH；以及
-第二Fc结构域。
因此，本公开提供了描绘于图3B-3D中的C型ABM的实施例，其包括：
·第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
-Fab1结构域的重链组分，其包括与Fab1结构域的轻链组分缔合的Fab1VH结构域(1)和Fab1 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab1 VL结构域(6)和Fab1 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)；
-Fab3结构域的重链组分，其包括与Fab3结构域的轻链组分缔合的Fab3VH结构域(1)和Fab3 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab3 VL结构域(6)和Fab3 CL结构域(7)；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第一Fc结构域，所述第一Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；以及
·第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
-Fab2结构域的重链组分，其包括与Fab2结构域的轻链组分缔合的Fab2VH结构域(1)和Fab2 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab2 VL结构域(6)和Fab2 CL结构域(7)；
-接头结构域(8)；
-Fab4结构域的重链组分，其包括与Fab4结构域的轻链组分缔合的Fab4VH结构域(1)和Fab4 CH1结构域(2)，多肽形式的轻链组分在N到C端取向上包括Fab4 VL结构域(6)和Fab4 CL结构域(7)；
-铰链结构域(3)，所述铰链结构域通过二硫键与第二多肽中的铰链结构域连接；以及
-第二Fc结构域，所述第二Fc结构域包括CH2结构域(4)和CH3结构域(5)；其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区。
虽然图3B-3D中描绘的C型ABM的实施例含有四个结合结构域(Fab1、Fab2、Fab3和Fab4)，但本公开的C型ABM可以含有额外的结合结构域，例如scFv或Fab结构域。然而，在某些方面，Fab1、Fab2、Fab3和Fab4是本公开的C型ABM的唯一结合结构域。
C型ABM的Fab3和Fab4结构域可以是非结合的(如图3B所示)或结合的(如图3C和图3D所示)。其中Fab3和Fab4是非结合的那些实施例在本文中通常被称为C1型ABM，并且此形式有时在本文中被称为“钳型”形式。其中Fab3和Fab4是结合的那些实施例在本文中通常被称为C2型ABM，并且此形式有时在本文中被称为“串联Fab”形式。术语“2+2串联Fab”是指图3C和图3D所示的实施例，其中Fab1、Fab2、Fab3和Fab4是串联Fab中唯一的结合结构域。C1型和C2型ABM中的每一个都可以是同二聚体或异二聚体。
在C1型ABM的某些实施例中，Fab1和Fab2结构域是不相同的(例如，结合不同的表位，无论是在相同的靶分子上还是在不同的靶分子上)，并且Fab3和Fab4结构域是相同的非结合结构域。在其它实施例中，Fab3和Fab4结构域是不同的非结合结构域。
在C2型ABM的某些实施例中，Fab1和Fab3结构域包括相同的VH结构域，并且Fab2和Fab4结构域包括相同的VH结构域，如图3C所示。这种构型被称为构型1，或1-1-2-2构型。在C2型ABM的替代实施例中，Fab1和Fab2结构域包括相同的VH结构域，并且Fab3和Fab4结构域包括相同的VH结构域，如图3D所示。这种构型被称为构型2，或1-2-1-2构型。
完整的ABM是通过以下形成的：两个半抗体通过两个Fc结构域缔合形成Fc区。当两个半抗体不相同时，例如当Fab1和Fab2包含不同的VH结构域时，可以使用Fc异二聚化方法(例如，如第6.2.7.2节中所述)来促进正确的半抗体配对或它们的纯化。异二聚化方法的实例是星形突变(如第6.2.7.2节所述)或孔内旋钮突变。
虽然图2B、3A、3B和3C示出了在通过Fc异二聚体配对的每个半抗体中包括不相同VH结构域的ABM，但这种形式也可用于Fc同二聚体。例如，虽然图2B和图3A分别示出了包括Fc异二聚体，从而允许在Fab1和Fab2中并入不同的VH结构域并产生多特异性(例如，双特异性)结合分子的A型ABM和B型ABM，但这种形式也可以用于具有Fc同二聚体和相同VH结构域的单特异性A型和B型ABM。类似地，Fc同二聚体可用于产生具有相同Fab1、Fab2、Fab3和Fab4VH结构域或相同Fab1和Fab2 VH结构域以及非结合Fab3和Fab4VH结构域的单特异性C型ABM。
进一步地，当第一和第二多肽包含不同的VH结构域时，可以使用不同的策略来允许多特异性结合分子中的正确VH-VL配对。例如，可以使用能够与ABM中多于一种类型的VH结构域有效配对的共同轻链。在此类实施例中，轻链多肽(例如，与Fab1和Fab2以及如果存在的话，Fab3和Fab4缔合的轻链)可以是相同的。可替代地，可以使用单结构域Fab，其中重链组分((1)和(2))可以与轻链组分((6)和(7))融合表达。
图1-3中所示的本公开的ABM的变体并非旨在限制；处其它外，本公开的ABM可以包含图1-3和下文第6.2节中展示的修饰的任何组合。此外，提及第一或第二多肽链或左或右半抗体仅是为了方便，并且并不旨在传达多肽链或半抗体以任何特定顺序产生或组装。
在一些实施例中，本公开的ABM的第一Fab(Fab1)结构域和第二Fab(Fab2)结构域可以各自结合相同的靶分子，例如小的可溶性分子。第一Fab(Fab1)结构域和第二Fab(Fab2)结构域可以结合相同的表位(例如，在图1B和图3D中描绘的实施例中，或在图3A或图3B的变体中，其中Fab1和Fab2两者具有相同的VH结构域(未示出))或者它们可以结合不同的表位(例如，在图2B、图3A、图3B和图3C中描绘的实施例中)，无论是在相同的靶分子上或在不同的靶分子上。在第一Fab(Fab1)结构域和第二Fab(Fab2)结构域结合不同表位(例如，同一靶分子上或不同靶分子上的两个不同表位)的情况下，可以选择它们使得Fab能够同时与其表位结合。
在一些实施例中，例如在C型ABM的实施例中，本公开的ABM可以包含第三Fab(Fab3)结构域和第四Fab(Fab4)结构域，如图3C、图3A和图3D所描绘的。第三个和第四个Fab结构域可以是非结合的，如图3C中所描绘，或者它们可以结合与分别由第一和第二Fab(Fab1和Fab2)结构域结合的表位相同或不同的表位。如本文所使用的，关于C型ABM，术语“第一和第二Fab结构域”和“Fab1和Fab2结构域”通常是指最N端的Fab结构域。
某些靶分子，具体地说，具有重复表位的靶分子，如可能存在于具有重复基序的多肽或具有多聚体结构的蛋白质(例如，同二聚体或同三聚体)中的靶分子，可以被两个或更多个抗体分子结合，从而导致大型复合物的形成。大型异质抗体复合物的生产被称为“纸娃娃(换装paper-dolling)”。抗体的大型复合物可通过吞噬作用迅速消除，从而导致抗体功效降低。大型复合物也可以增加治疗性抗体的免疫原性。参见例如，WO 2020047067A1。与从中获得Fab结构域的亲本抗体相比，本公开的ABM可能更不容易聚集，例如在体内或离体。通过非限制性实例的方式，对于其中两个Fab在不同表位处结合相同抗原的双特异性ABM，观察到(参见下文实例4)，与使用亲本mAb组合获得的结果不同，本公开的ABM主要与配体形成离散的1:1复合物，而几乎没有或没有额外的高阶复合物。相比之下，亲本mAb组合形成了多个更高阶结构(多聚体)，这表明这些亲本抗体在多个配体之间形成了桥梁，例如形成未折叠的“纸娃娃(paper doll)”结构。这些结果表明本文公开的ABM不易聚集，因为据信Fab结构域的接近性有利于形成1:1Fc-Fab配体复合物而不是更高阶的结构。在实践中，这可能导致单个ABM：靶分子复合物的相对浓度高于亲本抗体的预期浓度。
在一些实施例中，本公开的ABM特异性结合至少两个不同的表位(并且在一些情况下，三个或四个不同的表位)。至少两个不同的表位可以在相同的靶分子或不同的靶分子上。
6.2.1.Fab结构域
本公开的ABM在每个半抗体中包括至少一个Fab结构域。Fab结构域传统上是通过使用木瓜蛋白酶等酶对免疫球蛋白分子进行蛋白水解切割而产生的。在本公开的ABM中，Fab结构域被重组表达为较大分子的一部分。
Fab结构域可以包括来自任何合适物种的恒定和可变结构域序列，因此可以是鼠、嵌合、人或人源化的。
Fab结构域通常包括连接到VH结构域的CH1结构域，其与连接到VL结构域的CL结构域配对。在野生型免疫球蛋白中，VH结构域与VL结构域配对以构成Fv区，并且CH1结构域与CL结构域配对以进一步稳定结合模块。两个恒定结构域之间的二硫键可以进一步稳定Fab结构域。
对于本公开的ABM，具体地说，当轻链不是共同的或通用的轻链时，有利的是，使用Fab异二聚化策略以允许属于相同ABS的Fab结构域的正确缔合并使属于不同ABS的Fab结构域的异常配对最小化。例如，可以使用下表B中所示的Fab异二聚化策略：
Figure BDA0003577521890000401
因此，在某些实施例中，通过彼此交换Fab的VL和VH结构域或彼此交换CH1和CL结构域来促进Fab的两个多肽之间的正确缔合，例如，如WO 2009/080251中所述。
还可以通过在Fab的CH1结构域中引入一个或多个氨基酸修饰并在CL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰和/或在VH结构域中引入一个或多个氨基酸修饰并在VL结构域中引入一个或多个氨基酸修饰来促进正确的Fab配对。被修饰的氨基酸通常是VH:VL和CH1:CL界面的一部分，使得Fab组分优先彼此配对，而不是与其它Fab的组分配对。
在一个实施例中，一种或多种氨基酸修饰限于如Kabat残基编号所示的可变(VH、VL)和恒定(CH1、CL)结构域的保守框架残基。Almagro,2008,《生物科学前沿(Frontiers InBioscience)》13:1619-1633提供了基于Kabat、Chothia和IMGT编号方案的框架残基定义。
在一个实施例中，在VH和CH1和/或VL和CL结构域中引入的修饰是彼此互补的。重链和轻链界面的互补性可以基于空间和疏水接触、静电/电荷相互作用或多种相互作用的组合来实现。蛋白质表面之间的互补性在文献中被广泛描述为锁和键配合、旋钮到孔、突起和腔、供体和受体等，所有这些都暗示了两个相互作用表面之间结构和化学匹配的性质。
在一个实施例中，一种或多种引入的修饰跨Fab组分的界面引入新的氢键。在一个实施例中，一种或多种引入的修饰跨Fab组分的界面引入新的盐桥。示例性取代描述于WO2014/150973和WO 2014/082179中，二者的内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，Fab结构域在CH1结构域中包括192E取代，并且在CL结构域中包括114A和137K取代，所述取代在CH1和CL结构域之间引入盐桥(参见例如，Golay等人,2016,《免疫学杂志》196:3199-211)。
在一些实施例中，Fab结构域在CH1结构域中包括143Q和188V取代，并且在CL结构域中包括113T和176V取代，所述取代用于交换CH1和CL结构域之间的疏水和极性接触区(参见例如，Golay等人,2016,《免疫学杂志》196:3199-211)。
在一些实施例中，Fab结构域可以在一些或所有VH、CH1、VL、CL结构域中包括修饰以引入促进Fab结构域正确组装的正交Fab界面(Lewis等人,2014《自然生物技术》32:191-198)。在一个实施例中，在VH结构域中引入39K、62E修饰，在CH1结构域中引入H172A、F174G修饰，在VL结构域中引入1R、38D、(36F)修饰，并且在CL结构域中引入L135Y、S176W修饰。在另一个实施例中，在VH结构域中引入39Y修饰并且在VL结构域中引入38R修饰。
Fab结构域也可以被修饰成用工程化二硫键替换天然CH1:CL二硫键，从而提高Fab组分配对的效率。例如，可以通过在CH1结构域中引入126C和在CL结构域中引入121C来引入工程化二硫键(参见例如，Mazor等人,2015,《MAb》7:377-89)。
也可以通过用促进正确组装的替代结构域替换CH1结构域和CL结构域来修饰Fab结构域。例如，Wu等人,2015,《MAb》7:364-76描述了用T细胞受体的恒定结构域取代CH1结构域和用T细胞受体的b结构域取代CL结构域，并通过在VL结构域中引入38D修饰和在VH结构域中引入39K修饰，将这些结构域替换与VL和VH结构域之间的额外电荷-电荷相互作用配对。
代替或除了使用Fab异二聚化策略来促进正确的VH-VL配对之外，共同轻链(也被称为通用轻链)的VL可用于本公开的ABM每个Fab VL区。在各个实施例中，与采用原始同源VL相比，采用如本文所述的共同轻链减少了不适当种类的ABM的数量。在各个实施例中，从包括共同轻链的单特异性抗体中鉴定ABM的VL结构域。在各个实施例中，ABM的VH区包括在小鼠B细胞中体内重排的人重链可变基因区段，所述小鼠B细胞先前已经过工程改造以表达有限的人轻链库或单个人轻链，与人重链同源，并且响应暴露于所关注的抗原而产生含有多个人VH的抗体库，这些人VH与两种可能的人VL中的一种或一种同源，其中所述抗体库特异于所关注的抗原。共同轻链是源自重排的人Vκ1-39Jκ5序列或重排的人Vκ3-20Jκ1序列的轻链，并且包含体细胞突变(例如，亲和力成熟)版本。参见例如，美国专利第10,412,940号。
在一些实施例中，Fab呈单链Fab(“scFab”)的形式，其通常包括VH、CH1、VL、CL和接头。在一些实施例中，scFab的结构域按以下N端到C端顺序排列：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。接头可以是如第6.2.3节中所述的接头并且优选地是至少30个氨基酸，并且在某些方面，介于32和50个氨基酸之间。单链Fab结构域通过CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键进行稳定。
6.2.2.scFv
单链Fv或“scFv”抗体片段在单个多肽链中包括抗体的VH和VL结构域，能够被表达为单链多肽，并且保留其所源自的完整抗体的特异性。通常，scFv多肽进一步包括介于VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述多肽接头使scFv能够形成用于靶标结合的期望结构。适用于连接scFV的VH和VL链的接头的实例是第6.2.3节中鉴定的接头。
除非另有说明，否则如本文所使用的，scFv可以具有任意顺序的VL和VH可变区，例如，相对于多肽的N端和C端末端，scFv可以包括VL-接头-VH或者可以包括VH-接头-VL。
scFv可以包括来自任何合适物种的VH和VL序列，如鼠、人或人源化VH和VL序列。
为了产生编码scFv的核酸，将编码VH和VL的DNA片段可操作地连接到编码接头的另一个片段，例如，编码第6.2.3节中描述的任何接头(通常是包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸的序列的重复，如氨基酸序列(Gly4～Ser)3(SEQ ID NO:4)，使得VH和VL序列可以表达为连续的单链蛋白，其中VL和VH区通过柔性接头连接(参见例如，Bird等人,1988,《科学(Science)》242:423-426；Huston等人,1988,《美国国家科学院院刊》85:5879-5883；McCafferty等人,1990,《自然(Nature)》348:552-554)。
6.2.3.接头
在某些方面，本公开提供了ABM，其中两个或更多个结构域(例如，Fab和Fc区)通过接头(或“间隔子”)肽彼此连接。此类接头在本文中被称为“ABM接头”，其与例如第6.4节中所述的用于将药物连接至ABM的抗体-药物缀合物(“ADC”)接头相反。
肽接头(例如，聚甘氨酸)是本领域众所周知的，并且通常允许融合蛋白的一种或两种组分的适当折叠。接头提供融合蛋白组分的柔性连接区，从而允许分子的两个末端独立移动，并且可以在保持两个部分的适当功能中的每一个方面起重要作用。因此，在一些情况下，连接区既充当将两个部分组合在一起的接头，又充当使两个部分中的每一个形成其自身的生物结构而不干扰其它部分的间隔子。
ABM接头的范围可以为2个氨基酸到60个或更多个氨基酸，并且在某些方面，肽接头的长度范围为3个氨基酸到50个氨基酸、4到30个氨基酸、5到25个氨基酸、10-25个氨基酸、10-60个氨基酸、12-20个氨基酸、20-50个氨基酸或25-35个氨基酸。
本公开提供了包括第一多肽和第二多肽(例如，第6.2节中描述的实施例的第一多肽和第二多肽)的ABM，每个多肽分别包括第一接头和第二接头。第一接头和第二接头可以具有0到60或0到50个氨基酸的长度，如0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个氨基酸，例如0-10个、5-15个、10-20个、15-25个、0-30个、5-30个、10-30个、20-30个、0-40个、5-40个、10-40个、15-40个、20-40个、25-40个、30-40个、35-40个、0-50个、5-50个、10-50个、15-50个、20-50个、25-50个、30-50个、35-50个、40-50个或45-50个氨基酸。对于Fc-Fab、钳型和串联Fab形式的ABM，典型的接头长度在5到30之间，例如5-30个氨基酸残基。对于延伸型形式的ABM，典型的接头长度为25到45个，例如30-40个氨基酸残基。
带电的(例如，带电的亲水接头)和/或柔性接头是特别优选的。可用于本公开的ABM的柔性接头的实例包含由以下文献公开的接头：Chen等人,2013,《先进药物递送评论(Adv Drug Deliv Rev.)》65(10):1357-1369和Klein等人,2014,《蛋白质工程化、设计和选择(Protein Engineering,Design&Selection)27(10):325-330。特别有用的柔性接头是甘氨酸和丝氨酸的重复，例如GnS或SGn的单体或多聚体，其中n是1到18的整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18。最常见的GnS或SGn是(G4S)n(G4S被公开为SEQID NO:3)(即(Gly4Ser)n或(Gly–Gly–Gly–Gly–Ser)n)接头，其中n表示基序的重复数。
含有G4S(G4S被公开为SEQ ID NO:3)的4个、5个、6个或更多个重复(例如，6个、7个、8个、9个或10个或更多个重复)和/或另一个柔性接头基序的延伸接头对于延伸型形式特别有用，其中所述延伸接头充当间隔子，据信其提供更灵活的结合，从而导致对小的可溶性分子的更大亲和力和/或亲合力。
在一些实施例中，ABM接头是聚甘氨酸接头，如Gly-Gly、Gly-Gly-Gly(3Gly)、4Gly(SEQ ID NO:5)、5Gly(SEQ ID NO:6)、6Gly(SEQ ID NO:7)、7Gly(SEQ ID NO:8)、8Gly(SEQID NO:9)和9Gly(SEQ ID NO:10)。
在其它实施例中，ABM接头是甘氨酸-丝氨酸接头。此类接头的实例还包含Ser-Gly、Gly-Ser、Gly-Gly-Ser、Ser-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:11)、Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:12)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:3)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:13)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:14)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:15)、Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:16)、Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:17)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(G4S被公开为SEQ ID NO:3)和(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SG4被公开为SEQ ID NO:13)，其中n(基序的重复数)＝1到10。(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(G4S被公开为SEQ ID NO:3)和(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SG4被公开为SEQ ID NO:13)也分别被称为(G4S)n和(SG4)n。在一个实施例中，肽接头是(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)1(SEQ ID NO:3)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO:18)、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO:4)或(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4(SEQ ID NO:19)。在一些实施例中，第一接头和第二接头具有相同的氨基酸序列。在一些实施例中，聚甘氨酸和丝氨酸氨基酸序列包括2到6个重复的GGGGS(SEQ ID NO:3)氨基酸序列，如2个、3个、4个、5个或6个重复的GGGGS(SEQ ID NO:3)氨基酸序列。针对延伸型形式考虑了含有任何上述基序的4个、5个、6个或更多个重复(例如，6个、7个、8个、9个或10个或更多个重复)的延伸接头。
6.2.4.铰链区
在其它实施例中，本公开的ABM包括铰链区，例如，由两个铰链结构域构成的铰链区。铰链可用于将Fab结构域连接到Fc结构域或稳定ABM构型。
铰链区可以是天然的或经修饰的铰链区。铰链区通常存在于Fc区的N端；然而，在一些实施例中，铰链区可以另外或可替代地存在于本公开的ABM的Fc区的C端，例如在图13B和图13C中描绘的Fc-Fab构型中。
天然铰链区是通常在天然存在的抗体的Fab和Fc结构域之间发现的铰链区。经修饰的铰链区是长度和/或组成不同于天然铰链区的任何铰链。此类铰链可以包含来自其它物种的铰链区，如人、小鼠、大鼠、兔、鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼或山羊铰链区。其它经修饰的铰链区可以包括源自与重链Fc区不同类别或亚类的抗体的完整铰链区。可替代地，经修饰的铰链区可以包括天然铰链或重复单元的一部分，其中重复单元中的每个单元源自天然铰链区。在另一个备选方案中，可以通过将一个或多个半胱氨酸或其它残基转化为中性残基，如丝氨酸或丙氨酸，或通过将适当放置的残基转化为半胱氨酸残基来改变天然铰链区。通过这种方式，铰链区中半胱氨酸残基的数量可以增加或减少。其它经修饰的铰链区可以是完全合成的，并且可以被设计成具有期望的性质，如长度、半胱氨酸组成和柔韧性。
许多经修饰的铰链区已经在例如美国专利第5,677,425号、WO 99/15549、WO2005/003170、WO 2005/003169、WO 2005/003170、WO 98/25971和WO 2005/003171中进行了描述，并且这些专利通过引用并入本文。
在各个实施例中，铰链结构域内的位置233-236可以是G、G、G和空置；G、G、空置和空置；G、空置、空置和空置；或全部空置，其中位置按EU编号进行编号。
在一些实施例中，本公开的ABM包括经修饰的铰链结构域，与相同同种型(例如，人IgG1或人IgG4)的野生型铰链结构域相比，所述经修饰的铰链结构域降低对Fcγ受体的结合亲和力。
在一个实施例中，本公开的ABM的一个或两个链的Fc区在其N端具有完整的铰链结构域。
在一个实施例中，本公开的ABM的Fc区和铰链区均源自lgG4并且铰链区包括经修饰的序列CPPC(SEQ ID NO:20)。与含有序列CPPC(SEQ ID NO:20)的lgG1相比，人lgG4的核心铰链区含有序列CPSC(SEQ ID NO:21)。存在于lgG4序列中的丝氨酸残基导致该区域的柔韧性增加，因此一部分分子在同一蛋白质链内形成二硫键(链内二硫键)，而不是与IgG分子中的其它重链桥接以形成链间二硫键(Angel等人,1993,《分子免疫学(Mol Immunol)》30(1):105-108)。将丝氨酸残基变为脯氨酸以提供与lgG1相同的核心序列，允许在lgG4铰链区中完全形成链间二硫键，从而降低纯化产物的异质性。这种改变的同种型被称为lgG4P。
6.2.5.嵌合铰链序列
铰链区可以是嵌合铰链区。
例如，嵌合铰链可以包括源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“上铰链”序列，其与源自人IgG1、人IgG2或人IgG4铰链区的“下铰链”序列组合。
在特定实施例中，嵌合铰链区包括氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ IDNO:22)(之前被公开为WO2014/121087的SEQ ID NO:8，其通过引用整体并入本文)或ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:23)(之前被公开为WO2014/121087的SEQ ID NO:9)。此类嵌合铰链序列可以适当地连接至IgG4CH2区(例如通过并入IgG4 Fc结构域中，例如人或鼠Fc结构域，其可以在CH2和/或CH3结构域中被进一步修饰以降低效应子功能，例如第6.2.7.1节所述)。
6.2.6.具有降低的效应子功能的铰链序列
在另外的实施例中，铰链区可以被修饰以降低效应子功能，例如，如WO2016161010A2中所述，其通过引用整体并入本文。在各个实施例中，经修饰的铰链区的位置233-236是G、G、G和空置；G、G、空置和空置；G、空置、空置和空置；或全部空置，其中位置按EU编号进行编号(如WO 2016161010A2的图1所示)。这些区段可以表示GGG-、GG--、G---或----，其中“-”表示空置的位置。
位置236在经典人IgG2中是空置的，但在其它经典人IgG同种型中被占据。在所有四种人同种型中，位置233-235被除G以外的残基占据(如WO 2016161010A2的图1所示)。
位置233-236内的铰链修饰可以与被P占据的位置228组合。位置228在人IgG1和IgG2中天然被P占据，但在人IgG4中被S占据，并且在人IgG3中被R占据。IgG4抗体中的S228P突变有利于稳定IgG4抗体和减少外源性抗体和内源性抗体之间重链轻链对的交换。优选地，位置226-229分别被C、P、P和C占据。
示例性铰链区具有残基226-236，有时被称为中间(或核心)和下部铰链，其被指定为GGG-(233-236)、GG--(233-236)、G---(233-236)和无G(233-236)的经修饰的铰链序列占据。任选地，铰链结构域氨基酸序列包括CPPCPAPGGG-GPSVF(SEQ ID NO:24)(之前被公开为WO 2016161010A2的SEQ ID NO:1)、CPPCPAPGG--GPSVF(SEQ ID NO:25)(之前被公开为WO2016161010A2的SEQ ID NO:2)、CPPCPAPG---GPSVF(SEQ ID NO:26)(之前被公开为WO2016161010A2的SEQ ID NO:3)或CPPCPAP----GPSVF(SEQ ID NO:27)(之前被公开为WO2016161010A2的SEQ ID NO:4)。
上述经修饰的铰链区可以并入重链恒定区中，所述重链恒定区通常包含CH2和CH3结构域，并且其可以具有位于指定区域两侧的附加铰链区段(例如，上铰链)。存在的此类额外恒定区区段通常属于相同的同种型，优选地，人同种型，但也可以是不同同种型的杂合体。此类额外的人恒定区区段的同种型优选地是人IgG4，但也可以是人IgG1、IgG2或IgG3或其杂合体，其中结构域属于不同同种型。人IgG1、IgG2和IgG4的示例性序列显示在WO2016161010A2的图2-4中。
在具体的实施例中，经修饰的铰链序列可以连接至IgG4 CH2区(例如通过并入IgG4 Fc结构域中，例如人或鼠Fc结构域，其可以在CH2和/或CH3结构域中被进一步修饰以降低效应子功能，例如第6.2.7.1节所述)。
6.2.7.Fc结构域
本公开的ABM可以包含源自任何合适物种的Fc区。在一个实施例中，Fc区源自人Fc结构域。
Fc结构域可以源自任何合适的抗体类别，包含IgA(包含亚类lgA1和lgA2)、IgD、IgE、IgG(包含亚类lgG1、lgG2、lgG3和lgG4)以及IgM。在一个实施例中，Fc结构域源自lgG1、lgG2、lgG3或lgG4。在一个实施例中，Fc结构域源自lgG1。在一个实施例中，Fc结构域源自lgG4。
Fc区内的两个Fc结构域可以彼此相同或不同。在天然抗体中，Fc结构域通常是相同的，但为了产生抗原结合分子，例如本公开的ABM，Fc结构域可能有利地不同以允许异二聚化，如下文第6.2.7.2节所述。
在天然抗体中，IgA、IgD和IgG的重链Fc结构域由两个重链恒定结构域(CH2和CH3)构成，并且IgE和IgM的重链Fc结构域由三个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)构成。这些二聚体形成一个Fc区。
在本公开的ABM中，Fe区和/或其中的Fc结构域可以包括来自一种或多种不同类别(例如一种、两种或三种不同类别)的抗体的重链恒定结构域。
在一个实施例中，Fc区包括源自lgG1的CH2和CH3结构域。
在一个实施例中，Fc区包括源自lgG2的CH2和CH3结构域。
在一个实施例中，Fc区包括源自lgG3的CH2和CH3结构域。
在一个实施例中，Fc区包括源自lgG4的CH2和CH3结构域。
在一个实施例中，Fc区包括来自IgM的CH4结构域。IgM CH4结构域通常位于CH3结构域的C端。
在一个实施例中，Fc区包括源自IgG的CH2和CH3结构域以及源自IgM的CH4结构域。
应当理解，用于产生本公开的ABM的Fc区的重链恒定结构域可以包含上述天然存在的恒定结构域的变体。与野生型恒定结构域相比，此类变体可以包括一种或多种氨基酸变异。在一个实例中，本公开的Fc区包括至少一个在序列上不同于野生型恒定结构域的恒定结构域。应当理解，变体恒定结构域可以比野生型恒定结构域更长或更短。优选地，变体恒定结构域与野生型恒定结构域至少60％相同或类似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少70％相同或类似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少80％相同或类似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少90％相同或类似。在另一个实例中，变体恒定结构域至少95％相同或类似。
IgM和IgA作为共同H2L2抗体单元的共价多聚体天然存在于人类中。当IgM并入了J链时，其以五聚体形式出现，或者当缺少J链时，其以六聚体形式出现。IgA以单体和二聚体形式存在。IgM和IgA的重链具有18个氨基酸延伸到C端恒定结构域，被称为尾部(tailpiece)。尾部包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基在聚合物中的重链之间形成二硫键，并且被认为在聚合中具有重要作用。尾部还含有一个糖基化位点。在某些实施例中，本公开的ABM不包括尾部。
并入本公开的ABM中的Fc结构域可以包括改变蛋白质功能性质(例如，结合如FcRn或白细胞受体等Fc受体、结合补体、经修饰的二硫键结构或改变的糖基化模式)的一种或多种修饰。改变效应子功能的示例性Fc修饰在第6.2.7.1节中描述
还可以改变Fc结构域以包含改进非对称ABM的可制造性的修饰，例如通过允许异二聚化，这是不相同Fc结构域优先于相同Fc结构域的配对。异二聚化允许产生ABM，其中不同的ABS通过含有序列不同的Fc结构域的Fc区相互连接。第6.2.7.2节举例说明了异二聚化策略的实例。
应当理解，上述任何修饰可以以任何合适的方式组合以实现期望的功能性质和/或与其它修饰组合以改变ABM的性质。
6.2.7.1.具有改变的效应子功能的Fc结构域
在一些实施例中，Fc结构域包括一个或多个氨基酸取代，其降低与Fc受体的结合和/或效应子功能。
在特定实施例中，Fc受体是Fcγ受体。在一个实施例中，Fc受体是人Fc受体。在一个实施例中，Fc受体是活化的Fc受体。在具体的实施例中，Fc受体是活化的人Fcγ受体，更具体地，人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRlla，最具体地，人FcγRllla。在一个实施例中，效应子功能是选自补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和细胞因子分泌的组中的一种或多种。在特定实施例中，效应子功能是ADCC。
在一个实施例中，Fc区在选自E233、L234、L235、N297、P331和P329的组的位置处包括氨基酸取代(根据Kabat EU索引进行编号)。在更具体的实施例中，Fc区在选自L234、L235和P329的组的位置处包括氨基酸取代(根据Kabat EU索引进行编号)。在一些实施例中，Fc区包括氨基酸取代L234A和L235A(根据Kabat EU索引进行编号)。在一个此类实施例中，Fc区是Igd Fc区，具体地说，人Igd Fc区。在一个实施例中，Fc区在位置P329处包括氨基酸取代。在更具体的实施例中，氨基酸取代是P329A或P329G，具体地说，P329G(根据Kabat EU索引进行编号)。在一个实施例中，Fc区在位置P329处包括氨基酸取代并且在选自E233、L234、L235、N297和P331的位置处包括另外的氨基酸取代(根据Kabat EU索引进行编号)。在更具体的实施例中，另外的氨基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在特定实施例中，Fc区在位置P329、L234和L235处包括氨基酸取代(根据Kabat EU索引进行编号)。在更具体的实施例中，Fc区包括氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”、“PGLALA”或“LALAPG”)。
通常，相同的一个或多个氨基酸取代存在于Fc区的两个Fc结构域的每一个中。因此，在特定实施例中，Fc区的每个Fc结构域包括氨基酸取代L234A、L235A和P329G(Kabat EU索引编号)，即在Fc区的第一和第二Fc结构域中的每一个中，位置234处的亮氨酸残基被替换为丙氨酸残基(L234A)，位置235处的亮氨酸残基被替换为丙氨酸残基(L235A)，并且位置329处的脯氨酸残基被替换为甘氨酸残基(P329G)(根据Kabat EU索引进行编号)。
在一个实施例中，Fc结构域是IgG1 Fc结构域，具体地说，人IgG1 Fc结构域。在一些实施例中，IgG1 Fc结构域是变体IgG1，其包括D265A、N297A突变(EU编号)以降低效应子功能。
在另一个实施例中，Fc结构域是与Fc受体结合减少的IgG4 Fc结构域。与Fc受体结合减少的示例性IgG4 Fc结构域可以包括选自下表C的氨基酸序列。在一些实施例中，Fc结构域仅包含如下所示序列的粗体部分：
Figure BDA0003577521890000521
Figure BDA0003577521890000531
Figure BDA0003577521890000541
在特定实施例中，效应子功能降低的IgG4包括WO2014/121087的SEQ ID NO:31的氨基酸序列的粗体部分(对应于本发明的SEQ ID NO:31的氨基酸99-326)应用)，在本文中有时被称为IgG4s或hIgG4s。
对于异二聚体ABM，可以并入上述变体IgG4 Fc序列的组合，例如包括WO2014/121087的SEQ ID NO:30(或其粗体部分，对应于本申请的SEQ ID NO:30的氨基酸99-329)和WO2014/121087的SEQ ID NO:37(或其粗体部分，对应于本申请的SEQ ID NO:32的氨基酸99-329)的组合的Fc区或包括WO2014/121087的SEQ ID NO:31(或其粗体部分，对应于本申请的SEQ ID NO:31的氨基酸99-326)和WO2014/121087的SEQ ID NO:38(或其粗体部分，对应于本申请的SEQ ID NO:33的氨基酸99-326)的组合的Fc区。
6.2.7.2.Fc异源二聚化变体
许多多特异性分子形式需要两个Fc结构域之间的二聚化，与天然免疫球蛋白不同，这两个Fc结构域可操作地连接到不相同的抗原结合结构域(或其部分，例如，Fab的VH或VH-CH1)。两个Fc区的形成Fc结构域的不充分异二聚化可能是提高期望的多特异性分子产量的障碍，并代表纯化的挑战。本领域可用的多种方法可用于增强可能存在于本公开的ABM中的Fc结构域的二聚化，例如，如EP 1870459A1；美国专利第5,582,996号；美国专利第5,731,168号；美国专利第5,910,573号；美国专利第5,932,448号；美国专利第6,833,441号；美国专利第7,183,076号；美国专利申请公开号2006204493A1；以及PCT公开号W02009/089004A1中所公开的。
本公开提供了包括Fc异二聚体的ABM，即包括异源的、不相同的Fc结构域的Fc区。异二聚化策略用于增强与不同ABS可操作地连接的Fc区(或其部分，例如，Fab的VH或VH-CH1)的二聚化，并减少与相同ABS可操作地连接的Fc结构域的二聚化。通常，Fc异二聚体中的每个Fc结构域包括抗体的CH3结构域。CH3结构域源自任何同种型、类别或亚类的抗体的恒定区，优选地IgG(lgG1、lgG2、lgG3和lgG4)类别，如前面章节所述。
CH3结构域处两个不同重链的异二聚化产生期望的ABM，而相同重链的同二聚化将降低期望的ABM的产量。因此，在优选的实施例中，缔合形成本公开的ABM的两个半抗体将含有具有修饰的CH3结构域，相对于未经修饰的链，所述修饰有利于异二聚体缔合。
在具体的实施例中，所述促进Fe异二聚体形成的修饰是所谓的“旋钮入孔(knob-into-hole)”或“孔内旋钮(knob-in-hole)”修饰，包括在一个Fc结构域中的“旋钮”修饰和在另一个Fc结构域中的“孔”修饰。旋钮入孔技术描述于以下文献中：例如，美国专利第5,731,168号；US 7,695,936；Ridgway等人,1996,《蛋白质工程(Prot Eng)》9:617-621和Carter,2001,《免疫学方法(Immunol Meth)》248:7-15。通常，所述方法涉及在第一多肽的界面处引入突起(“旋钮”)和在第二多肽的界面中引入对应的空腔(“孔”)，使得突起可以定位在空腔中以便促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)替换来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链来构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或类似大小的补偿空腔。
因此，在一些实施例中，Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，从而在第一亚基的CH3结构域内产生突起，所述突起可以定位在第二亚基的CH3结构域内的空腔中，并且Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中的氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，从而在第二亚基的CH3结构域内产生空腔，第一亚基的CH3结构域内的突起可定位在所述空腔中。优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由以下组成的组：精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由以下组成的组：丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。可以通过改变编码多肽的核酸(例如通过位点特异性诱变或通过肽合成)来形成突起和空腔。示例性取代是Y470T。
在具体的此类实施例中，在第一Fc结构域中，位置366处的苏氨酸残基被替换为色氨酸残基(T366W)，并且在Fc结构域中，位置407处的酪氨酸残基被替换为缬氨酸残基(Y407V)，并且任选地，位置366处的苏氨酸残基被替换为丝氨酸残基(T366S)并且位置368处的亮氨酸残基被替换为丙氨酸残基(L368A)(根据Kabat EU索引进行编号)。在另外的实施例中，在第一Fc结构域中，位置354处的丝氨酸残基另外被替换为半胱氨酸残基(S354C)，或位置356处的谷氨酸残基被替换为半胱氨酸残基(E356C)(具体地说，位置354处的丝氨酸残基被替换为半胱氨酸残基)，并且在第二Fc结构域中，位置349处的酪氨酸残基另外被替换为半胱氨酸残基(Y349C)(根据Kabat EU索引进行编号)。在特定实施例中，第一Fc结构域包括氨基酸取代S354C和T366W，并且第二Fc结构域包括氨基酸取代Y349C、T366S、L368A和Y407V(根据Kabat EU索引进行编号)。
在一些实施例中，静电转向(例如，如Gunasekaran等人,2010,《生物化学杂志(JBiol Chem)》285(25):19637-46中所述)可用于促进Fc结构域的第一亚基和第二亚基的缔合。
作为替代，或除了使用经修饰以促进异二聚化的Fc结构域之外，可以修饰Fc结构域以允许能够选择Fc异二聚体的纯化策略。在一个此类实施例中，一个半抗体包括消除其与蛋白A的结合的经修饰的Fc结构域，从而实现产生异二聚体蛋白的纯化方法。参见例如，美国专利第8,586,713号。因此，ABM包括第一CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少一个氨基酸，并且其中与缺乏氨基酸差异的对应ABM相比，至少一个氨基酸差异降减少了ABM与蛋白A的结合。在一个实施例中，第一CH3结构域结合蛋白A，并且第二CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变/修饰，如H95R修饰(通过IMGT外显子编号；H435R，通过EU编号)。第二CH3可以进一步包括Y96F修饰(通过IMGT；Y436F，通过EU)。因此，这一类修饰在本文中被称为“星形”突变。
6.3.靶分子
本公开的ABM包括至少两个Fab结构域，Fab1和Fab2，每个结构域都特异性结合靶分子，例如小的可溶性分子。在某些实施例中，本公开的ABM进一步包括两个额外的Fab结构域，Fab3和Fab4，它们可以是结合的或非结合的。在一些实施例中，由Fab1、Fab2(以及当存在时，Fab3和Fab4的结合形式)结合的靶分子是蛋白质分子。
优选地，选择Fab1和Fab2，使得它们各自能够同时特异性地结合其相应的表位。在一些实施例中，Fab1和Fab2各自特异性地结合不同的靶分子，例如结合能够相互相互作用的一对分子(如肿瘤相关抗原和CD3)。在其它实施例中，Fab1和Fab2结合相同的靶分子，结合不同的表位或相同的表位。
据信，本公开＝的ABM特别有利于结合小分子量蛋白质，例如，分子小于100kDa、小于75kDa或小于60kDa的蛋白质(包含或不包含翻译后修饰，如糖基化)。在特定实施例中，由本公开的ABM结合的蛋白质的分子量范围为5kDa到75kDa、5kDa到60kDa、5kDa到45kDa、5kDa到30kDa、10kDa到75kDa、10kDa到60kDa、10kDa到45kDa或10kDa到30kDa，在每种情况下都包含或不包含翻译后修饰，如糖基化。
Fab1和/或Fab2可以结合的示例性靶分子包含ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRLI、ADORA2A、Aggrecan、AGR2、AICDA、AIF1、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、ART-4、B7、B7.1、B7.2、BAD、BAFF、BAGI、BAIi、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRl(MDRlS)、BlyS、BMPl、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMPS、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(凝集素)、BRCA1、Ba-733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CDI-IA、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、C19orf10(IL27w)、C3、C4A、CS、CSR1、CANT1、CASPI、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCLI(I-309)、CCLII(趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCLIS(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCLIS(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/趋化因子-2)、CCL2S(TECK)、CCL26(趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL2S、CCL3(MIP1a)、CCL4(MIP-1b)、CCLS(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCLS(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM14S)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCRS(CMKBRSI ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EB1)、CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLI(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CDlC、CD200、CD-22、CD24、CD2S、CD3S、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD44、CD4SRB、CD47、CD4S、CDS2、CD69、CD72、CD79A、CD79B、CDSO、CDS1、CDS3、CDS6、CD137、CD13S、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CDH1(E-钙粘蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDHlS、CDH19、CDH20、CDHS、CDH7、CDHS、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDKS、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSFS、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSFS、CLDN3、CLDN7(封闭素-7)、CLN3、CLU(聚簇蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COLISA1、COLIA1、COL4A3、COL6Al、CR2、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA-4、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CLI(SCYD1)、CX3CR1(V2S)、CXCLI(GRO1)、CXCLIO(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCLS(ENA-7S/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYBS、CYC1、CYSLTR1、HIF-1-a、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAB2IP、DES、DKFZp4S1J011S、DNCLI、DPP4、DAM、EGFR、EGFRvlll、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、EN01、EN02、EN03、EPHB4、EPO、EREG、ERKS、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF1S、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGFS、FGF7(KGF)、FGFS、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILI(EPSILON)、FILI(ZETA)、FLJ12SS4、FLJ2SS30、FLRT1(纤连蛋白)、FOS、FOSLI(FRA-1)、FY(DARC)、Flt-I、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GROB、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GDFS、GFil、GGTl、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPRS1(FKSGSO)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC4、HDACS、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIP1组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HUMCYT2A、HLA-DR、HMI 24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或1a、IGF-IR、IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-1、IL-10、IL-10RA、IL-10RB、IL-11、IL-11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-14、IL-1S、IL-1SRA、IL-16、IL-17、IL-17B、IL-17C、IL-17R、IL-18、IL-18BP、IL-18R1、IL-18RAP、IL-19、IL-IA、IL-1B、IL-1F10、IL-1FS、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1HY1、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAP、IL-1RAPL1、IL-1RAPL2、IL-1RL1、IL-1RL2 IL-1RN、IL-2、IL-20、IL-20RA、IL-21R、IL-22、IL-22R、IL-22RA2、IL-23、IL-24、IL-2S、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-2RA、IL-2RB、IL-2RG、IL-3、IL-30、IL-3RA、IL-4、IL-4R、IL-S、IL-5RA、IL-6、IL-6R、IL-6ST(糖蛋白130)、IL-7、IL-7R、IL-S、IL-SRA、IL-SRB、IL-9、IL-9R、IL-K、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6抗原)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b4整合素)胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4IFNAS、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNW1、JAG1、JAK1、JAK3、JUN、K6HF、KAi1、KDR、KITLG、KLFS(GC盒BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK1S、KLK3、KLK4、KLKS、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS 1-4、Le-Y、LDR/FUT、LAMAS、LEP(瘦素)、Lingo-p7S、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIB1、中期因子、MIF、MIP-2、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫蛋白-III)、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NCK2、神经能、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Noga)、NgRp7S、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOXS、NPPB、NROB1、NROB2、NR1D1、NR1D2、NRIH2、NRIH3、NRIH4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NRSA1、NRSA2、NR6A1、NRP1、NRP2、NTSE、NTN4、ODZ1、OPRD1、PCSK9、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PD-1、PD-L1、α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDFS、CGRP、Lingo-I、因子IXa、因子X、ICOS、GARP、BTLA、CD160、RORI、2B4、KIR、CD27、OX40、A2aR、PDGFA、PDGFB、PECAM1、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷聚糖、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDC1、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、10PIGF、ILGF、ILGF-IR、IL-6、RS5、RANTES、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFl10(ZNF144)、ROB02、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPINA1、SERPINA3、SERPINBS(乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STAB1、STATE、STEAP、STEAP2、TIOI、SAGE、5100、生存素、生存素-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn-抗原、ThomsonFriedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TB4R2、TBX21、TCP10、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFBlil、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLRS、TLR6、TLR7、TLRS、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSFS、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSFS、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF1S(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSFS(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSFS(CD30配体)、TNFSF9(4-lBB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TPS3、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAPS、TRAF6、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-IA抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、CS、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、CD19/CD3、BCMA/CD3、EGFR、HER3、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL1/IL-8、IL-6、IL-6R/IL-21、IL-21R、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFR-β、血管内皮生长因子(VEGF)受体2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL CS、VLA-4、c-FMS/CSFIR、RET、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、整合素、MMPs VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF、血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受体l/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、ENDOSIALIN/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-IR、IL 25 17A/F、EGF受体l/CD3和CD19/CD16、KHI、Tn-抗原、TF-抗原、CD44、糖脂、鞘糖脂，如30Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、唾液酸四糖神经酰胺、XCL1(淋巴细胞趋化素)、XCL2(SCM-1b)、XCR1(GPRS/CCXCR1)、YY1和ZFPM2。
在一些实施例中，本公开的ABM能够结合一对靶分子，例如，通过Fab1和Fab2。示例性靶分子对包含CD137和CD20、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、CD138和CD20、CDI 38和CD40、CDI 9和CD20、CD20和CD3、CD3和CD33、CD3和CD133、CD47和CD20、CD38和CD138、CD38和CD20、CD20和CD22、CD38和CD40、CD40和CD20、CD-8和IL-6、CSPGs和RGM A、CTLA-4和BTN02、IGF1和IGF2、IGF1/2和Erb2B、IGF-1R和EGFR、EGFR和CD13、IGF-1R和ErbB3、EGFR-2和IGFR、VEGFR-2和Met、VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)、IL-12和TWEAK、IL-13和IL-1β、PDGFR和VEGF、EpCAM和CD3、Her2和CD3、CD19和CD3、EGFR和Her3、CD16a和CD30、CD30和PSMA、EGFR和CD3、CEA和CD3、TROP-2和HSG、TROP-2和CD3、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、RGMA和RGM B、Te38和TNFa、TNFa和Blys、TNFa和CD-22、TNFa和CTLA-4结构域、TNFa和GP130、TNFa和IL-12p40以及TNFa和RANK配体。
在一些实施例中，本公开的ABM能够结合一种或多种细胞因子、细胞因子相关蛋白和/或细胞因子受体，例如一个或一对细胞因子、细胞因子相关蛋白和/或细胞因子受体，例如，通过Fab1和Fab2。示例性细胞因子、细胞因子相关蛋白和/或细胞因子受体包含BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FILI、FILI(EPSILON)、FILI(ZETA)、ILIA、ILIB、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、ILIO、ILi1、ILI2A、ILI2B、ILI3、ILI4、ILI5、ILI6、ILI7、ILI7B、ILI8、ILI9、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、FGER1、FGFR2、FGFR3、EGFR、RORI、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、A2aR、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、CD40、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、ILIR1、ILIR2、ILIRLI、ILIRL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL 7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、ILIORA、ILIORB、IL11RA、ILI2RB1、ILI2RB2、ILI3RA1、ILI3RA2、ILI5RA、ILI7R、ILI8R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、ILIRAP、ILIRAPLI、ILIRAPL2、ILIRN、IL6ST、ILI8BP、ILI8RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN和THPO。
在一些实施例中，本公开的ABM能够结合一种或多种趋化因子、趋化因子相关蛋白和/或趋化因子受体，例如一个或一对趋化因子、趋化因子相关蛋白和/或趋化因子受体，例如，通过Fab1和Fab2。示例性趋化因子、趋化因子相关蛋白和趋化因子受体包含CCLI(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCLII(趋化因子)、CCLI3(MCP-4)、CCLI5(MIP-1d)、CCLI 6(HCC-4)、CCLI 7(TARC)、CCLI 8(PARC)、CCLI9(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GRO1)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCLIO(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化素)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCRS(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSGSO)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、ILSRA(IL8Ra)、ILSRB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSFS、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、ILS、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在一些实施例中，本公开的ABM能够结合一对细胞因子、细胞因子受体和/或细胞因子相关蛋白。示例性细胞因子对包含IL-1a和IL-Ιβ、IL-12和IL-18、TNFa和IL-23、TNFa和IL-13、TNF和IL-18、TNF和IL-12、TNF和IL-1β、TNF和MIF、TNF和IL-6、TNF和IL-6受体、TNF和IL-17、IL-17和IL-20、IL-17和IL-23、TNF和IL-15、TNF和VEGF、VEGFR和EGFR、PDGFR和VEGF、IL-13和IL-9、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-25、IL-13和TARC、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-13和TGF-β、IL-13和LHR激动剂、IL-13和CL25、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和ADAM 8以及TNFa和PGE4、IL-13和PED2以及TNF和PEG2。
在一些实施例中，本公开的ABM能够结合单个细胞因子、细胞因子受体或细胞因子相关蛋白上的至少两个表位。示例性细胞因子包含TSLP、IL-1a、IL-Ιβ、IL-12、IL-18、TNFa、IL-23、IL-13、MIF、IL-6、IL-6受体、IL-17、IL-20、IL-15、VEGF、VEGFR、EGFR、PDGFR、IL-9、IL-4、IL-5、IL-25、TARC、MDC、TGF-β、LHR激动剂、CL25、SPRR2a、SPRR2b、ADAM 8、PGE4、PED2和PEG2。
在一些实施例中，本公开的ABM能够以与常规形式的抗体或抗体片段类似或更大的亲和力结合其抗原靶标。
在一些实施例中，本公开的ABM具有针对其靶分子的激动剂功能。在其它实施例中，本公开的ABM具有针对其抗原或靶分子的阻断和/或拮抗功能。
在某些方面，相对于亲本抗体(或亲本抗体对)，如相对于ABM的Fa所源自的亲本IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体，本公开的ABM具有与其抗原或靶分子类似或更低的IC50，例如，相对于常规IgG形式具有类似或更低的IC50。
在一些实施例中，本公开的ABM对于单个配体是双特异性的，并且相对于一种或多种亲本抗体以更高水平形成1:1配体复合物。
当Fab1和Fab2结合同一靶分子上的不同表位时，与靶分子的结合优选地是非竞争性的，即Fab1和Fab2不竞争结合靶分子(例如，如果表位重叠，则这可能会发生)。用于测量抗体和抗体片段之间的结合竞争的测定在本领域中是已知的，并且包含例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光活化细胞分选(FACS)测定和表面等离子共振测定。
例如，可以使用Octet HTX生物传感器平台(Pall ForteBio公司)上的实时、无标记生物层干涉测定来确定与靶分子结合的竞争。在该测定的具体实施例中，整个测定在25℃下在10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、1mg/mL BSA、0.05％v/v表面活性剂Tween-20，pH 7.4的缓冲液(HBS-EBT缓冲液)中进行，以1000rpm的速度摇动板。为了评估两种抗体或其抗原结合片段是否能够相互竞争以结合其特异性靶抗原上的相应表位，通过将生物传感器尖端浸入含有五-His标记的靶抗原(“五-His”被公开为SEQ ID NO:34)的孔，首先将五-His标记的靶抗原(“五-His”被公开为SEQ ID NO:34)捕获到抗五-His抗体(“五-His”被公开为SEQ ID NO:34)包被的Octet生物传感器尖端(Fortebio公司，#18-5122)。然后通过浸入含有第一抗体或其抗原结合片段(随后被称为Ab-1)的溶液(例如，50μg/mL溶液)的孔中，用Ab-1使捕获的抗原生物传感器尖端饱和。随后将生物传感器尖端浸入含有第二抗体或其抗原结合片段(随后被称为Ab-2)的溶液(例如，50μg/mL溶液)的孔中。在测定的每一步之间将生物传感器的尖端在HBS-EBT缓冲液中清洗。可以在整个测定过程期间监测实时结合反应，并且可以记录每个步骤结束时的结合反应。可以比较Ab-2与用Ab-1预先复合的靶抗原结合的反应，并且可以确定不同抗体/抗原结合片段针对相同靶抗原的竞争性/非竞争性行为。
在各个实施例中：
·ABM(例如，A型ABM或B型ABM)不包含Fab3和Fab4，并且Fab1和Fab2与同一靶分子上的相同或不同表位结合；
·ABM(例如，A型ABM或B型ABM)不包含Fab3和Fab4，并且Fab1和Fab2结合不同的靶分子；
·ABM(例如，C型ABM)包含非结合的Fab3和非结合的Fab4，并且Fab1和Fab2与同一靶分子上的相同或不同表位结合；
·ABM(例如，C型ABM)包含非结合的Fab3和非结合的Fab4，并且Fab1和Fab2结合不同的靶分子；
·ABM(例如，C型ABM)包含结合的Fab3和结合的Fab4，并且Fab1和Fab2结合相同的表位，而Fab3和Fab4结合与Fab1和Fab2所结合的表位不同的相同表位，无论是在与Fab1和Fab2所结合的靶分子相同的靶分子上还是在不同的靶分子上；
·ABM(例如，C型ABM)包含结合的Fab3和结合的Fab4，并且Fab1和Fab3结合相同的表位，而Fab2和Fab4结合与Fab1和Fab3所结合的表位不同的相同表位，无论是在与Fab1和Fab3所结合的靶分子相同的靶分子上还是在不同的靶分子上。
当Fab1、Fab2、Fab3和Fab4中的两个或更多个结合靶分子上的相同表位时，这样的Fab结构域可以具有相同或不同的重链CDR序列和/或相同或不同的VH序列。任选地，它们可以具有相同或不同的VL序列。
不受理论束缚，据信，与具有天然构型的亲本单特异性抗体或双特异性抗体相比，本公开的ABM具有以更大亲和力结合靶分子的优点。因此，在一些实施例中，与具有天然构型的亲本单特异性抗体或双特异性抗体相比，本公开的ABM可以以更大的亲和力结合一个或多个靶分子。例如，在一些实施例中，与对应的亲本单特异性抗体或双特异性抗体相比，ABM可以在基于细胞的结合测定中具有较低的与靶分子结合的KD和/或具有更强的EC50值(例如，如第7节中所述)。
给定抗体或ABM的激动剂或拮抗剂活性取决于靶标选择、表位覆盖和形式选择。例如，可以通过基于功能的筛选来实现对激动和拮抗抗体的鉴定。本公开的ABM形式特别有利于针对小的可溶性分子的拮抗剂活性。
6.4.抗体药物缀合物
本公开的ABM可以例如通过接头缀合至药物部分，特别是在ABM旨在用作癌症治疗剂的情况下。为方便起见，此类缀合物在本文中被称为抗体-药物缀合物(或“ADC”)。
在某些方面，药物部分发挥细胞毒性或细胞抑制活性。在一个实施例中，药物部分选自美登素(maytansinoid)、驱动蛋白样蛋白KIF11抑制剂、V-ATP酶(液泡型H+-ATP酶)抑制剂、促凋亡剂、Bcl2(B细胞淋巴瘤2)抑制剂、MCL1(髓细胞白血病1)抑制剂、HSP90(热休克蛋白90)抑制剂、IAP(凋亡抑制剂)抑制剂、mTOR(雷帕霉素机械靶点)抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、奥瑞他汀、多拉司他汀、MetAP(蛋氨酸氨基肽酶)、CRM1(染色体维持1)抑制剂、DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酸转移反应的抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2(细胞周期蛋白依赖性激酶2)抑制剂、CDK9(细胞周期蛋白依赖性激酶9)抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟粘合剂、RNA聚合酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DHFR(二氢叶酸还原酶)抑制剂。
在一些实施例中，细胞毒性剂是具有以下结构的美登素：
Figure BDA0003577521890000691
在一些实施例中，细胞毒性剂是具有以下结构的美登素：
Figure BDA0003577521890000692
在一些实施例中，ADC包括本公开的ABM和
Figure BDA0003577521890000701
其中
Figure BDA0003577521890000702
是与ABM的键。
在一些实施例中，抗体-药物缀合物包括本公开的ABM，和
Figure BDA0003577521890000703
其中
Figure BDA0003577521890000704
是与ABM的键。
在一些实施例中，ADC包括本公开的ABM和
Figure BDA0003577521890000705
其混合物，
其中
Figure BDA0003577521890000706
是与本公开的ABM的键。
在一些实施例中，该键通过半胱氨酸残基的硫成分与ABM连接。
在一些实施例中，该键通过赖氨酸残基的氮成分与ABM连接。
在本公开的ADC中，细胞毒性剂和/或细胞抑制剂通过ADC接头与ABM连接。将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂连接到ADC的ABM的ADC接头可以是短的、长的、疏水的、亲水的、柔性的或刚性的，或者可以由各自独立地具有一种或多种上述性质的区段构成，使得接头可以包含具有不同性质的区段。接头可以是多价的，使得它们将多于一种药剂共价连接到ABM上的单个位点，或者是单价的，使得它们将单个药剂共价连接到ABM上的单个位点。
在某些方面，接头选自可切割接头、不可切割接头、亲水接头、前部带电接头或基于二羧酸的接头。
如本领域技术人员将理解的，ADC接头通过在一个位置形成与细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的共价键以及在另一位置形成与ABM的共价键而将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与ABM连接。共价键是通过ADC接头上的官能团与药剂和ABM上的官能团之间的反应形成的。
ADC接头优选地但不必对细胞外条件化学稳定，并且可以被设计成在细胞内切割、献祭和/或以其它方式特异性地降解。可替代地，可以使用并非设计用于在细胞内特异性切割或降解的ADC接头。稳定与不稳定ADC接头的选择可能取决于细胞毒性剂和/或细胞抑制剂的毒性。对于对正常细胞有毒的药剂，优选稳定的接头。可以使用具有选择性或靶向且对正常细胞具有较低毒性的药剂，ADC接头与细胞外环境的化学稳定性不太重要。在ADC的情况下，可用于将药物与ABM连接的多种ADC接头是本领域已知的。任何这些ADC接头，以及其它ADC接头，可用于将细胞毒性剂和/或细胞抑制剂与本公开的ADC的ABM连接。
可用于将许多细胞毒性剂和/或细胞抑制剂连接至单个ABM分子的示例性多价ADC接头描述于以下文献中：例如，WO 2009/073445；WO 2010/068795；WO 2010/138719；WO2011/120053；WO 2011/171020；WO 2013/096901；WO 2014/008375；WO 2014/093379；WO2014/093394；WO 2014/093640，其内容通过引用整体并入本文。例如，由Mersana等人开发的Fleximer接头技术有可能实现具有良好物理化学性质的高-DAR ADC。Mersana技术基于通过一系列酯键将药物分子并入增溶性聚缩醛主链中。该方法可呈现高负载ADC(DAR高达20)，同时保持良好的物理化学性质。
可以使用的示例性单价ADC接头描述于以下文献中：例如，Nolting,2013,“抗体-药物缀合物(Antibody-Drug Conjugates”,《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》1045:71-100；Ducry等人,2010,《生物缀合化学(Bioconjugate Chem.)》21:5-13；Zhao等人,2011,《药物化学杂志(J.Med.Chem.)》54:3606-3623；美国专利第7,223,837号；美国专利第8,568,728号；美国专利第8,535,678号；和W02004010957，所述文献中的每一个通过引用并入本文。
作为实例而非限制，下文描述了可以包含在本公开的ADC中的一些可切割和不可切割的ADC接头。
在某些实施例中，所选择的ADC接头在体内是可切割的。可切割的ADC接头可能包含化学或酶不稳定或可降解的键。可切割的ADC接头通常依赖于细胞内的过程来释放药物，如细胞质的减少、溶酶体中的酸性条件暴露或细胞内特定蛋白酶或其它酶的切割。可切割的ADC接头通常并入一个或多个化学键，这些化学键可以进行化学或酶促切割，而ADC接头的其余部分是不可切割的。在某些实施例中，ADC接头包括化学不稳定基团，如腙和/或二硫基。包括化学不稳定基团的接头利用血浆和一些细胞质区室之间的差异性质。促进含有腙的ADC接头的药物释放的细胞内条件是内体和溶酶体的酸性环境，而含有二硫化物的ADC接头在含有高硫醇浓度的胞质溶胶(例如谷胱甘肽)中被还原。在某些实施例中，可以通过使用化学不稳定基团附近的取代基引入空间位阻来增加包括化学不稳定基团的ADC接头的等离子体稳定性。
可切割的ADC接头可以包含不可切割的部分或区段，和/或可切割的区段或部分可以包含在其它不可切割的ADC接头中以使其可切割。仅举例来说，聚乙二醇(PEG)和相关聚合物可以在聚合物主链中包含可切割基团。例如，聚乙二醇或聚合物ADC接头可以包含一个或多个可切割基团，如二硫化物、腙或二肽。
可以包含在ADC接头中的其它可降解的键包含由PEG羧酸或活化的PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应形成的酯键，其中此类酯基通常在生理条件下水解以释放生物活性剂。可水解降解的键包含但不限于碳酸酯键；由胺和醛反应产生的亚胺键；通过醇与磷酸基反应形成的磷酸酯键；作为醛和醇的反应产物的缩醛键；作为甲酸酯和醇的反应产物的原酸酯键；以及由亚磷酰胺基团(包含但不限于在聚合物末端)和寡核苷酸的5'羟基形成的寡核苷酸键。
在某些实施例中，ADC接头包括酶可切割的肽部分，例如三肽或二肽。在特定实施例中，所述二肽选自：Val-Cit；Cit-Val；Ala-Ala；Ala-Cit；Cit-Ala；Asn-Cit；Cit-Asn；Cit-Cit；Val-Glu；Glu-Val；Ser-Cit；Cit-Ser；Lys-Cit；Cit-Lys；Asp-Cit；Cit-Asp；Ala-Val；Val-Ala；Phe-Lys；Val-Lys；Ala-Lys；Phe-Cit；Leu-Cit；lle-Cit；Phe-Arg；和Trp-Cit。在某些实施例中，所述二肽选自：Cit-Val；和Ala-Val。
在上文或本文所讨论的ADC的任何各种实施例中，ADC的药物:抗体比率(或者，在此实例中，药物:ABM比率)可以为1到20，更典型地在2到10的范围内。
6.5.核酸和宿主细胞
在另一方面，本公开提供了编码本公开的ABM的核酸。在一些实施例中，ABM由单个核酸编码。在其它实施例中，ABM由多种(例如，两种、三种、四种或更多种)核酸编码。
单个核酸可以编码包括单个多肽链的ABM、包括两个或更多个多肽链的ABM或包括多于两个多肽链的ABM的一部分(例如，单个核酸可以编码包括三个、四个或更多个多肽链的ABM的两个多肽链，或包括四个或更多个多肽链的ABM的三个多肽链)。对于表达的单独控制，编码两个或更多个多肽链的开放阅读框可以在单独的转录调控元件(例如，启动子和/或增强子)的控制下。编码两个或更多个多肽的开放阅读框也可以由相同的转录调控元件控制，由内部核糖体进入位点(IRES)序列隔开，从而允许翻译成单独的多肽。
在一些实施例中，包括两个或更多个多肽链的ABM由两个或更多个核酸编码。编码ABM的核酸的数量可以等于或小于ABM中多肽链的数量(例如，当多于一个多肽链由单个核酸编码时)。
本公开的核酸可以是DNA或RNA(例如，mRNA)。
在另一方面，本公开提供了含有本公开的核酸的宿主细胞和载体。核酸可以在相同宿主细胞或单独宿主细胞中存在于单个载体或单独载体中，如下文更详细描述的。
6.5.1.载体
本公开提供了包括编码本文描述的ABM或ABM组分(例如半抗体的多肽链中的一个或两个)的核苷酸序列的载体。载体包含但不限于病毒、质粒、粘粒、λ噬菌体或酵母人工染色体(YAC)。
可以使用多种载体系统。例如，一类载体利用源自动物病毒，如例如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(劳氏肉瘤病毒(Rous SarcomaVirus)、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的DNA元件。另一类载体利用源自RNA病毒，如塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)、东方马脑炎病毒(Eastern Equine Encephalitisvirus)和黄病毒(Flaviviruses)的RNA元件。
此外，可以通过引入一种或多种允许选择经转染的宿主细胞的标志物来选择已将DNA稳定整合到其染色体中的细胞。例如，标志物可以为营养缺陷型宿主提供原性、杀生物剂抗性(例如，抗生素)或对如铜等重金属的抗性。可选择的标志物基因可以直接连接到待表达的DNA序列上，也可以通过共转化导入同一细胞中。mRNA的最佳合成可能还需要额外的元件。这些元件可能包含剪接信号，以及转录启动子、增强子和终止信号。
一旦已经制备了表达载体或含有构建体的DNA序列用于表达，就可以将表达载体转染或引入合适的宿主细胞中。可以采用各种技术来实现这一点，如例如原生质体融合、磷酸钙沉淀、电穿孔、逆转录病毒转导、病毒转染、基因枪、基于脂质的转染或其它常规技术。用于培养所得转染细胞和回收所表达多肽的方法和条件是本领域技术人员已知的，并且可以根据本说明书根据所使用的特定表达载体和哺乳动物宿主细胞而变化或优化。
6.5.2.细胞
本公开还提供了包括本公开的核酸的宿主细胞。
在一个实施例中，宿主细胞经基因工程改造以包括本文所述的一种或多种核酸。
在一个实施例中，宿主细胞是通过使用表达盒进行基因工程改造的。短语“表达盒”是指能够影响基因在与核苷酸序列相容的宿主中的表达的此类序列。这样的盒可以包含启动子、带有或不带有内含子的开放阅读框和终止信号。也可以使用在影响表达中必需或有帮助的附加因子，如例如诱导型启动子。
本公开还提供了包括本文所述的载体的宿主细胞。
细胞可以是但不限于真核细胞、细菌细胞、昆虫细胞或人类细胞。合适的真核细胞包含但不限于Vero细胞、HeLa细胞、COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、BHK细胞和MDCKII细胞。合适的昆虫细胞包含但不限于Sf9细胞。
6.6.药物组合物
本公开的ABM和/或ADC可以呈组合物的形式，所述组合物包括ABM和/或ADC和一种或多种载体、赋形剂和/或稀释剂，其任选地与提供改进的转移、递送、耐受性等的一种或多种其它药剂一起使用。组合物可以被配制用于特定用途，如用于人的药物用途或兽医用途。组合物的形式(例如，干粉、液体调配物等)和所使用的赋形剂、稀释剂和/或载体将取决于ABM和/或ADC的预期用途，并且对于治疗用途，将取决于施用模式。
施用于患者的抗原结合分子(如单特异性抗原结合分子或双特异性抗原结合分子)的剂量可以根据患者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。通常根据体重或体表面积计算优选的剂量。当本公开的双特异性抗原结合分子出于治疗目的用于成年患者中时，可能有利的是，通常以约0.01到约20mg/kg体重、更优选地约0.02到约7mg/kg体重、约0.03到约5mg/kg体重或约0.05到约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本公开的抗原结合分子。根据病状的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。可以凭经验确定用于施用抗原结合分子的有效剂量和时间表；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并且相应地调整剂量。此外，剂量的种间缩放可以使用本领域熟知的方法进行(例如，Mordenti等人,1991,《药学研究(Pharmaceut.Res.)》8:1351)。
对于治疗用途，组合物可以作为包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。所述组合物可以呈任何合适的形式(取决于将其施用于患者的期望方法)。药物组合物可以通过多种途径施用于患者，如口服、经皮、皮下、鼻内、静脉内、肌内、瘤内、鞘内、局部地或区域性地。在任何给定情况下，最合适的施用途径将取决于特定的抗体和/或ADC、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，药物组合物将通过静脉内或皮下施用。
药物组合物可以方便地以单位剂型存在，所述单位剂型含有预定量的本公开的ABM和/或ADC。包含在单位剂量中的ABM和/或ADC的量将取决于所治疗的疾病以及本领域众所周知的其它因素。这样的单位剂量可以呈含有适合单次施用的一定量的ABM和/或ADC的冻干干粉形式，或者呈液体形式。干粉单位剂型可以与注射器、适量的稀释剂和/或可用于施用的其它组分一起包装在试剂盒中。液体形式的单位剂量可以方便地以注射器的形式提供，所述注射器预填充有适合单次施用的一定量的ABM和/或ADC。
药物组合物也可以从含有适合多次施用的量的ADC中批量供应。
可以通过将具有期望纯度的ABM和/或ADC与本领域通常使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些都是在本文中被称为“载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和其它杂项添加剂混合来制备药物组合物以作为冻干调配物或水溶液储存。参见《雷明登氏制药科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》,第16版(Osol编辑,1980)。这种添加剂在所采用的剂量和浓度下对接受者应该是无毒的。
缓冲剂有助于将pH维持在接近生理条件的范围内。它们可以以多种浓度存在，但通常以约2mM到约50mM范围内的浓度存在。适用于本公开的缓冲剂包含有机酸和无机酸及其盐，如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸一钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸一钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸一钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸一钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐，如Tris。
可以添加防腐剂以减缓微生物生长，并且所述防腐剂可以以约0.2％-1％(w/v)的量添加。适用于本公开的防腐剂包含苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎氯铵(例如，氯化物、溴化物和碘化物)、六甲基氯化铵和对羟基苯甲酸烷基酯(如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。可以添加有时被称为“稳定剂”的等渗剂以确保本公开的液体组合物的等渗性，并且所述等渗剂包含多元糖醇，例如三元或更高级糖醇，如甘油、赤藓糖醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。稳定剂是指广泛类别的赋形剂，在功能上，其范围可以从填充剂到溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上面列举的)；氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等)、有机糖或糖醇(如乳糖、海藻糖、水苏糖，甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等)，包含环醇，如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个或更少残基的肽)；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖，如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，如乳糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖；和三糖，如棉子糖；以及多糖，如葡聚糖。稳定剂可以以每重量ADC 0.5到10wt％的量存在。
可以添加非离子表面活性剂或去污剂(也被称为“润湿剂”)来帮助溶解糖蛋白以及保护糖蛋白免受搅动引起的聚集，这也允许调配物暴露于剪切表面应力而不引起蛋白质的变性。合适的非离子表面活性剂包含聚山梨醇酯(20、80等)、聚氧杂异构体(184、188等)和普朗尼克多元醇(pluronic polyol)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/mL到约1.0mg/mL，例如约0.07mg/mL到约0.2mg/mL的范围存在。
其它杂项赋形剂包含填充剂(例如，淀粉)、螯合剂(例如，EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和助溶剂。
6.7.治疗适应证
本公开的ABM、ADC和药物组合物可用于治疗与被本公开的ABM结合的抗原或靶分子相关的病状，例如与抗原或靶分子或表达所述抗原或靶分子的异常细胞或组织的异常表达或活性相关的病状。本公开的ABM、ADC和药物组合物可以施用于有需要的受试者，例如，表现出与ABM所结合的抗原或靶分子的异常表达或活性相关的一种或多种病状的症状或标志的人或非人动物。
在一些实施例中，施用本公开的ABM、ADC或药物组合物以治疗其中需要刺激、活化和/或靶向抗原或靶分子的任何疾病或病症。在特定实施例中，本发明的ABM可用于治疗、预防和/或改善与抗原或靶分子的表达或活性相关或由其介导的任何疾病或病症。
本公开的ABM可以通过含有结合胸腺基质淋巴细胞生成素(“TSLP”)(例如，人TSLP)的多个Fab结构域(例如，Fab1和/或Fab2)之一的ABM来举例说明。TSLP是一种免疫细胞因子，其诱导具有前同种异体表型的树突状细胞介导的CD4+T细胞反应(Gilliet等人,2003,《实验医学杂志(J.Exp.Medicine)》197(8):1059-1063)。TSLP参与过敏性炎症的引发(Watanabe等人,2004,《自然免疫学(Nature Immunology)》5:426-434)。TSLP作用于多种细胞类型(例如，树突状细胞、CD4+T细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和2型先天淋巴细胞(ILC2)(Mjosberg等人,2012,《免疫(Immunity)》37(4):649-59)，以驱动炎症，具体地说，2型炎症(以产生细胞因子IL-5、IL-13和IL-4为特征)。2型炎症是哮喘和其它过敏性疾病(如特应性皮炎和Netherton综合征)的特征。已发现TSLP在动物中诱导成纤维细胞积聚和胶原蛋白沉积，这证明其在促进纤维化病症中具有额外的作用。
因此，作为TSLP拮抗剂的ABM可用于治疗炎症，具体地说，过敏性炎症，以及纤维化病症。与TSLP(单特异性或双特异性)结合的ABM可用于治疗有需要的受试者(例如人类受试者)中与TSLP信号传导相关的病状。与TSLP信号传导相关的示例性病状包含哮喘、特发性肺纤维化、特应性皮炎、过敏性结膜炎、过敏性鼻炎、Netherton综合征、嗜酸性食管炎(EoE)、食物过敏、过敏性腹泻、嗜酸性肠胃炎、过敏性支气管肺曲霉病(ABPA)、过敏性真菌性鼻窦炎、癌症、类风湿性关节炎、COPD、系统性硬化症、瘢痕疙瘩、溃疡性结肠炎、慢性鼻窦炎(CRS)、鼻息肉、慢性嗜酸性粒细胞性肺炎、嗜酸性支气管炎、乳糜泻、Churg-Strauss综合征、嗜酸性肌痛综合征、嗜酸性粒细胞增多综合征、嗜酸性肉芽肿伴多血管炎和炎症性肠病。
7.实例
7.1.实例1：替代形式抗原结合分子的构建
选择非竞争性亲本mAb用于构建用于人TSLP的替代形式双特异性ABM，所述人TSLP是一种属于细胞因子家族并具有约15-18kDa的分子量(取决于糖基化状态)的蛋白质。这些亲本mAb共享共同轻链。所有异二聚体双特异性ABM均在Fc区中构建有“旋钮入孔”突变以促进Fc异二聚体形成(Merchant等人,1998,《自然生物技术》16:677-681)。对于Fc-Fab形式(图1B和图2B)，通过使用(G4S)n接头将VH-CH1片段连接到Fc的C端末端来构建重链(G4S被公开为SEQ ID NO:3)，n＝1-6。在钳型形式(图3B)中，内部Fab片段是惰性的并且不与TSLP结合。该惰性Fab片段被替换为延伸型形式的柔性长(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ ID NO:3)，n＝6-8(图3A)。在2+2串联Fab形式中，所有四个Fab片段都是功能性的并且可以与抗原结合(图3C-3D)。钳型和2+2串联Fab形式的Fab片段之间的短接头是2xG4S(SEQ ID NO:18)或3xG4S(SEQ ID NO:4)。
类似地，选择非竞争性亲本mAb用于构建人配体X的双特异性Fc-Fab。这些亲本抗配体X mAb共享共同轻链。
对于细胞表面靶标，使用共享双特异性Fc-Fab的共同轻链的Fab片段，并使用具有降低的效应子功能的hIgG4(示出为hIgG4s)(US9359437B2)或hIgG1的恒定区，以类似方式构建Fc-Fab。
使用人IgG4恒定区的所有抗体在铰链区都含有S228P(EU)取代，以是半抗体形成最小化(Labrijn等人,2009,《自然生物技术》27:767-771)。
7.2.实例2：抗原结合分子的表达
将所有替代形式的双特异性ABM通过瞬时转染在Expi293F细胞(赛默飞世尔科技公司)中表达。使用带有HiTrap rProteinA FF柱(GE Healthcare)的ProteinMaker系统(马里兰州盖瑟斯堡市蛋白质生物解决方案公司(Protein BioSolutions,Gaithersburg,MD))对Expi293F上清液中的ABM进行纯化。在单步洗脱后，将ABM中和，透析成含有5％甘油的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的最终缓冲液，分装并储存在-80℃下。
7.3.实例3：抗hTSLP双特异性ABM在生物测定中的活性
对纯化的抗hTSLP双特异性ABM在荧光素酶报告基因测定中抑制hTSLP活性的能力进行了评估。将稳定表达hIL-7R、hTSLPR和STAT3-荧光素酶报告基因的Baf3细胞以40,000个细胞/孔接种于不含IL-3的培养基中并孵育过夜。对于hTSLP剂量反应曲线，将1:3连续稀释的hTSLP添加到每个孔中，hTSLP的最终浓度从10nM开始(图4A)。为了确定抗hTSLP ABM的阻断活性，使用“Race形式”阻断测定，在所述测定中，ABM和hTSLP被同时添加到报告细胞中。抗hTSLP ABM以1:3连续稀释，每种抗体的最终浓度从100nM开始。将人TSLP添加至TSLP剂量反应曲线的大约EC50处的恒定浓度。孵育5.5小时后，将板在室温下平衡15分钟。将100μl的One-Glo底物(Promega)添加到每个孔中。在室温下孵育5分钟后，在Envision上测量发光。在STAT3-萤光素酶报告基因测定中，三种非竞争性抗hTSLP亲本抗体30206、30217和30230的活性显示在图4B中。测试了使用这些亲本mAb的三个双特异性配对。常规hIgG4双特异性抗体显示出与对应的亲本抗体组合类似的阻断活性(图5)。对于每个双特异性配对，所有替代形式的双特异性ABM都显示出比常规hIgG4双特异性抗体更好的阻断活性(图6A-6C)。总的来说，对于所有测试的双特异性配对，最好的形式是Fc-Fab(具有图13A中所示的铰链构型)和2+2串联Fab_异二聚体。这些ABM的IC50值总结在表5-1中。
Figure BDA0003577521890000811
Figure BDA0003577521890000821
7.4.实例4：通过耦接到多角度光散射(A4F-MALLS)的非对称流场-流分级对抗hTSLP双特异性抗体和重组hTSLP之间形成的体外复合物进行大小分析
7.4.1.概述
使用耦接到多角度光散射(A4F-MALLS)的非对称流场-流分级对在表5-2中鉴定的以下抗TSLP ABM和重组hTSLP(REGN4009)之间形成的体外复合物进行大小分析：抗TSLP亲本Ab 30206hIgG4、抗TSLP亲本Ab 30217hIgG4、抗TSLP亲本Ab 30230hIgG4、Fc-Fab_30206x30217-2xG4S(“2xG4S”被公开为SEQ ID NO:18)、Fc-Fab_30217x30230-2xG4S(“2xG4S”被公开为SEQ ID NO:18)、钳型_30206x30217、钳型_30217x30230、2+2串联Fab_het(异)_30206x30217和2+2串联Fab_het(异)_30217x30230。在该研究中，Fc-Fab ABM具有图13A所示的铰链形式。
7.4.2.材料与方法
7.4.2.1.分子
下面的表5-2列出了通过A4F-MALLS分析的分子及其替代名称。
Figure BDA0003577521890000831
7.4.2.2.A4F-MALLS流动相缓冲液
通过混合1.4g磷酸二氢钠一水合物、10.7g磷酸氢二钠七水合物和500mL5M氯化钠来制备流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH 7.0±0.1)；然后用HPLC级水将溶液定容至5.0L。缓冲液的最终测量pH为7.0。在使用前过滤流动相缓冲液(0.2μm)。
7.4.2.3.AF-MALLS
A4F-MALLS系统由EclipseTM3+A4F分离系统构成，所述分离系统与配备有紫外(UV)二极管阵列检测器、Wyatt Technology Dawn
Figure BDA0003577521890000832
II激光散射仪(LS)和
Figure BDA0003577521890000833
T-rEX差示折射仪(RI)检测器的安捷伦1200系列HPLC系统耦接。检测器按以下顺序串联：UV-LS-RI。LS和RI检测器根据Wyatt Technology提供的说明进行校准。
将确定量的抗TSLP mAb各自与REGN4009(重组TSLP)组合并在1X DPBS(pH 7.4)中稀释，以产生等摩尔比:1μM抗TSLP mAb:1μM hTSLP。将每种亲本mAb的等摩尔组合制备为组合储备溶液，然后将每种组合储备溶液与等摩尔量的hTSLP混合，以产生0.5μM mAb1+0.5μMmAb2+1μM hTSLP的最终溶液浓度。将所有样品在环境温度下孵育2小时并在4℃下保持未过滤，然后注入配备有W350间隔箔(350μm间隔厚度，2.2cm间隔宽度)并使用10kDa MWCO再生纤维素膜的EclipseTM短通道中。在注入每个样品之前，使用流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH 7.0±0.1)对通道进行预平衡。将牛血清白蛋白(BSA；2mg/mL；10μg上样量)单独注射，并包含为系统适用性对照。
分级分离方法由四个步骤组成：注射、聚焦、洗脱和通道“冲洗”步骤。在整个分级分离方法中使用A4F-MALLS流动相缓冲液(10mM磷酸钠、500mM氯化钠、pH 7.0±0.1)。将每个样品(7μg)以0.2毫升/分钟的流速注入，持续1分钟，随后以1.0毫升/分钟的聚焦流速聚焦3分钟。将样品以1.0毫升/分钟的通道流速洗脱15分钟，其中恒定交叉流为3.0毫升/分钟，然后在5分钟内用3.0毫升/分钟到0毫升/分钟的线性梯度交叉流进行洗脱。最后，将交叉流保持在0毫升/分钟，持续额外5分钟，以冲洗通道。使用相同的参数设置对BSA进行分级。
7.4.2.4.MALLS数据分析
使用ASTRA V软件(版本5.3.4.14，Wyatt Technology)分析数据。将数据拟合到将过量散射光与溶质浓度和重均摩尔质量Mw相关联的等式(Kendrick等人,2001,《分析生物化学(Anal Biochem.)》,299(2):136-46；Wyatt,1993,《分析化学(Anal.Chim.Acta)》272(1):1-40)：
等式1：
Figure BDA0003577521890000841
其中c是溶质浓度，R(θ,c)是溶质的过量罗利比(Raleigh ratio)，作为散射角和浓度的函数，Mw是摩尔质量，P(θ)描述散射光的角度依赖性(对于回转半径<50nm的粒子为～1)，A2是渗透压膨胀的第二维里系数(可以忽略，因为测量是在稀溶液上进行的)以及
等式2：
Figure BDA0003577521890000851
其中n0代表溶剂折射率，NA是阿伏伽德罗数(Avogadro's number)，λ0是真空中入射光的波长，并且dn/dc代表溶质的特定折射率增量。
BSA单体的摩尔质量用于评估数据收集期间光散射和差示折射率检测器的校准常数(系统适用性检查)。从UV和RI检测器确定的BSA平均摩尔质量的相对标准偏差(％RSD)≤5.0％。
光散射检测器的归一化系数、检测器间延迟体积和谱带展宽项由针对所采用的A4F-MALLS条件收集的BSA色谱图计算得出。这些值应用于针对所有其它样品收集的数据文件，以校正这些术语。
使用Astra软件中提供的蛋白质缀合物分析实验性地确定dn/dc值和在215nm或280nm处的消光系数(针对糖基化进行了校正)。校正后的消光系数和dn/dc值用于分析所有蛋白质-蛋白质复合物样品。
7.4.3.结果
A4F-MALLS用于评估在几种抗hTSLP ABM和hTSLP之间形成的复合物的相对大小分布。具有hTSLP的潜在ABM复合物的理论摩尔质量和预测的化学计量如表5-3和5-4所示：
Figure BDA0003577521890000852
Figure BDA0003577521890000861
正如所料，当以等摩尔比组合时，每种单独的亲本抗TSLP mAb(H4H30206P2、H4H30217P2、H4H30230P2)与hTSLP形成典型的1:1和1:2复合物(峰3，～179kDa，图7，表5-5)。
Figure BDA0003577521890000862
然而，当两种亲本mAb的不同组合(H4H30206P2+H4H30217P2和H4H30217P2+H4H30230P2)与等摩尔量的hTSLP混合时，观察到异源复合物的异质分布，这表明每种亲本mAb可以接合hTSLP的相同分子，以在被称为“纸娃娃换装”的过程中形成延伸抗体-抗原晶格(图8)。在这些样品中，观察到摩尔质量约为342kDa的独特峰(峰4)，随后是一系列宽的、分辨率差的物种(峰5)，其摩尔质量分布范围为～650-5000kDa。根据计算出的各个组分的摩尔质量，峰4可以代表2:2mAb:hTLSP复合物，而峰5对应于由与≥3分子hTSLP配位的≥4分子mAb构成的高阶异源复合物的异质分布(表5-6)。
Figure BDA0003577521890000871
此外，还检查了在hTSLP和一组新型双特异性抗体(TS-FC1-eL1、TS-FC6-eL2)之间形成的复合物，所述双特异性抗体具有两个独特的Fab结构域，源自上述测试的相同亲本mAb组合，连接到人Fc结构域(Fc-Fab)的C端。与使用亲本mAb组合获得的结果不同，每种Fc-Fab双特异性抗体(bsAb)主要与hTLSP形成离散的1:1复合物(峰3，～178kDa；图9，表5-7)，而几乎没有或没有观察到额外的高阶复合物(“纸娃娃换装”)。
Figure BDA0003577521890000872
Figure BDA0003577521890000881
这表明每个Fc-Fab bsAb上的两个Fab结构域都更喜欢与hTSLP的相同分子结合，从而形成单配的二价相互作用，并因此排除了“纸娃娃换装”的过程。
还以类似的方式评估了本公开的另外两组ABM形式与hTSLP的复合物形成，所述另外两组ABM形式在每个结合臂上具有额外的外部Fab结构域(2+2串联Fab；TS-CL2-eL2、TS-CL3-eL2)或在每个臂上具有额外的内部非结合Fab(钳型；TS-CL4-eL1、TS-CL6-eL1)。通常，每个钳型ABM似乎与hTSLP形成一定程度的1:1复合物(峰3，～272kDa；图10，表5-8)；然而，在这些样品中也可以检测到广泛的、异质分布的高阶复合物(峰5，～650-7000kDa；图10，表5-8)，其表明不同程度的“纸娃娃换装”。
Figure BDA0003577521890000882
最后，当与等摩尔量的hTLSP混合时，每个2+2串联Fab bsAb在所有测试的新型双特异性形式中都显示出最高的“纸娃娃换装”倾向。在这些样品中，可以观察到与游离2+2串联Fab bsAb一致的独特峰(峰2；～255kDa)，然后是一系列宽的、分辨率差的峰，其代表越来越大的物种的异质分布，所述越来越大的物种终止于摩尔质量超过十(10)兆道尔顿的非常大的复合物(峰4-5，～500-14,000kDa；图11，表5-9)。
Figure BDA0003577521890000891
7.5.实例5：抗hTSLP Fc-Fab中的接头的优化
使用不同的接头构建一系列抗-hTSLP 30217x30230双特异性Fc-Fab，所述接头从2个氨基酸的GS接头到30个氨基酸的6xG4S接头(SEQ ID NO:38)。在hTSLP STAT3-萤光素酶报告基因测定中评估了这些Fc-Fab的活性(图12)。使用在2-5xG4S(G4S被公开为SEQ IDNO:3)之间的接头长度，观察到Fc-Fab最佳阻断活性。还使用30217x30230双特异性Fc-Fab作为实例评估了不同的铰链形式(图13)。在形式#1中，铰链序列位于Fc-Fab的N端末端，因为它出现在天然hIgG4序列中，具有S228P(EU)取代(图13A)。在形式#2中，相同的铰链序列从Fc-Fab的N端末端移除并插入到Fc CH3结构域的C端和(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ IDNO:3)之间(图13B)。在形式#3中，铰链也位于CH3结构域和(G4S)n接头(G4S被公开为SEQ IDNO:3)之间。然而，上部铰链序列被替换为G4S序列(G4S被公开为SEQ ID NO:3)(图13C)。所有三种铰链形式均与1xG4S接头(SEQ ID NO:3)或4xG4S接头(SEQ ID NO:19)组合，以构建抗hTSLP 30217x30230双特异性Fc-Fab。在hTSLP STAT3-萤光素酶报告基因测定中评估了这些Fc-Fab的活性(图13D)。对于具有4xG4S接头(SEQ ID NO:19)的Fc-Fab，不同的铰链形式对其TSLP阻断活性影响较小，其中铰链形式#1显示出最佳活性。对于具有1xG4S接头(SEQID NO:3)的Fc-Fab，铰链形式#1的IC50比其它两种铰链修饰好5到10倍。
7.6.实例6：Fc-Fab与Fc受体结合的Biacore分析
使用基于实时表面等离子共振的MASS-2(Bruker)/Biacore 3000(GEHealthcare)生物传感器测定不同抗TSLP Fc-Fab抗体与来自人的纯化重组人FcγR和FcRn受体亚型结合的平衡解离常数(KD值)。所测定的Fc-Fab构建体是TSLP 30206x30217 Fc_Fab 2xG4S(“2xG4S”被公开为SEQ ID NO:18)(也被称为REGN8759)和TSLP 30230x30217Fc_Fab 2xG4S(“2xG4S”被公开为SEQ ID NO:18)(也被称为REGN7860)，以及抗FelD1(-)-IgG1和IgG4同种型对照(分别被称为REGN1932和REGN1945)。所测定的Fc受体是人FcγRIIA(H131)-myc.6xHis、人FcγRIIA(R167)-10xHis、人FcγRIIB-myc.6xHis、人FcγRIIIA(F176)-myc.6xHis、人FcγRIIIB-mmh、人FcRn-mmh和人FcγRI-6xHis。
7.6.1.材料与方法
所有结合研究在25℃下在10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20、pH为7.4(HBS-ET)或PBS、0.05％v/v表面活性剂Tween-20、pH6.0(PBS-T-pH6.0)的运行缓冲液中进行。通过与小鼠抗五组氨酸单克隆抗体(“五组氨酸”被公开为SEQID NO:34)(GE Healthcare)或抗myc单克隆抗体(REGN642)的胺偶联对MASS-2/Biacore3000CM5传感器表面进行衍生化，以捕获用C端myc-myc-六组氨酸(“六组氨酸”被公开为SEQID NO:35)或组氨酸区域表达的FcγR和FcRn受体胞外结构域。对不同的抗TSLP Fc-Fab和野生型Fc同种型对照进行了结合研究。将在HBS-ET或PBS-T pH 7.4和pH 6.0运行缓冲液中制备的不同浓度的抗TSLP Fc-Fab(范围从5μM到0.3125μM，2倍稀释)以50微升/分钟的流速注射到FcγR和FcRn受体捕获的表面上。监测所有抗TSLP Fc-Fab与捕获的FcγR和FcRn受体中的每一个的结合，持续1.5-2分钟，并监测它们在HBST运行缓冲液中的解离，持续10分钟。在每个循环结束时，使用用于小鼠抗五组氨酸单克隆抗体(“五组氨酸”被公开为SEQ IDNO:34)或抗myc单克隆抗体的10mM甘氨酸-HCl pH 1.5注射20-30秒，使FcγR和FcRn受体捕获的表面再生。所有结合动力学实验均在25℃下进行。
7.6.2.数据分析
结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率如下计算的：
KD(M)＝kd/ka和t1/2(min)＝ln2/(60xkd)
7.6.3.结果
不同的抗TSLP Fc-Fab和对照抗体在25℃下与本公开的不同FcγR和FcRn受体结合的结合动力学参数分别显示在表5-10和5-11中。在表5-10中，NT表示未测试，并且IC表示不确定。在表5-11中，NB表示未结合，并且IC表示不确定。
Figure BDA0003577521890000911
Figure BDA0003577521890000921
Figure BDA0003577521890000922
7.7.实例7：野生型小鼠中抗TSLP Fc-Fab双特异性抗体的药代动力学评估
7.7.1.概述
与抗fel d 1IgG4同种型对照REGN1945、不相关的常规双特异性IgG4对照H4H21237D和hFcγ同二聚体REGN1627相比，在C57BL/6野生型(WT)小鼠中对两种抗TSLPFc-Fab双特异性结合分子的药代动力学曲线进行了评估：(1)30206x 30217IgG4 Fc-Fab双特异性，带有2xG4S接头(SEQ ID NO:18)，也被称为REGN8759；和(2)30230x 30217IgG4 Fc-Fab双特异性，带有2xG4S接头(SEQ ID NO:18)，也称为REGN 8760。
7.7.2.材料与方法
每种测试的抗体队列中含有5只小鼠。用REGN8759、REGN8760、REGN1945和H4H21237D给药的小鼠接受了单次皮下(SC)1mg/kg剂量。用hFcγ同二聚体REGN1627给药的小鼠接受了基于与研究中其它抗体摩尔等价(0.35mg/kg)的归一化SC剂量。在给药后6小时以及1天、2天、3天、4天、7天、10天、14天和21天，收集血液样品。将血液加工成血清并在-80℃下冷冻直至分析。使用GyroLab xPlore平台(Gyros)测量REGN8759和REGN8760的总血清浓度和功能性血清浓度以及REGN1945、H4H21237D和REGN1627的总血清浓度。
Gyros技术将亲和流通形式用于使用激光诱导荧光检测的自动免疫测定。将样品上样到含有多个径向排列的纳升级亲和捕获柱的压缩盘(CD)上。液体流动由离心力和毛细力控制。
对于总和功能性REGN8759、REGN8760的测量，以及对于血清中总REGN1945、H4H21237D和REGN1627的测量，将100μg/mL的测试物品或对照物品特异性生物素化捕获试剂(表5-11)添加到含有亲和柱的Gyrolab Bioaffy 200CD(Dynospheres)上，所述亲和柱预装了链霉亲和素包被的珠子。用于校准的标准品(表5-11)在0.488–2000ng/mL的浓度范围内运行。在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备血清样品的连续稀释液。在含有2％正常小鼠血清(NMS)的PBS+0.5％BSA中制备标准品的连续稀释液。在室温下，将1:50稀释的血清样品单峰和标准品的副本添加到捕获试剂包被的亲和柱上。使用在Rexxip F缓冲液(Gyros)中稀释的Alexa-647缀合的小鼠抗人IgG1/hIgG4单克隆抗体(REGN2567，0.5μg/mL)检测捕获到的人IgG；通过GyroLab xPlore仪器以反应单位(RU)记录所得荧光信号。相应测定的定量下限(LLOQ)被定义为标准曲线上的最低浓度，其质量控制(QC)样品被确定为始终偏离预期浓度小于25％(表5-12)。样品浓度通过使用GyrolabEvaluator软件中的4参数逻辑曲线拟合构建的标准曲线进行插值来确定。使用来自2个重复实验的平均浓度计算最终浓度。
Figure BDA0003577521890000941
通过非房室分析(NCA)使用
Figure BDA0003577521890000942
软件版本6.3(新泽西州普林斯顿Certara,L.P.)和血管外给药模型确定PK参数。使用每种抗体相应的平均浓度值(总药物)，使用具有线性插值和均匀加权的线性梯形规则确定所有PK参数，包含观察到的血清中最大浓度(Cmax)、观察到的估计半衰期(t1/2)、浓度曲线下面积对比直至最后可测量浓度的时间(AUClast)以及抗体清除率(Cl)。
7.7.3.结果
在WT小鼠中以1mg/kg SC施用抗TSLP Fc-Fab双特异性抗体和对照后，REGN8759和REGN8760在血清中表现出类似的最大药物总浓度(分别为Cmax＝11.7和10.7μg/mL)，而hIgG4同种型对照REGN1945、不相关的常规双特异性IgG4对照H4H21237D和hFcγ同二聚体REGN1627(Cmax剂量归一化)的浓度降低了约1.5-2倍(分别为Cmax＝8.2、7.8和6.4μg/mL)。
此外，REGN8759、REGN8760、REGN1945和H4H21237D都表现出类似的半衰期值(分别为T1/2＝12.1、12.2、10.9和11.2天)，而与所有其它测试药物相比，REGN1627的半衰期更快(6.4天)。此外，与REGN1945、H4H21237D和REGN1627相比(分别为AUClast＝88.0、84.1和19.7，分别为AUClast/D＝56.2(d*μg/mL)/(mg/kg)；分别为Cl＝9.5、8.2和45.2mL/天/kg)，REGN8759和REGN8760表现出更好的药物暴露(分别为AUClast＝131和122(d*μg/mL)/(mg/kg))和较慢的清除率(分别为Cl＝5.2、5.5mL/天/kg)。
此外，REGN8759和REGN8760的总和功能性TSLP结合浓度在所有测试时间点相当，这表明这些Fc-Fab分子在21天时仍然完整。总体而言，与hIgG4同种型对照、不相关的常规双特异性IgG4对照或hFcγ同二聚体相比，REGN8759和REGN8760的PK曲线类似或更好。
总和功能性REGN8759和REGN8760药物浓度以及总REGN1945、H4H21237D和REGN1627药物浓度的数据总结总结在表5-13中，平均PK参数在表5-14中描述，并且平均总抗体浓度对比时间示于图14和图15中。
Figure BDA0003577521890000951
Figure BDA0003577521890000961
Figure BDA0003577521890000962
Figure BDA0003577521890000971
PK参数源自总药物浓度的平均浓度对比时间曲线。T1/2和AUClast基于第21天的浓度。示出了所有剂量组的每个PK参数的平均值±SEM值。
缩写：AUClast＝从给药时间到最后可测量浓度的曲线下面积；AUClast/D＝相对于1mg/kg给药归一化的AUC最后剂量；t1/2＝消除的终末半衰期；Cmax＝峰值浓度；Cmax/d＝相对于1mg/kg给药归一化的Cmax剂量；tmax＝观察到Cmax的时间；Cl＝抗体随时间的清除率；SEM＝平均值的标准误差。
7.8.实例8：抗配体X Fc-Fab与配体X结合的Biacore分析
使用来自针对人配体X、mAbX1、mAbX2和mAbX3的三种非竞争性mAb的Fab片段制备人配体X的双特异性Fc-Fab，其是一种分子量范围为15-20kDa的可溶性单体蛋白，其中接头是G4S2(即，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18))。Fc-Fab具有图13A描绘的铰链形式。
在Biacore T200仪器上使用实时表面等离子体共振生物传感器测定来确定配体X与纯化的抗配体X抗体结合的平衡解离常数(KD值)。通过与单克隆小鼠抗人Fc抗体(REGN2567)的胺偶联对Biacore传感器表面进行衍生化，以捕获用人Fc恒定区表达的抗配体X抗体。在HBST运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％v/v表面活性剂P20)中执行Biacore结合研究。人配体X是从内部来源(REGN138)获得的。将在HBST运行缓冲液中制备的不同浓度的人配体X(范围从90nM到0.12nM，3倍稀释)以50微升/分钟的流速注射到抗配体X抗体捕获的表面上。监测所有配体X试剂与捕获的单克隆抗体中的每一个的结合，持续4分钟，并监测它们在HBST运行缓冲液中的解离，持续10分钟。所有结合动力学实验均在37℃下进行。通过使用双评估曲线拟合软件将实时传感图拟合到1:1结合模型来测定动力学缔合(ka)和解离(kd)速率常数。结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)是根据动力学速率常数如下计算的：
KD(M)＝kd/ka和t1/2(min)＝ln2/(60xkd)
人配体X在37℃下与抗配体X抗体结合的结合动力学参数示出在表5-15中。在37℃下，本公开的抗配体X Fc-Fab以0.25pM到18.4pM范围内的KD值结合人配体X，而亲本mAb以相应的0.56pM和557pM的KD值结合人配体X，如表5-15所示。
Figure BDA0003577521890000981
7.9.实例9：抗人配体X双特异性Fc-Fab在生物测定中的活性
评估纯化的抗人配体X双特异性Fc-Fab在受体X信号传导生物测定中抑制人配体X的能力。使用工程化荧光素酶报告细胞系对通过受体X的配体X信号传导进行生物测定。将报告细胞以10,000个细胞/孔接种在含有0.1％胎牛血清(Seradigm)的Opti-MEM(Gibco)中并孵育过夜。对于配体X剂量反应曲线，将1:3连续稀释的配体X添加到每个孔中，配体X的最终浓度从2nM开始。为了确定抗配体X亲本mAb和双特异性Fc-Fab的阻断活性，使用“Race形式”阻断测定，在所述测定中，抗体和配体X被同时添加到报告细胞中。抗配体X抗体以1:3连续稀释，最终浓度从100nM开始。将人配体X添加至10pM、100pM或1nM的恒定浓度。孵育5.5小时后，将测定板在室温下平衡15分钟。将100μl的One-Glo底物(Promega)添加到每个孔中。在室温下孵育5分钟后，在Envision上测量发光。
三种抗人配体X双特异性Fc-Fab在受体X生物测定中的活性显示在图16A-16C(mAbX1 x mAbX2)、图17A-17C(mAbX2 x mAbX3)和图18A-18C(mAbX1 x mAbX3)中。在相同测定中将它们的活性与对应的抗人配体X亲本mAb进行比较。mAbX1 x mAbX2 Fc-Fab具有最佳阻断活性，与亲本抗配体X mAb相比，IC50值显著提高。亲本mAb之一mAbX3在生物测定中不会阻断配体X对基线的活性，即使mAb比人配体X摩尔过量100到1000倍。有趣的是，使用mAbX3的两个Fc-Fab能够阻断配体X对基线的活性(图17A-17C和图18A-18C)。这些结果表明，与亲本抗配体X mAb相比，双特异性Fc-Fab具有更高的活性。这些抗配体X抗体的IC50值总结在表5-16中。
Figure BDA0003577521890000991
7.10.实例10：通过耦接到多角度光散射(A4F-MALLS)的非对称流场-流分级对抗配体X异二聚体和重组配体X之间形成的体外复合物进行大小分析
相对于与亲本mAb的复合物，使用耦接到多角度光散射(A4F-MALLS)的非对称流场-流分级对Fc-Fab、钳型和2+2串联Fab异二聚体形式的重组配体X和双特异性mAbX1 xmAbX2之间形成的体外复合物进行大小分析，如第7.4节所述。图19A-19E示出了此分析的结果。图19A和19B示出了配体X与亲本mAb的复合物(单独或组合)的体外分析结果；图19C示出了配体X与mAbX1 x mAbX2 Fc-Fab的复合物的体外分析结果；图19D示出了配体X与mAbX1 xmAbX2钳型的复合物的体外分析结果；并且图19E示出了配体X与mAbX1 x mAbX2 2+2串联Fab异二聚体的复合物的体外分析结果。如图19C所示，Fc-Fab形式显示出最少量的纸娃娃换装或聚集。
7.11.实例11：Fc-Fab保持与细胞表面靶标的结合
除了小的可溶性抗原外，还测试了细胞表面蛋白作为Fc-Fab的靶标。使用hIgG1恒定区(图20A)或效应子功能降低的hIgG4恒定区(US9359437B2)(显示为hIgG4s，图20B、20C、20D)将针对抗原Y(一种细胞表面抗原)的IgG抗体重新形式化为单特异性Fc-Fab(如图1B所示，其中铰链形式如图13A中所描绘)。针对每种抗-抗原Y Fc-Fab测试了三种不同的接头，1xG4S(SEQ ID NO:3)、2xG4S(SEQ ID NO:18)和3xG4S(SEQ ID NO:4)。在流式细胞术(FACS)结合测定中评估了这些Fc-Fab与细胞表面抗原Y的结合。收集表达抗原Y的细胞，并重悬于冷的FACS洗涤缓冲液(PBS+1％FBS)中。对于每个结合测定，将50,000-100,000个细胞与一抗一起在FACS洗涤缓冲液中于4℃下孵育30分钟。然后将细胞用冷的FACS洗涤缓冲液洗涤两次，并在4℃下与1:200稀释的APC-F(ab)'2抗人IgG Fcγ片段(Jackson ImmunoResearchLaboratories)一起孵育30分钟。在孵育结束时，将细胞用冷的FACS洗涤缓冲液洗涤两次，并在FACS Canto(BD Biosciences)上进行分析。
所有Fc-Fab都保持与细胞表面抗原Y的强结合。两组Fc-Fab具有与其亲本mAb类似的结合活性(图20A和20B)。与其亲本mAb相比，另外两组Fc-Fab显示出适度降低的与抗原Y的结合(图20C和20D)。1xG4S(SEQ ID NO:3)到3xG4S(SEQ ID NO:4)之间的接头长度变化对抗-抗原Y Fc-Fab的靶标结合影响最小。
测试另外的细胞表面蛋白作为Fc-Fab的靶标，包含CD3和细胞表面肿瘤相关抗原，抗原Z。Fc-Fab具有图13A中描绘的铰链形式。在FACS结合测定中，抗CD3 hIgG1 Fc-Fab显示出与CD3+Jurkat细胞的特异性结合(图21A)，而抗-抗原Z hIgG1 Fc-Fab显示出与抗原Z+细胞系的特异性结合(图21B)。1xG4S(SEQ ID NO:3)到5xG4S(SEQ ID NO:39)之间的接头长度变化对这些Fc-Fab的靶标结合影响较小，其中最短的接头导致对CD3和抗原Z两者的结合活性较弱。
7.12.实例12：双特异性CD3 x抗原Z Fc-Fab在使用T细胞作为效应细胞的生物测定中具有活性
如实例1中所述，使用hIgG1的恒定区产生针对CD3和抗原Z(细胞表面肿瘤相关抗原)的双特异性Fc-Fab。针对具有图13A中描绘的铰链形式的这些双特异性Fc-Fab，测试了三种不同的接头，1xG4S(SEQ ID NO:3)、2xG4S(SEQ ID NO:18)和3xG4S(SEQ ID NO:4)。在Jurkat NFAT-萤光素酶报告基因测定(图22A)和体外细胞毒性测定(图22B)中评估双特异性Fc-Fab的活性。在Jurkat NFAT-萤光素酶报告基因测定中，将Jurkat/NFAT-Luc报告细胞系与抗原Z+细胞系(每个细胞系50,000个细胞)在96孔板中以1:1的比率混合。将CD3 x抗原Z双特异性Fc-Fab添加到每个孔中，最终体积为100μl。将反应在37℃下孵育5小时。孵育后，将板在室温下平衡10分钟，然后将100μl One-Glo底物(Promega)添加到每个孔中。在Victor上测量发光。在细胞毒性测定中，使用用CD3/CD28珠和IL-2活化7天的人供体PBMC制备预活化的人T细胞。在细胞毒性测定当天，收获抗原Z+细胞并用8μM calcein-AM(Invitrogen)标记30分钟。将标记的靶细胞洗涤两次，并与预活化的人T细胞以1:10的比率混合，每孔有约10,000个靶细胞。将CD3 x抗原Z双特异性Fc-Fab的连续稀释液添加至200μl的最终体积。将反应在37℃下孵育3小时。孵育后，将板离心并将100μl上清液转移至半透明黑色透明底板，用于荧光读数。CD3 x抗原Z双特异性Fc-Fab在Jurkat报告基因测定(图22A)和细胞毒性测定(图22B)中均具有活性。在这两种测定中，具有更长接头的Fc-Fab显示出更强的活性。
8.具体实施例
本公开通过以下A组和B组具体实施例来举例说明。
在以下具体实施例和随后的权利要求的优选方面中，抗原结合结构域(例如，Fab)含有人源化或人VH和VL序列；Fc结构域包括人CH2和/或CH3结构域及其变体，例如与此类人序列具有至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的变体。进一步地，Fab结构域可以是由两个多肽链构成的Fab结构域，如本文所述，VH多肽链和VL多肽链，或是其中VH和VL存在于单个多肽链中的单链Fab(“scFab”)。除非另有明确说明，否则Fab结构域还可以包含结构域交换，例如存在于Crossmab形式中的结构域交换。
8.1.A组具体实施例
1.一种抗原结合分子，其与第一靶分子结合并且：
(a)包括：
(i)Fc区，所述Fc区包括两个Fc结构域；
(ii)第一Fab结构域和第二Fab结构域，
其中所述Fc区、所述第一Fab结构域和第二Fab结构域处于非天然免疫球蛋白构型；
其中所述第一Fab结构域和/或所述第二Fab结构域能够与所述第一靶分子结合；并且
(b)以比包括所述至少两个Fab结构域的天然免疫球蛋白更大的亲和力和/或亲合力结合所述第一靶分子。
2.一种抗原结合分子，其任选地是根据实施例1所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子与第一靶分子结合并且包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
(i)第一Fc结构域；以及
(ii)第一Fab结构域，所述第一Fab结构域包括与第一轻链可变区(VL)缔合的第一重链可变区(VH)；以及
(b)第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
(i)第二Fc结构域；以及
(ii)第二Fab结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH，
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区，并且任选地其中所述第一多肽和第二多肽是相同的。
3.根据实施例2所述的抗原结合分子，其包括所述第一Fc结构域和所述第一VH之间的第一接头。
4.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为5个氨基酸到60个氨基酸。
5.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为10个氨基酸到60个氨基酸残基。
6.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为5个氨基酸到20个氨基酸残基。
7.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为5个氨基酸到30个氨基酸残基。
8.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为10个氨基酸到30个氨基酸残基。
9.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为10个氨基酸到20个氨基酸残基。
10.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为20个氨基酸到50个氨基酸。
11.根据实施例3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为25到35个氨基酸。
12.根据实施例3到11中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头包括GnS或SGn的多聚体，任选地其中n是1到7的整数。
13.根据实施例12所述的抗原结合分子，其中所述第一接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的多聚体。
14.根据实施例13所述的抗原结合分子，其中所述第一接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的2到6个重复。
15.根据实施例14所述的抗原结合分子，其中所述第一接头包括(G4S)2(SEQ IDNO:18)、(G4S)3(SEQ ID NO:4)或(G4S)4(SEQ ID NO:19)。
16.根据实施例3到15中任一项所述的抗原结合分子，其包括所述第二Fc结构域和所述第二VH之间的第二接头。
17.根据实施例16所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头具有相同的氨基酸序列。
18.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第二接头的长度为5个氨基酸到60个氨基酸。
19.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第二接头的长度为10个氨基酸到60个氨基酸。
20.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为5个氨基酸到20个氨基酸残基。
21.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为5个氨基酸到30个氨基酸残基。
22.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为10个氨基酸到30个氨基酸残基。
23.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第一接头的长度为10个氨基酸到20个氨基酸残基。
24.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第二接头的长度为20个氨基酸到50个氨基酸。
25.根据实施例16或实施例17所述的抗原结合分子，其中所述第二接头的长度为25到35个氨基酸。
26.根据实施例16到25中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第二接头包括GnS或SGn的多聚体，任选地其中n是1到7的整数。
27.根据实施例26所述的抗原结合分子，其中所述第二接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的多聚体。
28.根据实施例27所述的抗原结合分子，其中所述第二接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的2到6个重复。
29.根据实施例28所述的抗原结合分子，其中所述第二接头包括(G4S)2(SEQ IDNO:18)、(G4S)3(SEQ ID NO:4)或(G4S)4(SEQ ID NO:19)。
30.根据实施例2到29中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽包括位于所述第一Fc结构域N端的第一铰链结构域并且所述第二多肽包括位于所述第二Fc结构域N端的第二铰链结构域。
31.根据实施例30所述的抗原结合分子，其中所述第一铰链结构域和所述第二铰链结构域通过二硫键连接。
32.根据实施例30所述的抗原结合分子，其中所述第一铰链结构域和所述第二铰链结构域不通过二硫键连接。
33.根据实施例2到32中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽不包括位于所述第一Fc结构域N端的VH。
34.根据实施例2到33中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第二多肽不包括位于所述第二Fc结构域N端的VH。
35.根据实施例2到29中任一项所述的抗原结合分子，其具有一个铰链区。
36.根据实施例35所述的抗原结合分子，其具有图13A所示的铰链形式。
37.根据实施例35所述的抗原结合分子，其具有图13C所示的铰链形式。
38.根据实施例2到29中任一项所述的抗原结合分子，其具有两个铰链区。
39.根据实施例38所述的抗原结合分子，其具有图13B所示的铰链形式。
40.根据实施例2到39中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽和第二多肽不相同。
41.根据实施例2到40中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一VL和第二VL是通用轻链。
42.根据实施例2到40中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域或所述第二Fab结构域的轻链恒定区和第一重链恒定区(CH1)呈Crossmab排列。
43.根据实施例1到42中任一项所述的抗原结合分子，其是二价的。
44.一种抗原结合分子，其任选地是根据实施例1所述的抗原结合分子，所述抗原结合分子包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
(i)第一Fab结构域，所述第一Fab结构域包括与第一VL缔合的第一VH；
(ii)第一间隔结构域；
(iii)第一Fc结构域；以及
(b)第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
(i)第二Fab结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH；
(ii)第二间隔结构域；
(iii)第二Fc结构域；并且
其中所述第一Fab结构域和/或所述第二Fab结构域能够与所述第一靶分子结合，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区，并且任选地其中所述第一多肽和第二多肽是相同的。
45.根据实施例44所述的抗原结合分子，其包括所述第一间隔结构域和所述第一Fc结构域之间以及所述第二间隔结构域和所述第二Fc结构域之间的铰链结构域。
46.根据实施例44或实施例45所述的抗原结合分子，其中所述铰链结构域通过二硫键连接。
47.根据实施例44到46中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一VL和第二VL是通用轻链。
48.根据实施例44到46中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域或所述第二Fab结构域的轻链恒定区和第一重链恒定区(CH1)呈Crossmab排列。
49.根据实施例44到48中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一间隔结构域和所述第二间隔结构域各自包括延伸接头。
50.根据实施例49所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头的长度为至少30个氨基酸。
51.根据实施例49或实施例50所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头的长度为30个酸残基到70个氨基酸。
52.根据实施例49或实施例50所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头的长度为30个酸残基到55个氨基酸。
53.根据实施例49或实施例50所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头的长度为30个酸残基到40个氨基酸。
54.根据实施例49到53中任一项所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头包括GnS或SGn的多聚体，任选地其中n是1到7的整数。
55.根据实施例54所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的多聚体。
56.根据实施例55所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的5到12个重复。
57.根据实施例56所述的抗原结合分子，其中每个延伸接头包括(G4S)6(SEQ IDNO:38)、(G4S)7(SEQ ID NO:36)或(G4S)8(SEQ ID NO:37)。
58.根据实施例44到57中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二间隔结构域是相同的。
59.根据实施例44到58中任一项所述的抗原结合分子，其是二价的。
60.根据实施例44所述的抗原结合分子，其中所述第一间隔结构域包括第三Fab结构域，所述第三Fab结构域包括与第三VL缔合的第三VH，并且所述第二间隔结构域包括第四Fab结构域，所述第四Fab结构域包括与第四VL缔合的第四VH。
61.根据实施例60所述的抗原结合分子，其中所述第三VL和所述第四VL是通用轻链，其中所述Fc区。
62.根据实施例60或实施例61所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽包括所述第一VH和所述第三VH之间的第一接头，并且所述第二多肽包括所述第二VH和所述第四VH之间的第二接头。
63.根据实施例62所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自的长度为10个氨基酸到60个氨基酸。
64.根据实施例62或实施例63所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自的长度为20个氨基酸到50个氨基酸。
65.根据实施例62或实施例63所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自的长度为25到35个氨基酸。
66.根据实施例62或实施例63所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括GnS或SGn的多聚体，任选地其中n是1到7的整数。
67.根据实施例66所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括G4S(SEQ ID NO:3)的多聚体。
68.根据实施例67所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括G4S(SEQ ID NO:3)的2到6个重复。
69.根据实施例68所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括(G4S)2(SEQ ID NO:18)、(G4S)3(SEQ ID NO:4)或(G4S)4(SEQ ID NO:19)。
70.根据实施例62到69中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头具有相同的氨基酸序列。
71.根据实施例60到70中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第三Fab结构域和所述第四Fab结构域是非结合的。
72.根据实施例71所述的抗原结合分子，其中所述第三VH和所述第四VH是通用重链。
73.根据实施例71或实施例72所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域和所述第二Fab结构域各自能够结合所述第一靶分子上的相同或不同表位。
74.根据实施例60到73中任一项所述的抗原结合分子，其是二价的。
75.根据实施例60到70中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第三Fab结构域和所述第四Fab结构域各自能够结合相同或不同的表位。
76.根据实施例75所述的抗原结合分子，其中所述第三Fab结构域和所述第四Fab结构域各自能够结合相同的靶分子。
77.根据实施例76所述的抗原结合分子，其中所述第三Fab结构域和所述第四Fab结构域各自能够结合所述第一靶分子。
78.根据实施例75到77中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二Fab结构域结合相同的表位。
79.根据实施例78所述的抗原结合分子，其中所述第一和第二Fab结构域具有相同的序列。
80.根据实施例75到79中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第三和第四Fab结构域结合相同的表位。
81.根据实施例80所述的抗原结合分子，其中所述第三和第四Fab结构域具有相同的序列。
82.根据实施例75到77中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一和第三Fab结构域结合相同的表位。
83.根据实施例82所述的抗原结合分子，其中所述第一和第三Fab结构域具有相同的序列。
84.根据实施例75到77、82和83中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第二和第四Fab结构域结合相同的表位。
85.根据实施例84所述的抗原结合分子，其中所述第二和第四Fab结构域具有相同的序列。
86.根据实施例60到70和75到85中任一项所述的抗原结合分子，其是四价的。
87.根据实施例1到86中任一项所述的抗原结合分子，其是所述第一靶分子的拮抗剂。
88.根据实施例1到87中任一项所述的抗原结合分子，其抑制所述第一靶分子与结合配偶体的结合，任选地其中所述结合配偶体是所述第一靶分子的受体。
89.根据实施例1到88中任一项所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包括人Fc序列。
90.根据实施例1到89中任一项所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包括人IgG1或人IgG4 Fc序列。
91.根据实施例1到90中任一项所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包括Fc异二聚体。
92.根据实施例89所述的抗原结合分子，其中与野生型Fc结构域相比，所述Fc异二聚体中的所述Fc结构域包括孔内旋钮突变。
93.根据实施例92所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽中的所述Fc结构域包括旋钮突变并且所述第二多肽中的所述Fc结构域包括孔突变。
94.根据实施例92所述的抗原结合分子，其中所述第二多肽中的所述Fc结构域包括旋钮突变并且所述第一多肽中的所述Fc结构域包括孔突变。
95.根据实施例89所述的抗原结合分子，其中与野生型Fc区相比，所述Fc区包括星形突变。
96.根据实施例89所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽中的所述Fc结构域包括H435R突变和Y436F突变。
97.根据实施例89所述的抗原结合分子，其中所述第二多肽中的所述Fc结构域包括H435R突变和Y436F突变。
98.根据实施例1到97中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域中的所述CL和所述CH1通过二硫键连接。
99.根据实施例1到98中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第二Fab结构域中的所述CL和所述CH1通过二硫键连接。
100.根据实施例1到99中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域和所述第二Fab结构域与所述第一靶分子结合。
101.根据实施例1到100中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是小的可溶性配体。
102.根据实施例1到101中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是细胞因子或趋化因子。
103.根据实施例1到100中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是细胞表面蛋白。
104.根据实施例1到100和103中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是肿瘤相关抗原。
105.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于100kDa的分子，不包含翻译后修饰。
106.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于100kDa的分子，包含翻译后修饰。
107.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于75kDa的分子，不包含翻译后修饰。
108.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于75kDa的分子，包含翻译后修饰。
109.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于60kDa的分子，不包含翻译后修饰。
110.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于60kDa的分子，包含翻译后修饰。
111.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于45kDa的分子，不包含翻译后修饰。
112.根据实施例1到104中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量小于45kDa的分子，包含翻译后修饰。
113.根据实施例1到112中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量为至少5kDa的分子，不包含翻译后修饰。
114.根据实施例1到112中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量为至少5kDa的分子，包含翻译后修饰。
115.根据实施例1到112中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量为至少5kDa的分子，不包含翻译后修饰。
116.根据实施例1到112中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量为至少5kDa的分子，包含翻译后修饰。
117.根据实施例1到112中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量为至少10kDa的分子，不包含翻译后修饰。
118.根据实施例1到112中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子具有分子量为至少10kDa的分子，包含翻译后修饰。
119.根据实施例1到118中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是糖基化的。
120.根据实施例1到118中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子未被糖基化
121.根据实施例1到120中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是单体。
122.根据实施例1到120中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是二聚体。
123.根据实施例122所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是同二聚体。
124.根据实施例122所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是异二聚体。
125.根据实施例1到120中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是三聚体。
126.根据实施例125所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是同三聚体。
127.根据实施例1到120中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是四聚体。
128.根据实施例127所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是同四聚体。
129.根据实施例1到128中任一项所述的抗原结合分子，其是单特异性的。
130.根据实施例1到128中任一项所述的抗原结合分子，其是双特异性的。
131.根据实施例130所述的抗原结合分子，其能够结合所述第一靶分子上的第一表位和第二表位。
132.根据实施例131所述的抗原结合分子，其包括至少一个结合所述第一靶分子上的所述第一表位的Fab结构域和至少一个结合所述第二表位的Fab结构域。
133.根据实施例132所述的抗原结合分子，其能够同时结合所述第一靶分子上的不同表位。
134.根据实施例130所述的抗原结合分子，其能够结合所述第一靶分子并结合第二靶分子。
135.根据实施例134所述的抗原结合分子，其包括至少一个结合所述第一靶分子的Fab结构域和至少一个结合所述第二靶分子的Fab结构域。
136.根据实施例135所述的抗原结合分子，其可以同时结合所述第一靶分子和所述第二靶分子。
137.根据实施例1到136中任一项所述的抗原结合分子，相对于包括所述第一Fab和所述第二Fab的人IgG抗体，其以较低的IC50阻断所述靶分子与其受体的结合。
138.根据实施例1到137中任一项所述的抗原结合分子，与包括所述第一Fab和所述第二Fab的人IgG抗体相比，其以更大的亲和力结合所述靶分子。
139.一种缀合物，其包括根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子和细胞毒性剂或细胞抑制剂。
140.一种药物组合物，其包括根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子或根据实施例139所述的缀合物和赋形剂。
141.一种治疗患有与靶分子的异常表达或活性相关的病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子、根据实施例139所述的缀合物或根据实施例140所述的药物组合物。
142.一种在受试者中抑制与靶分子相关的分子通路的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子、根据实施例139所述的缀合物或根据实施例140所述的药物组合物。
143.一种根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子、根据实施例139所述的缀合物或根据实施例140所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与分别由所述抗原结合分子、缀合物或所述药物组合物中存在的抗原结合分子或缀合物结合的靶分子相关的病状。
144.一种核酸分子或多个核酸分子，其包括编码根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子的一个或多个核苷酸序列。
145.根据实施例144所述的核酸分子或多个核酸分子，其中所述一个或多个核苷酸序列各自可操作地连接至表达控制序列。
146.一种经工程改造以表达根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子的细胞。
147.一种用一种或多种表达载体转染的细胞，所述一种或多种表达载体包括在一个或多个启动子的控制下编码根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子的一个或多个核酸序列。
148.一种产生根据实施例1到138中任一项所述的抗原结合分子的方法，所述方法包括：
(a)在表达所述抗原结合分子的条件下培养根据实施例146或实施例147所述的细胞；以及
(b)从细胞培养物中回收所述抗原结合分子
149.根据实施例148所述的方法，其进一步包括富集所述抗原结合分子。
150.根据实施例148或实施例149所述的方法，其进一步包括纯化所述抗原结合分子。
8.2.B组具体实施例
1.一种抗原结合分子，其包括：
(a)第一重链多肽，所述第一重链多肽包括：第一CH氨基酸序列；第一VH氨基酸序列；以及第二CH氨基酸序列，其中所述第一VH氨基酸序列位于所述第一CH氨基酸序列和所述第二CH氨基酸序列之间；以及
(b)第二重链多肽，所述第二重链多肽包括：第三CH氨基酸序列；第二VH氨基酸序列；以及第四CH氨基酸序列，其中所述第二VH氨基酸序列位于所述第三CH氨基酸序列和所述第四CH氨基酸序列之间。
2.根据实施例1所述的抗原结合分子，其中所述第一CH氨基酸序列包括位于所述第一VH氨基酸序列N端的第一CH3氨基酸序列。
3.根据实施例2所述的抗原结合分子，其中所述第一CH3包括H435R突变和Y436F突变。
4.根据实施例2或实施例3所述的抗原结合分子，其进一步包括将所述第一VH氨基酸序列的N端末端连接到所述第一CH3氨基酸序列的C端末端的第一接头。
5.根据实施例1到4中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第三CH氨基酸序列包括位于所述第二VH氨基酸序列N端的第二CH3氨基酸序列。
6.根据实施例5所述的抗原结合分子，其进一步包括将所述第二VH氨基酸序列的N端末端连接到所述第二CH3氨基酸序列的C端末端的第二接头。
7.根据实施例1到6中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第二CH氨基酸序列包括位于所述第一VH氨基酸序列C端的第一CH1氨基酸序列。
8.根据实施例1到7中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第四CH氨基酸序列包括位于所述第二VH氨基酸序列C端的第二CH2氨基酸序列。
9.根据实施例1到8中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括位于所述第一CH3氨基酸序列N端的第一CH2氨基酸序列。
10.根据实施例1到9中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括位于所述第二CH3氨基酸序列N端的第二CH2氨基酸序列。
11.根据实施例1到10中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子不包含铰链区二硫键。
12.根据实施例1到11中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包括：第一VL氨基酸序列；以及第一CL氨基酸序列。
13.根据实施例12所述的抗原结合分子，其进一步包括将第一CL与所述第一CH1连接的二硫键。
14.根据实施例1到13中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包括：第二VL氨基酸序列；以及第二CL氨基酸序列。
15.根据实施例14所述的抗原结合分子，其进一步包括将第二CL与所述第二CH1连接的二硫键。
16.根据实施例6到15中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括多肽。
17.根据实施例16所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头具有0到50个氨基酸的长度。
18.根据实施例16到17中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头具有相同的氨基酸序列。
19.根据实施例16到18中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括聚甘氨酸和丝氨酸氨基酸序列。
20.根据实施例19所述的抗原结合分子，其中所述聚甘氨酸和丝氨酸氨基酸序列包括2到6个重复的GGGGS(SEQ ID NO:3)氨基酸序列。
21.根据实施例20所述的抗原结合分子，其中所述聚甘氨酸和丝氨酸氨基酸序列包括(G4S)2(SEQ ID NO:18)、(G4S)3(SEQ ID NO:4)或(G4S)4(SEQ ID NO:19)。
22.根据实施例14到21中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一轻链多肽和所述第二轻链多肽具有相同的氨基酸序列。
23.根据实施例1到22中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽具有相同的氨基酸序列。
24.根据实施例1到22中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽具有不相同的氨基酸序列。
25.根据实施例1到24中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的一种或多种抗原：ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRLI、ADORA2A、Aggrecan、AGR2、AICDA、AIF1、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、ART-4、B7、B7.1、B7.2、BAD、BAFF、BAGI、BAIi、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRl(MDRlS)、BlyS、BMPl、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMPS、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(凝集素)、BRCA1、Ba-733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CDI-IA、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、C19orf10(IL27w)、C3、C4A、CS、CSR1、CANT1、CASPI、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCLI(I-309)、CCLII(趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCLIS(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCLIS(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/趋化因子-2)、CCL2S(TECK)、CCL26(趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL2S、CCL3(MIP1a)、CCL4(MIP-1b)、CCLS(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCLS(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM14S)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCRS(CMKBRSIChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EB1)、CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLI(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CDlC、CD200、CD-22、CD24、CD2S、CD3S、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD44、CD4SRB、CD47、CD4S、CDS2、CD69、CD72、CD79A、CD79B、CDSO、CDS1、CDS3、CDS6、CD137、CD13S、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CDH1(E-钙粘蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDHlS、CDH19、CDH20、CDHS、CDH7、CDHS、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDKS、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSFS、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSFS、CLDN3、CLDN7(封闭素-7)、CLN3、CLU(聚簇蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COLISA1、COLIA1、COL4A3、COL6Al、CR2、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA-4、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CLI(SCYD1)、CX3CR1(V2S)、CXCLI(GRO1)、CXCLIO(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCLS(ENA-7S/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYBS、CYC1、CYSLTR1、HIF-1-a、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAB2IP、DES、DKFZp4S1J011S、DNCLI、DPP4、DAM、EGFR、EGFRvlll、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、EN01、EN02、EN03、EPHB4、EPO、EREG、ERKS、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF1S、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGFS、FGF7(KGF)、FGFS、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILI(EPSILON)、FILI(ZETA)、FLJ12SS4、FLJ2SS30、FLRT1(纤连蛋白)、FOS、FOSLI(FRA-1)、FY(DARC)、Flt-I、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GROB、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GDFS、GFil、GGTl、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPRS1(FKSGSO)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC4、HDACS、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIP1组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HUMCYT2A、HLA-DR、HMI 24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或1a、IGF-IR、IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-1、IL-10、IL-10RA、IL-10RB、IL-11、IL-11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-14、IL-1S、IL-1SRA、IL-16、IL-17、IL-17B、IL-17C、IL-17R、IL-18、IL-18BP、IL-18R1、IL-18RAP、IL-19、IL-IA、IL-1B、IL-1F10、IL-1FS、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1HY1、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAP、IL-1RAPL1、IL-1RAPL2、IL-1RL1、IL-1RL2 IL-1RN、IL-2、IL-20、IL-20RA、IL-21R、IL-22、IL-22R、IL-22RA2、IL-23、IL-24、IL-2S、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-2RA、IL-2RB、IL-2RG、IL-3、IL-30、IL-3RA、IL-4、IL-4R、IL-S、IL-5RA、IL-6、IL-6R、IL-6ST(糖蛋白130)、IL-7、IL-7R、IL-S、IL-SRA、IL-SRB、IL-9、IL-9R、IL-K、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6抗原)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b4整合素)胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4IFNAS、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNW1、JAG1、JAK1、JAK3、JUN、K6HF、KAi1、KDR、KITLG、KLFS(GC盒BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK1S、KLK3、KLK4、KLKS、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS 1-4、Le-Y、LDR/FUT、LAMAS、LEP(瘦素)、Lingo-p7S、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIB1、中期因子、MIF、MIP-2、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫蛋白-III)、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NCK2、神经能、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Noga)、NgRp7S、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOXS、NPPB、NROB1、NROB2、NR1D1、NR1D2、NRIH2、NRIH3、NRIH4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NRSA1、NRSA2、NR6A1、NRP1、NRP2、NTSE、NTN4、ODZ1、OPRD1、PCSK9、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PD-1、PD-L1、α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDFS、CGRP、Lingo-I、因子IXa、因子X、ICOS、GARP、BTLA、CD160、RORI、2B4、KIR、CD27、OX40、A2aR、PDGFA、PDGFB、PECAM1、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷聚糖、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDC1、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、10PIGF、ILGF、ILGF-IR、IL-6、RS5、RANTES、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFl10(ZNF144)、ROB02、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPINA1、SERPINA3、SERPINBS(乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STAB1、STATE、STEAP、STEAP2、TIOI、SAGE、5100、生存素、生存素-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn-抗原、ThomsonFriedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TB4R2、TBX21、TCP10、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFBlil、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLRS、TLR6、TLR7、TLRS、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSFS、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSFS、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF1S(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSFS(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSFS(CD30配体)、TNFSF9(4-lBB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TPS3、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAPS、TRAF6、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-IA抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、CS、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、CD19/CD3、BCMA/CD3、EGFR、HER3、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL1/IL-8、IL-6、IL-6R/IL-21、IL-21R、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFR-β、血管内皮生长因子(VEGF)受体2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL CS、VLA-4、c-FMS/CSFIR、RET、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、整合素、MMPs VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF、血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受体l/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、ENDOSIALIN/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-IR、IL 25 17A/F、EGF受体l/CD3和CD19/CD16、KHI、Tn-抗原、TF-抗原、CD44、糖脂、鞘糖脂，如30Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、唾液酸四糖神经酰胺、XCL1(淋巴细胞趋化素)、XCL2(SCM-1b)、XCR1(GPRS/CCXCR1)、YY1和ZFPM2。
26.根据实施例1到24中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的靶抗原对：CD137和CD20、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、CD138和CD20、CDI 38和CD40、CDI 9和CD20、CD20和CD3、CD3和CD33、CD3和CD133、CD47和CD20、CD38和CD138、CD38和CD20、CD20和CD22、CD38和CD40、CD40和CD20、CD-8和IL-6、CSPGs和RGM A、CTLA-4和BTN02、IGF1和IGF2、IGF1/2和Erb2B、IGF-1R和EGFR、EGFR和CD13、IGF-1R和ErbB3、EGFR-2和IGFR、VEGFR-2和Met、VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)、IL-12和TWEAK、IL-13和IL-1β、PDGFR和VEGF、EpCAM和CD3、Her2和CD3、CD19和CD3、EGFR和Her3、CD16a和CD30、CD30和PSMA、EGFR和CD3、CEA和CD3、TROP-2和HSG、TROP-2和CD3、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、RGMA和RGM B、Te38和TNFa、TNFa和Blys、TNFa和CD-22、TNFa和CTLA-4结构域、TNFa和GP130、TNFa和IL-12p40以及TNFa和RANK配体。
27.根据实施例1到24中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的一种或两种细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FILI、FILI(EPSILON)、FILI(ZETA)、ILIA、ILIB、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、ILIO、ILi1、ILI2A、ILI2B、ILI3、ILI4、ILI5、ILI6、ILI7、ILI7B、ILI8、ILI9、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、FGER1、FGFR2、FGFR3、EGFR、RORI、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、A2aR、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、CD40、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、ILIR1、ILIR2、ILIRLI、ILIRL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL 7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、ILIORA、ILIORB、IL11RA、ILI2RB1、ILI2RB2、ILI3RA1、ILI3RA2、ILI5RA、ILI7R、ILI8R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、ILIRAP、ILIRAPLI、ILIRAPL2、ILIRN、IL6ST、ILI8BP、ILI8RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN和THPO。
28.根据实施例1到24中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的一种或多种趋化因子、趋化因子受体和趋化因子相关蛋白：CCLI(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCLII(趋化因子)、CCLI3(MCP-4)、CCLI5(MIP-1d)、CCLI 6(HCC-4)、CCLI7(TARC)、CCLI 8(PARC)、CCLI9(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GRO1)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCLIO(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化素)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCRS(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSGSO)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、ILSRA(IL8Ra)、ILSRB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSFS、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、ILS、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
29.根据实施例1到24中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够其中所述双特异性抗原结合分子能够结合细胞因子对。
30.根据实施例29所述的抗原结合分子，其中所述双特异性抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的细胞因子对：TSLP、IL-1a和IL-Ιβ、IL-12和IL-18、TNFa和IL-23、TNFa和IL-13、TNF和IL-18、TNF和IL-12、TNF和IL-1β、TNF和MIF、TNF和IL-6、TNF和IL-6受体、TNF和IL-17、IL-17和IL-20、IL-17和IL-23、TNF和IL-15、TNF和VEGF、VEGFR和EGFR、PDGFR和VEGF、IL-13和IL-9、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-25、IL-13和TARC、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-13和TGF-β、IL-13和LHR激动剂、IL-13和CL25、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和ADAM 8以及TNFa和PGE4、IL-13和PED2以及TNF和PEG2。
31.根据实施例1到30中任一项所述的抗原结合分子，其中相对于特异于每个表位的单特异性抗体或抗体片段，所述抗原结合分子能够其中所述双特异性抗原结合分子以类似或更大的亲和力结合每个表位。
32.根据实施例1到31中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有激动剂功能。
33.根据实施例1到31中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有阻断功能，其相对于亲本抗体具有类似或更低的IC50，任选地其中所述亲本抗体是IgG同种型的人抗体。
34.根据实施例1到33中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子对单个配体是双特异性的，并且相对于一种或多种亲本抗体形成更高水平的1:1配体复合物。
35.一种抗原结合分子，其包括：
特异性结合第一表位的第一抗原结合Fab结构域；
特异性结合不同于所述第一表位的第二表位的第二抗原结合Fab结构域；
包括第一重链多肽和第二重链多肽的Fc结构域；
将所述第一抗原结合Fab结构域的重链的N端末端连接到所述第一重链多肽的C端末端的第一接头；以及
将所述第二抗原结合Fab结构域的重链的N端末端连接到所述第二重链多肽的C端末端的第二接头。
36.根据实施例35所述的抗原结合分子，其中所述第一重链多肽包括：
第一CH氨基酸序列；
第一VH氨基酸序列；以及
第二CH氨基酸序列，其中所述第一VH氨基酸序列位于所述第一CH氨基酸序列和所述第二CH氨基酸序列之间。
37.根据实施例36所述的抗原结合分子，其中所述第一CH氨基酸序列包括位于所述第一VH氨基酸序列N端的第一CH3氨基酸序列。
38.根据实施例36所述的抗原结合分子，其中所述第一CH3包括H435R突变和Y436F突变
39.根据实施例35到38中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第二重链多肽包括：
第三CH氨基酸序列；
第二VH氨基酸序列；以及
第四CH氨基酸序列，其中所述第二VH氨基酸序列位于所述第三CH氨基酸序列和所述第四CH氨基酸序列之间。
40.根据实施例39所述的抗原结合分子，其中所述第一CH氨基酸序列包括位于所述第一VH氨基酸序列N端的第一CH3氨基酸序列。
41.根据实施例40所述的抗原结合分子，其中所述第一CH3包括H435R突变和Y436F突变
42.根据实施例40或实施例41所述的抗原结合分子，其进一步包括将所述第一VH氨基酸序列的N端末端连接到所述第一CH3氨基酸序列的C端末端的第一接头。
43.根据实施例35到42中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第三CH氨基酸序列包括位于所述第二VH氨基酸序列N端的第二CH3氨基酸序列。
44.根据实施例43所述的抗原结合分子，其进一步包括将所述第二VH氨基酸序列的N端末端连接到所述第二CH3氨基酸序列的C端末端的第二接头。
45.根据实施例35到44中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第二CH氨基酸序列包括位于所述第一VH氨基酸序列C端的第一CH1氨基酸序列。
46.根据实施例35到45中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第四CH氨基酸序列包括位于所述第二VH氨基酸序列C端的第二CH1氨基酸序列。
47.根据实施例35到46中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括位于所述第一CH3氨基酸序列N端的第一CH2氨基酸序列。
48.根据实施例35到47中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括位于所述第二CH3氨基酸序列N端的第二CH2氨基酸序列。
49.根据实施例35到48中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子不包含铰链区二硫键。
50.根据实施例35到49中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括第一轻链多肽，所述第一轻链多肽包括：第一VL氨基酸序列；以及第一CL氨基酸序列。
51.根据实施例50所述的抗原结合分子，其进一步包括将第一CL与所述第一CH1连接的二硫键。
52.根据实施例35到51中任一项所述的抗原结合分子，其进一步包括第二轻链多肽，所述第二轻链多肽包括：第二VL氨基酸序列；以及第二CL氨基酸序列。
53.根据实施例521所述的抗原结合分子，其进一步包括将第二CL与所述第二CH1连接的二硫键。
54.根据实施例44到53中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括多肽。
55.根据实施例54所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头具有0到50个氨基酸的长度。
56.根据实施例54到55中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头具有相同的氨基酸序列。
57.根据实施例54到56中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一接头和所述第二接头各自包括聚甘氨酸和丝氨酸氨基酸序列。
58.根据实施例57所述的抗原结合分子，其中所述聚甘氨酸和丝氨酸氨基酸序列包括2到6个重复的GGGGS(SEQ ID NO:3)氨基酸序列。
59.根据实施例58所述的抗原结合分子，其中所述聚甘氨酸和丝氨酸氨基酸序列包括(G4S)2(SEQ ID NO:18)、(G4S)3(SEQ ID NO:4)或(G4S)4(SEQ ID NO:19)。
60.根据实施例52到59中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一轻链多肽和所述第二轻链多肽具有相同的氨基酸序列。
61.根据实施例35到60中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽具有相同的氨基酸序列。
62.根据实施例35到60中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一重链多肽和所述第二重链多肽具有不相同的氨基酸序列。
63.根据实施例35到61中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的一种或多种抗原：ABCF1、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRLI、ADORA2A、Aggrecan、AGR2、AICDA、AIF1、AIG1、AKAP1、AKAP2、AMH、AMHR2、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL3、ANGPTL4、ANPEP、APC、APOC1、AR、AZGP1(锌-a-糖蛋白)、ART-4、B7、B7.1、B7.2、BAD、BAFF、BAGI、BAIi、BCL2、BCL6、BDNF、BLNK、BLRl(MDRlS)、BlyS、BMPl、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMPS、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、BPAG1(凝集素)、BRCA1、Ba-733、BAGE、BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-I、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CD1a、CD2、CD3、CD4、CDS、CD8、CDI-IA、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a-e、CD67、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK-4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、C19orf10(IL27w)、C3、C4A、CS、CSR1、CANT1、CASPI、CASP4、CAV1、CCBP2(D6/JAB61)、CCLI(I-309)、CCLII(趋化因子)、CCL13(MCP-4)、CCLIS(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCLIS(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL2(MCP-1)、MCAF、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、SLC、exodus-2、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/趋化因子-2)、CCL2S(TECK)、CCL26(趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL2S、CCL3(MIP1a)、CCL4(MIP-1b)、CCLS(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCLS(mcp-2)、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CCR1(CKR1/HM14S)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCRS(CMKBRSIChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EB1)、CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI)、CCR9(GPR-9-6)、CCRLI(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、CD164、CDlC、CD200、CD-22、CD24、CD2S、CD3S、CD3E、CD3G、CD3Z、CD4、CD44、CD4SRB、CD47、CD4S、CDS2、CD69、CD72、CD79A、CD79B、CDSO、CDS1、CDS3、CDS6、CD137、CD13S、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CDH1(E-钙粘蛋白)、CDH10、CDH12、CDH13、CDHlS、CDH19、CDH20、CDHS、CDH7、CDHS、CDH9、CDK2、CDK3、CDK4、CDKS、CDK6、CDK7、CDK9、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN1C、CDKN2A(p16INK4a)、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、CEBPB、CER1、CHGA、CHGB、几丁质酶、CHST1O、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSFS、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSFS、CLDN3、CLDN7(封闭素-7)、CLN3、CLU(聚簇蛋白)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CNR1、COLISA1、COLIA1、COL4A3、COL6Al、CR2、CRP、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、CTLA-4、CTNNB1(b-连环蛋白)、CTSB(组织蛋白酶B)、CX3CLI(SCYD1)、CX3CR1(V2S)、CXCLI(GRO1)、CXCLIO(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCLS(ENA-7S/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、CYBS、CYC1、CYSLTR1、HIF-1-a、结肠特异性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、c-met、DAB2IP、DES、DKFZp4S1J011S、DNCLI、DPP4、DAM、EGFR、EGFRvlll、EGP-1、EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、E2F1、ECGF1、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EGFR、ELAC2、ENG、EN01、EN02、EN03、EPHB4、EPO、EREG、ERKS、ESR1、ESR2、F3(TF)、FADD、FasL、FASN、FCER1A、FCER2、FCGR3A、FGF、FGF1(aFGF)、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF1S、FGF19、FGF2(bFGF)、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGFS、FGF7(KGF)、FGFS、FGF9、FGFR3、FIGF(VEGFD)、FILI(EPSILON)、FILI(ZETA)、FLJ12SS4、FLJ2SS30、FLRT1(纤连蛋白)、FOS、FOSLI(FRA-1)、FY(DARC)、Flt-I、Flt-3、叶酸受体、G250抗原、GAGE、GROB、GABRP(GABAa)、GAGEB1、GAGEC1、GALNAC4S-6ST、GATA3、GDFS、GFil、GGTl、GM-CSF、GNAS1、GNRH1、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR44、GPRS1(FKSGSO)、GRCC10(C10)、GRP、GSN(凝溶胶蛋白)、GSTP1、HAVCR2、HDAC4、HDACS、HDAC7A、HDAC9、HGF、HIP1组胺和组胺受体、HLA-A、HLA-DRA、HM74、HMOX1、HUMCYT2A、HLA-DR、HMI 24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2或1a、IGF-IR、IFN-γ、IFN-α、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-25、IGBP1、IGF1、IGF1R、IGF2、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP6、IL-1、IL-10、IL-10RA、IL-10RB、IL-11、IL-11RA、IL-12、IL-12A、IL-12B、IL-12RB1、IL-12RB2、IL-13、IL-13RA1、IL-13RA2、IL-14、IL-1S、IL-1SRA、IL-16、IL-17、IL-17B、IL-17C、IL-17R、IL-18、IL-18BP、IL-18R1、IL-18RAP、IL-19、IL-IA、IL-1B、IL-1F10、IL-1FS、IL-1F6、IL-1F7、IL-1F8、IL-1F9、IL-1HY1、IL-1R1、IL-1R2、IL-1RAP、IL-1RAPL1、IL-1RAPL2、IL-1RL1、IL-1RL2 IL-1RN、IL-2、IL-20、IL-20RA、IL-21R、IL-22、IL-22R、IL-22RA2、IL-23、IL-24、IL-2S、IL-26、IL-27、IL-28A、IL-28B、IL-29、IL-2RA、IL-2RB、IL-2RG、IL-3、IL-30、IL-3RA、IL-4、IL-4R、IL-S、IL-5RA、IL-6、IL-6R、IL-6ST(糖蛋白130)、IL-7、IL-7R、IL-S、IL-SRA、IL-SRB、IL-9、IL-9R、IL-K、INHA、INHBA、INSL3、INSL4、IRAK1、IRAK2、ITGA1、ITGA2、ITGA3、ITGA6(a6抗原)、ITGAV、ITGB3、ITGB4(b4整合素)胰岛素样生长因子-I(IGF-1)、ICEBERG、ICOSL、ID2、IFN-a、IFNA1、IFNA2、IFNA4IFNAS、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNW1、JAG1、JAK1、JAK3、JUN、K6HF、KAi1、KDR、KITLG、KLFS(GC盒BP)、KLF6、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK1S、KLK3、KLK4、KLKS、KLK6、KLK9、KRT1、KRT19(角蛋白19)、KRT2A、KRTHB6(毛发特异性II型角蛋白)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS 1-4、Le-Y、LDR/FUT、LAMAS、LEP(瘦素)、Lingo-p7S、Lingo-Troy、LPS、LTA(TNF-b)、LTB、LTB4R(GPR16)、LTB4R2、LTBR、MACMARCKS、MAG或Omgp、MAP2K7(c-Jun)、MDK、MIB1、中期因子、MIF、MIP-2、MKI67(Ki-67)、MMP2、MMP9、MS4A1、MSMB、MT3(金属硫蛋白-III)、MTSS1、MUC1(粘蛋白)、MYC、MYD88、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MAGE、MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ES0-1、TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUM-1/2、MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、NCK2、神经能、NFKB1、NFKB2、NGFB(NGF)、NGFR、NgR-Lingo、NgR-Nogo66(Noga)、NgRp7S、NgR-Troy、NME1(NM23A)、NOXS、NPPB、NROB1、NROB2、NR1D1、NR1D2、NRIH2、NRIH3、NRIH4、NR1I2、NR1I3、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR2F6、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR4A3、NRSA1、NRSA2、NR6A1、NRP1、NRP2、NTSE、NTN4、ODZ1、OPRD1、PCSK9、P2RX7、PAP、PART1、PATE、PAWR、PCA3、PCNA、PD-1、PD-L1、α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDFS、CGRP、Lingo-I、因子IXa、因子X、ICOS、GARP、BTLA、CD160、RORI、2B4、KIR、CD27、OX40、A2aR、PDGFA、PDGFB、PECAM1、PF4(CXCL4)、PGF、PGR、磷聚糖、PIAS2、PIK3CG、PLAU(uPA)、PLG、PLXDC1、PPBP(CXCL7)、PPID、PR1、PRKCQ、PRKD1、PRL、PROC、PROK2、PSAP、PSCA、PTAFR、PTEN、PTGS2(COX-2)、PTN、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME、PSMA、10PIGF、ILGF、ILGF-IR、IL-6、RS5、RANTES、RAC2(p21Rac2)、RARB、RGS1、RGS13、RGS3、RNFl10(ZNF144)、ROB02、S100A2、SCGB1D2(亲脂素B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SCYE1(内皮单核细胞活化细胞因子)、SDF2、SERPINA1、SERPINA3、SERPINBS(乳腺丝抑蛋白)、SERPINE1(PAI-1)、SERPINF1、SHBG、SLA2、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、SLIT2、SPP1、SPRR1B(Sprl)、ST6GAL1、STAB1、STATE、STEAP、STEAP2、TIOI、SAGE、5100、生存素、生存素-2B、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、TNF-α、Tn-抗原、ThomsonFriedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、TB4R2、TBX21、TCP10、TDGF1、TEK、TGFA、TGFB1、TGFBlil、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、THBS1(血小板反应蛋白-1)、THBS2、THBS4、THPO、TIE(Tie-1)、TIMP3、组织因子、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、TLRS、TLR6、TLR7、TLRS、TLR9、TNF、TNF-a、TNFAIP2(B94)TNFAIP3、TNFRSF11A、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF21、TNFRSFS、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF7、TNFRSFS、TNFRSF9、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF1S(VEGI)、TNFSF18、TNFSF4(OX40配体)、TNFSFS(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSFS(CD30配体)、TNFSF9(4-lBB配体)、TOLLIP、Toll-样受体、TOP2A(拓扑异构酶Iia)、TPS3、TPM1、TPM2、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAPS、TRAF6、TREM1、TREM2、TRPC6、TSLP、TWEAK、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-IA抗原、补体因子C3、C3a、C3b、C5a、CS、血管生成标志物、bcl-2、bcl-6、Kras、cMET、CD19/CD3、BCMA/CD3、EGFR、HER3、IL17RA/IL7R、IL-6/IL-23、IL1/IL-8、IL-6、IL-6R/IL-21、IL-21R、ANG2/VEGF、VEGF/PDGFR-β、血管内皮生长因子(VEGF)受体2/CD3、PSMA/CD3、EPCAM/CD3、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、VEGFB、VEGFC、多功能蛋白聚糖、VHL CS、VLA-4、c-FMS/CSFIR、RET、HER3、HER4、IGFR、PDGFR、c-KIT、BCR、整合素、MMPs VEGF、EGF、PIGF、PDGF、HGF、血管生成素、ERBB-3/C-MET、ERBB-2/C-MET、EGF受体l/CD3、EGFR/HER3、PSCA/CD3、C-MET/CD3、ENDOSIALIN/CD3、EPCAM/CD3、IGF-1R/CD3、FAPALPHA/CD3、EGFR/IGF-IR、IL 25 17A/F、EGF受体l/CD3和CD19/CD16、KHI、Tn-抗原、TF-抗原、CD44、糖脂、鞘糖脂，如30Gg3、Gb3、GD3、GD2、Gb5、Gm1、Gm2、唾液酸四糖神经酰胺、XCL1(淋巴细胞趋化素)、XCL2(SCM-1b)、XCR1(GPRS/CCXCR1)、YY1和ZFPM2。
64.根据实施例35到61中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的靶抗原对：CD137和CD20、CD137和EGFR、CD137和Her-2、CD137和PD-1、CD137和PDL-1、VEGF和PD-L1、Lag-3和TIM-3、OX40和PD-1、TIM-3和PD-1、TIM-3和PDL-1、EGFR和DLL-4、CD138和CD20、CDI 38和CD40、CDI 9和CD20、CD20和CD3、CD3和CD33、CD3和CD133、CD47和CD20、CD38和CD138、CD38和CD20、CD20和CD22、CD38和CD40、CD40和CD20、CD-8和IL-6、CSPGs和RGM A、CTLA-4和BTN02、IGF1和IGF2、IGF1/2和Erb2B、IGF-1R和EGFR、EGFR和CD13、IGF-1R和ErbB3、EGFR-2和IGFR、VEGFR-2和Met、VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)、IL-12和TWEAK、IL-13和IL-1β、PDGFR和VEGF、EpCAM和CD3、Her2和CD3、CD19和CD3、EGFR和Her3、CD16a和CD30、CD30和PSMA、EGFR和CD3、CEA和CD3、TROP-2和HSG、TROP-2和CD3、MAG和RGM A、NgR和RGM A、NogoA和RGM A、OMGp和RGM A、PDL-1和CTLA-4、CTLA-4和PD-1、PD-1和TIM-3、RGMA和RGM B、Te38和TNFa、TNFa和Blys、TNFa和CD-22、TNFa和CTLA-4结构域、TNFa和GP130、TNFa和IL-12p40以及TNFa和RANK配体。
65.根据实施例35到61中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的一种或两种细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FILI、FILI(EPSILON)、FILI(ZETA)、ILIA、ILIB、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、ILIO、ILi1、ILI2A、ILI2B、ILI3、ILI4、ILI5、ILI6、ILI7、ILI7B、ILI8、ILI9、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、FGER1、FGFR2、FGFR3、EGFR、RORI、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、A2aR、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、CD40、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配体)、TNFSF5(CD40配体)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配体)、TNFSF8(CD30配体)、TNFSF9(4-1BB配体)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(AP03L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、ILIR1、ILIR2、ILIRLI、ILIRL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL 7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、ILIORA、ILIORB、IL11RA、ILI2RB1、ILI2RB2、ILI3RA1、ILI3RA2、ILI5RA、ILI7R、ILI8R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、ILIRAP、ILIRAPLI、ILIRAPL2、ILIRN、IL6ST、ILI8BP、ILI8RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN和THPO。
66.根据实施例35到61中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的一种或多种趋化因子、趋化因子受体和趋化因子相关蛋白：CCLI(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCLII(趋化因子)、CCLI3(MCP-4)、CCLI5(MIP-1d)、CCLI 6(HCC-4)、CCLI7(TARC)、CCLI 8(PARC)、CCLI9(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/exodus-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GRO1)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCLIO(IP 10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴细胞趋化素)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCRS(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSGSO)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、ILSRA(IL8Ra)、ILSRB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSFS、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、ILS、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
67.根据实施例35到61中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够其中所述抗原结合分子能够结合细胞因子对。
68.根据实施例67所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子能够结合选自由以下组成的组的细胞因子对：TSLP、IL-1a和IL-Ιβ、IL-12和IL-18、TNFa和IL-23、TNFa和IL-13、TNF和IL-18、TNF和IL-12、TNF和IL-1β、TNF和MIF、TNF和IL-6、TNF和IL-6受体、TNF和IL-17、IL-17和IL-20、IL-17和IL-23、TNF和IL-15、TNF和VEGF、VEGFR和EGFR、PDGFR和VEGF、IL-13和IL-9、IL-13和IL-4、IL-13和IL-5、IL-13和IL-25、IL-13和TARC、IL-13和MDC、IL-13和MIF、IL-13和TGF-β、IL-13和LHR激动剂、IL-13和CL25、IL-13和SPRR2a、IL-13和SPRR2b、IL-13和ADAM 8以及TNFa和PGE4、IL-13和PED2以及TNF和PEG2。
69.根据实施例35到68中任一项所述的抗原结合分子，其中相对于特异于每个表位的单特异性抗体或抗体片段，所述抗原结合分子能够其中所述抗原结合分子以类似或更大的亲和力结合每个表位。
70.根据实施例35到69中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有激动剂功能。
71.根据实施例35到70中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子具有阻断功能，其相对于亲本抗体具有类似或更低的IC50，任选地其中所述亲本抗体是IgG同种型的人抗体。
72.根据实施例35到71中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子对单个配体是双特异性的，并且相对于一种或多种亲本抗体形成更高水平的1:1配体复合物。
73.根据实施例35到72中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子与选自由以下组成的组的药剂缀合：免疫粘附素分子、显像剂、治疗剂和细胞毒性剂。
74.一种药物组合物，其包括根据实施例1到73中任一项所述的抗原结合，以及药学上可接受的载体。
75.一种编码根据实施例1到73中任一项所述的抗原结合分子的核酸分子。
76.根据实施例74所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地连接至表达控制序列。
77.一种表达载体，其包括根据实施例75或76所述的核酸分子。
78.一种宿主细胞，其包括根据实施例75或76所述的核酸分子或根据实施例77所述的载体。
79.根据实施例78所述的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞。
80.根据实施例78或79所述的宿主细胞，其中所述细胞是动物细胞。
81.根据实施例78到79中任一项所述的宿主细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞，任选地是CHO细胞。
82.一种治疗患有与实施例63中所述的任何一种或多种抗原相关的病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施例1到73中任一项所述的抗原结合分子。
83.一种在受试者中抑制分子通路的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施例1到73中任一项所述的抗原结合分子以抑制所述分子通路。
84.一种在受试者中活化分子通路的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施例1到73中任一项所述的抗原结合分子以活化所述分子通路。
85.一种根据实施例1到73中任一项所述的抗原结合分子在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与实施例63中所述的任何一种或多种抗原相关的病状。
9.参考文献引用
本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和其它文件出于所有目的在此通过引用整体并入，其程度就如同单独地指明了每个单独的出版物、专利、专利申请或其它文件出于所有目的通过引用并入。在本文中并入的一个或多个参考文献的教导与本公开之间存在不一致的情况下，本说明书的教导是预期的。
序列表
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<120> 新型抗原结合分子形式
<130> RGN-001WO
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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Pro Pro Val Ala
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Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
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Ala
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe
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Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Pro Ser Val Phe
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<400> 28
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
100 105 110
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
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<400> 29
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10 15
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 30
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 31
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 32
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 32
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
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35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 33
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 33
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成5xHi标签”
<400> 34
His His His His His
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成6xHis标签”
<400> 35
His His His His His His
1 5
<210> 36
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 36
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 37
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 37
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 38
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 38
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 39
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 39
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25

Claims (61)

1.一种抗原结合分子，其与第一靶分子结合并且包括：
(a)第一多肽，所述第一多肽在N到C端取向上包括：
(i)第一Fc结构域；以及
(ii)第一Fab结构域，所述第一Fab结构域包括与第一轻链可变区(VL)缔合的第一重链可变区(VH)；以及
(b)第二多肽，所述第二多肽在N到C端取向上包括：
(i)第二Fc结构域；以及
(ii)第二Fab结构域，所述第二Fab结构域包括与第二VL缔合的第二VH，
其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域彼此缔合以形成Fc区。
2.根据权利要求1所述的抗原结合分子，其包括所述第一Fc结构域和所述第一VH之间的第一接头。
3.根据权利要求2所述的抗原结合分子，其中所述第一接头长度为5个氨基酸到60个氨基酸、长度为10个氨基酸到60个氨基酸残基、长度为5个氨基酸到20个氨基酸残基、长度为5个氨基酸到30个氨基酸残基、长度为10个氨基酸到30个氨基酸残基、长度为10个氨基酸到20个氨基酸残基、长度为20个氨基酸到50个氨基酸或长度为25个氨基酸到35个氨基酸。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的抗原结合分子，其中所述第一接头包括GnS或SGn的多聚体，任选地其中n是1到7的整数。
5.根据权利要求4所述的抗原结合分子，其中所述第一接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的多聚体，任选地其中所述第一接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的2到6个重复，任选地其中所述第一接头包括(G4S)2(SEQ ID NO:18)、(G4S)3(SEQ ID NO:4)或(G4S)4(SEQ ID NO:19)。
6.根据权利要求2到5中任一项所述的抗原结合分子，其包括所述第二Fc结构域和所述第二VH之间的第二接头，任选地其中所述第一接头和所述第二接头具有相同的氨基酸序列。
7.根据权利要求6所述的抗原结合分子，其中所述第二接头长度为5个氨基酸到60个氨基酸、长度为10个氨基酸到60个氨基酸、长度为5个氨基酸到20个氨基酸残基、长度为5个氨基酸到30个氨基酸残基、长度为10个氨基酸到30个氨基酸残基、长度为10个氨基酸到20个氨基酸残基、长度为20个氨基酸到50个氨基酸或长度为25个氨基酸到35个氨基酸。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的抗原结合分子，其中所述第二接头包括GnS或SGn的多聚体，任选地其中n是1到7的整数。
9.根据权利要求8所述的抗原结合分子，其中所述第二接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的多聚体，任选地其中所述第二接头包括G4S(SEQ ID NO:3)的2到6个重复，任选地其中所述第二接头包括(G4S)2(SEQ ID NO:18)、(G4S)3(SEQ ID NO:4)或(G4S)4(SEQ ID NO:19)。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽包括位于所述第一Fc结构域N端的第一铰链结构域并且所述第二多肽包括位于所述第二Fc结构域N端的第二铰链结构域。
11.根据权利要求10所述的抗原结合分子，其中所述第一铰链结构域和所述第二铰链结构域通过二硫键连接。
12.根据权利要求10所述的抗原结合分子，其中所述第一铰链结构域和所述第二铰链结构域不通过二硫键连接。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽不包括位于所述第一Fc结构域N端的VH和/或其中所述第二多肽不包括位于所述第二Fc结构域N端的VH。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的抗原结合分子，其具有一个铰链区。
15.根据权利要求14所述的抗原结合分子，其具有图13A或图13C所示的铰链形式。
16.根据权利要求1到13中任一项所述的抗原结合分子，其具有两个铰链区。
17.根据权利要求16所述的抗原结合分子，其具有图13B所示的铰链形式。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽和第二多肽是相同的。
19.根据权利要求1到17中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽和第二多肽不相同。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一VL和第二VL是通用轻链，或其中所述第一Fab结构域或所述第二Fab结构域的轻链恒定区和第一重链恒定区(CH1)呈Crossmab排列。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域和所述第二Fab结构域不是单链Fab的形式。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的抗原结合分子，与包括所述第一Fab结构域和所述第二Fab结构域的天然免疫球蛋白相比，其以更大的亲和力和/或亲合力结合所述第一靶分子。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的抗原结合分子，其是二价的。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的抗原结合分子，其是所述第一靶分子的拮抗剂。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的抗原结合分子，其抑制所述第一靶分子与结合配偶体的结合，任选地其中所述结合配偶体是所述第一靶分子的受体。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包括人Fc序列。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包括人IgG1或人IgG4 Fc序列。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的抗原结合分子，其中所述Fc区包括Fc异二聚体，任选地其中与野生型Fc结构域相比，所述Fc异二聚体中的所述Fc结构域包括孔内旋钮突变。
29.根据权利要求28所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽中的所述Fc结构域包括旋钮突变并且所述第二多肽中的所述Fc结构域包括孔突变。
30.根据权利要求28所述的抗原结合分子，其中所述第二多肽中的所述Fc结构域包括旋钮突变并且所述第一多肽中的所述Fc结构域包括孔突变。
31.根据权利要求26所述的抗原结合分子，其中与野生型Fc区相比，所述Fc区包括星形突变。
32.根据权利要求26所述的抗原结合分子，其中所述第一多肽中的所述Fc结构域包括H435R突变和Y436F突变。
33.根据权利要求26所述的抗原结合分子，其中所述第二多肽中的所述Fc结构域包括H435R突变和Y436F突变。
34.根据权利要求1到33中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域中的CL和CH1通过二硫键连接和/或其中所述第二Fab结构域中的CL和CH1通过二硫键连接。
35.根据权利要求1到34中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一Fab结构域和所述第二Fab结构域与所述第一靶分子结合。
36.根据权利要求1到35中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是小的可溶性配体，任选地其中所述第一靶分子是细胞因子或趋化因子。
37.根据权利要求1到35中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是细胞表面蛋白，任选地其中所述第一靶分子是肿瘤相关抗原。
38.根据权利要求1到37中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子的分子量(i)小于100kDa，不包含翻译后修饰；小于100kDa，包含翻译后修饰；小于75kDa，不包含翻译后修饰；小于75kDa，包含翻译后修饰；小于60kDa，不包含翻译后修饰；小于60kDa，包含翻译后修饰；小于45kDa，不包含翻译后修饰；或小于45kDa，包含翻译后修饰；和/或分子量(ii)为至少5kDa，不包含翻译后修饰；为至少5kDa，包含翻译后修饰；为至少10kDa，不包含翻译后修饰；或为至少10kDa包含翻译后修饰。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是糖基化的。
40.根据权利要求1到38中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子未被糖基化。
41.根据权利要求1到40中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是单体。
42.根据权利要求1到40中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是二聚体，所述二聚体任选地是同二聚体或异二聚体。
43.根据权利要求1到40中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是三聚体，所述三聚体任选地是同三聚体。
44.根据权利要求1到40中任一项所述的抗原结合分子，其中所述第一靶分子是四聚体，所述四聚体任选地是同四聚体。
45.根据权利要求1到44中任一项所述的抗原结合分子，其是单特异性的。
46.根据权利要求1到44中任一项所述的抗原结合分子，其是双特异性的。
47.根据权利要求46所述的抗原结合分子，其能够结合所述第一靶分子上的第一表位和第二表位，任选地其包括至少一个结合所述第一靶分子上的所述第一表位的Fab结构域和至少一个结合所述第二表位的Fab结构域，任选地其能够同时结合所述第一靶分子上的不同表位。
48.根据权利要求46所述的抗原结合分子，其能够结合所述第一靶分子并结合第二靶分子。
49.根据权利要求48所述的抗原结合分子，其包括至少一个结合所述第一靶分子的Fab结构域和至少一个结合所述第二靶分子的Fab结构域，任选地其可以同时结合所述第一靶分子和所述第二靶分子。
50.根据权利要求1到49中任一项所述的抗原结合分子，相对于包括所述第一Fab和所述第二Fab的人IgG抗体，其以较低的IC50阻断所述靶分子与其受体的结合。
51.根据权利要求1到50中任一项所述的抗原结合分子，与包括所述第一Fab和所述第二Fab的人IgG抗体相比，其以更大的亲和力结合所述靶分子。
52.一种缀合物，其包括根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子和细胞毒性剂或细胞抑制剂。
53.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子或根据权利要求52所述的缀合物和赋形剂。
54.一种治疗患有与靶分子的异常表达或活性相关的病状的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子、根据权利要求52所述的缀合物或根据权利要求53所述的药物组合物。
55.一种在受试者中抑制与靶分子相关的分子通路的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子、根据权利要求52所述的缀合物或根据权利要求53所述的药物组合物。
56.一种在用于治疗与靶分子的异常表达或活性相关的病状的方法中使用的根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子、根据权利要求52所述的缀合物或根据权利要求53所述的药物组合物。
57.一种用于抑制与靶分子相关的分子通路的根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子、根据权利要求52所述的缀合物或根据权利要求53所述的药物组合物。
58.一种核酸分子或多个核酸分子，其包括编码根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子的一个或多个核苷酸序列，任选地其中所述一个或多个核苷酸序列各自可操作地连接至表达控制序列。
59.一种经工程改造以表达根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子的细胞。
60.一种用一种或多种表达载体转染的细胞，所述一种或多种表达载体包括在一个或多个启动子的控制下编码根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子的一个或多个核酸序列。
61.一种产生根据权利要求1到51中任一项所述的抗原结合分子的方法，所述方法包括：
(a)在表达所述抗原结合分子的条件下培养根据权利要求59或权利要求60所述的细胞；以及
(b)从细胞培养物中回收所述抗原结合分子；并且，任选地所述方法进一步包括富集所述抗原结合分子和/或纯化所述抗原结合分子。
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