KR20220058546A - 신규 항원 결합 분자 포맷 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비-네이티브(non-native) 배치(configuration)에서 Fab 도메인을 포함하는 항원 결합 분자(ABM), ABM 및 세포독성제(cytotoxic agent) 또는 세포증식억제제(cytostatic agent)를 포함하는 ABM 접합체, ABM 및 ABM 접합체를 함유하는 약학적 조성물, 암을 치료하기 위해 ABM, ABM 접합체 및 약학적 조성물을 사용하는 방법, ABM을 인코딩하는 핵산, ABM을 발현하도록 조작된 세포, 및 ABM을 생성하는 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 8월 8일에 출원된 미국 임시 특허 출원 62/884,496호 및 2020년 7월 10일에 출원된 미국 임시 특허 출원 63/050,483호의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참조로서 본원에 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하고, 그 전문은 참조로서 본원에 포함된다. 2020년 8월 6일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 RGN-001WO_SL.txt로 명명되고, 크기는 25,358 바이트이다.
대부분의 천연 발생 항체 분자는 일반적으로 2개의 소위 경쇄 폴리펩타이드(경쇄) 및 2개의 소위 중쇄 폴리펩타이드(중쇄)를 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는, 항원과 상호작용할 수 있는 결합 영역을 포함하는 가변 도메인(가변 영역)(일반적으로 폴리펩타이드 사슬의 아미노 말단 부분)을 함유한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드는 불변 영역(일반적으로 카르복실 말단 부분)을 포함한다.
세포 또는 세포주의 단일 클론에 의해 생성되는 재조합 단일클론 항체는 지난 20년 동안 여러 가지 상이한 질환의 치료를 위한 생물학적 약물의 매우 성공적인 부류로서 출현하였다. 단일클론 항체(mAb)는 생물치료(biotherapeutic) 생성물의 유의한 부류이고, 이들 단일클론 항체는 많은 생명-위협적 질환 및 만성 질환을 치료하는 데 있어서 두드러진 성공을 거두었다.
에피토프가 항체의 항원 결합 부분, 예를 들어 Fab 도메인에 의해 접근 가능할 때, 친화도 및/또는 결합력에서의 증가가 발생한다. 그러나, 종래의 항체 형식의 기하학은, 특히 표적이 작은 크기일 때, 또는 요망되는 에피토프(다수의 표적 분자 상의 에피토프 포함)가 상대적으로 근접한 물리적 근접성에 있거나 근접한 물리적 근접성에 있는 것이 요망될 때, 단일 표적 분자 상의 다수의 에피토프를 인식하는 항체의 능력을 제한한다. 그러므로, 대안적인 항체-항원 결합 기하학을 통해 친화도, 결합력, 또는 항체 기능을 향상시킬 결합 분자의 생산에 효율적인 플랫폼이 유용할 것이다.
본 개시내용은 비-네이티브(non-native) 배치에서 적어도 2개의 Fab 도메인을 함유하는 항원 결합 분자("ABM")를 제공한다. ABM은 각각이 Fc 도메인을 포함하는 적어도 2개의 폴리펩타이드 사슬, 및 적어도 2개의 Fab 도메인의 하나의 구성요소를 포함한다. 개시내용의 예시적인 ABM은 도 1b, 2b 및 3a 내지 3d에 예시되어 있다.
Fc 도메인 및 임의의 회합된 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 각각의 폴리펩타이드 사슬은 본원에서 "반항체(half antibody)"로 지칭된다. 개시내용의 전형적인 ABM은 이의 Fc 도메인을 통해 회합된 2개의 반항체를 포함한다. 회합된 Fc 도메인은 함께 Fc 영역을 형성한다. Fc 영역에 더하여, 개시내용의 전형적인 ABM은 각각의 반항체에서 비-네이티브 배치에서 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함한다. 비-네이티브 배치에서 Fab 도메인 중 적어도 하나 또는 이러한 Fab 도메인 둘 다는 표적 분자에 결합한다. "네이티브 배치" 또는 "네이티브 면역글로불린 배치"는 천연-발생 IgG 항체에서 항체 도메인의 배치를 의미한다. 수반되는 개략적인 도면에서, VH 도메인은 숫자 (1)로 표지되며, CH1 도메인은 숫자 (2)로 표지되고, 힌지 도메인은 숫자 (3)으로 표지되며, CH2 도메인은 숫자 (4)로 표지되고, CH3 도메인은 숫자 (5)로 표지되며, VL 도메인은 숫자 (6)으로 표지되고, CL 도메인은 숫자 (7)로 표지되며, 힌지 도메인이 아닌 링커는 숫자 (8)로 표지된다. 그러므로, 첨부된 도면에서 표지를 참조로 하여, 네이티브 면역글로불린 배치는
ㆍ N-으로부터-C 말단 배향으로, VH 도메인(1), CH1 도메인(2), 제2(중쇄) 폴리펩타이드의 힌지 영역에 이황화 브릿지를 통해 연결된 힌지 영역 (3); CH2 도메인(4), 및 CH3 도메인(5)으로 본질적으로 구성되는 제1(중쇄) 폴리펩타이드;
ㆍ N-으로부터-C 말단 배향으로, VH 도메인(1), CH1 도메인(2), 제1(중쇄) 폴리펩타이드의 힌지 영역에 이황화 브릿지를 통해 연결된 힌지 영역 (3); CH2 도메인(4), 및 CH3 도메인(5)으로 본질적으로 구성되는 제2(중쇄) 폴리펩타이드;
ㆍ N-으로부터-C 말단 배향으로, 제1(중쇄) 폴리펩타이드와 회합된 VL 도메인(6) 및 CL 도메인(7)으로 본질적으로 구성되는 제3(경쇄) 폴리펩타이드; 및
ㆍ N-으로부터-C 말단 배향으로, 제2(중쇄) 폴리펩타이드와 회합된 VL 도메인(6) 및 CL 도메인(7)으로 본질적으로 구성되는 제4(경쇄) 폴리펩타이드로 본질적으로 구성된다.
"네이티브 배치" 또는 "네이티브 면역글로불린 배치"라는 지칭은 용어 야생형 항체 서열 또는 단독 단일특이적 항체로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 그보다는, 도 1a 및 도 2a에서, 형식은 변이체 서열을 갖는 단일특이적 항체(도 1a) 또는 전형적인 이중특이적 항체(도 2b) 둘 다에 적용될 수 있다. 도 1a의 단일특이적 항체 형식과 도 2a의 이중특이적 항체 형식 사이의 근본적인 차이는 이들의 배치가 아니라, Fc 헤테로이량체(예를 들어, 섹션 6.2.7.2에기재된 바와 같음)의 사용이며, 여기서 각각의 Fc 영역은 상이한 VH 도메인에 연결되어 상이한 에피토프에의 결합을 가능하게 한다. 명료성을 위해, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이중특이적"은, 동일한 항원 또는 표적 분자 상에 있거나 상이한 항원 또는 표적 분자 상에 있든지 간에, 임의의 2개의 상이한 에피토프에의 결합을 지칭한다.
개시내용의 ABM은 작은 가용성 표적 분자, 예를 들어 사이토카인 또는 케모카인에 결합하는 데 특히 유용하고, 예를 들어 결합 파트너, 예컨대 수용체에의 표적 분자의 결합을 차단함으로써 표적 분자의 활성을 길항시키는 데 적용된다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 개시내용의 결합 형식은 적어도 2개의 Fab 도메인을 포함하는 네이티브 면역글로불린보다 더 큰 친화도 및/또는 결합력으로 표적 분자에 결합하는 것을 허용하는 것으로 여겨진다.
이들 ABM 형식은 아래에서 더 상세히 기재되어 있다.
제1 양태에서, 개시내용의 ABM은
ㆍ 제1 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 선택적인 힌지 도메인;
- 제1 Fc 도메인; 및
- 제1 경쇄 가변 영역(VL)과 회합된 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 Fab(Fab1) 도메인을 포함하는, 제1 반항체; 및
ㆍ 제2 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 선택적인 힌지 도메인;
- 제2 Fc 도메인; 및
- 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab("Fab2") 도메인을 포함하는, 제2 반항체
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성하고, 선택적인 힌지 도메인은 존재한다면 이황화 브릿지를 통해 서로 회합될 수 있다.
일반적으로 본원에서 ABM 형식 "A"("형식 A")로 지칭되고 이따금 본원에서 "Fc-Fab" 형식으로 지칭되는 이러한 유형의 ABM의 2개의 구현예는 도 1b 및 도 2b, 뿐만 아니라 도 13a, 도 13b 및 도 13c에 도시된 이들의 변이에 예시되어 있다. 이에, 본 개시내용은 도 1b 및 도 2b에 도시된 형식 A ABM을 제공하며, 형식 A ABM은
ㆍ 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 Fc 도메인;
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- 링커(8); 및
- Fab1 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab1 VH 도메인(1) 및 Fab1 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab1 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab1 VL 도메인(6) 및 Fab1 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 이황화 결합을 통해 제1 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제2 Fc 도메인;
- 이황화 결합을 통해 제1 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- 링커(8); 및
- Fab2 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab2 VH 도메인(1) 및 Fab2 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab2 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab2 VL 도메인(6) 및 Fab2 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소를 포함하는, 제2 폴리펩타이드
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성한다.
도 1b의 구현예에서, Fc 호모이량체를 형성하는 Fc 도메인을 포함하는 반항체는 둘 다 동일하고, 생성된 ABM은 단일특이적이다. 도 2b의 구현예에서, ABM은 Fc 헤테로이량체를 포함하여, 상이한 Fab1 VH 도메인 및 Fab2 VH 도메인의 사용 및 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적 분자의 생성을 가능하게 한다. 도 1b, 도 2b 및 도 13a는 ABM이 Fc 도메인에 대해 N-말단에서 힌지 도메인으로 이루어진 힌지 영역을 갖는 구현예를 예시하는 한편, 형식 A ABM은 힌지 영역을 갖지 않거나(예시되지 않음), Fc 영역에 대해 C-말단에서 힌지 영역을 갖거나(도 13c), Fc 영역에 대해 N-말단 및 C-말단에서 힌지 영역을 갖는다(도 13b). Fc 영역에 대해 N-말단 및/또는 C-말단에서 사용될 수 있는 예시적인 힌지 도메인은 아미노산 서열 GGGGSCPPC(SEQ ID NO:1) 및 ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2)를 포함하지만, 도 13a 내지 도 13c에 도시된 바와 같이, 형식 A ABM은 대안적인 힌지 영역 서열을 가질 수 있다. 마찬가지로, 도 13a 내지 도 13c가 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)를 도시하긴 하지만, 다른 링커 서열이 사용될 수 있다.
도 1b 및 도 2b는 단지 2개의 결합 도메인(Fab1 및 Fab2)을 함유하는 형식 A ABM의 구현예를 예시하는 한편, 개시내용의 ABM은 추가의 결합 도메인, 예를 들어, scFv 또는 Fab 도메인을 함유할 수 있다. 그러나 소정의 양태에서, Fab1 및 Fab2는 형식 A ABM의 단독 결합 도메인이다.
제2 양태에서, 개시내용의 ABM은
ㆍ 제1 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제1 VL과 회합된 제1 VH를 포함하는 제1 Fab(Fab1) 도메인;
- 제1 스페이서(spacer) 도메인; 및
- 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 반항체; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab(Fab2) 도메인;
- 제2 스페이서 도메인; 및
- 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성한다.
이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, Fc 도메인과 Fab 도메인 사이의 스페이서 도메인의 포함은 Fc 영역과 Fab의 항원 결합 부위 사이의 더 큰 가요성(flexibility), 그리고 결과적으로 ABM의 항원 또는 표적 분자에의 이러한 ABM의 결합의 더 높은 친화도 및/또는 친화력을 초래하는 것으로 여겨진다. 용어 "항원" 및 "표적 분자"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
소정의 구현예에서, 스페이서 도메인은 연장된 링커이다. 일반적으로 본원에서 형식 "B"("형식 B")로 지칭되고 이따금 "리치(Reach)" 형식으로 지칭되는 ABM의 이러한 형식은 도 3a에 예시되어 있다. 이에, 본 개시내용은 도 3a에 도시된 형식 B ABM을 제공하며, 형식 B ABM은
ㆍ 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab1 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab1 VH 도메인(1) 및 Fab1 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab1 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab1 VL 도메인(6) 및 Fab1 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 연장된 링커인 링커 도메인(8);
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab2 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab2 VH 도메인(1) 및 Fab2 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab2 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab2 VL 도메인(6) 및 Fab2 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 연장된 링커인 링커 도메인(8);
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함한다.
도 3a에 도시된 형식 B ABM의 구현예가 단지 2개의 결합 도메인(Fab1 및 Fab2)을 포함하는 한편, 개시내용의 형식 B ABM은 추가의 결합 도메인, 예를 들어, scFv 또는 Fab 도메인을 함유할 수 있다. 그러나 소정의 양태에서, Fab1 및 Fab2는 개시내용의 형식 B ABM의 단독 결합 도메인이다.
다른 구현예에서, 스페이서 도메인은 Fab 도메인이다. 본원에서 형식 "C"("형식 C")로 지칭되는 ABM의 이러한 형식의 상이한 변이는 도 3b 내지 3d에 예시되어 있다. 그러므로, 형식 C ABM은 하기와 같이 배치된 제3 Fab(Fab3) 도메인 및 제4 Fab(Fab4) 도메인을 포함한다:
ㆍ 제1 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제1 VL과 회합된 제1 VH를 포함하는 제1 Fab(Fab1) 도메인;
- 제3 VL과 회합된 제3 VH를 포함하는 제3 Fab(Fab3) 도메인; 및
- 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 반항체; 및
ㆍ 제2 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab(Fab2) 도메인;
- 제4 VL과 회합된 제4 VH를 포함하는 제4 Fab(Fab4) 도메인; 및
- 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 반항체.
이에, 본 개시내용은 도 3b 내지 도 3d에 도시된 형식 C ABM을 제공하며, 형식 C ABM은
ㆍ 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab1 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab1 VH 도메인(1) 및 Fab1 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab1 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab1 VL 도메인(6) 및 Fab1 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 링커 도메인(8);
- Fab3 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab3 VH 도메인(1) 및 Fab3 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab3 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab3 VL 도메인(6) 및 Fab3 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab2 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab2 VH 도메인(1) 및 Fab2 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab2 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab2 VL 도메인(6) 및 Fab2 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 링커 도메인(8);
- Fab4 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab4 VH 도메인(1) 및 Fab4 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab4 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab4 VL 도메인(6) 및 Fab4 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성한다.
도 3b 내지 3d에 도시된 형식 C ABM의 구현예가 4개의 결합 도메인(Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab4)을 포함하는 한편, 개시내용의 형식 C ABM은 추가의 결합 도메인, 예를 들어, scFv 또는 Fab 도메인을 함유할 수 있다. 그러나 소정의 양태에서, Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab4는 개시내용의 형식 C ABM의 단독 결합 도메인이다.
형식 C ABM의 Fab3 및 Fab4 도메인은 비-결합적(도 3b에 예시된 바와 같음) 또는 결합적일 수 있다(도 3c 및 도 3d에 예시된 바와 같음). Fab3 및 Fab4가 비-결합적인 구현예는 일반적으로, 본원에서 형식 C1 ABM으로 지칭되고, 이러한 형식은 이따금 본원에서 "클램프(Clamp)"로 지칭된다. Fab3 및 Fab4가 결합적인 구현예는 일반적으로, 본원에서 형식 C2 ABM으로 지칭되고, 이러한 형식은 이따금 본원에서 "탠덤(Tandem) Fab"로 지칭된다. 용어 "2+2 탠덤 Fab"는, Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab 4가 탠덤 Fab에서 단독 결합 도메인인, 도 3c 및 도 3d에서 예시된 구현예를 지칭한다. 형식 C1 ABM 및 형식 C2 ABM은 각각 호모이량체성 또는 헤테로이량체성일 수 있다.
형식 C1 ABM의 소정의 구현예에서, Fab1 도메인 및 Fab2 도메인은 동일하지 않고(예를 들어, 동일한 표적 분자 상에 있거나 상이한 표적 분자 상에 있든지 간에, 상이한 에피토프에 결합함), Fab3 도메인 및 Fab4 도메인은 동일한 비-결합적 도메인이다. 다른 구현예에서, Fab3 및 Fab4 도메인은 상이한 비-결합적 도메인이다.
형식 C2 ABM의 소정의 구현예에서, 도 3c에 도시된 바와 같이, Fab1 도메인 및 Fab3 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함하고, Fab2 도메인 및 Fab4 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함한다. 이러한 배치는 배치 1, 또는 1-1-2-2 배치로 지칭된다. 형식 C2 ABM의 대안적인 구현예에서, 도 3d에 도시된 바와 같이, Fab1 도메인 및 Fab2 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함하고, Fab3 도메인 및 Fab4 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함한다. 이러한 배치는 배치 2, 또는 1-2-1-2 배치로 지칭된다.
완전 ABM은 2개의 Fc 도메인을 통해 2개의 반항체의 회합에 의해 형성되어, Fc 영역을 형성한다. 2개의 반항체가 동일하지 않을 때, 예를 들어 Fab1 및 Fab2가 상이한 VH 도메인을 포함할 때, 예를 들어 섹션 6.2.7.2에 기재된 바와 같이 Fc 헤테로이량체화 접근법은 올바른 반항체 쌍형성(pairing) 및/또는 이의 정제를 용이하게 하는 데 이용될 수 있다. 헤테로이량체화 접근법의 예는 스타 돌연변이(star mutation)(섹션 6.2.7.2에 기재된 바와 같음) 또는 노브-인-홀 돌연변이(knob-in-hole mutation)이다.
도 2b, 3a, 3b 및 3c는 Fc 헤테로이량체를 통해 쌍형성된 각각의 반항체에 동일하지 않은 VH 도메인을 포함하는 ABM을 도시하는 한편, 이러한 형식은 또한 Fc 호모이량체에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 2b 및 도 3a는 각각 Fc 헤테로이량체를 포함하여 Fab1 및 Fab2에서 상이한 VH 도메인의 혼입 및 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적 결합 분자의 생성을 가능하게 하는 형식 A ABM 및 형식 B ABM을 도시하는 한편, 이러한 포맷은 또한 Fc 호모이량체 및 동일한 VH 도메인을 갖는 단일특이적 형식 A 및 형식 B ABM에 사용될 수 있다. 유사하게는, Fc 호모이량체는 동일한 Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab4 VH 도메인 또는 동일한 Fab1 및 Fab2 VH 도메인 및 비-결합적 Fab3 및 Fab4 VH 도메인을 갖는 단일특이적 형식 C ABM을 생성하는 데 사용될 수 있다.
추가로, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 상이한 VH 도메인을 포함할 때, 다중특이적 결합 분자에서 올바른 VH-VL 쌍형성을 허용하기 위해 상이한 전략이 사용될 수 있다. 예를 들어, ABM 내의 하나 초과의 유형의 VH 도메인과 작동적으로 쌍형성할 수 있는 보편적 경쇄가 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 경쇄 폴리펩타이드(예를 들어, Fab1과 Fab2와 회합된 경쇄, 및 존재한다면 Fab3와 Fab4와 회합된 경쇄)는 동일할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 구성요소((1) 및 (2))가 경쇄 구성요소((6) 및 (7))와의 융합으로서 발현될 수 있는 단일 도메인 Fab가 사용될 수 있다.
도 1 내지 도 3에 도시된 개시내용의 ABM의 변동은 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 개시내용의 ABM은 도 1 내지 도 3 및 다른 것들 중에서도 아래의 섹션 6.2에서 예시된 변형들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬 또는 좌측 또는 우측 반항체의 언급은 단지 편의를 위한 것이며, 폴리펩타이드 사슬 또는 반항체는 임의의 특정 순서로 생성되거나 조립됨을 시사하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM의 제1 Fab(Fab1) 도메인 및 제2 Fab(Fab2) 도메인은 각각 동일한 표적 분자, 예를 들어 작은 가용성 분자에 결합할 수 있다. 제1 Fab(Fab1) 도메인 및 제2 Fab(Fab2) 도메인은 동일한 에피토프에 결합할 수 있거나(예를 들어, 도 1b 및 도 3d에 도시된 구현예, 또는 Fab1과 Fab2가 둘 다 동일한 VH 도메인을 갖는 도 3a 또는 도 3b의 변동에서(도시되지 않음)), 이들은 동일한 표적 분자 상에 있거나 상이한 표적 분자 상에 있든지 간에, 상이한 에피토프에 결합할 수 있다(예를 들어, 도 2b, 도 3a, 도 3b, 및 도 3c의 구현예에서). 제1 Fab(Fab1) 도메인 및 제2 Fab(Fab2) 도메인이 상이한 에피토프, 예를 들어, 동일한 표적 분자 상의 또는 상이한 표적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 이들은 Fab가 이의 에피토프에 동시에 결합할 수 있도록 선택될 수 있다.
예를 들어 형식 C ABM의 일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 도 3b, 도 3c, 및 도 3d에 도시된 바와 같이 제3 Fab(Fab3) 도메인 및 제4 Fab(Fab4) 도메인을 포함할 수 있다. 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 도 3b에 도시된 바와 같이 비-결합적일 수 있거나, 이들은 도 3c 및 도 3d에 도시된 바와 같이 결합적일 수 있다. Fab3 및 Fab4가 존재할 때, 이들은 Fab1 도메인 및 Fab2 도메인에 의해 각각 결합된 에피토프로부터의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 예를 들어, 도 3c의 구현예에서 예시된 바와 같이, Fab1 및 Fab 3은 에피토프를 공유할 수 있고, Fab2 및 Fab4는 에피토프를 공유할 수 있다. 대안적으로 예를 들어, 도 3d의 구현예에서 예시된 바와 같이, Fab1 및 Fab 2는 에피토프를 공유할 수 있고, Fab3 및 Fab4는 에피토프를 공유할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 형식 C ABM을 참조로 하여, 용어 "제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인" 및 "Fab1 도메인 및 Fab2 도메인"은 전형적으로 가장 N-말단인 Fab 도메인을 지칭하고, "제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인" 및 "Fab3 도메인 및 Fab4 도메인"에 대한 지칭은 전형적으로 내부 Fab 도메인을 지칭한다.
개시내용의 예시적인 항원 결합 분자는 이의 구성요소와 배치, 및 이의 표적 분자를 포함하여, 섹션 6.2 및 6.3, 뿐만 아니라 아래의 "A" 구체적인 구현예 1 내지 138 및 "B" 구체적인 구현예 1 내지 72에 기재되어 있다.
나아가, 본 개시내용은 개시내용의 ABM을 포함하는 접합체, 예를 들어, 약물 접합체(본원에서 편의상 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"로 지칭되는 약물 접합체)를 제공한다. 접합체의 예시적인 특질은 섹션 6.4, 뿐만 아니라 아래의 "A" 구체적인 구현예 139 및 "B" 구체적인 구현예 73에 기재되어 있다.
나아가, 개시내용은 개시내용의 ABM을 인코딩하는 핵산을 제공한다. ABM을 인코딩하는 핵산은 단일 핵산(예를 들어, ABM의 모든 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 벡터) 또는 복수의 핵산(예를 들어, ABM의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 2개 이상의 벡터)일 수 있다. 나아가, 개시내용은 개시내용의 핵산 및 ABM을 발현하도록 조작되는 숙주 세포 및 세포주를 제공한다. 나아가, 개시내용은 개시내용의 ABM을 생성하는 방법을 제공한다. 예시적인 핵산, 숙주 세포, 세포주, 및 ABM을 생성하는 방법은 섹션 6.5, 아래의 "A" 구체적인 구현예 144-145, 및 "B" 구체적인 구현예 75-81에 기재되어 있다.
나아가, 개시내용은 개시내용의 ABM 및 ADC를 인코딩하는 약학적 조성물을 제공한다. 예시적인 약학적 조성물은 섹션 6.6, 뿐만 아니라 아래의 "A" 구체적인 구현예 140 및 "B" 구체적인 구현예 74에 기재되어 있다.
나아가, 개시내용의 ABM, 접합체, 및 약학적 조성물을 사용하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이들이 결합하는 표적 분자의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련된 병태를 치료하기 위한 것이다. 예시적인 방법은 섹션 6.7, 아래의 "A" 구체적인 구현예 141-143 및 "B" 구체적인 구현예 82-85에 기재되어 있다.
도 1a 내지 1b: 개시내용의 예시적인 호모이량체성(단일특이적 2가) 형식 A ABM(도 1b) 및 상응하는 네이티브 항체 형식(도 1a)의 개략적인 표현이다. 도면 범례: (1) = VH; (2) = CH1; (3) = 힌지; (4) = CH2; (5) = CH3; (6) = VL; (7) = CL; (8) = 링커.
도 2a 내지 2b: 개시내용의 헤테로이량체성 이중특이적 형식 A ABM(도 2b) 및 상응하는 전형적인 이중특이적 항체 형식(도 2a)의 개략적인 표현이다. 작은 항원(Ag)은, 이중특이적 ABM이 작은 항원과 상호작용할 수 있을 잠재적인 방식을 나타내는 것으로 제시된다. 도면 범례: (1) = VH; (2) = CH1; (3) = 힌지; (4) = CH2; (5) = CH3; (6) = VL; (7) = CL; (8) = 링커. CH3 도메인 중 하나에서 별표는, 2개의 CH3이 동일하지 않고, 헤테로이량체화를 허용하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 노브-인-홀 돌연변이, 스타 돌연변이 등)를 함유함을 나타낸다.
도 3a 내지 3d: 개시내용의 예시적인 형식 B ABM(도 3a) 및 개시내용의 예시적인 형식 C ABM(도 3b 내지 도 3d)의 개략적인 표현이다. 도시된 형식 C ABM의 특정 구현예는 예시적인 헤테로이량체성 형식 C1 ABM(도 3b), 예시적인 헤테로이량체성 형식 C2 ABM(도 3c), 및 예시적인 호모이량체성 형식 C2 ABM(도 3d)이다. 일부 구현예에서, 이들 이중특이적 ABM은 보편적 경쇄 VL-CL을 사용한다. 모든 형식의 일부 구현예에서, VH1-CH1/VL-CL 및 VH2-CH1/VL-CL은 항원에 대한 비-경쟁적 mAb로부터의 Fab 단편이다. 도 3b에 도시된 형식(이따금 본원에서 "클램프" 형식으로 지칭됨)에서, 내부 Fab 단편 VH3-CH1/VL-CL은 표적 분자에 결합하지 않는다. 도 3a에 도시된 형식(이따금 본원에서 "리치" 형식으로 지칭됨)에서, 내부 Fab는 가요성의 긴(long) 링커로 대체된다. 도면 범례: (1) = VH; (2) = CH1; (3) = 힌지; (4) = CH2; (5) = CH3; (6) = VL; (7) = CL; (8) = 링커. CH3 도메인 중 하나에서 별표는, 2개의 CH3이 동일하지 않고, 헤테로이량체화를 허용하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 노브-인-홀 돌연변이, 스타 돌연변이 등)를 함유함을 나타낸다.
도 4a 내지 4b: 도 4a 및 도 4b는 TSLP 차단 생물검정에서 TSLP 모(parental) Ab의 활성을 도시하는 그래프이다. 도 4a는 hIL7R과 hTSLPR을 둘 다 발현하는 Baf3 세포를 사용하는 STAT3-루시퍼라제 리포터 검정에서 hTSLP의 용량 반응 곡선이다. 도 4b는 TSLP 차단 생물검정에서 선택된 TSLP Ab의 활성이다. TSLP Ab는 100 pM 불변 hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 5: 도 5는, 항-hTSLP 이중특이적 IgG4 Ab가 상응하는 모 Ab 조합과 유사한 TSLP 차단 활성을 보여주었음을 실증하는 그래프이다. 항-hTSLP 모 Ab 조합 및 이중특이적 IgG4 Ab는 hTSLP 차단 생물검정에서 이의 활성에 대해 비교되었다. TSLP Ab는 100 pM hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 6a 내지 6c: 도 6a 내지 도 6c는 TSLP 차단 생물검정에서 상이한 형식의 이중특이적 항-hTSLP Ab를 비교하는 그래프이다. 몇몇 모 Ab 쌍형성을 시험하였다: 30206x30217(도 6a), 30206x30230(도 6b), 30217x30230(도 6c). TSLP Ab는 100 pM hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 6a 내지 도 6c에 개시된 "2xG4S" 및 "4xG4S"는 각각 SEQ ID NO:18 및 SEQ ID NO:19이다.
도 7: 도 7은 hTSLP(REGN4009)의 존재 하에 개별 모 mAb의 분획도(fractogram)를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP mAb:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS: asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering)에 의해 분석되었다. H4H30217P2(회색 파선) 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된(resolved) 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 8: 도 8은 hTSLP의 존재 하에 모 mAb 조합의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP mAb 조합:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. H4H30217P2(회색 파선) 및 hTSLP(검정색 파선), 및 H4H30217P2:hTSLP 복합체(검정색 점선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 9: 도 9는 hTSLP의 존재 하에 Fc-Fab 이중특이적 Ab의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP Fc-Fab:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. TS-FC1-eL1(검정색 점선), TS-FC6-eL2(회색 점선), 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 10: 도 10은 hTSLP의 존재 하에 클램프 이중특이적 Ab의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP 클램프:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. TS-CL4-eL1(검정색 점선), TS-CL6-eL1(회색 점선), 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 11: 도 11은 hTSLP의 존재 하에 2+2 탠덤 Fab 이중특이적 Ab의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP 2+2 탠덤 Fab:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. TS-CL2-eL2(검정색 점선), TS-CL3-eL2(회색 점선), 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 12: 도 12는 TSLP 차단 생물검정에서 상이한 링커 길이를 갖는 항-hTSLP 30217x30230 이중특이적 Fc-Fab의 활성을 비교하는 그래프이다. TSLP Ab는 120 pM 불변 hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 모든 값은 TSLP 차단 Ab의 부재 하에 STAT3-루시퍼라제 활성으로 정규화되고, STAT3-Luc 활성의 백분율로서 표현되었다. 도 12에 개시된 G4S, (G4S)2, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, 및 (G4S)6 링커는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 4, 19, 39, 및 38이다.
도 13a 내지 13d: 도 13a 내지 도 13c는 상이한 힌지 형식의 개략도이다. 도 13a: 힌지 서열 ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2) 및 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 도시된 힌지 형식 1이며; 도 13b: 힌지 서열 ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2) 및 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 도시된 힌지 형식 2이고; 도 13c: 힌지 서열 GGGGSCPPC(SEQ ID NO:1) 및 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 도시된 힌지 형식 3이다. 도 13d는 상이한 힌지 형식(G4S 링커(SEQ ID NO:3)를 갖는 힌지 형식 1, G4S 링커(SEQ ID NO:3)를 갖는 힌지 형식 2, G4S 링커(SEQ ID NO:3)를 갖는 힌지 형식 3, (G4S)4 링커(SEQ ID NO:19)를 갖는 힌지 형식 1, (G4S)4 링커(SEQ ID NO:19)를 갖는 힌지 형식 2, 및 (G4S)4 링커(SEQ ID NO:19)를 갖는 힌지 형식 3)을 갖는 30217x30230 Fc-Fab의 활성을 도시하는 그래프이다. TSLP Ab는 120 pM hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 모든 값은 TSLP 차단 Ab의 부재 하에 STAT3-루시퍼라제 활성으로 정규화되고, STAT3-Luc 활성의 백분율로서 표현되었다.
도 14: 도 14는 WT 마우스에서 항-TSLP 이중특이적 Fc-Fab 분자 REGN8759 및 REGN8760; hIgG4 이소타입 대조군 REGN1945; 종래의 hIgG4 이중특이적 이소타입 대조군 H4H21237D; 및 hFcγ 호모이량체 REGN1627의 약물동력학적 프로파일을 도시한다.
도 15: 도 15는 WT 마우스에서 항-TSLP Fc-Fab 항체 REGN8759 및 REGN8760; hIgG4 이소타입 대조군 REGN1945; 종래의 hIgG4 이중특이적 이소타입 대조군 H4H21237D; 및 hFcγ 호모이량체 REGN1627의 몰 당량 약물동력학적 프로파일을 도시한다.
도 16a 내지 16c: 도 16a 내지 도 16c는 리간드 X 신호전달 생물검정에서 항-리간드 X 모 mAb mAbX1, mAbX2, 및 이중특이적 Fc-Fab mAbX1 x mAbX2의 저해 활성을 비교하는 그래프이다. 항-리간드 X Ab는 10 pM(도 16a), 100 pM(도 16b), 또는 1 nM(도 16c) 불변 인간 리간드 X의 존재 하에 수용체 X 신호전달을 위해 조작된 루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 17a 내지 17c: 도 17a 내지 도 17c는 리간드 X 신호전달 생물검정에서 항-리간드 X 모 mAb mAbX2, mAbX3, 및 이중특이적 Fc-Fab mAbX2 x mAbX3의 저해 활성을 비교하는 그래프이다. 항-리간드 X Ab는 10 pM(도 17a), 100 pM(도 17b), 또는 1 nM(도 17c) 불변 인간 리간드 X의 존재 하에 수용체 X 신호전달을 위해 조작된 루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 18a 내지 18c: 도 18a 내지 도 18c는 리간드 X 신호전달 생물검정에서 항-리간드 X 모 mAb mAbX1, mAbX3, 및 이중특이적 Fc-Fab mAbX1 x mAbX3의 저해 활성을 비교하는 그래프이다. 항-리간드 X Ab는 10 pM(도 18a), 100 pM(도 18b), 또는 1 nM(도 18c) 불변 인간 리간드 X의 존재 하에 수용체 X 신호전달을 위해 조작된 루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 19a 내지 19e: 도 19a 내지 도 19e는 리간드 X와 항-리간드 X 항체와의 복합체의 분획도를 도시하는 그래프이다. 리간드 X와 조합된 항-리간드 X 항체는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. 항체 및 리간드 X의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다. 도 19a 및 도 19b는 모 항체 mAbX1, mAbX2, 및 리간드 X의 분획도를 도시하며; 도 19c는 mAbX1 x mAbX2 Fc-Fab 및 리간드 X의 분획도를 도시하고; 도 19d는 mAbX1 x mAbX2 클램프 및 리간드 X의 분획도를 도시하며; 도 19e는 mAbX1 x mAbX2 2+2 탠덤 Fab 헤테로이량체 및 리간드 X의 분획도를 도시한다.
도 20a 내지 20d: 도 20a 내지 도 20d는 FACS-기초 검정에서 측정된 바와 같이, 항원 Y-발현 세포에의 항원 Y Fc-Fab의 결합을 도시하는 그래프이다. 도 20a에서, 항-항원 Y IgG1 mAb mAbY1은 상이한 길이의 G4S 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)와 함께 IgG1 Fc-Fab로서 클로닝되었다. Fc-Fab 및 모 IgG1 mAb는 세포 표면 항원 Y에 대해 유사한 결합을 보여주었다. 도 20b, 도 20c, 도 20d에서, 항-항원 Y IgG4s mAb mAbY2, mAbY3, 및 mAbY4는 상이한 G4S 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)와 함께 IgG4s Fc-Fab로서 클로닝되었다. 모든 Fc-Fab는 항원 Y FACS 결합 검정에서 강한 활성을 보여주었다. 도 20a 내지 도 20d에 개시된 "1xG4S", "2xG4S", "3xG4S", "4xG4S", 및 "5xG4S"는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 4, 19, 및 39이다.
도 21a 내지 21b: 도 21a 내지 도 21b는 FACS-기초 검정에서 세포 표면 에피토프에의 항-CD3 및 항-항원 Z Fc-Fab의 결합을 도시하는 그래프이다. 항-CD3(도 21a) Ab 및 항-항원 Z(도 21b) Ab는 상이한 길이의 G4S 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)와 함께 IgG1 Fc-Fab로서 클로닝되었다. 이들 Fc-Fab는 세포 표면 CD3(도 21a) 및 항원 Z(도 21b)에 대해 특이적인 결합을 보여주었다. 도 21a 내지 도 21b에 개시된 "1xG4S", "2xG4S", "3xG4S", "4xG4S", 및 "5xG4S"는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 4, 19, 및 39이다.
도 22a 내지 22b: 도 22a 및 도 22b는 CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab가 생물검정에서 활성적이었음을 도시하는 그래프이다. 도 22a에서, CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab는 항원 Z+ 세포의 존재 하에 Jurkat/NFAT-루시퍼라제 리포터 세포에서 TCR 신호전달을 활성화시켰다. 도 22b에서, CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab는 3시간 칼세인 방출 검정에서 예비-활성화된 인간 공여자 T 세포에 의해 항원 Z+ 세포의 사멸화(killing)를 촉발하였다. 도 22a 내지 도 22b에 개시된 "1xG4S", "2xG4S", 및 "3xG4S"는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 및 4이다.
도 2a 내지 2b: 개시내용의 헤테로이량체성 이중특이적 형식 A ABM(도 2b) 및 상응하는 전형적인 이중특이적 항체 형식(도 2a)의 개략적인 표현이다. 작은 항원(Ag)은, 이중특이적 ABM이 작은 항원과 상호작용할 수 있을 잠재적인 방식을 나타내는 것으로 제시된다. 도면 범례: (1) = VH; (2) = CH1; (3) = 힌지; (4) = CH2; (5) = CH3; (6) = VL; (7) = CL; (8) = 링커. CH3 도메인 중 하나에서 별표는, 2개의 CH3이 동일하지 않고, 헤테로이량체화를 허용하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 노브-인-홀 돌연변이, 스타 돌연변이 등)를 함유함을 나타낸다.
도 3a 내지 3d: 개시내용의 예시적인 형식 B ABM(도 3a) 및 개시내용의 예시적인 형식 C ABM(도 3b 내지 도 3d)의 개략적인 표현이다. 도시된 형식 C ABM의 특정 구현예는 예시적인 헤테로이량체성 형식 C1 ABM(도 3b), 예시적인 헤테로이량체성 형식 C2 ABM(도 3c), 및 예시적인 호모이량체성 형식 C2 ABM(도 3d)이다. 일부 구현예에서, 이들 이중특이적 ABM은 보편적 경쇄 VL-CL을 사용한다. 모든 형식의 일부 구현예에서, VH1-CH1/VL-CL 및 VH2-CH1/VL-CL은 항원에 대한 비-경쟁적 mAb로부터의 Fab 단편이다. 도 3b에 도시된 형식(이따금 본원에서 "클램프" 형식으로 지칭됨)에서, 내부 Fab 단편 VH3-CH1/VL-CL은 표적 분자에 결합하지 않는다. 도 3a에 도시된 형식(이따금 본원에서 "리치" 형식으로 지칭됨)에서, 내부 Fab는 가요성의 긴(long) 링커로 대체된다. 도면 범례: (1) = VH; (2) = CH1; (3) = 힌지; (4) = CH2; (5) = CH3; (6) = VL; (7) = CL; (8) = 링커. CH3 도메인 중 하나에서 별표는, 2개의 CH3이 동일하지 않고, 헤테로이량체화를 허용하는 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 노브-인-홀 돌연변이, 스타 돌연변이 등)를 함유함을 나타낸다.
도 4a 내지 4b: 도 4a 및 도 4b는 TSLP 차단 생물검정에서 TSLP 모(parental) Ab의 활성을 도시하는 그래프이다. 도 4a는 hIL7R과 hTSLPR을 둘 다 발현하는 Baf3 세포를 사용하는 STAT3-루시퍼라제 리포터 검정에서 hTSLP의 용량 반응 곡선이다. 도 4b는 TSLP 차단 생물검정에서 선택된 TSLP Ab의 활성이다. TSLP Ab는 100 pM 불변 hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 5: 도 5는, 항-hTSLP 이중특이적 IgG4 Ab가 상응하는 모 Ab 조합과 유사한 TSLP 차단 활성을 보여주었음을 실증하는 그래프이다. 항-hTSLP 모 Ab 조합 및 이중특이적 IgG4 Ab는 hTSLP 차단 생물검정에서 이의 활성에 대해 비교되었다. TSLP Ab는 100 pM hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 6a 내지 6c: 도 6a 내지 도 6c는 TSLP 차단 생물검정에서 상이한 형식의 이중특이적 항-hTSLP Ab를 비교하는 그래프이다. 몇몇 모 Ab 쌍형성을 시험하였다: 30206x30217(도 6a), 30206x30230(도 6b), 30217x30230(도 6c). TSLP Ab는 100 pM hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 6a 내지 도 6c에 개시된 "2xG4S" 및 "4xG4S"는 각각 SEQ ID NO:18 및 SEQ ID NO:19이다.
도 7: 도 7은 hTSLP(REGN4009)의 존재 하에 개별 모 mAb의 분획도(fractogram)를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP mAb:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS: asymmetric flow field-flow fractionation coupled to multi-angle light scattering)에 의해 분석되었다. H4H30217P2(회색 파선) 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된(resolved) 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 8: 도 8은 hTSLP의 존재 하에 모 mAb 조합의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP mAb 조합:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. H4H30217P2(회색 파선) 및 hTSLP(검정색 파선), 및 H4H30217P2:hTSLP 복합체(검정색 점선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 9: 도 9는 hTSLP의 존재 하에 Fc-Fab 이중특이적 Ab의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP Fc-Fab:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. TS-FC1-eL1(검정색 점선), TS-FC6-eL2(회색 점선), 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 10: 도 10은 hTSLP의 존재 하에 클램프 이중특이적 Ab의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP 클램프:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. TS-CL4-eL1(검정색 점선), TS-CL6-eL1(회색 점선), 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 11: 도 11은 hTSLP의 존재 하에 2+2 탠덤 Fab 이중특이적 Ab의 분획도를 도시하는 그래프이다. 항-TSLP 2+2 탠덤 Fab:hTSLP 복합체(실선)는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. TS-CL2-eL2(검정색 점선), TS-CL3-eL2(회색 점선), 및 hTSLP(검정색 파선)의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다.
도 12: 도 12는 TSLP 차단 생물검정에서 상이한 링커 길이를 갖는 항-hTSLP 30217x30230 이중특이적 Fc-Fab의 활성을 비교하는 그래프이다. TSLP Ab는 120 pM 불변 hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 모든 값은 TSLP 차단 Ab의 부재 하에 STAT3-루시퍼라제 활성으로 정규화되고, STAT3-Luc 활성의 백분율로서 표현되었다. 도 12에 개시된 G4S, (G4S)2, (G4S)3, (G4S)4, (G4S)5, 및 (G4S)6 링커는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 4, 19, 39, 및 38이다.
도 13a 내지 13d: 도 13a 내지 도 13c는 상이한 힌지 형식의 개략도이다. 도 13a: 힌지 서열 ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2) 및 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 도시된 힌지 형식 1이며; 도 13b: 힌지 서열 ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2) 및 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 도시된 힌지 형식 2이고; 도 13c: 힌지 서열 GGGGSCPPC(SEQ ID NO:1) 및 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 도시된 힌지 형식 3이다. 도 13d는 상이한 힌지 형식(G4S 링커(SEQ ID NO:3)를 갖는 힌지 형식 1, G4S 링커(SEQ ID NO:3)를 갖는 힌지 형식 2, G4S 링커(SEQ ID NO:3)를 갖는 힌지 형식 3, (G4S)4 링커(SEQ ID NO:19)를 갖는 힌지 형식 1, (G4S)4 링커(SEQ ID NO:19)를 갖는 힌지 형식 2, 및 (G4S)4 링커(SEQ ID NO:19)를 갖는 힌지 형식 3)을 갖는 30217x30230 Fc-Fab의 활성을 도시하는 그래프이다. TSLP Ab는 120 pM hTSLP의 존재 하에 Baf3/hIL7R/hTSLPR/STAT3-루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 모든 값은 TSLP 차단 Ab의 부재 하에 STAT3-루시퍼라제 활성으로 정규화되고, STAT3-Luc 활성의 백분율로서 표현되었다.
도 14: 도 14는 WT 마우스에서 항-TSLP 이중특이적 Fc-Fab 분자 REGN8759 및 REGN8760; hIgG4 이소타입 대조군 REGN1945; 종래의 hIgG4 이중특이적 이소타입 대조군 H4H21237D; 및 hFcγ 호모이량체 REGN1627의 약물동력학적 프로파일을 도시한다.
도 15: 도 15는 WT 마우스에서 항-TSLP Fc-Fab 항체 REGN8759 및 REGN8760; hIgG4 이소타입 대조군 REGN1945; 종래의 hIgG4 이중특이적 이소타입 대조군 H4H21237D; 및 hFcγ 호모이량체 REGN1627의 몰 당량 약물동력학적 프로파일을 도시한다.
도 16a 내지 16c: 도 16a 내지 도 16c는 리간드 X 신호전달 생물검정에서 항-리간드 X 모 mAb mAbX1, mAbX2, 및 이중특이적 Fc-Fab mAbX1 x mAbX2의 저해 활성을 비교하는 그래프이다. 항-리간드 X Ab는 10 pM(도 16a), 100 pM(도 16b), 또는 1 nM(도 16c) 불변 인간 리간드 X의 존재 하에 수용체 X 신호전달을 위해 조작된 루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 17a 내지 17c: 도 17a 내지 도 17c는 리간드 X 신호전달 생물검정에서 항-리간드 X 모 mAb mAbX2, mAbX3, 및 이중특이적 Fc-Fab mAbX2 x mAbX3의 저해 활성을 비교하는 그래프이다. 항-리간드 X Ab는 10 pM(도 17a), 100 pM(도 17b), 또는 1 nM(도 17c) 불변 인간 리간드 X의 존재 하에 수용체 X 신호전달을 위해 조작된 루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 18a 내지 18c: 도 18a 내지 도 18c는 리간드 X 신호전달 생물검정에서 항-리간드 X 모 mAb mAbX1, mAbX3, 및 이중특이적 Fc-Fab mAbX1 x mAbX3의 저해 활성을 비교하는 그래프이다. 항-리간드 X Ab는 10 pM(도 18a), 100 pM(도 18b), 또는 1 nM(도 18c) 불변 인간 리간드 X의 존재 하에 수용체 X 신호전달을 위해 조작된 루시퍼라제 리포터 세포주와 함께 인큐베이션되었다. 5.5시간의 인큐베이션 후 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
도 19a 내지 19e: 도 19a 내지 도 19e는 리간드 X와 항-리간드 X 항체와의 복합체의 분획도를 도시하는 그래프이다. 리간드 X와 조합된 항-리간드 X 항체는 다각도 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALS)에 의해 분석되었다. 항체 및 리간드 X의 개별 시료로부터의 분획도는 또한 중첩된다. 체류 시간의 함수로서 215 nm에서 상대적인 UV 흡광도는 각각의 시료에 대해 도시되고, 분해된 피크의 측정된 몰 질량이 표시된다. 도 19a 및 도 19b는 모 항체 mAbX1, mAbX2, 및 리간드 X의 분획도를 도시하며; 도 19c는 mAbX1 x mAbX2 Fc-Fab 및 리간드 X의 분획도를 도시하고; 도 19d는 mAbX1 x mAbX2 클램프 및 리간드 X의 분획도를 도시하며; 도 19e는 mAbX1 x mAbX2 2+2 탠덤 Fab 헤테로이량체 및 리간드 X의 분획도를 도시한다.
도 20a 내지 20d: 도 20a 내지 도 20d는 FACS-기초 검정에서 측정된 바와 같이, 항원 Y-발현 세포에의 항원 Y Fc-Fab의 결합을 도시하는 그래프이다. 도 20a에서, 항-항원 Y IgG1 mAb mAbY1은 상이한 길이의 G4S 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)와 함께 IgG1 Fc-Fab로서 클로닝되었다. Fc-Fab 및 모 IgG1 mAb는 세포 표면 항원 Y에 대해 유사한 결합을 보여주었다. 도 20b, 도 20c, 도 20d에서, 항-항원 Y IgG4s mAb mAbY2, mAbY3, 및 mAbY4는 상이한 G4S 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)와 함께 IgG4s Fc-Fab로서 클로닝되었다. 모든 Fc-Fab는 항원 Y FACS 결합 검정에서 강한 활성을 보여주었다. 도 20a 내지 도 20d에 개시된 "1xG4S", "2xG4S", "3xG4S", "4xG4S", 및 "5xG4S"는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 4, 19, 및 39이다.
도 21a 내지 21b: 도 21a 내지 도 21b는 FACS-기초 검정에서 세포 표면 에피토프에의 항-CD3 및 항-항원 Z Fc-Fab의 결합을 도시하는 그래프이다. 항-CD3(도 21a) Ab 및 항-항원 Z(도 21b) Ab는 상이한 길이의 G4S 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)와 함께 IgG1 Fc-Fab로서 클로닝되었다. 이들 Fc-Fab는 세포 표면 CD3(도 21a) 및 항원 Z(도 21b)에 대해 특이적인 결합을 보여주었다. 도 21a 내지 도 21b에 개시된 "1xG4S", "2xG4S", "3xG4S", "4xG4S", 및 "5xG4S"는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 4, 19, 및 39이다.
도 22a 내지 22b: 도 22a 및 도 22b는 CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab가 생물검정에서 활성적이었음을 도시하는 그래프이다. 도 22a에서, CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab는 항원 Z+ 세포의 존재 하에 Jurkat/NFAT-루시퍼라제 리포터 세포에서 TCR 신호전달을 활성화시켰다. 도 22b에서, CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab는 3시간 칼세인 방출 검정에서 예비-활성화된 인간 공여자 T 세포에 의해 항원 Z+ 세포의 사멸화(killing)를 촉발하였다. 도 22a 내지 도 22b에 개시된 "1xG4S", "2xG4S", 및 "3xG4S"는 각각 SEQ ID NO:3, 18, 및 4이다.
6.1. 정의
본원에 사용된 바와 같이, 하기 용어는 하기 의미를 갖는 것으로 의도된다:
항체 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는, 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 이와 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는, 이황화 결합에 의해 상호연결된 4개의 폴리펩타이드 사슬인 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 종래의 형식의 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 영역 및 VL 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역으로 산재된(interspersed) 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성의 영역으로 추가로 소분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 아미노산 공통(consensus) 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석(side-by-side analysis)에 기초하여 정의될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 또한, 완전 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 천연적으로 발생하는, 효소적으로 수득 가능한, 합성의, 또는 유전적으로 조작되는 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 임의의 적합한 표준 기법, 예컨대 단백분해성 절단 또는 재조합 유전적 조작 기법을 사용하여 완전(full) 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 예를 들어, 상업적인 공급원, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 알려져 있고/거나 쉽게 입수 가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는 화학적으로 또는 분자생물학 기법을 사용함으로써 시퀀싱되고 조작되어, 예를 들어, 하나 이상의 가변 도메인 및/또는 불변 도메인을 적합한 배치로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형시키거나, 첨가하거나 결실시키는 등을 수행할 수 있다.
항원-결합 단편은, (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일-사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성되는 최소 인식 단위(예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드), 또는 제약(constrained) FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 포함한다. 다른 조작되는 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-그래프팅된 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 소형 모듈 면역약제(SMIPs; small modular immunopharmaceuticals), 및 상어(shark) 가변 IgNAR 도메인은 또한 본원에 사용된 바와 같이 표현 "항원-결합 단편" 내에 포괄된다.
항체의 항원-결합 단편은 전형적으로, 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성의 것일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접해 있거나 이와 함께 프레임에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 회합된 VH 도메인을 갖는 항원-결합 단편에서, VH 도메인 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열에서 서로에 대해 놓일 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체성이고 VH-VH, VH-VL, 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원-결합 단편은 단량체성 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
소정의 구현예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 개시내용의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 도메인 및 불변 도메인의 예시적인 배치는: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL을 포함한다. 상기 나열된 임의의 예시적인 배치를 포함한 가변 도메인 및 불변 도메인의 임의의 배치에서, 가변 도메인 및 불변 도메인은 서로 직접 연결될 수 있거나 완전 또는 부분 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은, 단일 폴리펩타이드 분자 내의 인접한 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 사이에서 가요성 또는 반-가요성(linkage) 연결부를 초래하는 적어도 2개의(예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상의) 아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱이, 본 개시내용의 항체의 항원-결합 단편은 서로 그리고/또는 하나 이상의 단량체성 VH 도메인 또는 VL 도메인과의 비-공유 회합에서(예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 상기 나열된 임의의 가변 및 불변 도메인 배치의 호모-이량체 또는 헤테로-이량체(또는 다른 다량체)를 포함할 수 있다.
완전 항체 분자에 관하여, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 여기서 각각의 가변 도메인은 상이한 항원에 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 형식을 포함한 임의의 다중특이적 항체 형식은 당업계에서 이용 가능한 일상적인 기법을 사용하여 본 개시내용의 항체의 항원-결합 단편의 맥락에서 사용하기 위해 개조될 수 있다.
항원 결합 분자 또는 ABM : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 분자" 또는 "ABM"은 2개의 반항체를 포함하는 분자(예를 들어, 다수의 폴리펩타이드 사슬의 조립체)를 지칭한다. 전형적으로, 각각의 반항체는 적어도 하나의 항원-결합 부위를 포함한다. 개시내용의 ABM은 단일특이적 또는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적)일 수 있다. 단일특이적 결합 분자에서 항원 결합 부위는 모두 동일한 에피토프에 결합하는 반면, 다중특이적 결합 분자는 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자일 수 있는 상이한 에피토프에 결합하는 적어도 2개의 항원-결합 부위를 갖는다.
회합되는 : ABM의 맥락에서 용어 "회합되는"은 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 특히, 용어 "회합되는"은, 2개 이상의 폴리펩타이드는 예를 들어, 분자 상호작용을 통해 비-공유적으로 또는 하나 이상의 이황화 브릿지 또는 화학적 가교-연결부를 통해 공유적으로 서로 회합되어, 항원-결합 부위가 이의 각각의 표적에 결합할 수 있는 기능적 ABM을 생성함을 의미한다. 개시내용의 ABM에 존재할 회합의 예는 Fc 영역에서 호모이량체성 또는 헤테로이량체성 Fc 도메인 사이의 회합, Fab 도메인에서 VH 영역과 VL 영역 사이의 회합, Fab 도메인에서 CH1과 CL 사이의 회합, 및 도메인 치환된 Fab에서 CH3과 CH3 사이의 회합을 포함한다(그러나 이들로 제한되지 않음).
2가 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "2가"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 ABM을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2개의 항원 결합 부위는 동일한 표적의 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 구현예에서, 2개의 항원 결합 부위는 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자이든지 간에, 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다.
상보성 결정 영역 또는 CDR : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 특이성 및 항원 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 서열을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 3개의 CDR(CDR-H1, CDR-H2, HCDR-H3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 3개의 CDR(CDR1-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 존재한다. CDR의 경계를 식별하는 데 사용될 수 있는 예시적인 관례는 예를 들어, 카바트 정의, 초티아 정의, ABS 정의, 및 IMGT 정의를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Kabat, 1991, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md.](카바트 숫자매김 체계); 문헌[Al-Lazikani 등, 1997, J. Mol. Biol. 273:927-948](초티아 숫자매김 체계); 문헌[Martin 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272](ABS 숫자매김 체계); 및 문헌[Lefranc 등, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77](IMGT 숫자매김 체계)을 참조한다. 공개 데이터베이스는 또한, 항체 내의 CDR 서열을 식별하기 위해 이용 가능하다.
사이토카인 : 용어 "사이토카인"은, 케모카인, 인터페론, 인터루킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자를 포함하는, 세포 신호전달 활성을 갖는 저분자량 세포외 폴리펩타이드/당단백질의 군의 구성원을 지칭한다. 사이토카인은 면역 반응(예를 들어, 세포 및 다른 사이토카인의 활성, 분화, 증식, 및 생성)을 조절하는 것을 담당하며, 전형적으로 면역 세포에 의해, 주로 T 세포, 호중구, 및 대식세포에 의해 합성될 뿐만 아니라, 비-면역 세포에 의해서도 합성될 수 있다. 사이토카인은 단량체, 이량체(호모이량체와 헤테로이량체 둘 다), 삼량체(호모삼량체(homotrimer) 포함), 및 사량체(호모사량체 포함)로서 존재한다. 사이토카인은 대략 5 내지 70 kDa 분자량 범위이지만, 대부분은 대략 5 내지 대략 20 kDa 범위이다. 많은 사이토카인은 4-α-나선 다발 구조를 공유한다. 다른 사이토카인은 시스테인 잔기의 쌍으로부터 형성되는 3개의 이황화 브릿지를 함유하는 시스테인 노트(knot)를 특징으로 한다. 추가의 사이토카인은 이따금 세포 표면 단백질에 존재하는 특질인 호모삼량체성 피라미드 구조를 특징으로 한다.
EC50: 용어 "EC50"은 명시된 노출 시간 후 기준선과 최대 사이의 절반의 반응을 유도하는 항체 또는 ABM의 반수 최대 유효 농도(half maximal effective concentration)를 지칭한다. EC50은 본질적으로, 이의 최대 효과의 50%가 관찰되는 항체 또는 ABM의 농도를 나타낸다. 소정의 구현예에서, EC50 값은 예를 들어, FACS 결합 검정에 의해 결정되는 바와 같이, 항체 또는 ABM에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 표적 분자를 발현하는 세포에의 반수-최대 결합을 제공하는 항체 또는 ABM의 농도와 동등하다. 그러므로, 감소된 또는 더 약한 결합은 증가된 EC50, 또는 반수 최대 유효 농도 값으로 관찰된다. 개시내용의 ABM의 EC50 값은 일부 구현예에서, 약 10-5 M 이하(예를 들어, 10-5 M 미만, 10-6 M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 또는 10-9 M 미만)의 EC50 값을 특징으로 할 수 있다.
에피토프 : 용어 "에피토프"는, 파라토프(paratope)로 알려진 항체 또는 항원-결합 분자의 가변 영역 내의 특이적인 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정기를 지칭한다. 단일 항원 또는 표적 분자는 하나 초과의 에피토프를 가질 수 있다. 그러므로, 상이한 항체 또는 항원-결합 분자는 항원 또는 표적 분자 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고, 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체배좌(conformational) 또는 선형일 수 있다. 입체배좌 에피토프는 선형 폴리펩타이드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된(juxtaposed) 아미노산에 의해 생성된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬 내의 인접 아미노산 잔기에 의해 생성되는 에피토프이다. 소정의 상황에서, 에피토프는 항원 또는 표적 분자 상의 당류(saccharides), 포스포릴기, 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.
Fab : 개시내용의 ABM의 맥락에서 용어 "Fab"는 제1 불변 도메인(본원에서 C1로 지칭됨)에 대해 N-말단에서 항체의 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드 사슬, 및 상기 제1 불변 도메인과 쌍을 형성할 수 있는 제2 불변 도메인(본원에서 C2로 지칭됨)에 대해 N-말단에서 항체의 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드 사슬의 쌍을 지칭한다. 네이티브 면역글로불린에서, VH는 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)에 대해 N-말단이고, VL은 경쇄의 불변 도메인(CL)에 대해 N-말단이다. 개시내용의 Fab는 네이티브 배향에 따라 배열되거나, 올바른 VH 및 VL 쌍형성을 용이하게 하는 도메인 치환 또는 스왑(swap)을 포함할 수 있으며, 특히 개시내용의 ABM은 동일하지 않은 Fab를 포함한다. 예를 들어, Fab 내의 CH1과 CL 도메인 쌍을 CH3-도메인 쌍으로 대체하여, 헤테로이량체성 ABM에서 올바른 변형된 Fab-사슬 쌍형성을 용이하게 하는 것이 가능하다. CH1 및 CL을 역전시키는 것이 또한 가능하며, 따라서 CH1은 VL에 부착되고 CL은 VH에 부착되며, 일반적으로 Crossmab로 알려진 배치이다. 치환된 또는 스와핑된 불변 도메인의 사용에 대해 대안적으로 또는 이에 더하여, 올바른 사슬 쌍형성은 개시내용의 헤테로이량체성 ABM의 가변 영역 둘 다와 쌍을 형성할 수 있는 유니버셜 경쇄의 사용에 의해 달성될 수 있다. 개시내용의 ABM을 기재하는 데 있어서, 각각의 설명을 위해 C1 도메인은 명세서 어디에서나 CH1 도메인으로 지칭되고 C2 도메인은 본원에서 CL 도메인으로 지칭되지만; 도메인 스와핑된 형식이 또한 포함되는 것으로 의도된다. 다른 형태의 조작된 Fab는 섹션 6.2.1에 예시되어 있다.
Fc : 용어 "Fc"는, 전형적으로 Fc 수용체, 예를 들어, FcγR, 즉, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16), 또는 FcRn, 즉, 신생아(neonatal) Fc 수용체에 결합하는 적어도 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 중쇄 불변 영역의 부분을 지칭한다. 용어 "Fc"는 또한, 네이티브 면역글로불린의 Fc와 상이한 조작된 Fc를 포괄한다. 예를 들어, CH2 및 CH3 영역은, 이것이 임의의 Fc 수용체에 결합하는 것을 불가능하게 만드는 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 다른 변형을 포함하도록 조작될 수 있으며, CH2 및 CH3 영역은 이의 전형적인 생물학적 기능의 측면에서 비-기능적인 것으로 여겨진다. 다른 형태의 조작된 Fc는 섹션 6.2.7에 예시되어 있다.
Fc 도메인 및 Fc 영역 : 용어 "Fc 도메인"은 또 다른 중쇄의 상응하는 부분과 쌍형성하는 중쇄의 부분을 지칭한다. 용어 "Fc 영역"은 2개의 중쇄 Fc 도메인의 회합에 의해 형성되는 항체-기초 결합 분자의 영역을 지칭한다. Fc 영역 내의 2개의 Fc 도메인은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 네이티브 항체에서, Fc 도메인은 전형적으로 동일하지만, 개시내용의 ABM을 생성하는 목적을 위해, 하나의 또는 둘 다의 Fc 도메인은 유리하게는 헤테로이량체화를 가능하게 하도록 변형될 것이다.
반항체 : 용어 "반항체"는 적어도 Fc 도메인을 포함하며 Fc 도메인을 포함하는 또 다른 분자와 예를 들어 이황화 브릿지 또는 분자 상호작용(예를 들어, Fc 헤테로이량체 사이의 노브-인-홀 상호작용)을 통해 회합될 수 있는 분자를 지칭한다. 반항체는 하나의 폴리펩타이드 사슬 또는 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 중쇄 및 경쇄)로 이루어질 수 있다.
중쇄 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중쇄" 또는 "면역글로불린(Ig) 중쇄"는 임의의 유기체로부터의 Ig 중쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 다르게 명시되지 않는 한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 다르게 명시되지 않는 한, 3개의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 중쇄 가변 도메인의 단편은 CDR, 또는 CDR과 FR 둘 다를 포함한다. 전형적인 중쇄 불변 영역(CH)은 가변 도메인 다음에, N-말단으로부터 C-말단까지: CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다(예를 들어 도 1a 및 도 2a 참조). 항원-결합 분자 및 이중특이적 중쇄 항원-결합 분자에 관하여 본원에 개시된 바와 같이 비-전형적인 중쇄는 예를 들어, N-말단으로부터 C-말단까지 임의의 2개의 중쇄 불변 영역(CH) 사이에 가변 도메인(VH)을 갖는다: CH2 도메인, CH3 도메인, VH 도메인, 및 CH2 도메인(예를 들어 도 1b 및 도 2b 참조). 일 구현예에서, Fc 부분은 적어도 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
힌지 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "힌지"는 면역글로불린의 CH2 도메인의 N-말단에 CH1의 C-말단을 연결하는 연속 아미노산 잔기의 영역을 포함하는 것으로 의도된다. CH2 엑손에 의해 코딩되는 CH2 도메인의 N-말단의 몇몇 아미노산은 또한 "하위(lower) 힌지"의 파트인 것으로 여겨진다. 임의의 하나의 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, IgG1, IgG2, 및 IgG4의 힌지 영역의 아미노산은 별도의 힌지 엑손에 의해 인코딩되는 12-15개의 연속 아미노산, 및 CH2 도메인(CH2 엑손에 의해 인코딩됨)의 몇몇 N-말단 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하였다(문헌[Brekke 등, 1995, Immunology Today 16(2):85-90]). 한편, IgG3은 4개의 분절로 구성된 힌지 영역을 포함한다: IgG1의 힌지 영역을 닮은 하나의 상위 분절, 및 IgG3에 독특한 동일한 아미노산 반복인 3개의 분절.
숙주 세포 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 개시내용의 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 소정의 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 뒤이은 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있으나 본원에 사용된 바와 같은 용어의 범위 내에 여전히 포함된다. 전형적인 숙주 세포는 진핵 숙주 세포, 예컨대 포유류 숙주 세포이다. 예시적인 진핵 숙주 세포는 효모 및 포유류 세포, 예를 들어 척추동물 세포, 예컨대 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간 세포주, 예를 들어 HKB11 세포, PER.C6 세포, HEK 세포, 또는 CHO 세포를 포함한다.
면역글로불린 : 용어 "면역글로불린"(Ig)은 경쇄(L)의 하나의 쌍 및 중쇄(H)의 하나의 쌍인 폴리펩타이드 사슬의 2개 쌍으로 구성된 구조적으로 관련된 당단백질의 부류를 지칭하며, 이들 4개는 모두 이황화 결합에 의해 상호연결될 수 있다. 면역글로불린의 구조는 양호하게 특징화되었다. 예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989))]을 참조한다. 각각의 중쇄는 전형적으로 중쇄 가변 영역(본원에서 VH 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(CH 또는 CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 전형적으로 3개의 도메인, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. CH1 도메인 및 CH2 도메인은 힌지에 의해 연결된다. Fc 부분은 적어도 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다.
전형적으로, 면역글로불린의 아미노산 잔기의 숫자매김은 IMGT, 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 따라, 또는 예를 들어, 문헌[Kabat 등 Sequences of Proteins of Immunological interest. 5th ed. US Department of Health and Human Services, NIH publication No. 91-3242 (1991)]에서와 같이 카바트의 EU 숫자매김 시스템("EU 숫자매김" 또는 "EU 지수"로도 알려져 있음)에 의한 것이다.
이소타입 : 용어 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 인코딩되는 면역글로불린 부류 또는 서브부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)를 지칭한다.
작동적으로 연결되는 : 용어 "작동적으로 연결되는"은 구성요소가 이의 의도된 방식으로 작용하도록 허용하는 것으로 기재된 바와 같이 이러한 구성요소의 물리적 또는 기능적 병치(juxtaposition)를 지칭한다. 폴리펩타이드와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결되는"은, 2개 이상의 영역이 기능적 폴리펩타이드를 생성하도록 연결된 폴리펩타이드 사슬의 2개 이상의 영역 사이의 기능적 관계를 지칭할 수 있다. 예컨대 DNA 발현 벡터 작제물의 맥락에서 핵산과 관련하여, 용어 "작동적으로 연결되는"은 예를 들어, 제어 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 오퍼레이터를 지칭하며, 제어 서열이 코딩 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩타이드의 생성을 안내(direct)하도록 코딩 서열과 비교한 위치에 놓인다.
폴리펩타이드 및 단백질 : 용어 "단백질"은 적어도 하나의 폴리펩타이드로 이루어진 4원(quaternary) 구조, 3원(ternary) 구조 및 다른 복잡한 거대분자를 포함하는 것으로 의미된다. 용어 "단백질"은 폴리펩타이드를 포함한다.
용어 "폴리펩타이드"는 인접 아미노산 잔기의 카르복실기와 아미노기 사이에서 펩타이드 결합에 의해 함께 연결된 아미노산의 단일 선형 중합체 사슬을 지칭한다. 개시내용의 폴리펩타이드는 면역글로불린 도메인으로부터 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 표기된 단백질 또는 폴리펩타이드"로부터 유래되는" 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열은 폴리펩타이드의 기원을 지칭한다.
용어 "단백질"은 큰 폴리펩타이드, 예컨대 하나 또는 다수의 폴리펩타이드로 이루어진 것을 기재하는 데 사용될 수 있다.
단일 사슬 Fab : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬 Fab" 또는 "scFab"는 항체의 VH, CH1, VL 및 CL 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다.
단일 사슬 Fv 또는 scFv : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬을 지칭하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다.
특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로(또는 선택적으로) 결합한다"는, ABM 또는 이의 항원 결합 부위("ABS")가 생리학적 조건 하에 상대적으로 안정한 표적 분자와 복합체를 형성함을 의미한다. 특이적인 결합은 약 5x10-2 M 이하(예를 들어, 5x10-2 M 미만, 10-2 M 미만, 5x10-3 M 미만, 10-3 M 미만, 5x10-4 M 미만, 10-4 M 미만, 5x10-5 M 미만, 10-5 M 미만, 5x10-6 M 미만, 10-6 M 미만, 5x10-7 M 미만, 10-7 M 미만, 5x10-8 M 미만, 10-8 M 미만, 5x10-9 M 미만, 10-9 M 미만, 또는 10-10 M 미만)의 KD를 특징으로 할 수 있다. 표적 분자에의 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, ABM 또는 ABS의 결합 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명(예를 들어, Biacore 검정), 형광-활성화된 세포 분류(FACS) 결합 검정 등을 포함한다. 그러나, 하나의 종으로부터의 표적 분자에 특이적으로 결합하는 ABM 또는 이의 ABS 항체는 하나 이상의 다른 종으로부터의 표적 분자와 교차-반응성을 갖는다.
표적 분자 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적 분자"는 ABM의 항원 결합 부위에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 임의의 생물학적 분자(예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 이들의 조합)를 지칭한다. 예시적인 표적 분자는 ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRLI, ADORA2A, 아그레칸(aggrecan), AGR2, AICDA, AIF1, AIG1, AKAP1, AKAP2, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOC1, AR, AZGP1(아연-a-당단백질), ART-4, B7, B7.1, B7.2, BAD, BAFF, BAGI, BAIi, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLRl (MDRlS), BlyS, BMPl, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMPS, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1(플렉틴), BRCA1, Ba-733, BAGE, BrE3- 항원, CA125, CAMEL, CAP-I, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CDI-IA, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, C19orf10(IL27w), C3, C4A, CS, CSR1, CANT1, CASPI, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCLI(I-309), CCLII(에오탁신(eotaxin)), CCL13(MCP-4), CCLIS(MIP-1d), CCL16(HCC- 4), CCL17(TARC), CCLIS(PARC), CCL19(MIP-3b), CCL2(MCP-1), MCAF, CCL20(MIP-3a), CCL21(MIP- 2), SLC, 엑소두스(exodus)-2, CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF- 1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL2S(TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27(CTACK/ILC), CCL2S, CCL3(MIP1a), CCL4(MIP-1b), CCLS(RANTES), CCL7(MCP-3), CCLS(mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1(CKR1/HM14S), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCRS(CMKBRSI ChemR13), CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EB1), CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI), CCR9(GPR-9-6), CCRLI(VSHK1), CCRL2(L-CCR), CD164, CDlC, CD200, CD-22, CD24, CD2S, CD3S, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD44, CD4SRB, CD47, CD4S, CDS2, CD69, CD72, CD79A, CD79B, CDSO, CDS1, CDS3, CDS6, CD137, CD13S, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CDH1(E-캐드헤린(cadherin)), CDH10, CDH12, CDH13, CDHlS, CDH19, CDH20, CDHS, CDH7, CDHS, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDKS, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A(p21 Wap1/Cip1), CDKN1B(p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A(p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CER1, CHGA, CHGB, 키티나제(chitinase), CHST1O, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSFS, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSFS, CLDN3, CLDN7(클라우딘(claudin)-7), CLN3, CLU(클러스테린(clusterin)), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CNR1, COLISA1, COLIA1, COL4A3, COL6Al, CR2, CRP, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(GCSF), CTLA-4, CTNNB1(b-카테닌), CTSB(카텝신(cathepsin) B), CX3CLI(SCYD1), CX3CR1(V2S), CXCLI(GRO1), CXCLIO(IP-10), CXCL11(I-TAC/IP-9), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCLS(ENA-7S/LIX), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/ STRL33/Bonzo), CYBS, CYC1, CYSLTR1, HIF-1-a, 결장-특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAB2IP, DES, DKFZp4S1J011S, DNCLI, DPP4, DAM, EGFR, EGFRvlll, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, E2F1, ECGF1, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, EN01, EN02, EN03, EPHB4, EPO, EREG, ERKS, ESR1, ESR2, F3(TF), FADD, FasL, FASN, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1(aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF1S, FGF19, FGF2(bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3(int-2), FGF4(HST), FGFS, FGF7(KGF), FGFS, FGF9, FGFR3, FIGF(VEGFD), FILI(EPSILON), FILI(ZETA), FLJ12SS4, FLJ2SS30, FLRT1(피브로넥틴), FOS, FOSLI(FRA- 1), FY(DARC), Flt-I, Flt-3, 폴레이트 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GDFS, GFil, GGTl, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPR2(CCR10), GPR31, GPR44, GPRS1(FKSGSO), GRCC10(C10), GRP, GSN(겔솔린(gelsolin)), GSTP1, HAVCR2, HDAC4, HDACS, HDAC7A, HDAC9, HGF, HIP1 히스타민 및 히스타민 수용체, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOX1, HUMCYT2A, HLA-DR, HMI 24, 인간 융모성 생식선 자극호르몬(HCG: human chorionic gonadotropin) 및 이의 서브단위, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자(HIF-1; hypoxia inducible factor-1), HSP70-2M, HST-2 또는 1a, IGF-IR, IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, IGBP1, IGF1, IGF1R, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, IL-1, IL-10, IL-10RA, IL-10RB, IL-11, IL-11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL-13RA1, IL-13RA2, IL-14, IL-1S, IL-1SRA, IL-16, IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17R, IL-18, IL-18BP, IL-18R1, IL-18RAP, IL-19, IL-IA, IL-1B, IL-1F10, IL-1FS, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1HY1, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAP, IL-1RAPL1, IL-1RAPL2, IL-1RL1, IL-1RL2 IL-1RN, IL-2, IL-20, IL-20RA, IL-21R, IL-22, IL-22R, IL-22RA2, IL-23, IL-24, IL-2S, IL-26, IL-27, IL-28A, IL-28B, IL-29, IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG, IL-3, IL-30, IL-3RA, IL-4, IL-4R, IL-S, IL-5RA, IL-6, IL-6R, IL-6ST(당단백질 130), IL-7, IL-7R, IL-S, IL-SRA, IL-SRB, IL-9, IL-9R, IL-K, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6(a6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4(b 4 인테그린), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-1), ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4 IFNAS, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNW1,, JAG1, JAK1, JAK3, JUN, K6HF, KAi1, KDR, KITLG, KLFS(GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK1S, KLK3, KLK4, KLKS, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19(케라틴 19), KRT2A, KRTHB6(모발-특이적 유형 II 케라틴), KC4-항원, KS-1-항원, KS 1-4, Le-Y, LDR/FUT, LAMAS, LEP(렙틴), Lingo-p7S, Lingo-Troy, LPS, LTA(TNF-b), LTB, LTB4R(GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG 또는 Omgp, MAP2K7(c-Jun), MDK, MIB1, 미드카인(midkine), MIF, MIP-2, MKI67(Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3(메탈로티오넥틴-III), MTSS1, MUC1(뮤신), MYC, MYD88, 대식세포 이동 저해 인자(MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ES0-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, NCK2, 뉴로칸(neurocan), NFKB1, NFKB2, NGFB(NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgR-Nogo66(Noga), NgRp7S, NgR-Troy, NME1(NM23A), NOXS, NPPB, NROB1, NROB2, NR1D1, NR1D2, NRIH2, NRIH3, NRIH4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NRSA1, NRSA2, NR6A1, NRP1, NRP2, NTSE, NTN4, ODZ1, OPRD1, PCSK9, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, PCA3, PCNA, PD-1, PD-L1, 알파4베타7, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDFS, CGRP, Lingo-I, 인자 IXa, 인자 X, ICOS, GARP, BTLA, CD160, RORI, 2B4, KIR, CD27, OX40, A2aR, PDGFA, PDGFB, PECAM1, PF4(CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸(phosphacan), PIAS2, PIK3CG, PLAU(uPA), PLG, PLXDC1, PPBP(CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2(COX-2), PTN, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 프로스타틱 산 포스파타제(prostatic acid phosphatase), PSA, PRAME, PSMA, 10 PIGF, ILGF, ILGF-IR, IL-6, RS5, RANTES, RAC2(p21Rac2), RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFl10(ZNF144), ROB02, S100A2, SCGB1D2(리포필린(lipophilin) B), SCGB2A1(맘마글로빈(mammaglobin) 2), SCGB2A2(맘마글로빈 1), SCYE1(내피 단핵구-활성화 사이토카인), SDF2, SERPINA1, SERPINA3, SERPINBS(마스핀(maspin)), SERPINE1(PAI-1), SERPINF1, SHBG, SLA2, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPP1, SPRR1B(Sprl), ST6GAL1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TIOI, SAGE, 5100, 서바이빈(survivin), 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신(tenascin), TRAIL 수용체, TNF-α, Tn-항원, 톰슨프라이덴리히(ThomsonFriedenreich) 항원, 종양 괴사 항원, TB4R2, TBX21, TCP10, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFBlil, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, THBS1(트롬보스폰딘(thrombospondin)-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE(Tie-1), TIMP3, 조직 인자, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLRS, TLR6, TLR7, TLRS, TLR9, TNF, TNF-a, TNFAIP2(B94), TNFAIP3, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSFS, TNFRSF6(Fas), TNFRSF7, TNFRSFS, TNFRSF9, TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(AP03L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF1S(VEGI), TNFSF18, TNFSF4(OX40 리간드), TNFSFS(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSFS(CD30 리간드), TNFSF9(4-lBB 리간드), TOLLIP, Toll-유사(Toll-like) 수용체, TOP2A(토포이소머라제(topoisomerase) Iia), TPS3, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAPS, TRAF6, TREM1, TREM2, TRPC6, TSLP, TWEAK, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-IA 항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, CS, 혈관신생 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, CD19/CD3, BCMA/CD3, EGFR, HER3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL1/ IL-8, IL-6, IL-6R/IL-21, IL-21R, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용기(acceptor) 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, VEGFB, VEGFC, 베르시칸(versican), VHL CS, VLA-4, c-FMS/CSFIR, RET, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린, MMPs VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 앤지오포이에틴(angiopoietin), ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 l/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-IR, IL 25 17A/F, EGF 수용체 l/CD3, 및 CD19/CD16, KHI, Tn-항원, TF-항원, CD44, 당지질, 당스핑고지질(glycosphingolipid), 예컨대 30 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알릴테트라오실레라마이드(sialyltetraosylceramide), XCL1(림포탁신(lymphotactin)), XCL2(SCM-1b), XCR1(GPRS/ CCXCR1), YY1, 및 ZFPM2를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 표적 분자는 작은 가용성(즉, 막-결합되지 않은) 분자이다.
4가 : 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "4가"는 4개의 항원 결합 부위를 갖는 ABM을 지칭한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 2개는 동일한 에피토프에 결합하고, 다른 2개의 결합 부위는 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자이든지 간에 상이한 에피토프에 결합한다.
유니버셜 중쇄 : ABM의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유니버셜 중쇄"는 재배열된 중쇄 가변 영역을 갖는 중쇄, 예를 들어, 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역을 갖는 인간 중쇄를 지칭한다. 예시적인 재배열된 Ig 중쇄 가변 영역은 미국 특허출원공개 2014/0245468호 및 미국 특허 제9,204,624호 및 제9,930,871호에 제공되며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 유니버셜 중쇄는 "보편적(common) 중쇄"로도 알려져 있다.
유니버셜 경쇄 : ABM의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유니버셜 중쇄"는 재배열된 경쇄 가변 영역을 갖는 경쇄, 예를 들어, 재배열된 Ig 경쇄 가변 영역을 갖는 인간 경쇄를 지칭한다. 유니버셜 경쇄는 "보편적 중쇄"로도 알려져 있다. 맥락에서, ABM은 동일한 ABM에서 상이한 가변 영역을 갖는 2개의 상이한 Fab 도메인의 중쇄 영역과 쌍형성할 수 있는 경쇄 폴리펩타이드를 지칭한다. 유니버셜 경쇄는 또한 "보편적 경쇄"로 알려져 있다. 예시적인 재배열된 Ig 경쇄 가변 영역은 예를 들어, 미국 특허 제9,969,814호; 제10,130,181호, 및 제10,143,186호 및 미국 특허출원공개 2012/0021409호, 2012/0192300호, 2013/0045492호, 2013/0185821호, 2013/0302836호, 및 2015/0313193호에 제공되며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
VH : 용어 "VH"는 Fab의 중쇄를 포함하여 항체의 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다.
VL : 용어 "VL"은 Fab의 경쇄를 포함하여 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
6.2. 항원 결합 분자(ABM)
항원-결합 분자, 예컨대 단일특이적 및 이중특이적 항원-결합 분자가 본원에 개시된다. 개시된 항원 결합 분자는 전형적인 항체 구조와 상이한 결합 도메인 배열을 갖는다. 개시된 항원 결합 분자는 단일 표적 분자 또는 항원에 이중특이적으로 결합할 수 있으며, 이는 항원 또는 표적 분자에 대해 증가된 친화도 및/또는 결합력을 초래할 수 있다. 예를 들어, Fab가 둘 다 상이한 에피토프에서 동일한 항원에 결합하는 이중특이적 항원-결합 분자에 대해, 항원에 대한 친화도는 에피토프 중 단지 하나에만 결합되는 항체에 비해 증가하는 것으로 예상될 것이다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본원에 개시된 ABM은 Fab1 도메인 및 Fab2 도메인의 증가된 근접성(proximity) 및/또는 더 큰 가요성(flexibility)으로부터 비롯되는 항원 또는 표적 분자에 대해 증가된 결합력을 갖는 것으로 여겨지며, 이는 Fab 도메인의 결합 부위가 이격되어 있는 종래의 형식의 항체에 비해 항원 결합 부위의 국재적인 농도를 증가시킬 것이다.
제1 양태에서, 개시내용의 ABM은
ㆍ 제1 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 선택적인 힌지 도메인;
- 제1 Fc 도메인; 및
- 제1 경쇄 가변 영역(VL)과 회합된 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 Fab(Fab1) 도메인을 포함하는, 제1 반항체; 및
ㆍ 제2 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 선택적인 힌지 도메인;
- 제2 Fc 도메인; 및
- 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab("Fab2") 도메인을 포함하는, 제2 반항체
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성하고, 선택적인 힌지 도메인은 존재한다면 이황화 브릿지를 통해 서로 회합될 수 있다.
일반적으로 본원에서 ABM 형식 "A"("형식 A")로 지칭되고 이따금 본원에서 "Fc-Fab" 형식으로 지칭되는 이러한 유형의 ABM의 2개의 구현예는 도 1b 및 도 2b, 뿐만 아니라 도 13a, 도 13b, 및 도 13c에 도시된 이들의 변이에 예시되어 있다. 이에, 본 개시내용은 도 1b 및 도 2b에 도시된 형식 A ABM을 제공하며, 형식 A ABM은
ㆍ 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 Fc 도메인;
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- 링커(8); 및
- Fab1 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab1 VH 도메인(1) 및 Fab1 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab1 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab1 VL 도메인(6) 및 Fab1 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소를 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 이황화 결합을 통해 제1 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제2 Fc 도메인;
- 이황화 결합을 통해 제1 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 선택적인 힌지 도메인(3);
- 링커(8); 및
- Fab2 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab2 VH 도메인(1) 및 Fab2 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab2 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab2 VL 도메인(6) 및 Fab2 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소를 포함하는, 제2 폴리펩타이드
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성한다.
도 1b의 구현예에서, Fc 호모이량체를 형성하는 Fc 도메인을 포함하는 반항체는 둘 다 동일하고, 생성된 ABM은 단일특이적이다. 도 2b의 구현예에서, ABM은 Fc 헤테로이량체를 포함하여, 상이한 Fab1 VH 도메인 및 Fab2 VH 도메인의 사용 및 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적 분자의 생성을 가능하게 한다. 도 1b, 도 2b, 및 도 13a는 ABM이 Fc 도메인에 대해 N-말단에서 힌지 도메인으로 이루어진 힌지 영역을 갖는 구현예를 예시하는 한편, 형식 A ABM은 힌지 영역을 갖지 않거나(예시되지 않음), Fc 영역에 대해 C-말단에서 힌지 영역을 갖거나(도 13c), Fc 영역에 대해 N-말단 및 C-말단에서 힌지 영역을 갖는다(도 13b). Fc 영역에 대해 N-말단 및/또는 C-말단에서 사용될 수 있는 예시적인 힌지 도메인은 아미노산 서열 GGGGSCPPC(SEQ ID NO:1) 및 ESKYGPPCPPC(SEQ ID NO:2)를 포함하지만, 도 13a 내지 도 13c에 도시된 바와 같이, 형식 A ABM은 대안적인 힌지 영역 서열을 가질 수 있다. 마찬가지로, 도 13a 내지 도 13c가 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)를 도시하긴 하지만, 다른 링커 서열이 사용될 수 있다.
도 1b 및 도 2b는 단지 2개의 결합 도메인(Fab1 및 Fab2)을 함유하는 형식 A ABM의 구현예를 예시하는 한편, 개시내용의 ABM은 추가의 결합 도메인, 예를 들어, scFv 또는 Fab 도메인을 함유할 수 있다. 그러나 소정의 양태에서, Fab1 및 Fab2는 형식 A ABM의 단독 결합 도메인이다.
제2 양태에서, 개시내용의 ABM은
ㆍ 제1 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제1 VL과 회합된 제1 VH를 포함하는 제1 Fab(Fab1) 도메인;
- 제1 스페이서 도메인; 및
- 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 반항체; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab(Fab2) 도메인;
- 제2 스페이서 도메인; 및
- 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성한다.
이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, Fc 도메인과 Fab 도메인 사이의 스페이서 도메인의 포함은 Fc 영역과 Fab의 항원 결합 부위 사이의 더 큰 가요성, 그리고 결과적으로 ABM의 표적 분자에의 이러한 ABM의 결합의 더 높은 친화도 및/또는 친화력을 초래하는 것으로 여겨진다.
소정의 구현예에서, 스페이서 도메인은 연장된 링커이다. 일반적으로 본원에서 형식 "B"("형식 B")로 지칭되고 이따금 "리치" 형식으로 지칭되는 ABM의 이러한 형식은 도 3a에 예시되어 있다. 이에, 본 개시내용은 도 3a에 도시된 형식 B ABM을 제공하며, 형식 B ABM은
ㆍ 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab1 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab1 VH 도메인(1) 및 Fab1 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab1 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab1 VL 도메인(6) 및 Fab1 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 연장된 링커인 링커 도메인(8);
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab2 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab2 VH 도메인(1) 및 Fab2 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab2 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab2 VL 도메인(6) 및 Fab2 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 연장된 링커인 링커 도메인(8);
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함한다.
도 3a에 도시된 형식 B ABM의 구현예가 단지 2개의 결합 도메인(Fab1 및 Fab2)을 포함하는 한편, 개시내용의 형식 B ABM은 추가의 결합 도메인, 예를 들어, scFv 또는 Fab 도메인을 함유할 수 있다. 그러나 소정의 양태에서, Fab1 및 Fab2는 개시내용의 형식 B ABM의 단독 결합 도메인이다.
다른 구현예에서, 스페이서 도메인은 Fab 도메인이다. 본원에서 형식 "C"("형식 C")로 지칭되는 ABM의 이러한 형식의 상이한 변이는 도 3b 내지 3d에 예시되어 있다. 그러므로, 형식 C ABM은 하기와 같이 배치된 제3 Fab(Fab3) 도메인 및 제4 Fab(Fab4) 도메인을 포함한다:
ㆍ 제1 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제1 VL과 회합된 제1 VH를 포함하는 제1 Fab(Fab1) 도메인;
- 제3 VL과 회합된 제3 VH를 포함하는 제3 Fab(Fab3) 도메인; 및
- 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 반항체; 및
ㆍ 제2 반항체로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab(Fab2) 도메인;
- 제4 VL과 회합된 제4 VH를 포함하는 제4 Fab(Fab4) 도메인; 및
- 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 반항체.
이에, 본 개시내용은 도 3b 내지 도 3d에 도시된 형식 C ABM을 제공하며, 형식 C ABM은
ㆍ 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab1 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab1 VH 도메인(1) 및 Fab1 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab1 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab1 VL 도메인(6) 및 Fab1 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 링커 도메인(8);
- Fab3 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab3 VH 도메인(1) 및 Fab3 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab3 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab3 VL 도메인(6) 및 Fab3 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제1 Fc 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
ㆍ 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
- Fab2 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab2 VH 도메인(1) 및 Fab2 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab2 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab2 VL 도메인(6) 및 Fab2 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 링커 도메인(8);
- Fab4 도메인의 경쇄 구성요소에 회합된 Fab4 VH 도메인(1) 및 Fab4 CH1 도메인(2)을 포함하는 Fab4 도메인의 중쇄 구성요소, N-으로부터-C 말단 배향으로 Fab4 VL 도메인(6) 및 Fab4 CL 도메인(7)을 포함하는 폴리펩타이드 형태의 경쇄 구성요소;
- 이황화 결합을 통해 제2 폴리펩타이드 내의 힌지 도메인에 연결되는 힌지 도메인(3); 및
- CH2 도메인(4) 및 CH3 도메인(5)을 포함하는 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성한다.
도 3b 내지 3d에 도시된 형식 C ABM의 구현예가 4개의 결합 도메인(Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab4)을 포함하는 한편, 개시내용의 형식 C ABM은 추가의 결합 도메인, 예를 들어, scFv 또는 Fab 도메인을 함유할 수 있다. 그러나 소정의 양태에서, Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab4는 개시내용의 형식 C ABM의 단독 결합 도메인이다.
형식 C ABM의 Fab3 및 Fab4 도메인은 비-결합적(도 3b에 예시된 바와 같음) 또는 결합적일 수 있다(도 3c 및 도 3d에 예시된 바와 같음). Fab3 및 Fab4가 비-결합적인 구현예는 일반적으로, 본원에서 형식 C1 ABM으로 지칭되고, 이러한 형식은 이따금 본원에서 "클램프"로 지칭된다. Fab3 및 Fab4가 결합적인 구현예는 일반적으로, 본원에서 형식 C2 ABM으로 지칭되고, 이러한 형식은 이따금 본원에서 "탠덤 Fab"로 지칭된다. 용어 "2+2 탠덤 Fab"는, Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab 4가 탠덤 Fab에서 단독 결합 도메인인, 도 3c 및 도 3d에서 예시된 구현예를 지칭한다. 형식 C1 ABM 및 형식 C2 ABM은 각각 호모이량체성 또는 헤테로이량체성일 수 있다.
형식 C1 ABM의 소정의 구현예에서, Fab1 도메인 및 Fab2 도메인은 동일하지 않고(예를 들어, 동일한 표적 분자 상에 있거나 상이한 표적 분자 상에 있든지 간에, 상이한 에피토프에 결합함), Fab3 도메인 및 Fab4 도메인은 동일한 비-결합적 도메인이다. 다른 구현예에서, Fab3 및 Fab4 도메인은 상이한 비-결합적 도메인이다.
형식 C2 ABM의 소정의 구현예에서, 도 3c에 도시된 바와 같이, Fab1 도메인 및 Fab3 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함하고, Fab2 도메인 및 Fab4 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함한다. 이러한 배치는 배치 1, 또는 1-1-2-2 배치로 지칭된다. 형식 C2 ABM의 대안적인 구현예에서, 도 3d에 도시된 바와 같이, Fab1 도메인 및 Fab2 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함하고, Fab3 도메인 및 Fab4 도메인은 동일한 VH 도메인을 포함한다. 이러한 배치는 배치 2, 또는 1-2-1-2 배치로 지칭된다.
완전 ABM은 2개의 Fc 도메인을 통해 2개의 반항체의 회합에 의해 형성되어, Fc 영역을 형성한다. 2개의 반항체가 동일하지 않을 때, 예를 들어 Fab1 및 Fab2가 상이한 VH 도메인을 포함할 때, 예를 들어 섹션 6.2.7.2에 기재된 바와 같이 Fc 헤테로이량체화 접근법은 올바른 반항체 쌍형성 또는 이의 정제를 용이하게 하는 데 이용될 수 있다. 헤테로이량체화 접근법의 예는 스타 돌연변이(섹션 6.2.7.2에 기재된 바와 같음) 또는 노브-인-홀 돌연변이이다.
도 2b, 3a, 3b 및 3c는 Fc 헤테로이량체를 통해 쌍형성된 각각의 반항체에 동일하지 않은 VH 도메인을 포함하는 ABM을 도시하는 한편, 이러한 형식은 또한 Fc 호모이량체에 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 2b 및 도 3a는 각각 Fc 헤테로이량체를 포함하여 Fab1 및 Fab2에서 상이한 VH 도메인의 혼입 및 다중특이적, 예를 들어, 이중특이적 결합 분자의 생성을 가능하게 하는 형식 A ABM 및 형식 B ABM을 도시하는 한편, 이러한 포맷은 또한 Fc 호모이량체 및 동일한 VH 도메인을 갖는 단일특이적 형식 A 및 형식 B ABM에 사용될 수 있다. 유사하게는, Fc 호모이량체는 동일한 Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab4 VH 도메인 또는 동일한 Fab1 및 Fab2 VH 도메인 및 비-결합적 Fab3 및 Fab4 VH 도메인을 갖는 단일특이적 형식 C ABM을 생성하는 데 사용될 수 있다.
추가로, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 상이한 VH 도메인을 포함할 때, 다중특이적 결합 분자에서 올바른 VH-VL 쌍형성을 허용하기 위해 상이한 전략이 사용될 수 있다. 예를 들어, ABM 내의 하나 초과의 유형의 VH 도메인과 작동적으로 쌍형성할 수 있는 보편적 경쇄가 사용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 경쇄 폴리펩타이드(예를 들어, Fab1과 Fab2와 회합된 경쇄, 및 존재한다면 Fab3와 Fab4와 회합된 경쇄)는 동일할 수 있다. 대안적으로, 중쇄 구성요소((1) 및 (2))가 경쇄 구성요소((6) 및 (7))와의 융합으로서 발현될 수 있는 단일 도메인 Fab가 사용될 수 있다.
도 1 내지 도 3에 도시된 개시내용의 ABM의 변동은 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 개시내용의 ABM은 도 1 내지 도 3 및 다른 것들 중에서도 아래의 섹션 6.2에서 예시된 변형들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 추가로, 제1 또는 제2 폴리펩타이드 사슬 또는 좌측 또는 우측 반항체의 언급은 단지 편의를 위한 것이며, 폴리펩타이드 사슬 또는 반항체는 임의의 특정 순서로 생성되거나 조립됨을 시사하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM의 제1 Fab(Fab1) 도메인 및 제2 Fab(Fab2) 도메인은 각각 동일한 표적 분자, 예를 들어 작은 가용성 분자에 결합할 수 있다. 제1 Fab(Fab1) 도메인 및 제2 Fab(Fab2) 도메인은 동일한 에피토프에 결합할 수 있거나(예를 들어, 도 1b 및 도 3d에 도시된 구현예, 또는 Fab1과 Fab2가 둘 다 동일한 VH 도메인을 갖는 도 3a 또는 도 3b의 변동에서(도시되지 않음)), 이들은 동일한 표적 분자 상에 있거나 상이한 표적 분자 상에 있든지 간에, 상이한 에피토프에 결합할 수 있다(예를 들어, 도 2b, 도 3a, 도 3b, 및 도 3c의 구현예에서). 제1 Fab(Fab1) 도메인 및 제2 Fab(Fab2) 도메인이 상이한 에피토프, 예를 들어, 동일한 표적 분자 상의 또는 상이한 표적 분자 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 이들은 Fab가 이의 에피토프에 동시에 결합할 수 있도록 선택될 수 있다.
예를 들어 형식 C ABM의 일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 도 3c, 도 3a, 및 도 3d에 도시된 바와 같이 제3 Fab(Fab3) 도메인 및 제4 Fab(Fab4) 도메인을 포함할 수 있다. 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 도 3c에 도시된 바와 같이 비-결합적일 수 있거나, 이들은 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인(Fab1 및 Fab2)에 의해 각각 결합된 에피토프로부터 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 형식 C ABM을 참조로 하여, 용어 "제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인" 및 "Fab1 도메인 및 Fab2 도메인"은 전형적으로 가장 N-말단인 Fab 도메인을 지칭한다.
소정의 표적 분자, 특히 반복 모티프를 갖는 폴리펩타이드 또는 다량체 구조(예를 들어, 호모이량체 또는 호모삼량체)를 갖는 단백질에 존재할 수 있는 바와 같이 반복된 에피토프를 갖는 표적 분자는 2개 이상의 항체 분자에 의해 결합되어, 큰 복합체의 형성을 유발할 수 있다. 큰 이종성 항체 복합체의 생성은 "페이퍼-돌링(paper-dolling)"으로 지칭된다. 항체의 큰 복합체는 식세포작용에 의해 신속하게 제거되어, 항체의 감소된 효능을 유발할 수 있다. 큰 복합체는 또한, 치료 항체의 면역원성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 국제공개 WO2020047067A1호를 참조한다. 개시내용의 ABM은, 예를 들어 Fab 도메인이 수득된 모 항체와 비교하여 생체내에서 또는 생체외에서 응집(aggregation)되는 경향이 더 적을 수 있다. 비제한적인 예로서, Fab가 둘 다 상이한 에피토프에서 동일한 항원에 결합하는 이중특이적 ABM에 대해, 모 mAb 조합으로 수득되는 결과와 달리, 개시내용의 ABM은 주로, 추가의 더 고차의(higher order) 복합체가 거의 없거나 전혀 없는 리간드와 별도의 1:1 복합체를 형성하였음이 관찰되었다(아래 실시예 4 참조). 대조적으로, 모 mAb 조합은 다수의 더 고차의 구조(다량체)를 형성하였고, 이는 이들 모 항체가 다수의 리간드 사이에서 브릿지를 형성하였으며, 예를 들어 폴딩되지 않은(unfolded) "페이퍼 돌(paper doll)" 구조를 형성함을 시사한다. 이들 결과는, 본원에 개시된 바와 같은 ABM이 응집을 받는 경향이 더 적으며, Fab 도메인의 근접성이 더 고차의 구조에 걸쳐 1:1 Fc-Fab 리간드 복합체의 형성을 선호하는 것으로 여겨지기 때문이다. 실제로, 이는 모 항체에 대해 예상될 것보다 더 높은 상대 농도의 단일 ABM:표적 분자 복합체를 초래할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 적어도 2개의 상이한 에피토프(및 일부 상황에서 3개 또는 4개의 상이한 에피토프)에 특이적으로 결합한다. 적어도 2개의 상이한 에피토프는 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자 상에 존재할 수 있다.
6.2.1. Fab 도메인
개시내용의 ABM은 각각의 반항체에 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함한다. Fab 도메인은 전형적으로, 파파인과 같은 효소를 사용한 면역글로불린 분자의 단백분해성 절단에 의해 생성되었다. 개시내용의 ABM에서, Fab 도메인은 더 큰 분자의 파트로서 재조합적으로 발현된다.
Fab 도메인은 임의의 적합한 종으로부터의 불변 도메인 서열 및 가변 도메인 서열을 포함할 수 있고, 뮤린, 키메라, 인간 또는 인간화일 수 있다.
Fab 도메인은 전형적으로, VL 도메인에 부착된 CL 도메인과 쌍형성하는 VH 도메인에 부착된 CH1 도메인을 포함한다. 야생형 면역글로불린에서, VH 도메인은 VL 도메인과 쌍을 형성하여, Fv 영역을 이루고, CH1 도메인은 CL 도메인과 쌍을 형성하여 결합 분자를 추가로 안정화시킨다. 2개의 불변 도메인 사이의 이황화 결합은 Fab 도메인을 추가로 안정화시킬 수 있다.
개시내용의 ABM에 대해, 특히 경쇄가 보편적 또는 유니버셜 경쇄가 아닐 때, 동일한 ABS에 속하는 Fab 도메인의 올바른 회합을 허용하고 상이한 ABS에 속하는 Fab 도메인의 비정상적인 쌍형성을 최소화하기 위해 Fab 헤테로이량체화 전략을 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, 아래 표 B에 나타낸 Fab 헤테로이량체화가 사용될 수 있다:
이에, 소정의 구현예에서, Fab의 2개의 폴리펩타이드 사이의 올바른 회합은 예를 들어, 국제공개 WO 2009/080251호에 기재된 바와 같이 Fab의 VL 도메인 및 VH 도메인을 서로 교환함으로써 또는 CH1 도메인 및 CL 도메인을 서로 교환함으로써 촉진된다.
올바른 Fab 쌍형성은 또한, Fab의 CH1 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형 및 CL 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형 및/또는 VH 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형 및 VL 도메인에 하나 이상의 아미노산 변형을 도입함으로써 촉진될 수 있다. 변형되는 아미노산은 전형적으로, Fab 구성요소가 다른 Fab의 구성요소보다 서로 우선적으로 쌍을 형성하게 되는 VH:VL 및 CH1 :CL 계면의 파트이다.
일 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 잔기의 카바트 숫자매김에 의해 지시된 바와 같이, 가변(VH, VL) 및 불변(CH1, CL) 도메인의 보존된 프레임워크 잔기로 제한된다. 문헌[Almagro, 2008, Frontiers In Bioscience 13:1619-1633]은 카바트, 초티아, 및 IMGT 숫자매김 체계에 기초하여 프레임워크 잔기의 정의를 제공한다.
일 구현예에서, VH 및 CH1 및/또는 VL 및 CL 도메인에 도입되는 변형은 서로 상보적이다. 중쇄 및 경쇄 계면에서의 상보성은 입체(steric) 및 소수성 접촉, 정전기/전하 상호작용 또는 여러 가지 상호작용들의 조합에 기초하여 달성될 수 있다. 단백질 계면 사이의 상보성은 자물쇠와 열쇠 맞춤(lock and key fit), 노브 인투 홀(knob into hole), 돌출부 및 공극(protrusion and cavity), 공여기 및 수용기 등의 측면에서 문헌에서 널리 기재되어 있으며, 이들 모두는 2개의 상호작용 계면 사이의 구조적 및 화학적 매치의 성질을 암시한다.
일 구현예에서, 하나 이상의 도입되는 변형은 Fab 구성요소의 계면을 가로질러 새로운 수소 결합을 도입한다. 일 구현예에서, 하나 이상의 도입되는 변형은 Fab 구성요소의 계면을 가로질러 새로운 염 브릿지를 도입한다. 예시적인 치환은 국제공개 WO 2014/150973호 및 WO 2014/082179호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.
일부 구현예에서, Fab 도메인은 CH1 도메인에 192E 치환 및 CL 도메인에 114A 및 137K 치환을 포함하며, 이는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에 염-브릿지를 도입한다(예를 들어, 문헌[Golay 등, 2016, J Immunol 196:3199-211] 참조).
일부 구현예에서, Fab 도메인은 CH1 도메인에 143Q 및 188V 치환 및 CL 도메인에 113T 및 176V 치환을 포함하며, 이는 CH1 도메인과 CL 도메인 사이에서 접촉의 소수성 및 극성 영역을 스와핑하는 역할을 한다(예를 들어, 문헌[Golay 등, 2016, J Immunol 196:3199-211] 참조).
일부 구현예에서, Fab 도메인은 VH, CH1 , VL, CL 도메인 중 일부 또는 모두에 변형을 포함하여, Fab 도메인의 올바른 조립을 촉진하는 직교 Fab 계면을 도입할 수 있다(문헌[Lewis 등, 2014 Nature Biotechnology 32:191-198]). 일 구현예에서, 39K, 62E 변형은 VH 도메인에 도입되며, H172A, F174G 변형은 CH1 도메인에 도입되고, 1 R, 38D, (36F) 변형은 VL 도메인에 도입되며, L135Y, S176W 변형은 CL 도메인에 도입된다. 또 다른 구현예에서, 39Y 변형은 VH 도메인에 도입되고, 38R 변형은 VL 도메인에 도입된다.
Fab 도메인은 또한, 네이티브 CH1:CL 이황화 결합을 조작된 이황화 결합으로 대체하여, Fab 구성요소 쌍형성의 효율을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 조작된 이황화 결합은 126C를 CH1 도메인에 그리고 121 C를 CL 도메인에 도입함으로써 도입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Mazor 등, 2015, MAbs 7:377-89] 참조).
Fab 도메인은 또한, CH1 도메인 및 CL 도메인을, 올바른 조립을 촉진하는 대안적인 도메인으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wu 등, 2015, MAbs 7:364-76]은 T 세포 수용체의 CH1 도메인을 불변 도메인으로 치환하며 T 세포 수용체의 CL 도메인을 b 도메인으로 치환하고, VL 도메인에 38D 변형 및 VH 도메인에 39K 변형을 도입함으로써 VL 도메인과 VH 도메인 사이에서 추가의 전하-전하 상호작용과 이들 도메인 대체를 쌍형성하는 것을 기재한다.
올바른 VH - VL 쌍형성을 촉진하기 위한 Fab 헤테로이량체화 전략의 사용 대신에 또는 이에 더하여, 보편적 경쇄(유니버셜 경쇄로도 지칭됨)의 VL은 개시내용의 ABM의 각각의 Fab VL 영역에 사용될 수 있다. 다양한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 보편적 경쇄를 이용하는 것은 원래의 동족(cognate) VL을 이용하는 것과 비교하여 부적절한 종의 ABM의 수를 감소시킨다. 다양한 구현예에서, ABM의 VL 도메인은 보편적 경쇄를 포함하는 단일특이적 항체로부터 식별된다. 다양한 구현예에서, ABM의 VH 영역은, 인간 중쇄와 동족인 제한된 인간 경쇄 레퍼토리, 또는 단일 인간 경쇄를 발현하도록 이전에 조작된 마우스 B 세포 내에서 생체내에서 재배열되고, 관심 항원에의 노출에 반응하여 하나의 또는 2개의 가능한 인간 VL 중 하나와 동족인 복수의 인간 VH를 함유하는 항체 레퍼토리를 생산하는 인간 중쇄 가변 유전자 분절을 포함하며, 여기서 항체 레퍼토리는 관심 항원에 특이적이다. 보편적 경쇄는 재배열된 인간 Vκ1-39Jκ5 서열 또는 재배열된 인간 Vκ3-20Jκ1 서열로부터 유래되는 것이고, 체세포적으로 돌연변이화된(예를 들어, 친화도 성숙된) 버전을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제10,412,940호를 참조한다.
일부 구현예에서, Fab는 단일 사슬 Fab("scFab")의 형식이며, 이는 전형적으로 VH, CH1, VL, CL 및 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, scFab의 도메인은 N-말단으로부터 C-말단 순서로 배열된다: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL. 링커는 섹션 6.2.3에 기재된 바와 같은 링커일 수 있고, 바람직하게는 적어도 30개 아미노산, 소정의 양태에서 32개 내지 50개 아미노산이다. 단일 사슬 Fab 도메인은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이에서 천연 이황화 결합을 통해 안정화된다.
6.2.2. scFv
단일 사슬 Fv 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 단일 폴리펩타이드 사슬에 포함하며, 단일 사슬 폴리펩타이드로서 발현될 수 있고, 이것이 유래되는 무손상(intact) 항체의 특이성을 보유한다. 일반적으로, scFv 폴리펩타이드는, scFv가 표적화 결합에 요망되는 구조를 형성하게 하는 폴리펩타이드 링커를 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 추가로 포함한다. scFV의 VH 사슬 및 VL 사슬을 연결하는 데 적합한 링커의 예는 섹션 6.2.3에서 식별된 링커이다.
명시되지 않는 한 본원에 사용된 바와 같이, scFv는 예를 들어, 폴리펩타이드의 N-말단 단부 및 C-말단 단부에 대해 어느 순서에서 VL 가변 영역 및 VH 가변 영역을 가질 수 있거나, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 VH-링커-VL를 포함할 수 있다.
scFv는 임의의 적합한 종으로부터의 VH 및 VL 서열, 예컨대 뮤린, 인간, 또는 인간화 VH 및 VL 서열을 포함할 수 있다.
scFv-인코딩 핵산을 생성하기 위해, VH 및 VL-인코딩 DNA 단편은 링커를 인코딩하는, 예를 들어, 섹션 6.2.3에 기재된 임의의 링커를 인코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결되어(전형적으로 아미노산 글리신 및 세린을 함유하는 서열의 반복, 예컨대 아미노산 서열 (Gly4~Ser)3(SEQ ID NO:4)), VH 및 VL 서열은, 가요성 링커에 의해 접합되는 VL 및 VH 영역과 함께 인접(contiguous) 단일-사슬 단백질로서 발현될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bird 등, 1988, Science 242:423-426]; 문헌[Huston 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[McCafferty 등, 1990, Nature 348:552-554] 참조).
6.2.3. 링커
소정의 양태에서, 본 개시내용은, 2개 이상의 도메인(예를 들어, Fab 및 Fc 영역)이 링커(또는 "스페이서") 펩타이드에 의해 서로 연결되는 ABM을 제공한다. 이러한 링커는 본원에서 예를 들어, 섹션 6.4에 기재된 바와 같이 약물을 ABM에 부착시키는 데 사용되는 항체-약물 접합체("ADC") 링커와 대조적으로, "ABM 링커"로 지칭된다.
펩타이드 링커(예를 들어, 폴리글리신)는 당업계에 잘 알려져 있고, 전형적으로 융합 단백질의 구성요소 중 하나 또는 둘 다의 적절한 폴딩(folding)을 가능하게 한다. 링커는 융합 단백질의 구성요소의 가요성 연접(junction) 영역을 제공하여, 분자의 2개 단부(end)가 독립적으로 움직이는 것을 가능하게 하며, 2개의 모이어티의 적절한 기능을 각각 보유하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 연접 영역은 일부 경우 2개 파트를 함께 조합하는 둘 다 링커로서, 그리고 2개 파트 각각이 그 자체의 생물학적 구조를 형성하고 다른 파트를 간섭하지 않게 하는 스페이서로서 작용한다.
ABM 링커는 2개 아미노산 내지 60개 이상의 아미노산 범위일 수 있고, 소정의 양태에서, 펩타이드 링커는 3개 아미노산 내지 50개 아미노산, 4 내지 30개 아미노산, 5 내지 25개 아미노산, 10 내지 25개 아미노산, 10개 아미노산 내지 60개 아미노산, 12개 아미노산 내지 20개 아미노산, 20개 아미노산 내지 50개 아미노산, 또는 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이이다.
본 개시내용은 각각이 제1 링커 및 제2 링커를 각각 포함하는 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드(예를 들어, 섹션 6.2에 기재된 구현예의 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드)를 포함하는 ABM을 제공한다. 제1 링커 및 제2 링커는 0 내지 60개 또는 0 내지 50개 아미노산, 예컨대 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 아미노산, 예를 들어 0-10, 5-15, 10-20 15-25, 0-30, 5-30, 10-30, 20-30, 0-40, 5-40, 10-40, 15-40, 20-40, 25-40, 30-40, 35-40, 0-50, 5-50, 10-50, 15-50, 20-50, 25-50, 30-50, 35-50, 40-50, 또는 45-50개 아미노산의 길이를 가질 수 있다. Fc-Fab, 클램프 및 탠덤 Fab 형식 ABM에 대해, 전형적인 링커 길이는 5개 내지 30개, 예를 들어, 5-30개 아미노산 잔기이다. 리치 형식 ABM에 대해, 전형적인 링커 길이는 25개 내지 45개, 예를 들어, 30-40개 아미노산 잔기이다.
하전된 링커(예를 들어, 하전된 친수성 링커) 및/또는 가요성 링커가 특히 바람직하다. 개시내용의 ABM에 사용될 수 있는 가요성 링커의 예는 문헌[Chen 등, 2013, Adv Drug Deliv Rev. 65(10):1357-1369] 및 문헌[Klein 등, 2014, Protein Engineering, Design & Selection 27(10):325-330]에 개시된 것을 포함한다. 특히 유용한 가요성 링커는 글리신 및 세린의 반복, 예를 들어, GnS 또는 SGn의 단량체 또는 다량체이며, 여기서 n은 1 내지 18의 정수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18이다. GnS 또는 SGn의 가장 보편적인 것은 (G4S)n(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)(즉, (Gly4Ser)n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n) 링커이며, 여기서 n은 모티프의 반복의 수를 나타낸다.
G4S(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)의 4, 5, 6개 이상의 반복(예를 들어, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 반복)를 함유하는 연장된 링커 및/또는 또 다른 가요성 링커 모티프는 특히 리치 형식에 유용하며, 여기서 연장된 링커는, 작은 가용성 분자로의 더 큰 친화도 및/또는 결합력을 초래하는 더 가요성의 결합을 제공하는 것으로 여겨지는 스페이서로서 작용한다.
일부 구현예에서, ABM 링커는 폴리글리신 링커, 예컨대 Gly-Gly, Gly-Gly-Gly(3Gly), 4Gly(SEQ ID NO:5), 5Gly(SEQ ID NO:6), 6Gly(SEQ ID NO:7), 7Gly(SEQ ID NO:8), 8Gly(SEQ ID NO:9), 및 9Gly(SEQ ID NO:10)이다.
다른 구현예에서, ABM 링커는 글리신-세린 링커이다. 이러한 링커의 예는 또한, Ser-Gly, Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:11), Ser-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:12), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:3), Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:13), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:14), Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:15), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:16), Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO:17), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(G4S는 SEQ ID NO:3으로 개시됨), 및 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SG4는 SEQ ID NO:13으로 개시됨)을 포함하며, 여기서, n(모티프의 반복의 수) = 1 내지 10이다. (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(G4S는 SEQ ID NO:3으로 개시됨) 및 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n(SG4는 SEQ ID NO:13으로 개시됨)은 (G4S)n 및 (SG4)n으로 알려져 있다. 일 구현예에서, 펩타이드 링커는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)1(SEQ ID NO:3), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO:18), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO:4), 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4(SEQ ID NO:19)이다. 일부 구현예에서, 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리 글리신 및 세린 아미노산 서열은 2개 내지 6개 반복된 GGGGS(SEQ ID NO:3) 아미노산 서열, 예컨대 2, 3, 4, 5, 또는 6개 반복된 GGGGS(SEQ ID NO:3) 아미노산 서열을 포함한다. 임의의 전술된 모티프의 4, 5, 6개 이상의 반복(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 반복)을 함유하는 연장된 링커가 리치 형식을 위해 고려된다.
6.2.4. 힌지 영역
다른 구현예에서, 개시내용의 ABM은 힌지 영역, 예를 들어, 2개의 힌지 도메인으로 이루어진 힌지 영역을 포함한다. 힌지는 Fab 도메인을 Fc 도메인에 연결하기 위해 또는 ABM 배치를 안정화시키기 위해 사용될 수 있다.
힌지 영역은 네이티브 또는 변형된 힌지 영역일 수 있다. 힌지 영역은 전형적으로 Fc 영역의 N-말단에서 발견되며; 그러나, 일부 구현예에서, 힌지 영역은 추가로 또는 대안적으로 개시내용의 ABM의 Fc 영역의 C-말단에서, 예를 들어 도 13b 및 도 13c에 도시된 Fc-Fab 배치에서 발견될 수 있다.
네이티브 힌지 영역은, 천연적으로 발생하는 항체에서 Fab 도메인과 Fc 도메인 사이에서 통상적으로 발견될 힌지 영역이다. 변형된 힌지 영역은 네이티브 힌지 영역으로부터 길이 및/또는 조성이 상이한 임의의 힌지이다. 이러한 힌지는 다른 종으로부터의 힌지 영역, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼, 상어, 돼지, 햄스터, 낙타, 리마 또는 염소 힌지 영역을 포함할 수 있다. 다른 변형된 힌지 영역은 중쇄 Fc 영역과 상이한 부류 또는 서브부류의 항체로부터 유래되는 완전 힌지 영역을 포함할 수 있다. 대안적으로, 변형된 힌지 영역은, 천연 힌지의 파트, 또는 반복 내의 각각의 단위가 천연 힌지 영역으로부터 유래되는 반복 단위를 포함할 수 있다. 추가 대안에서, 천연 힌지 영역은 하나 이상의 시스테인 또는 다른 잔기를 중성 잔기, 예컨대 세린 또는 알라닌으로 전환시킴으로써, 또는 적합하게 배치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환시킴으로써 변경될 수 있다. 이러한 것은 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는 증가되거나 저하될 수 있음을 의미한다. 다른 변형된 힌지 영역은 전적으로 합성일 수 있고, 요망되는 특성, 예컨대 길이, 시스테인 조성 및 가요성을 소유하도록 설계될 수 있다.
많은 변형된 힌지 영역은 예를 들어, 미국 특허 제5,677,425호, 국제공개 WO 99/15549호, WO 2005/003170호, WO 2005/003169호, WO 2005/003170호, WO 98/25971호, 및 WO 2005/003171호에 이미 기재되어 있고, 이들은 참조로서 본원에 포함된다.
다양한 구현예에서, 힌지 도메인 내의 위치 233-236은 G, G, G 및 비점유(unoccupied); G, G, 비점유, 및 비점유; G, 비점유, 비점유, 및 비점유; 또는 모두 비점유일 수 있고, 위치는 EU 숫자매김에 의해 숫자매김된다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 동일한 이소타입(예를 들어, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4)의 야생형 힌지 도메인에 비해 Fcγ 수용체에 대한 결합 친화도를 감소시키는 변형된 힌지 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 개시내용의 ABM의 하나의 사슬 또는 사슬 둘 다의 Fc 영역은 이의 N-말단에 무손상(intact) 힌지 도메인을 소유한다.
일 구현예에서, 개시내용의 ABM의 Fc 영역과 힌지 영역은 둘 다 IgG4로부터 유래되고, 힌지 영역은 변형된 서열 CPPC(SEQ ID NO:20)을 포함한다. 인간 IgG4의 코어 힌지 영역은, 서열 CPPC(SEQ ID NO:20)를 함유하는 IgG1과 비교하여 서열 CPSC(SEQ ID NO:21)를 함유한다. IgG4 서열에 존재하는 세린 잔기는 이 영역에서 증가된 가요성을 유발하고, 따라서, 분자의 일부는, 사슬간 이황화를 형성하기 위해 IgG 분자에서 다른 중쇄에 브릿지하기 보다는 동일한 단백질 사슬 내에서 이황화 결합(사슬내 이황화)을 형성한다(문헌[Angel 등, 1993, Mol Immunol 30(1):105-108]). IgG1과 동일한 코어 서열을 제공하기 위해 세린 잔기를 프롤린으로 바꾸는 것은, IgG4 힌지 영역에서 사슬간 이황화의 완전한 형성을 가능하게 하여, 정제된 생성물에서 불균질성(heterogeneity)을 감소시킨다. 이러한 변경된 이소타입은 IgG4P라고 한다.
6.2.5. 키메라 힌지 서열
힌지 영역은 키메라 힌지 영역일 수 있다.
예를 들어, 키메라 힌지는 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "하위(lower) 힌지" 서열과 조합된, 인간 IgG1, 인간 IgG2 또는 인간 IgG4 힌지 영역으로부터 유래되는 "상위(upper) 힌지" 서열을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 키메라 힌지 영역은 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:22)(국제공개 WO2014/121087호의 SEQ ID NO:8로서 이전에 개시되며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함됨) 또는 ESKYGPPCPPCPAPPVA(SEQ ID NO:23)(WO2014/121087호의 SEQ ID NO:9로서 이전에 개시됨)를 포함한다. 이러한 키메라 힌지 서열은 IgG4 CH2 영역에 적합하게 연결될 수 있다(예를 들어, 섹션 6.2.7.1에 기재된 바와 같이 이펙터 기능을 감소시키기 위해 CH2 및/또는 CH3 도메인에서 추가로 변형될 수 있는, 예를 들어, IgG4 Fc 도메인, 예를 들어 인간 또는 뮤린 Fc 도메인 내로의 혼입에 의해).
6.2.6. 감소된 이펙터 기능을 갖는 힌지 서열
추가 구현예에서, 힌지 영역은 예를 들어 국제공개 WO2016161010A2호에 기재된 바와 같이 이펙터 기능을 감소시키기 위해 변형될 수 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 다양한 구현예에서, 변형된 힌지 영역의 위치 233-236은 G, G, G 및 비점유(unoccupied); G, G, 비점유, 및 비점유; G, 비점유, 비점유, 및 비점유; 또는 모두 비점유일 수 있고, 위치는 EU 숫자매김에 의해 숫자매김된다(국제공개 WO2016161010A2호의 도 1에 도시된 바와 같음). 이들 분절은 GGG-, GG--, G--- 또는 ----로 표현될 수 있으며, "-"는 비점유된 위치를 나타낸다.
위치 236은 캐노니컬(canonical) 인간 IgG2에서 비점유되지만, 다른 캐노니컬 인간 IgG 이소타입에 의해 점유된다. 위치 233-235는 모든 4개의 인간 이소타입에서 G 이외의 잔기에 의해 점유된다(국제공개 WO2016161010A2호의 도 1에 도시된 바와 같음).
위치 233-236 내의 힌지 변형은 P에 의해 점유되는 위치 228과 조합될 수 있다. 위치 228은 인간 IgG1 및 IgG2에서 P에 의해 천연적으로 점유되지만, 인간 IgG4에서 S 및 인간 IgG3에서 R에 의해 점유된다. IgG4 항체에서 S228P 돌연변이는 IgG4 항체를 안정화시키고 외인성 항체와 내인성 항체 사이의 중쇄 경쇄 쌍의 교환을 감소시키는 데 유리하다. 바람직하게는 위치 226 내지 229는 C, P, P 및 C에 의해 각각 점유된다.
예시적인 힌지 영역은 이따금, GGG-(233-236), GG--(233-236), G---(233-236) 및 G 없음(no G)(233-236)으로 표기되는 변형된 힌지 서열에 의해 점유되는 중간(또는 코어) 및 하위 힌지로 지칭되는 잔기 226-236을 포함한다. 선택적으로, 힌지 도메인 아미노산 서열은 CPPCPAPGGG-GPSVF(SEQ ID NO:24) (국제공개 WO2016161010A2호의 SEQ ID NO:1로서 이전에 개시됨), CPPCPAPGG--GPSVF(SEQ ID NO:25)(국제공개 WO2016161010A2호의 SEQ ID NO:2로서 이전에 개시됨), CPPCPAPG---GPSVF(SEQ ID NO:26)(국제공개 WO2016161010A2호의 SEQ ID NO:3으로서 이전에 개시됨), 또는 CPPCPAP----GPSVF(SEQ ID NO:27)(국제공개 WO2016161010A2호의 SEQ ID NO:4로서 이전에 개시됨)를 포함한다.
상기 기재된 변형된 힌지 영역은 중쇄 불변 영역 내로 혼입될 수 있으며, 이는 전형적으로 CH2 및 CH3 도메인을 포함하고, 표기된 영역을 플랭킹(flanking)하는 추가 힌지 분절(예를 들어, 상위 힌지)을 가질 수 있다. 존재하는 이러한 추가 불변 영역 분절은 전형적으로 동일한 이소타입, 바람직하게는 인간 이소타입의 것이지만, 상이한 이소타입의 하이브리드일 수 있다. 이러한 추가의 인간 불변 영역 분절의 이소타입은 바람직하게는 인간 IgG4일 뿐만 아니라, 도메인이 상이한 이소타입의 것인 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG3 또는 이의 하이브리드일 수 있다. 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4의 예시적인 서열은 국제공개 WO2016161010A2호의 도 2 내지 도 4에 도시되어 있다.
구체적인 구현예에서, 변형된 힌지 서열은 IgG4 CH2 영역에 연결될 수 있다(예를 들어, 섹션 6.2.7.1에 기재된 바와 같이 이펙터 기능을 감소시키기 위해 CH2 및/또는 CH3 도메인에서 추가로 변형될 수 있는, 예를 들어, IgG4 Fc 도메인, 예를 들어 인간 또는 뮤린 Fc 도메인 내로의 혼입에 의해).
6.2.7. Fc 도메인
개시내용의 ABM은 임의의 적합한 종으로부터 유래된 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, Fc 영역은 인간 Fc 도메인으로부터 유래된다.
Fc 도메인은 IgA(서브부류 lgA1 및 lgA2를 포함함), IgD, IgE, IgG(서브부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함함), 및 IgM을 포함하여 임의의 적합한 부류의 항체부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래된다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1로부터 유래된다. 일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG4로부터 유래된다.
Fc 영역 내의 2개의 Fc 도메인은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 네이티브 항체에서, Fc 도메인은 전형적으로 동일하지만, 항원 결합 분자, 예를 들어, 개시내용의 ABM을 생성하는 목적을 위해, Fc 도메인은 유리하게는 아래 섹션 6.2.7.2에 기재된 바와 같이 헤테로이량체화를 가능하게 하도록 상이할 것이다.
네이티브 항체에서, IgA, IgD 및 IgG의 중쇄 Fc 도메인은 2개의 중쇄 불변 도메인(CH2 및 CH3)으로 이루어지고, IgE 및 IgM의 중쇄 Fc 도메인은 3개의 중쇄 불변 도메인(CH2, CH3 및 CH4)으로 이루어진다. 이들은 이량체화되어, Fc 영역을 생성한다.
본 개시내용의 ABM에서, Fc 영역, 및/또는 그 안의 Fc 도메인은 하나 이상의 상이한 부류, 예를 들어 1개, 2개 또는 3개의 상이한 부류의 항체로부터의 중쇄 불변 도메인을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, Fc 영역은 IgG1로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, Fc 영역은 IgG2로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, Fc 영역은 IgG3으로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, Fc 영역은 IgG4로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, Fc 영역은 IgM으로부터의 CH4 도메인을 포함한다. IgM CH4 도메인은 전형적으로, CH3 도메인의 C-말단에 위치한다.
일 구현예에서, Fc 영역은 IgG로부터 유래되는 CH2 및 CH3 도메인 및 IgM으로부터 유래되는 CH4 도메인을 포함한다.
본 개시내용의 ABM에 대한 Fc 영역을 생성하는 데 사용하기 위한 중쇄 불변 도메인은 상기 기재된 천연 발생 불변 도메인의 변이체를 포함할 수 있는 것으로 여겨질 것이다. 이러한 변이체는 야생형 불변 도메인과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변이를 포함할 수 있다. 일례에서, 본 개시내용의 Fc 영역은, 야생형 불변 도메인으로부터의 서열에서 다양한 적어도 하나의 불변 도메인을 포함한다. 변이체 불변 도메인은 야생형 불변 도메인보다 더 길거나 더 짧을 수 있는 것으로 이해될 것이다. 바람직하게는 변이체 불변 도메인은 야생형 불변 도메인과 적어도 60% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 70% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 80% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 90% 동일하거나 유사하다. 또 다른 예에서, 변이체 불변 도메인은 적어도 95% 동일하거나 유사하다.
IgM 및 IgA는 인간에서 보편적 H2L2 항체 단위의 공유 다량체로서 천연적으로 발생한다. IgM은 이것이 J-사슬을 혼입하였 때 오량체로서, 또는 이것이 J-사슬이 결여될 때 육량체로서 발생한다. IgA는 단량체 및 이량체 형태로서 발생한다. IgM 및 IgA의 중쇄는 테일피스(tailpiece)로 알려진 C-말단 불변 도메인에 18개 아미노산 연장부(extension)를 소유한다. 테일피스는 중합체 내 중쇄 사이에서 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하고, 중합에서 중요한 역할을 갖는 것으로 여겨진다. 테일피스는 또한 글리코실화 부위를 함유한다. 소정의 구현예에서, 본 개시내용의 ABM은 테일피스를 포함하지 않는다.
본 개시내용의 ABM 내로 혼입되는 Fc 도메인은, 단백질의 기능적 특성, 예를 들어, Fc-수용체, 예컨대 FcRn 또는 백혈구 수용체에의 결합, 보체에의 결합, 변형된 이황화 결합 구조, 또는 변경된 글리코실화 패턴을 변경시키는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 이펙터 기능을 변경시키는 예시적인 Fc 변형은 섹션 6.2.7.1에 기재되어 있다.
Fc 도메인은 또한, 예를 들어 헤테로이량체화를 가능하게 함으로써 비대칭 ABM의 생산성(manufacturability)을 향상시키는 변형을 포함하도록 변경될 수 있으며, 이는 동일한 Fc 도메인을 능가하는 동일하지 않은 Fc 도메인의 우선적인 쌍형성이다. 헤테로이량체화는, 상이한 ABS가, 서열이 상이한 Fc 도메인을 함유하는 Fc 영역에 의해 서로 연결되는 ABM의 생성을 허용한다. 헤테로이량체화 전략의 예는 섹션 6.2.7.2에 예시되어 있다.
상기 언급된 임의의 변형은, ABM의 요망되는 기능적 특성을 달성하기 위해 임의의 적합한 방식으로 조합되고/거나 특성을 변경시키기 위한 다른 변형과 조합될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
6.2.7.1. 변경된 이펙터 기능을 갖는 Fc 도메인
일부 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에의 결합 및/또는 이펙터 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 구현예에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일 구현예에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일 구현예에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 구현예에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 더 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRlla, 가장 구체적으로 인간 FcγRllla이다. 일 구현예에서, 이펙터 기능 보체 의존적 세포독성(CDC), 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC), 항체-의존적 세포성 식세포작용(ADCP), 및 사이토카인 분비의 군으로부터 선택되는 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 이펙터 기능은 ADCC이다.
일 구현예에서, Fc 영역은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 구현예에서, Fc 영역은 L234, L235 및 P329(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)의 군으로부터 선택되는 위치에서 아미노산 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 아미노산 치환 L234A 및 L235A(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)를 포함한다. 하나의 이러한 구현예에서, Fc 영역은 Igd Fc 영역, 특히 인간 Igd Fc 영역이다. 일 구현예에서, Fc 영역은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 구현예에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)이다. 일 구현예에서, Fc 영역은 위치 P329에서 아미노산 치환, 및 E233, L234, L235, N297 및 P331(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)로부터 선택되는 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 구현예에서, 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 구현예에서, Fc 영역은 위치 P329, L234 및 L235(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김)에서 아미노산 치환을 포함한다. 더 특정한 구현예에서, Fc 영역은 아미노산 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA", "PGLALA" 또는 "LALAPG")를 포함한다.
전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 치환은 Fc 영역의 2개의 Fc 도메인 각각에 존재한다. 그러므로, 특정 구현예에서, Fc 영역의 각각의 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G(카바트 EU 지수 숫자매김)를 포함하며, 즉, Fc 영역 내의 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인 각각에서 위치 234에서의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되며(L234A), 위치 235에서의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체되고(L235A), 위치 329에서의 프롤린 잔기는 글리신 잔기에 의해 대체된다(P329G)(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김).
일 구현예에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, IgG1 Fc 도메인은 이펙터 기능을 감소시키기 위해 D265A, N297A 돌연변이(EU 숫자매김)를 포함하는 변이체 IgG1이다.
또 다른 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에의 감소된 결합을 갖는 IgG4 Fc 도메인이다. Fc 수용체에의 감소된 결합을 갖는 예시적인 IgG4 Fc 도메인은 아래 표 C로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 도메인은 아래 제시된 서열의 볼드 부분만 포함한다:
특정 구현예에서, 감소된 이펙터 기능을 갖는 IgG4는, 이따금 본원에서 IgG4s 또는 hIgG4s로 지칭되는 국제공개 WO2014/121087호의 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열의 볼드체 부분(본 출원의 SEQ ID NO:31의 아미노산 99-326에 상응함)을 포함한다.
헤테로이량체성 ABM에 대해, 상기 제시된 변이체 IgG4 Fc 서열의 조합, 예를 들어 국제공개 WO2014/121087호의 SEQ ID NO:30(또는 이의 볼드체 부분으로서, 본 출원의 SEQ ID NO:30의 아미노산 99-329에 상응함)과 국제공개 WO2014/121087호의 SEQ ID NO:37(또는 이의 볼드체 부분으로서, 본 출원의 SEQ ID NO:32의 아미노산 99-329에 상응함)의 조합을 포함하는 Fc 영역 또는 국제공개 WO2014/121087호의 SEQ ID NO:31(또는 이의 볼드체 부분으로서, 본 출원의 SEQ ID NO:31의 아미노산 99-326에 상응함)과 국제공개 WO2014/121087호의 SEQ ID NO:38(또는 이의 볼드체 부분으로서, 본 출원의 SEQ ID NO:33의 아미노산 99-326에 상응함)의 조합을 포함하는 Fc 영역을 혼입하는 것이 가능하다.
6.2.7.2. Fc 헤테로이량체화 변이체
많은 다중특이적 분자 형식은, 네이티브 면역글로불린과는 달리, 동일하지 않은 항원-결합 도메인(또는 이의 부분, 예를 들어, Fab의 VH 또는 VH-CH1)에 작동적으로 연결되는 2개의 Fc 도메인 사이에서 이량체화를 수반한다. Fc 도메인을 형성하기 위한 2개의 Fc 영역의 부적절한 헤테로이량체화는 요망되는 다중특이적 분자의 수율을 증가시키는 데 있어서 장애물이 될 수 있고, 정제의 어려움을 나타낸다. 당업계에서 이용 가능한 여러 가지 접근법은 예를 들어 유럽 특허출원공개 EP 1870459A1호; 미국 특허 제5,582,996호; 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제5,910,573호; 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 제6,833,441호; 미국 특허 제7,183,076호; 미국 특허 출원 공보 2006204493A1호; 및 국제공개 W02009/089004A1호에 개시된 바와 같은 개시내용의 ABM에 존재할 Fc 도메인의 이량체화를 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
본 개시내용은 Fc 헤테로이량체, 즉, 이종성의 동일하지 않은 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역을 포함하는 ABM을 제공한다. 헤테로이량체화 전략은 상이한 ABS(또는 이의 부분, 예를 들어, Fab의 VH 또는 VH-CH1)에 작동적으로 연결된 Fc 영역의 이량체화를 증강시키고 동일한 ABS에 작동적으로 연결된 Fc 도메인의 이량체화를 감소시키기 위해 사용된다. 전형적으로, Fc 헤테로이량체 내의 각각의 Fc 도메인은 항체의 CH3 도메인을 포함한다. CH3 도메인은 선행 섹션에 기재된 바와 같이 임의의 이소타입, 부류 또는 서브부류, 바람직하게는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 부류의 항체의 불변 영역으로부터 유래된다.
CH3 도메인에서 2개의 상이한 중쇄의 헤테로이량체화는 요망되는 ABM을 유도하는 한편, 동일한 중쇄의 호모이량체화는 요망되는 ABM의 수율을 감소시킬 것이다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 회합되어 개시내용의 ABM을 형성하는 2개의 반항체는, 비변형된 사슬에 비해 헤테로이량체성 회합을 선호하는 변형을 갖는 CH3 도메인을 함유할 것이다.
구체적인 구현예에서, Fc 헤테로이량체의 형성을 촉진하는 상기 변형은, Fc 도메인 중 하나에 "노브" 변형 및 다른 Fc 도메인에 "홀" 변형을 포함하는 소위 "노브-인투-홀" 또는 "노브-인-홀" 변형이다. 노브-인투-홀 기술은 예를 들어, 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제7,695,936호; 문헌[Ridgway 등, 1996, Prot Eng 9:617-621], 및 문헌[Carter, 2001, Immunol Meth 248:7-15]에 기재되어 있다. 일반적으로, 방법은 제1 폴리펩타이드의 계면에 융기부(protuberance)("노브") 및 제2 폴리펩타이드의 계면에 상응하는 공극("홀")을 도입하는 것을 수반하며, 따라서 융기부는 공극에 위치하여 헤테로이량체 형성을 촉진하고 호모이량체 형성을 방해할 수 있다. 융기부는 제1 폴리펩타이드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 작제된다. 융기부와 동일한 또는 상이한 크기의 보상적(compensatory) 공극은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩타이드의 계면에서 생성된다.
이에 일부 구현예에서, Fc 도메인의 제1 서브단위의 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제1 서브단위의 CH3 도메인 내에서 융기부를 생산하며, 이러한 융기부는 제2 서브단위의 CH3 도메인 내의 공극(cavity)에 위치할 수 있고, Fc 도메인의 제2 서브단위의 CH3 도메인에서의 아미노산 잔기는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어, 제2 서브단위의 CH3 도메인 내에서 공극을 생산하며, 이러한 공극 내에서 제1 서브단위의 CH3 도메인 내의 융기부가 위치할 수 있다. 바람직하게는 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 융기부 및 공극은 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 예를 들어 부위-특이적 돌연변이형성에 의해 또는 펩타이드 합성에 의해 변경시킴으로써 만들어질 수 있다. 예시적인 치환은 Y470T이다.
구체적인 이러한 구현예에서, 제1 Fc 도메인에서 위치 366에서의 트레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 대체되며(T366W), Fc 도메인에서 위치 407에서의 티로신 잔기는 발린 잔기로 대체되고(Y407V), 선택적으로 위치 366에서의 트레오닌 잔기는 세린 잔기로 대체되며(T366S), 위치 368에서의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 대체된다(L368A)(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김). 추가 구현예에서, 제1 Fc 도메인에서 추가로 위치 354에서의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 대체되거나(S354C) 위치 356에서의 글루탐산 잔기는 시스테인 잔기로 대체되며(E356C)(특히 위치 354에서의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 대체됨), 제2 Fc 도메인에서 추가로 위치 349에서의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 대체된다(Y349C)(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김). 특정 구현예에서, 제1 Fc 도메인은 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다(카바트 EU 지수에 따른 숫자매김).
일부 구현예에서, 정전기적 스티어링(electrostatic steering)(예를 들어, 문헌[Gunasekaran 등, 2010, J Biol Chem 285(25): 19637-46]에 기재된 바와 같음)은 Fc 도메인의 제1 서브단위 및 제2 서브단위의 회합을 촉진하는 데 사용될 수 있다.
헤테로이량체화를 촉진하기 위해 변형되는 Fc 도메인의 사용에 대한 대안으로서 또는 이에 더하여, Fc 도메인은 Fc 헤테로이량체의 선택을 가능하게 하는 정제 전략을 가능하게 하도록 변형될 수 있다. 하나의 이러한 구현예에서, 하나의 반항체는, 단백질 A에의 상기 반항체의 결합을 무효화하는 변형된 Fc 도메인을 포함하여, 헤테로이량체성 단백질을 산출하는 정제 방법을 가능하게 한다. 예를 들어, 미국 특허 제8,586,713호를 참조한다. 이와 같이, ABM은 제1 CH3 도메인 및 제2 Ig CH3 도메인을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 적어도 하나의 아미노산에 의해 서로 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는, 아미노산 차이를 결여하는 상응하는 ABM과 비교하여 단백질 A에의 ABM의 결합을 감소시킨다. 일 구현예에서, 제1 CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 CH3 도메인은 단백질 A 결합을 감소시키거나 무력화시키는 돌연변이/변형, 예컨대 H95R 변형(IMGT 엑손 숫자매김에 의해; EU 숫자매김에 의해 H435R)을 함유한다. 제2 CH3은 Y96F 변형(IMGT에 의해; EU에 의해 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 그러므로, 변형의 부류는 본원에서 "스타(star)" 돌연변이로서 지칭된다.
6.3. 표적 분자
개시내용의 ABM은 적어도 2개의 Fab 도메인인 Fab1 및 Fab2를 포함하며, 이들은 각각 표적 분자, 예를 들어 작은 가용성 분자에 특이적으로 결합한다. 소정의 구현예에서, 개시내용의 ABM은, 결합적 또는 비-결합적일 수 있는 2개의 추가 Fab 도메인인 Fab3 및 Fab4를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, Fab1, Fab2, 및 존재할 때 결합 형태의 Fab3 및 Fab4에 의해 결합되는 표적 분자는 단백질 분자이다.
바람직하게는, Fab1 및 Fab2는, 각각이 이의 각각의 에피토프에 동시에 특이적으로 결합할 수 있도록 선택된다. 일부 구현예에서, Fab1 및 Fab2는 각각 상이한 표적 분자에, 예를 들어 서로 상호작용할 수 있는 분자의 쌍(예컨대 종양 관련 항원 및 CD3)에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, Fab1 및 Fab2는 동일한 표적 분자에, 상이한 에피토프에 또는 동일한 에피토프에 결합한다.
개시내용의 ABM은 특히 저분자량 단백질, 예를 들어, 100 kDa 미만, 75 kDa 미만, 또는 60 kDa 미만의 분자를 갖는 단백질에 결합하는 데 유리하다(번역후 변형, 예컨대 글리코실화를 포함하거나 배제함). 특정 구현예에서, 개시내용의 ABM에 의해 결합되는 단백질은 각각의 경우 번역후 변형 예컨대 글리코실화를 포함하거나 배제하여, 5 kDa 내지 75 kDa, 5 kDa 내지 60 kDa, 5 kDa 내지 45 kDa, 5 kDa 내지 30 kDa, 10 kDa 내지 75 kDa, 10 kDa 내지 60 kDa, 10 kDa 내지 45 kDa, 또는 10 kDa 내지 30 kDa 범위의 분자량을 갖는다.
Fab1 및/또는 Fab2가 결합할 수 있는 예시적인 표적 분자는 ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRLI, ADORA2A, 아그레칸, AGR2, AICDA, AIF1, AIG1, AKAP1, AKAP2, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOC1, AR, AZGP1(아연-a-당단백질), ART-4, B7, B7.1, B7.2, BAD, BAFF, BAGI, BAIi, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLRl (MDRlS), BlyS, BMPl, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMPS, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1(플렉틴), BRCA1, Ba-733, BAGE, BrE3- 항원, CA125, CAMEL, CAP-I, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CDI-IA, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, C19orf10(IL27w), C3, C4A, CS, CSR1, CANT1, CASPI, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCLI(I-309), CCLII(에오탁신), CCL13(MCP-4), CCLIS(MIP-1d), CCL16(HCC- 4), CCL17(TARC), CCLIS(PARC), CCL19(MIP-3b), CCL2(MCP-1), MCAF, CCL20(MIP-3a), CCL21(MIP- 2), SLC, 엑소두스-2, CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF- 1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL2S(TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27(CTACK/ILC), CCL2S, CCL3(MIP1a), CCL4(MIP-1b), CCLS(RANTES), CCL7(MCP-3), CCLS(mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1(CKR1/HM14S), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCRS(CMKBRSI ChemR13), CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EB1), CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI), CCR9(GPR-9-6), CCRLI(VSHK1), CCRL2(L-CCR), CD164, CDlC, CD200, CD-22, CD24, CD2S, CD3S, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD44, CD4SRB, CD47, CD4S, CDS2, CD69, CD72, CD79A, CD79B, CDSO, CDS1, CDS3, CDS6, CD137, CD13S, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CDH1(E-캐드헤린), CDH10, CDH12, CDH13, CDHlS, CDH19, CDH20, CDHS, CDH7, CDHS, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDKS, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A(p21 Wap1/Cip1), CDKN1B(p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A(p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CER1, CHGA, CHGB, 키티나제, CHST1O, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSFS, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSFS, CLDN3, CLDN7(클라우딘-7), CLN3, CLU(클러스테린), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CNR1, COLISA1, COLIA1, COL4A3, COL6Al, CR2, CRP, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(GCSF), CTLA-4, CTNNB1(b-카테닌), CTSB(카텝신 B), CX3CLI(SCYD1), CX3CR1(V2S), CXCLI(GRO1), CXCLIO(IP-10), CXCL11(I-TAC/IP-9), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCLS(ENA-7S/LIX), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/ STRL33/Bonzo), CYBS, CYC1, CYSLTR1, HIF-1-a, 결장-특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAB2IP, DES, DKFZp4S1J011S, DNCLI, DPP4, DAM, EGFR, EGFRvlll, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, E2F1, ECGF1, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, EN01, EN02, EN03, EPHB4, EPO, EREG, ERKS, ESR1, ESR2, F3(TF), FADD, FasL, FASN, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1(aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF1S, FGF19, FGF2(bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3(int-2), FGF4(HST), FGFS, FGF7(KGF), FGFS, FGF9, FGFR3, FIGF(VEGFD), FILI(EPSILON), FILI(ZETA), FLJ12SS4, FLJ2SS30, FLRT1(피브로넥틴), FOS, FOSLI(FRA- 1), FY(DARC), Flt-I, Flt-3, 폴레이트 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GDFS, GFil, GGTl, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPR2(CCR10), GPR31, GPR44, GPRS1(FKSGSO), GRCC10(C10), GRP, GSN(겔솔린), GSTP1, HAVCR2, HDAC4, HDACS, HDAC7A, HDAC9, HGF, HIP1 히스타민 및 히스타민 수용체, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOX1, HUMCYT2A, HLA-DR, HMI 24, 인간 융모성 생식선 자극호르몬(HCG) 및 이의 서브단위, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자(HIF-1), HSP70-2M, HST-2 또는 1a, IGF-IR, IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, IGBP1, IGF1, IGF1R, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, IL-1, IL-10, IL-10RA, IL-10RB, IL-11, IL-11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL-13RA1, IL-13RA2, IL-14, IL-1S, IL-1SRA, IL-16, IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17R, IL-18, IL-18BP, IL-18R1, IL-18RAP, IL-19, IL-IA, IL-1B, IL-1F10, IL-1FS, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1HY1, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAP, IL-1RAPL1, IL-1RAPL2, IL-1RL1, IL-1RL2 IL-1RN, IL-2, IL-20, IL-20RA, IL-21R, IL-22, IL-22R, IL-22RA2, IL-23, IL-24, IL-2S, IL-26, IL-27, IL-28A, IL-28B, IL-29, IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG, IL-3, IL-30, IL-3RA, IL-4, IL-4R, IL-S, IL-5RA, IL-6, IL-6R, IL-6ST(당단백질 130), IL-7, IL-7R, IL-S, IL-SRA, IL-SRB, IL-9, IL-9R, IL-K, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6(a6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4(b 4 인테그린), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-1), ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4 IFNAS, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNW1,, JAG1, JAK1, JAK3, JUN, K6HF, KAi1, KDR, KITLG, KLFS(GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK1S, KLK3, KLK4, KLKS, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19(케라틴 19), KRT2A, KRTHB6(모발-특이적 유형 II 케라틴), KC4-항원, KS-1-항원, KS 1-4, Le-Y, LDR/FUT, LAMAS, LEP(렙틴), Lingo-p7S, Lingo-Troy, LPS, LTA(TNF-b), LTB, LTB4R(GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG 또는 Omgp, MAP2K7(c-Jun), MDK, MIB1, 미드카인, MIF, MIP-2, MKI67(Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3(메탈로티오넥틴-III), MTSS1, MUC1(뮤신), MYC, MYD88, 대식세포 이동 저해 인자(MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ES0-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, NCK2, 뉴로칸, NFKB1, NFKB2, NGFB(NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgR-Nogo66(Noga), NgRp7S, NgR-Troy, NME1(NM23A), NOXS, NPPB, NROB1, NROB2, NR1D1, NR1D2, NRIH2, NRIH3, NRIH4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NRSA1, NRSA2, NR6A1, NRP1, NRP2, NTSE, NTN4, ODZ1, OPRD1, PCSK9, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, PCA3, PCNA, PD-1, PD-L1, 알파4베타7, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDFS, CGRP, Lingo-I, 인자 IXa, 인자 X, ICOS, GARP, BTLA, CD160, RORI, 2B4, KIR, CD27, OX40, A2aR, PDGFA, PDGFB, PECAM1, PF4(CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸(phosphacan), PIAS2, PIK3CG, PLAU(uPA), PLG, PLXDC1, PPBP(CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2(COX-2), PTN, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 프로스타틱 산 포스파타제, PSA, PRAME, PSMA, 10 PIGF, ILGF, ILGF-IR, IL-6, RS5, RANTES, RAC2(p21Rac2), RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFl10(ZNF144), ROB02, S100A2, SCGB1D2(리포필린 B), SCGB2A1(맘마글로빈 2), SCGB2A2(맘마글로빈 1), SCYE1(내피 단핵구-활성화 사이토카인), SDF2, SERPINA1, SERPINA3, SERPINBS(마스핀(maspin)), SERPINE1(PAI-1), SERPINF1, SHBG, SLA2, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPP1, SPRR1B(Sprl), ST6GAL1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TIOI, SAGE, 5100, 서바이빈, 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신, TRAIL 수용체, TNF-α, Tn-항원, 톰슨프라이덴리히 항원, 종양 괴사 항원, TB4R2, TBX21, TCP10, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFBlil, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, THBS1(트롬보스폰딘-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE(Tie-1), TIMP3, 조직 인자, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLRS, TLR6, TLR7, TLRS, TLR9, TNF, TNF-a, TNFAIP2(B94), TNFAIP3, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSFS, TNFRSF6(Fas), TNFRSF7, TNFRSFS, TNFRSF9, TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(AP03L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF1S(VEGI), TNFSF18, TNFSF4(OX40 리간드), TNFSFS(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSFS(CD30 리간드), TNFSF9(4-lBB 리간드), TOLLIP, Toll-유사 수용체, TOP2A(토포이소머라제 Iia), TPS3, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAPS, TRAF6, TREM1, TREM2, TRPC6, TSLP, TWEAK, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-IA 항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, CS, 혈관신생 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, CD19/CD3, BCMA/CD3, EGFR, HER3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL1/ IL-8, IL-6, IL-6R/IL-21, IL-21R, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용기 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, VEGFB, VEGFC, 베르시칸, VHL CS, VLA-4, c-FMS/CSFIR, RET, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린, MMPs VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 앤지오포이에틴, ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 l/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-IR, IL 25 17A/F, EGF 수용체 l/CD3, 및 CD19/CD16, KHI, Tn-항원, TF-항원, CD44, 당지질, 당스핑고지질, 예컨대 30 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알릴테트라오실레라마이드, XCL1(림포탁신), XCL2(SCM-1b), XCR1(GPRS/ CCXCR1), YY1, 및 ZFPM2를 포함한다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 예를 들어, Fab1 및 Fab2를 통해 표적 분자의 쌍에 결합할 수 있다. 표적 분자의 예시적인 쌍은 CD137과 CD20, CD137과 EGFR, CD137과 Her-2, CD137과 PD-1, CD137과 PDL-1, VEGF와 PD-L1, Lag-3과 TIM-3, OX40과 PD-1, TIM-3과 PD-1, TIM-3과 PDL-1, EGFR과 DLL-4, CD138과 CD20, CDI 38과 CD40, CDI 9와 CD20, CD20과 CD3, CD3과 CD33, CD3과 CD133, CD47과 CD20, CD38과 CD138, CD38과 CD20, CD20과 CD22, CD38과 CD40, CD40과 CD20, CD-8과 IL-6, CSPGs와 RGM A, CTLA-4와 BTN02, IGF1과 IGF2, IGF1/2와 Erb2B, IGF-1R과 EGFR, EGFR과 CD13, IGF-1R과 ErbB3, EGFR-2과 IGFR, VEGFR-2와 Met, VEGF-A와 앤지오포이에틴-2(Ang-2), IL-12와 TWEAK, IL-13과 IL-1 베타, PDGFR과 VEGF, EpCAM과 CD3, Her2와 CD3, CD19와 CD3, EGFR과 Her3, CD16a와 CD30, CD30과 PSMA, EGFR과 CD3, CEA와 CD3, TROP-2와 HSG, TROP-2와 CD3, MAG와 RGM A, NgR과 RGM A, NogoA와 RGM A, OMGp와 RGM A, PDL-1과 CTLA-4, CTLA-4와 PD-1, PD-1과 TIM-3, RGMA와 RGM B, Te38과 TNFa, TNFa와 Blys, TNFa와 CD-22, TNFa와 CTLA-4 도메인, TNFa와 GP130, TNFa와 IL-12p40, 및 TNFa와 RANK 리간드를 포함한다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 예를 들어, Fab1 및 Fab2를 통해 하나 이상의 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및/또는 사이토카인 수용체, 예를 들어, 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및/또는 사이토카인 수용체 중 하나 또는 이의 쌍에 결합할 수 있다. 예시적인 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및/또는 사이토카인 수용체는 BMP1, BMP2, BMP3B(GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(G-CSF), EPO, FGF1(aFGF), FGF2(bFGF), FGF3(int-2), FGF4(HST), FGF5, FGF6(HST-2), FGF7(KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNG, IFNW1, FILI, FILI(EPSILON), FILI(ZETA), ILIA, ILIB, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILIO, ILi1, ILI2A, ILI2B, ILI3, ILI4, ILI5, ILI6, ILI7, ILI7B, ILI8, ILI9, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, FGER1, FGFR2, FGFR3, EGFR, RORI, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L, A2aR, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70, CD40, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA(TNF-b), LTB, TNF(TNF-a), TNFSF4(OX40 리간드), TNFSF5(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSF8(CD30 리간드), TNFSF9(4-1BB 리간드), TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(AP03L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF15(VEGI), TNFSF18, FIGF(VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, ILIR2, ILIRLI, ILIRL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL 7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL11RA, ILI2RB1, ILI2RB2, ILI3RA1, ILI3RA2, ILI5RA, ILI7R, ILI8R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRN, IL6ST, ILI8BP, ILI8RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP(렙틴), PTN, 및 THPO를 포함한다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 예를 들어, Fab1 및 Fab2를 통해 하나 이상의 케모카인, 케모카인-관련 단백질, 및/또는 케모카인 수용체, 예를 들어, 케모카인, 케모카인-관련 단백질, 및/또는 케모카인 수용체 중 하나 또는 이의 쌍에 결합할 수 있다. 예시적인 케모카인, 케모카인-관련 단백질 및 케모카인 수용체는 CCLI(I-309), CCL2(MCP-1/MCAF), CCL3(MIP1a), CCL4(MIP-1b), CCL5(RANTES), CCL7(MCP-3), CCL8(mcp-2), CCLII(에오탁신), CCLI3(MCP-4), CCLI5(MIP-1 d), CCLI 6(HCC-4 ), CCLI 7(TARC), CCLI 8(PARC), CCLI9(MIP-3b), CCL20(MIP-3a), CCL21(SLC/ 엑소두스-2), CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF-1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL25(TECK), CCL26(에오탁신- 3), CCL27(CTACK/ILC), CCL28, CXCLI(GRO1), CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCL5(ENA-78), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCLIO(IP 10), CXCL11(I-TAC), CXCL12(SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4(CXCL4), PPBP(CXCL7), CX3CL1(SCYD1), SCYE1, XCL1(림포탁틴(lymphotactin)), XCL2(SCM-1b), BLR1(MDR15), CCBP2(D6/JAB61), CCR1(CKR1/ HM145), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6(CMKBR6/ CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EBI1), CCRS(CMKBR8/TER1/CKR-L1), CCR9(GPR-9-6), CCRL1(VSHK1), CCRL2(L-CCR), XCR1(GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CX3CR1(V28), CXCR4, GPR2(CCR10), GPR31, GPR81(FKSGSO), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, ILSRA(IL8Ra), ILSRB(IL8Rb), LTB4R(GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSFS, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10(C10), EPO, FY(DARC), GDF5, HIF1A, ILS, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL을 포함한다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 사이토카인, 사이토카인 수용체 및/또는 사이토카인-관련 단백질의 쌍에 결합할 수 있다. 사이토카인의 예시적인 쌍은 IL-1a와 IL-Ιβ, IL-12와 IL-18, TNFa와 IL-23, TNFa와 IL-13, TNF와 IL-18, TNF와 IL-12, TNF와 IL-1베타, TNF와 MIF, TNF와 IL-6, TNF와 IL-6 수용체, TNF와 IL-17, IL-17과 IL-20, IL-17과 IL-23, TNF와 IL-15, TNF와 VEGF, VEGFR과 EGFR, PDGFR과 VEGF, IL-13과 IL-9, IL-13과 IL-4, IL-13과 IL-5, IL-13과 IL-25, IL-13과 TARC, IL-13과 MDC, IL-13과 MIF, IL-13과 TGF-β, IL-13과 LHR 작용제, IL-13과 CL25, IL-13과 SPRR2a, IL-13과 SPRR2b, IL-13과 ADAM 8, 및 TNFa와 PGE4, IL-13과 PED2, 및 TNF와 PEG2를 포함한다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 단일 사이토카인, 사이토카인 수용체 또는 사이토카인-관련 단백질 상의 적어도 2개의 에피토프에 결합할 수 있다. 예시적인 사이토카인은 TSLP, IL-1a, IL-Ιβ, IL-12, IL-18, TNFa, IL-23, IL-13, MIF, IL-6, IL-6 수용체, IL-17, IL-20, IL-15, VEGF, VEGFR, EGFR, PDGFR, IL-9, IL-4, IL-5, IL-25, TARC, MDC, TGF-β, LHR 작용제, CL25, SPRR2a, SPRR2b, ADAM 8, PGE4, PED2, 및 PEG2를 포함한다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 종래의 형식의 항체 또는 항체 단편에 비해 유사한 또는 더 큰 친화도로 이의 항원 표적에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 이의 표적 분자(들)에 대해 작용제 기능을 갖는다. 다른 구현예에서, 개시내용의 ABM은 이의 항원 또는 표적 분자(들)에 대해 차단 및/또는 길항제 기능을 갖는다.
소정의 양태에서, 개시내용의 ABM은, ABM의 Fab가 유래되었던 모 항체(또는 모 항체의 쌍), 예컨대 모 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM 항체에 비해 이의 항원(들) 또는 표적 분자(들)와 유사하거나 더 낮은 IC50, 예를 들어, 종래의 IgG 형식에 비해 유사하거나 더 낮은 IC50을 갖는다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM은 단일 리간드에 대해 이중특이적이고, 모 항체 또는 항체들에 비해 더 높은 수준에서 1:1 리간드 복합체를 형성한다.
Fab1 및 Fab2가 동일한 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 결합할 때, 표적 분자에의 결합은 바람직하게는 비-경쟁적이며, 즉, Fab1 및 Fab2는 표적 분자에의 결합에 대해 경쟁하지 않는다(이는 예를 들어, 에피토프가 중첩된다면 발생할 것임). 항체와 항체 단편 사이에서의 결합 경쟁을 측정하기 위한 검정은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA), 형광 활성화된 세포 분류(FACS) 검정 및 표면 플라즈몬 공명 검정을 포함한다.
표적 분자에의 결합에 대한 경쟁은 예를 들어, Octet HTX 바이오센서 플랫폼(Pall ForteBio Corp.) 상에서 실시간 무표지(label-free) 생물층 간섭 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 검정의 구체적인 구현예에서, 전체 검정은 25℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 1 mg/mL BSA, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH 7.4의 완충액(HBS-EBT 완충액)에서 1000 rpm의 속도에서 플레이트를 진탕하면서 수행된다. 2개의 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 이의 특이적인 표적 항원 상의 이의 각각의 에피토프에의 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있는지의 여부를 평가하기 위해, 펜타-His 태깅된 표적 항원("펜타-His"는 SEQ ID NO:34로서 개시됨)은 먼저, 펜타-His 태깅된 표적 항원("펜타-His"는 SEQ ID NO:34로서 개시됨)을 함유하는 웰에 항-펜타-His 항체("펜타-His"는 SEQ ID NO:34로서 개시됨) 코팅된 Octet 바이오센서 팁(Fortebio Inc, # 18-5122)을 침지시킴으로써 이러한 바이오센서 팁 상에 포착된다. 그 후에, 항원 포착된 바이오센서 팁은, Ab-1의 용액(예를 들어, 50 μg/mL 용액)을 함유하는 웰 내로 딥핑(dipping)시킴으로써 제1 항체 또는 이의 항원-결합 단편(후속적으로 Ab-1로 지칭됨)으로 포화된다. 그 후에, 바이오센서 팁은 후속적으로, 제2 항체 또는 이의 항원-결합 단편(후속적으로 Ab-2로 지칭됨)의 용액(예를 들어, 50 μg/mL 용액)을 함유하는 웰 내로 딥핑된다. 바이오센서 팁은 검정의 모든 단계 사이에서 HBS-EBT 완충액에서 세척된다. 실시간 결합 반응은 검정의 전체 과정 동안 모니터링될 수 있고, 모든 단계의 종료 시 결합 반응은 기록될 수 있다. Ab-1과 예비-복합체화된 표적 항원에 대한 Ab-2 결합의 반응은 비교될 수 있고, 동일한 표적 항원에 대한 상이한 항체/항원-결합 단편의 경쟁적/비-경쟁적 거동이 결정될 수 있다.
다양한 구현예에서:
ㆍ ABM(예를 들어, 형식 A ABM 또는 형식 B ABM)은 Fab3 및 Fab4를 포함하지 않고, Fab1 및 Fab2는 동일한 표적 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하며;
ㆍ ABM(예를 들어, 형식 A ABM 또는 형식 B ABM)은 Fab3 및 Fab4를 포함하지 않고, Fab1 및 Fab2는 상이한 표적 분자 상에 결합하고;
ㆍ ABM(예를 들어, 형식 C ABM)은 비-결합적 Fab3 및 비-결합적 Fab4를 포함하고, Fab1 및 Fab2는 동일한 표적 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합하며;
ㆍ ABM(예를 들어, 형식 C ABM)은 비-결합적 Fab3 및 비-결합적 Fab4를 포함하고, Fab1 및 Fab2는 상이한 표적 분자 상에 결합하고;
ㆍ ABM(예를 들어, 형식 C ABM)은 결합적 Fab3 및 결합적 Fab4를 포함하며, Fab1 및 Fab2는 동일한 에피토프에 결합하고, Fab3 및 Fab4는, Fab1 및 Fab2에 의해 결합되는 표적 분자와 동일한 표적 분자 상의 또는 상이한 표적 분자 상의, Fab1 및 Fab2에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 동일한 에피토프에 결합하며;
ㆍ ABM(예를 들어, 형식 C ABM)은 결합적 Fab3 및 결합적 Fab4를 포함하며, Fab1 및 Fab3은 동일한 에피토프에 결합하고, Fab2 및 Fab4는, Fab1 및 Fab3에 의해 결합되는 표적 분자와 동일한 표적 분자 상의 또는 상이한 표적 분자 상의, Fab1 및 Fab3에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 동일한 에피토프에 결합한다.
Fab1, Fab2, Fab3, 및 Fab4 중 2개 이상이 표적 분자 상의 동일한 에피토프에 결합할 때, 이러한 Fab 도메인은 동일한 또는 상이한 중쇄 CDR 서열 및/또는 동일한 또는 상이한 VH 서열을 가질 수 있다. 선택적으로, 이들은 동일한 또는 상이한 VL 서열을 가질 수 있다.
이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 개시내용의 ABM은 네이티브 배치를 갖는 모(parental) 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체보다 더 큰 친화도로 표적 분자에 결합하는 이점을 갖는 것으로 여겨진다. 이에, 개시내용의 ABM은 일부 구현예에서, 네이티브 배치를 갖는 모 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체보다 더 큰 친화도로 하나 이상의 표적 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, ABM은 일부 구현예에서, 상응하는 모 단일특이적 항체 또는 이중특이적 항체(예를 들어, 섹션 7에 기재된 바와 같음)보다 표적 분자에의 결합에 대해 더 낮은 KD를 가질 수 있고/거나 세포 기초 결합 검정에서 더 강력한 EC50 값을 가질 수 있다.
주어진 항체 또는 ABM의 작용제 또는 길항제 활성은 표적 선택, 에피토프 적용 범위(coverage) 및 형식 선택에 의존한다. 작용제성 항체 및 길항제성 항체의 식별은 예를 들어, 기능적 기초 스크리닝을 통해 달성될 수 있다. 본 개시내용의 ABM 형식은 특히 작은 가용성 분자에 대한 길항제 활성에 유리하다.
6.4. 항체 약물 접합체
개시내용의 ABM은, 특히 ABM이 암 치료제로서 사용되는 것으로 의도되는 경우, 예를 들어, 링커를 통해 약물 모이어티에 접합될 수 있다. 이러한 접합체는 본원에서 편의상 항체-약물 접합체(또는 "ADC")로 지칭된다.
소정의 양태에서, 약물 모이어티는 세포독성 또는 세포증식억제(cytostatic) 활성을 발휘한다. 일 구현예에서, 약물 모이어티는 메이탄시노이드(maytansinoid), 키네신-유사 단백질 KIF11 저해제, V-ATPase(액포-유형 H+ -ATPase) 저해제, 세포자멸사유도제(pro-apoptotic agent), Bcl2(B-세포 림프종 2) 저해제, MCL1(골수 세포 백혈병 1) 저해제, HSP90(열 충격 단백질 90) 저해제, IAP(세포자멸사의 저해제) 저해제, mTOR(라파마이신의 기계적 표적) 저해제, 미세소관 안정화제, 미세소관 탈안정화제, 오리스타틴(auristatin), 돌라스타틴(dolastatin), MetAP(메티오닌 아미노펩티다제), CRM1(염색체 유지 1) 저해제, DPPIV(디펩티딜 펩티다제 IV) 저해제, 프로테아솜 저해제, 미토콘드리아에서 포스포릴 이전 반응의 저해제, 단백질 합성 저해제, 키나제 저해제, CDK2(사이클린-의존적 키나제 2) 저해제, CDK9(사이클린-의존적 키나제 9) 저해제, 키네신 저해제, HDAC(히스톤 탈아세틸라제) 저해제, DNA 손상제, DNA 알킬화제, DNA 인터칼레이터(DNA intercalator), DNA 부홈 결합제(DNA minor groove binder), RNA 폴리머라제 저해제, 토포이소머라제(topoisomerase) 저해제, 또는 DHFR(디하이드로폴레이트 리덕타제; di hydrofolate reductase) 저해제로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 세포독성제는 하기 구조를 갖는 메이탄시노이드이다:
일부 구현예에서, 세포독성제는 하기 구조를 갖는 메이탄시노이드이다:
일부 구현예에서, ADC는 개시내용의 ABM을 포함하고,
여기서, 
는 ABM에의 결합이다.
일부 구현예에서, 항체-약물 접합체는 개시내용의 ABM을 포함하고,
여기서, 
는 ABM에의 결합이다.
일부 구현예에서, ADC는 개시내용의 ABM 및
이들의 혼합물을 포함하고,
여기서, 
는 개시내용의 ABM에의 결합이다.
일부 구현예에서, 결합은 시스테인 잔기의 황 구성원을 통해 ABM에 연결된다.
일부 구현예에서, 결합은 리신 잔기의 질소 구성원을 통해 ABM에 연결된다.
개시내용의 ADC에서, 세포독성제 및/또는 세포증식억제제(cytostatic agent)는 ADC 링커에 의해 ABM에 연결된다. 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 ADC의 ABM에 연결하는 ADC 링커는 짧거나, 길거나, 소수성이거나, 친수성이거나, 가요성이거나 강성(rigid)일 수 있거나, 각각 독립적으로, 링커가 상이한 특성을 갖는 분절을 포함할 수 있도록 하나 이상의 상기 언급된 특성을 갖는 분절로 이루어질 수 있다. 링커는, 이러한 링커가 하나 초과의 제제를 ABM 상의 단일 부위에 공유 연결하도록 다가(polyvalent)일 수 있거나, 이러한 링커가 단일 제제를 ABM 상의 단일 부위에 공유 연결하도록 1가일 수 있다.
소정의 양태에서, 링커는 절단 가능한 링커, 비-절단 가능한 링커, 친수성 링커, 프로하전된(procharged) 링커, 또는 디카르복실산 기초 링커로부터 선택된다.
당업자에 의해 이해될 바와 같이, ADC 링커는 하나의 위치에서 세포독성제 및/또는 세포증식억제제에 공유 연결부 및 또 다른 위치에서 ABM에 공유 연결부를 형성함으로써 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 ABM에 연결한다. 공유 연결부는 ADC 링커 상의 작용기와 제제 및 ABM 상의 작용기 사이에서의 반응에 의해 형성된다.
ADC 링커는 바람직하게는, 세포 외부의 조건에 화학적으로 안정하지만 그럴 필요는 없고, 세포 내부에서 절단되고/거나 희생되고(immolate)/거나 그렇지 않으면 특이적으로 분해되도록 설계될 수 있다. 대안적으로, 세포 내부에서 특이적으로 절단되거나 분해되도록 설계되지 않은 ADC 링커가 사용될 수 있다. 안정한 ADC 링커 대 불안정한 ADC 링커의 선택은 세포독성제 및/또는 세포증식억제제의 독성에 의존할 수 있다. 정상적인 세포에 대해 독성인 제제에 대해서는, 안정한 링커가 바람직하다. 선택적이거나 표적화되고 정상 세포에게 더 낮은 독성을 갖는 제제가 이용될 수 있으며, 세포외 환경에 대한 ADC 링커의 화학적 안정성은 덜 중요하다. ADC의 맥락에서 약물을 ABM에 연결하는 데 유용한 광범위하게 다양한 ADC 링커는 당업계에 알려져 있다. 임의의 이들 ADC 링커, 뿐만 아니라 다른 ADC 링커는 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 개시내용의 ADC의 ABM에 연결시키는 데 사용될 수 있다.
많은 세포독성제 및/또는 세포증식억제제를 단일 ABM 분자에 연결하는 데 사용될 수 있는 예시적인 다가(polyvalent) ADC 링커는 예를 들어, 국제공개 WO 2009/073445호; WO 2010/068795호; WO 2010/138719호; WO 2011/120053호; WO 2011/171020호; WO 2013/096901호; WO 2014/008375호; WO 2014/093379호; WO 2014/093394호; WO 2014/093640호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다. 예를 들어, Mersana 등에 의해 개발된 Fleximer 링커 기술은 양호한 물리화학적 특성을 갖는 고(high)-DAR ADC를 가능하게 하는 잠재성을 갖는다. Mersana 기술은 에스테르 결합의 서열을 통해 약물 분자를 가용성 폴리-아세탈 백본 내로 혼입하는 것에 기초한다. 방법은 양호한 물리화학적 특성을 유지시키는 한편 고도로-로딩된 ADC(20까지의 DAR)를 제공한다.
사용될 수 있는 예시적인 1가 ADC 링커는 예를 들어, 문헌[Nolting, 2013, Antibody-Drug Conjugates, Methods in Molecular Biology 1045:71-100]; 문헌[Ducry 등, 2010, Bioconjugate Chem. 21:5-13]; 문헌[Zhao 등, 2011, J. Med. Chem. 54:3606-3623]; 미국 특허 제7,223,837호; 미국 특허 제8,568,728호; 미국 특허 제8,535,678호; 및 국제공개 W02004010957호에 기재되어 있으며, 이들은 각각 본원에 참조로서 포함된다.
예로서 그리고 제한 없이, 개시내용의 ADC에 포함될 수 있는 일부 절단 가능한 ADC 링커 및 비절단 가능한 ADC 링커는 아래 기재되어 있다.
소정의 구현예에서, 선택되는 ADC 링커는 생체내에서 절단 가능하다. 절단 가능한 ADC 링커는 화학적으로 또는 효소적으로 불안정한 또는 분해 가능한 연결부를 포함할 수 있다. 절단 가능한 ADC 링커는 일반적으로, 세포 내부에서 약물을 유리시키는 과정, 예컨대 세포질에서의 감소, 리소좀에서 산성 조건에의 노출, 또는 세포 내에서 특정 프로테아제 또는 다른 효소에 의한 절단에 의존한다. 절단 가능한 ADC 링커는 일반적으로, ADC 링커의 나머지가 비절단 가능한 한편, 화학적으로 또는 효소적으로 절단 가능한 하나 이상의 화학적 결합을 혼입한다. 소정의 구현예에서, ADC 링커는 화학적으로 불안정한 이변적(labile) 기, 예컨대 하이드라존 및/또는 이황화 기를 포함한다. 화학적으로 이변적인 기를 포함하는 링커는 혈장과 일부 세포질 구획 사이에서 차별적인 특성을 이용한다. ADC 링커를 함유하는 하이드라존에 대한 약물 방출을 용이하게 하는 세포내 조건은 엔도솜 및 리소좀의 산성 조건인 한편, ADC 링커를 함유하는 디설파이드는 세포기질에서 환원되며, 이는 높은 티올 농도, 예를 들어, 글루타티온을 함유한다. 소정의 구현예에서, 화학적으로 이변적인 기를 포함하는 ADC 링커의 혈장 안정성은 화학적으로 이변적인 기 주변에서 치환기를 사용하여 입체 장해(steric hindrance)를 도입함으로써 증가될 수 있다.
절단 가능한 ADC 링커는 비절단 가능한 부분 또는 분절을 포함할 수 있고/거나 절단 가능한 분절 또는 부분은 그렇지 않으면 비-절단 가능한 ADC 링커에 포함되어 이를 절단 가능하게 만들 수 있다. 단지 예로서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 관련 중합체는 중합체 백본에 절단 가능한 기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 중합체 ADC 링커는 하나 이상의 절단 가능한 기, 예컨대 이황화, 하이드라존 또는 디펩타이드를 포함할 수 있다.
ADC 링커에 포함될 수 있는 다른 분해 가능한 연결부는, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적 활성제 상의 알코올기의 반응에 의해 형성되는 에스테르 연결부를 포함하며, 여기서 이러한 에스테르기는 일반적으로 생리학적 조건 하에 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출시킨다. 가수분해적으로 분해 가능한 연결부는 탄수화물 연결부; 아민과 알데하이드의 반응으로부터 비롯되는 이민 연결부; 알코올을 포스페이트기와 반응시킴으로써 형성되는 포스페이트 에스테르 연결부; 알데하이드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 연결부; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 연결부; 및 중합체의 단부를 포함하지만 이로 제한되지 않는 포스포라미다이트기(phosphoramidite group) 및 올리고뉴클레오타이드의 5' 하이드록실기에 의해 형성되는 올리고뉴클레오타이드 연결부를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.
소정의 구현예에서, ADC 링커는 효소적으로 절단 가능한 펩타이드 모이어티, 예를 들어 트리펩타이드 또는 디펩타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 디펩타이드는 Val-Cit; Cit-Val; Ala-Ala; Ala-Cit; Cit-Ala; Asn-Cit; Cit-Asn; Cit-Cit; Val-Glu; Glu-Val; Ser-Cit; Cit-Ser; Lys-Cit; Cit-Lys; Asp-Cit; Cit-Asp; Ala-Val; Val-Ala; Phe-Lys; Val-Lys; Ala-Lys; Phe-Cit; Leu-Cit; lle-Cit; Phe-Arg; 및 Trp-Cit로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 디펩타이드는 Cit-Val; 및 Ala-Val으로부터 선택된다.
상기 또는 본원에서 논의된 ADC의 임의의 다양한 구현예에서, ADC는 1 내지 20, 더 전형적으로 2 내지 10의 범위의 약물:항체 비(또는 이러한 경우 약물:ABM 비)를 가질 수 있다.
6.5. 핵산 및 숙주 세포
또 다른 양태에서, 개시내용은 개시내용의 ABM을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, ABM은 단일 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구현예에서, ABM은 복수의(예를 들어, 2, 3, 4개 이상의) 핵산에 의해 인코딩된다.
단일 핵산은, 단일 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 ABM, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 ABM, 또는 2개 초과의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 ABM의 부분을 인코딩할 수 있다(예를 들어, 단일 핵산은 3개, 4개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 ABM의 2개의 폴리펩타이드 사슬, 또는 4개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 ABM의 3개의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩할 수 있음). 발현의 별도의 제어를 위해, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 인코딩하는 개방 리딩 프레임은 별도의 전사 조절 요소(예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)의 제어 하에 있을 수 있다. 2개 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 개방 리딩 프레임은 또한, 별도의 폴리펩타이드로의 번역을 가능하게 하는 내부 리보솜 진입 부위(IRES; internal ribosome entry site) 서열에 의해 분리되는, 동일한 전사 조절 요소에 의해 제어될 수 있다.
일부 구현예에서, 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 ABM은 2개 이상의 핵산에 의해 인코딩된다. ABM을 인코딩하는 핵산의 수는 ABM 내의 폴리펩타이드 사슬의 수와 동일하거나 그보다 적을 수 있다(예를 들어, 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬이 단일 핵산에 의해 인코딩될 때).
개시내용의 핵산은 DNA 또는 RNA(예를 들어, mRNA)일 수 있다.
또 다른 양태에서, 개시내용은 개시내용의 핵산을 함유하는 숙주 세포 및 벡터를 제공한다. 핵산은 본원 아래에서 더 상세히 기재되는 바와 같이, 동일한 숙주 세포 또는 별개의 숙주 세포에 존재하는 단일 벡터 또는 별개의 벡터에 존재할 수 있다.
6.5.1. 벡터
개시내용은 본원에 기재된 ABM 또는 ABM 구성요소, 예를 들어 반항체의 폴리펩타이드 사슬 중 1개 또는 2개를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 바이러스, 플라스미드, 코스미드, 람다 파지 또는 효모 인공 염색체(YAC; yeast artificial chromosome)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
수많은 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 부류의 벡터는, 예를 들어, 소 유두종 바이러스(bovine papilloma virus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스, 백시나 바이러스, 바큘로바이러스, 레트로바이러스(라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus), MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래되는 DNA 요소를 이용한다. 또 다른 부류의 벡터는 RNA 바이러스, 예컨대 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 동부 말 뇌염 바이러스(Eastern Equine Encephalitis virus) 및 플라비바이러스(Flavivirus)로부터 유래되는 RNA 요소를 이용한다.
추가로, DNA를 세포의 염색체 내로 안정하게 통합시킨 세포는, 형질주입된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 선택될 수 있다. 마커는 예를 들어, 영양요구성(auxotrophic) 숙주에 대한 양성자이전(prototropy), 살생물제 내성(예를 들어, 항생제), 또는 중금속, 예컨대 구리에 대한 내성 등을 제공할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 발현될 DNA 서열에 직접 연결되거나, 공동-형질전환에 의해 동일한 세포 내로 도입될 수 있다. 추가 요소가 또한, mRNA의 최적 합성에 필요할 수 있다. 이들 요소는 스플라이스 신호, 뿐만 아니라 전사 프로모터, 인핸서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다.
일단, 작제물을 함유하는 발현 벡터 또는 DNA 서열이 발현을 위해 제조되면, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 형질주입되거나 도입될 수 있다. 이를 달성하기 위해 예를 들어, 원형질체 융합(protoplast fusion), 칼슘 포스페이트 침전, 전기천공, 레트로바이러스 형질도입, 바이러스 형질주입, 유전자 총(gene gun), 지질 기초 형질주입 또는 다른 종래의 기법과 같은 다양한 기법이 이용될 수 있다. 생성된 형질주입된 세포를 배양하고 발현된 폴리펩타이드를 회수하기 위한 방법 및 조건은 당업자에게 알려져 있고, 본 명세서에 기초하여 이용되는 특정 발현 벡터 및 포유류 숙주 세포에 따라 다양화되거나 최적화될 수 있다.
6.5.2. 세포
개시내용은 또한, 개시내용의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 하나 이상의 핵산을 포함하도록 유전적으로 조작된다.
일 구현예에서, 숙주 세포는 발현 카세트를 사용하여 유전적으로 조작된다. 어구 "발현 카세트"는 뉴클레오타이드 서열과 융화성(compatible)인 숙주에서 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 이러한 서열을 지칭한다. 이러한 카세트는 프로모터, 인트론과 함께 또는 없이 개방 리딩 프레임, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유도적 프로모터와 같이 발현에 영향을 미치는 데 필요하거나 유용한 추가 인자가 또한 사용될 수 있다.
개시내용은 또한, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
세포는 진핵 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 또는 인간 세포일 수 있으나 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 진핵 세포는 Vero 세포, HeLa 세포, COS 세포, CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포 및 MDCKII 세포를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 적합한 곤충 세포는 Sf9 세포를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다.
6.6. 약학적 조성물
개시내용의 ABM 및/또는 ADC는 ABM 및/또는 ADC 및 하나 이상의 담체, 부형제 및/또는 희석제를 선택적으로 향상된 이전, 전달, 내약성(tolerance) 등을 제공하는 하나 이상의 다른 제제와 함께 포함하는 조성물의 형태로 존재할 수 있다. 조성물은 특정 용도를 위해, 예컨대 인간에서의 약학적 용도 또는 수의학 용도를 위해 제형화될 수 있다. 조성물의 형태(예를 들어, 건조 분말, 액체 제형 등) 및 사용되는 부형제, 희석제 및/또는 담체는 ABM 및/또는 ADC의 의도된 용도에, 그리고 치료적 용도의 경우 투여 모드에 의존할 것이다.
환자에게 투여되는 항원-결합 분자, 예컨대 단일특이적 항원-결합 분자 또는 이중특이적 항원-결합 분자의 용량은 환자의 연령 및 체격, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 다양할 수 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 본 개시내용의 이중특이적 항원-결합 분자가 성인 환자에서 치료적 목적을 위해 사용될 때, 본 개시내용의 항원-결합 분자를 통상 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 더 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7 mg/kg 체중, 약 0.03 내지 약 5 mg/kg 체중, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내로 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도 및 기간은 조정될 수 있다. 항원-결합 분자를 투여하기 위한 효과적인 투약량 및 스케쥴은 경험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 환자 진행은 주기적 평가에 의해 모니터링되고 용량은 이에 따라 조정될 수 있다. 더욱이, 투약량의 종간 스케일링(interspecies scaling)은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, 문헌[Mordenti 등, 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351]).
치료적 용도를 위해, 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 멸균 약학적 조성물의 파트로서 공급될 수 있다. 이러한 조성물은 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다(상기 조성물을 환자에게 투여하는 요망되는 방법에 따라). 약학적 조성물은 여러 가지 경로에 의해, 예컨대 경구로, 경피로, 피하로, 비강내로, 정맥내로, 근육내로, 종양내로, 수막공간내로(intrathecally), 국소로(topically) 또는 국재로(locally) 환자에게 투여될 수 있다. 임의의 주어진 사례에서 투여에 가장 적합한 경로는 특정 항체 및/또는 ADC, 대상체, 및 질환의 성질과 중증도 및 대상체의 신체 조건에 의존할 것이다. 전형적으로, 약학적 조성물은 정맥내로 또는 피하로 투여될 것이다.
약학적 조성물은 편리하게는 용량당 예정된 양의 개시내용의 ABM 및/또는 ADC를 함유하는 단위 투약 형태로 제시될 수 있다. 단위 용량에 포함되는 ABM 및/또는 ADC의 양은 치료되는 질환, 뿐만 아니라 당업계에 잘 알려진 바와 같은 다른 인자에 의존할 것이다. 이러한 단위 투약량은 단일 투여에 적합한 양의 ABM 및/또는 ADC를 함유하는 동결건조된 건조 분말의 형태로 또는 액체의 형태로 존재할 수 있다. 건조 분말 단위 투약 형태는 주사기, 적합한 양의 희석제 및/또는 투여에 유용한 다른 구성요소를 갖는 키트에서 포장될 수 있다. 액체 형태의 단위 투약량은 편리하게는, 단일 투여에 적합한 양의 ABM 및/또는 ADC로 예비-충전된 주사기의 형태로 공급될 수 있다.
약학적 조성물은 또한, 다수의 투여에 적합한 양의 ADC를 함유하는 벌크로 공급될 수 있다.
약학적 조성물은 저장을 위해, 요망되는 순도를 갖는 ABM 및/또는 ADC를 당업계에서 전형적으로 이용되는 선택적인 약학적으로-허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(이들은 모두 본원에서 "담체"로 지칭됨), 즉, 완충제, 안정화제, 보존제, 등장성제, 비-이온성 세제, 항산화제, 및 다른 여러 가지 첨가제와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 제조될 수 있다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980)]을 참조한다. 이러한 첨가제는 이용되는 투약량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이어야 한다.
완충제는 생리학적 조건과 근사한 범위에서 pH를 유지시키는 데 도움을 준다. 이들은 광범위하게 다양한 농도에서 존재할 수 있으나, 전형적으로 약 2 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재할 것이다. 본 개시내용으로 사용하기에 적합한 완충제는 유기산과 무기산 둘 다 및 이들의 염, 예컨대 시트레이트 완충액(예를 들어, 모노소듐 시트레이트-디소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리소듐 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노소듐 시트레이트 혼합물 등), 숙시네이트 완충액(예를 들어, 숙신산-모노소듐 숙시네이트 혼합물, 숙신산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 숙신산-디소듐 숙시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충액(예를 들어, 타르트산-소듐 타르트레이트 혼합물, 타르트산-포타슘 타르트레이트 혼합물, 타르트산-소듐 하이드록사이드 혼합물 등), 푸마레이트 완충액(예를 들어, 푸마르산-모노소듐 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디소듐 푸마레이트 혼합물, 모노소듐 푸마레이트-디소듐 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충액(예를 들어, 글루콘산-소듐 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 글루콘산-포타슘 글리우코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충액(예를 들어, 옥살산-소듐 옥살레이트 혼합물, 옥살산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 옥살산-포타슘 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충액(예를 들어, 락트산-소듐 락테이트 혼합물, 락트산-소듐 하이드록사이드 혼합물, 락트산-포타슘 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충액(예를 들어, 아세트산-소듐 아세테이트 혼합물, 아세트산-소듐 하이드록사이드 혼합물 등)을 포함한다. 추가로, 포스페이트 완충액, 히스티딘 완충액 및 트리메틸아민 염, 예컨대 Tris가 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지체시키기 위해 첨가될 수 있고, 약 0.2% (w/v) 내지 1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 개시내용으로 사용되기에 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 및 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 및 3-펜타놀을 포함한다. 이따금 "안정화제"로도 알려진 등장성제는 본 개시내용의 액체 조성물의 등장성을 보장하기 위해 첨가될 수 있고, 다수산기(polyhydric) 당 알코올, 예를 들어 3수산기(trihydric) 이상의 당 알코올, 예컨대 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 안정화제는, 기능이 벌킹제로부터 첨가제까지일 수 있는 넓은 범주의 부형제를 지칭하며, 이는 치료제를 용해시키거나 용기 벽에의 변성 또는 접착을 방지하는 것을 돕는다. 전형적인 안정화제는 다수산기(polyhydric) 당 알코올(상기 열거됨); 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파리긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등, 유기 당 또는 당 알코올, 예컨대 시클리톨(cyclitol), 예컨대 이노시톨을 포함하여 락토스, 트레할로스, 스타키오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 미오이노시톨(myoinisitol), 갈락티톨(galactitol), 글리세롤 등; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 중합체; 황 함유 환원제, 예컨대 우레아, 글루타티온, 티옥트산(thioctic acid), 소듐 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, a-모노티오글리세롤 및 소듐 티오설페이트; 저분자량 폴리펩타이드(예를 들어, 10개 이하의 잔기의 펩타이드); 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 하이드로필릭(hydrophylic) 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈 단당류, 예컨대 자일로스, 만노스, 프룩토스, 글루코스; 이당류, 예컨대 락토스, 말토스, 수크로스 및 트레할로스; 및 삼당류, 예컨대 라피노스; 및 다당류, 예컨대 덱스트란일 수 있다. 안정화제는 ADC의 중량당 0.5 내지 10 중량% 범위의 양으로 존재할 수 있다.
비-이온성 계면활성제 또는 세제("습윤제"로도 알려져 있음)는 당단백질을 용해시키는 것을 돕기 위해, 뿐만 아니라 진탕-유도 응집에 대해 당단백질을 보호하기 위해 첨가될 수 있으며, 이는 또한 단백질의 변성을 야기하지 않으면서 응력을 받은(stressed) 전단 표면(shear surface)에 제형이 노출되는 것을 허용한다. 적합한 비-이온성 계면활성제는 폴리소르베이트(20, 80 등), 폴리옥사머(184, 188 등), 및 플루로닉 폴리올을 포함한다. 비-이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 예를 들어 약 0.07 mg/mL 내지 약 0.2 mg/mL의 범위로 존재할 수 있다.
추가의 여러 가지 부형제는 벌킹제(bulking agent)(예를 들어, 전분), 킬레이트제(예를 들어, EDTA), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌, 비타민 E), 및 공용매를 포함한다.
6.7. 치료 적응증
개시내용의 ABM, ADC, 및 약학적 조성물은 개시내용의 ABM에 의해 결합되는 항원 또는 표적 분자와 관련된 병태, 예를 들어 항원 또는 표적 분자 또는 이러한 항원 또는 표적 분자를 발현하는 비정상적인 세포 또는 조직의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 개시내용의 ABM, ADC, 및 약학적 조성물은, ABM이 결합하는 항원 또는 표적 분자의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련된 병태의 하나 이상의 증상 또는 적응증을 나타내는, 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 인간 또는 비-인간 동물에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시내용의 ABM, ADC, 또는 약학적 조성물은, 항원 또는 표적 분자의 자극, 활성화 및/또는 표적화가 요망되는 임의의 질환 또는 장애를 치료하기 위해 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ABM은 발현 또는 활성 또는 항원 또는 표적 분자와 관련이 있거나 이에 의해 매개되는 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용될 수 있다.
개시내용의 ABM은 흉선 기질상 림포포이에틴("TSLP; thymic stromal lymphopoietin"), 예를 들어, 인간 TSLP에 결합하는 하나 이상의 Fab 도메인(예를 들어, Fab1 및/또는 Fab2)을 함유하는 ABM에 의해 예시된다. TSLP는 프로알로겐성(proallogenic) 표현형과 함께 수지상 세포-매개 CD4+ T 세포 반응을 유도하는 면역 사이토카인이다(문헌[Gilliet 등, 2003, J. Exp. Medicine 197(8):1059-1063]). TSLP는 알레르기성 염증의 개시에 관여한다(문헌[Watanabe 등, 2004, Nature Immunology 5:426-434]). TSLP는 넓은 범위의 세포 유형(예를 들어, 수지상 세포, CD4+ T 세포, 호산구, 호염기구, 비만 세포 및 유형 2 선천성 림프구 세포(ILC2; type 2 innate lymphoid cell)(문헌[Mjosberg 등, 2012, Immunity 37(4):649-59])에 작용하여, 염증, 특히 유형 2 염증(사이토카인 IL-5, IL-13 및 IL-4의 생성을 특징으로 함)을 유도한다. 유형 2 염증은 천식 및 다른 알레르기 질환, 예컨대 아토피성 피부염 및 어린선양 홍피증(Netherton Syndrome)의 특질이다. TSLP는 동물에서 섬유아세포 축적 및 콜라겐 침착을 유도하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 섬유증 장애(fibrotic disorder)를 촉진하는 데 있어서 추가 역할을 실증한다.
이에, TSLP 길항제인 ABM은 염증, 특히 알레르기성 염증, 뿐만 아니라 섬유증 장애의 치료에 유용하다. TSLP에 결합하는(단일특이적으로 또는 이중특이적으로) ABM은 이를 필요로 하는 대상체에서, 예를 들어 인간 대상체에서 TSLP 신호전달와 관련된 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. TSLP 신호전달과 관련된 예시적인 병태는 천식, 특발성 폐 섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 아토피성 피부염, 알레르기성 결막염(allergic conjunctivitis), 알레르기성 비염, 어린선양 홍피증, 호산구증가성 식도염(EoE; eosinophilic esophagitis), 음식 알레르기, 알레르기성 설사, 호산구증가성 위장염(eosinophilic gastroenteritis), 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증(ABPA; allergic bronchopulmonary aspergillosis), 알레르기성 진균성 부비동염(allergic fungal sinusitis), 암, 류마티스 관절염, COPD, 전신 경화증(systemic sclerosis), 켈로이드(keloid), 궤양성 대장염, 만성 비부비동염(CRS; chronic rhinosinusitis), 비용종증(nasal polyposis), 만성 호산구증가성 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 호산구증가성 기관지염(eosinophilic bronchitis), 실리악 질환(coeliac disease), 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 호산구증가성 근육통 증후군(eosinophilic myalgia syndrome), 과호산구증가성 증후군(hypereosinophilic syndrome), 다발혈관염을 동반한 호산구증가성 사구체신염(eosinophilic granulomatosis with polyangiitis) 및 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease)을 포함한다.
7. 실시예
7.1. 실시예 1: 대안적인 형식 항원 결합 분자의 작제
사이토카인 계열에 속하고 대략 15-18 kDa의 분자량을 갖는 단백질(글리코실화의 상태에 따라)인 인간 TSLP에 대한 대안적인 형식 이중특이적 ABM의 작제를 위해 비-경쟁적 모 mAb를 선택하였다. 이들 모 mAb는 보편적 경쇄를 공유한다. 모든 헤테로이량체성 이중특이적 ABM을, Fc 헤테로이량체 형성을 촉진하기 위해 Fc 영역에서 "노브-인투-홀" 돌연변이와 함께 작제하였다(문헌[Merchant 등, 1998, Nat Biotechnol. 16:677-681]). Fc-Fab 형식(도 1b 및 도 2b)에 대해, (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)를 사용하여 VH-CH1 단편을 Fc의 C-말단 단부에 연결함으로써 중쇄를 작제하였고, n=1 내지 6이다. 클램프 형식(도 3b)에서, 내부의 Fab 단편은 불활성이고, TSLP에 결합하지 않는다. 이러한 불활성 Fab 단편을 리치 형식에서 가요성의 긴 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 대체하고, n=6 내지 8이다(도 3a). 2+2 탠덤 Fab 형식에서, 모든 4개의 Fab 단편은 기능적이고 항원에 결합할 수 있다(도 3c 내지 도 3d). 클램프 형식 및 2+2 탠덤 Fab 형식에서 Fab 단편 사이의 짧은 링커는 2xG4S(SEQ ID NO:18) 또는 3xG4S(SEQ ID NO:4)이다.
유사하게는, 비-경쟁적 모 mAb를 인간 리간드 X에 대한 이중특이적 Fc-Fab의 작제를 위해 선택하였다. 이들 모 항-리간드 X mAb는 보편적 경쇄를 공유한다.
세포 표면 표적에 대해, 이중특이적 Fc-Fab에 대한 보편적 경쇄를 공유하는 Fab 단편을 사용하고, 감소된 이펙터 기능을 갖는 hIgG4(hIgG4s로 제시됨)(US9359437B2) 또는 hIgG1의 불변 영역을 사용하여 Fc-Fab를 유사한 방식으로 작제하였다.
인간 IgG4 불변 영역을 사용하는 모든 항체는 힌지 영역에 S228P(EU) 치환을 함유하여, 반항체 형성을 최소화한다(문헌[Labrijn 등, 2009, Nat Biotechnol 27:767-771]).
7.2. 실시예 2: 항원 결합 분자의 발현
모든 대안적인 형식 이중특이적 ABM을 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific)에서 일시적인 형질주입에 의해 발현시켰다. HiTrap rProteinA FF 컬럼(GE Healthcare)과 함께 ProteinMaker 시스템(Protein BioSolutions, Gaithersburg, MD)을 사용하여 Expi293F 상층액 내 ABM을 정제하였다. 단일 단계 용리 후, ABM을 중화시키고, 5% 글리세롤과 함께 포스페이트 완충 식염수(PBS)의 최종 완충액으로 투석시키고, 분취하고, -80℃에서 저장하였다.
7.3. 실시예 3: 생물검정에서 항-hTSLP 이중특이적 ABM의 활성
정제된 항-hTSLP 이중특이적 ABM을 루시퍼라제 리포터 검정에서 hTSLP 활성을 저해하는 이의 능력에 대해 평가하였다. hIL-7R, hTSLPR, 및 STAT3-루시퍼라제 리포터를 안정하게 발현하는 Baf3 세포를 IL-3이 없는 배양 배지에서 40,000개 세포/웰로 평판배양하고, 밤새 인큐베이션하였다. hTSLP 용량 반응 곡선에 대해, 1:3의 일련으로 희석된 hTSLP를 각각의 웰에 첨가하고, hTSLP의 최종 농도는 10 nM에서 시작하였다(도 4a). 항-hTSLP ABM의 차단 활성을 결정하기 위해, ABM 및 hTSLP를 리포터 세포에 동시에 첨가하는 "레이스 형식(Race format)" 차단 검정을 사용하였다. 항-hTSLP ABM을 1:3으로 일련으로 희석시켰고, 각각의 항체의 최종 농도는 100 nM에서 시작하였다. 인간 TSLP를 TSLP 용량 반응 곡선의 대략 EC50에서 불변 농도까지 첨가하였다. 5.5시간 인큐베이션 후, 플레이트를 실온에서 15분 동안 평형화시켰다. 100 μl의 One-Glo 기질(Promega)을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 5분 인큐베이션 후, 발광을 Envision 상에서 측정하였다. STAT3-루시퍼라제 리포터 검정에서 3개의 비-경쟁적 항-hTSLP 모 항체인 30206, 30217, 및 30230의 활성을 도 4b에 도시한다. 이들 모 mAb를 사용하는 3개의 이중특이적 쌍형성을 시험하였다. 종래의 hIgG4 이중특이적 항체는 상응하는 모 항체 조합과 유사한 차단 활성을 보여주었다(도 5). 각각의 이중특이적 쌍형성에 대해, 모든 대안적인 형식 이중특이적 ABM은 종래의 hIgG4 이중특이적 항체보다 더 양호한 차단 활성을 보여주었다(도 6a 내지 도 6c). 전반적으로, 최상의 형식은 시험된 모든 이중특이적 쌍형성에 대해 Fc-Fab(힌지 배치는 도 13a에 도시되어 있음) 및 2+2 탠덤 Fab_헤테로이량체이다. 이들 ABM의 IC50 값을 표 5-1에 요약한다.
7.4. 실시예 4: 다각도 레이저 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALLS)에 의한 항-hTSLP 이중특이적 항체와 재조합 hTSLP 사이에서 형성된 시험관내 복합체의 크기 분석
7.4.1. 개요
다각도 레이저 광산란에 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALLS)를 사용하여, 표 5-2에서 식별된 하기 항-TSLP ABM과 재조합 hTSLP(REGN4009) 사이에서 형성된 시험관내 복합체의 크기 분석을 수행하였다: 항-TSLP 모 Ab 30206 hIgG4, 항-TSLP 모 Ab 30217 hIgG4, 항-TSLP 모 Ab 30230 hIgG4, Fc-Fab_30206x30217-2xG4S("2xG4S"는 SEQ ID NO:18로서 개시됨), Fc-Fab_30217x30230-2xG4S ("2xG4S"는 SEQ ID NO:18로서 개시됨), 클램프_30206x30217, 클램프_30217x30230, 2+2 탠덤 Fab_het_30206x30217 및 2+2 탠덤 Fab_het_30217x30230. 이 연구에서, Fc-Fab ABM은 도 13a에 도시된 힌지 형식을 가졌다.
7.4.2. 재료 및 방법
7.4.2.1. 분자
표 5-2는 A4F-MALLS에 의해 분석된 분자 및 이의 대안적인 표기를 나열한다.
7.4.2.2. A4F-MALLS 이동상 완충액
1.4 g 소듐 포스페이트 모노베이직(monobasic) 모노하이드레이트, 10.7 g 소듐 포스페이트 디베이직(dibasic) 헵타하이드레이트, 및 500 mL 5 M 소듐 클로라이드를 조합함으로써 이동상 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드, pH 7.0 ± 0.1)을 제조하고; 그 후에 용액을 HPLC 등급수(grade water)를 이용하여 부피를 5.0 L로 만들었다. 완충액의 최종 측정된 pH는 7.0이었다. 이동상 완충액을 사용 전에 여과하였다(0.2 μm).
7.4.2.3. AF-MALLS
A4F-MALLS 시스템은 자외선(UV) 다이오드 어레이 검출기, Wyatt Technology Dawn HELEOS® II 레이저 광 산란 기기(LS), 및 Optilab® T-rEX 시차 굴절계(RI) 검출기가 장착된 Agilent 1200 Series HPLC 시스템에 커플링된 Eclipse™ 3+ A4F 분리 시스템으로 이루어졌다. 검출기를 하기 순서대로 일련으로 연결하였다: UV-LS-RI. LS 검출기 및 RI 검출기를 Wyatt Technology에 의해 제공된 설명서에 따라 보정하였다.
정의된 양의 항-TSLP mAb를 각각 REGN4009(재조합 TSLP)와 조합하고, 1X DPBS, pH 7.4에서 희석시켜, 등몰비:1 μM 항-TSLP mAb:1 μM hTSLP를 산출하였다. 각각의 모 mAb의 등몰 조합을 콤보 스톡 용액으로서 제조한 다음, 각각의 콤보 스톡 용액을 등몰 양의 hTSLP와 혼합하여, 0.5 μM mAb1 + 0.5 μM mAb2 + 1 μM hTSLP의 최종 용액 농도를 산출하였다. 모든 시료를 주위 온도에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 여과하지 않은 채 유지시킨 후, W350 스페이서 호일(350 μm 스페이서 두께, 2.2 cm 스페이서 폭)이 갖춰지고 10 kDa MWCO 재생된 셀룰로스 막을 사용하여 Eclipse™ 짧은 채널 내로 주입하였다. 채널을 이동상 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드, pH 7.0 ± 0.1)으로 예비-평형화시킨 후, 각각의 시료를 주입하였다. 소 혈청 알부민(BSA; 2 mg/mL; 10 μg 시료 로드(load))을 별도로 주입하고, 시스템 적합성 대조군으로서 포함시켰다.
분획화 방법은 4개 단계로 구성되었다: 주입, 포커싱, 용리, 및 채널 "세척(wash-out)" 단계. A4F-MALLS 이동상 완충액(10 mM 소듐 포스페이트, 500 mM 소듐 클로라이드, pH 7.0 ± 0.1)을 분획화 방법 전과정에 걸쳐 사용하였다. 각각의 시료(7 μg)를 1분 동안 0.2 mL/분의 유속으로 주입하고, 후속적으로 3분 동안 1.0 mL/분의 포커스 유속으로 포커싱하였다. 시료를 15분 동안 일정한 십자류(cross flow) 3.0 mL/분과 함께 1.0 mL/분의 채널 유속으로, 뒤이어 5분에 걸쳐 3.0 mL/분 내지 0 mL/분의 선형 구배 십자류로 용리하였다. 마지막으로, 십자류를 추가 5분 동안 0 mL/분에서 유지시켜, 채널을 세척하였다. 동일한 매개변수 설정을 사용하여 BSA를 분획화하였다.
7.4.2.4. MALLS 데이터 분석
ASTRA V 소프트웨어(버전 5.3.4.14, Wyatt Technology)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 데이터를, 과량의 산란된 광을 용질 농도 및 중량-평균 몰 질량, Mw에 관련짓는 방정식에 맞추었고(문헌[Kendrick 등, 2001, Anal Biochem. 299(2):136-46]; 문헌[Wyatt, 1993, Anal. Chim. Acta 272(1):1-40]):
여기서, c는 용질 농도이며, R(θ,c)은 산란각 및 농도의 함수로서 용질로부터의 초과 레일리 비(excess Raleigh ratio)이고, Mw는 몰 질량이며, P(θ)는 산란된 광의 각도 의존성(angular dependence)(회전 반경(radius of gyration)이 < 50 nm인 입자에 대해 대략 1)을 기재하고, A2는 삼투압(측정이 희석 용액 상에서 수행되기 때문에 이는 무시될 수 있음)의 확장에서 제2 비리알 계수(virial coefficient)이고,
여기서, n0는 용매 굴절률을 나타내며, NA는 아보가르도 수이고, λ0는 진공에서 입사광의 파장이며, dn/dc는 용질에 대한 특정 굴절률 증가분(refractive index increment)을 나타낸다.
BSA 단량체의 몰 질량은 데이터 수집(시스템 적합성 점검) 동안 광 산란 및 시차 굴절률 검출기의 보정 상수(calibration constant)를 평가하는 역할을 하였다. UV 검출기 및 RI 검출기로부터 결정된 BSA의 평균 몰 질량의 상대 표준 편차(%RSD)는 ≤ 5.0%이었다.
이용되는 A4F-MALLS 조건에 대해 수집된 BSA 크로마토그램으로부터 광 산란 검출기에 대한 정규화 계수, 검출기간 지연 시간(inter-detector delay volume) 및 밴드 브로드닝 텀(band broadening term)을 계산하였다. 이들 값을 모든 다른 시료에 대해 수집된 데이터 파일에 적용하여, 이들 텀에 대해 교정하였다.
Astra 소프트웨어에 제공된 단백질 접합체 분석을 사용하여, 215 nm 또는 280 nm에서 dn/dc 값 및 소광 계수(extinction coefficient)(글리코실화에 대해 교정됨)를 실험적으로 결정하였다. 교정된 소광 계수 및 dn/dc 값을 사용하여, 모든 단백질-단백질 복합체 시료를 분석하였다.
7.4.3. 결과
A4F-MALLS를 사용하여, 몇몇 항-hTSLP ABM과 hTSLP 사이에서 형성된 복합체의 상대 크기 분포를 평가하였다. hTSLP와의 잠재적인 ABM 복합체의 이론적 몰 질량 및 예측된 화학양론을 표 5-3 및 표 5-4에 나타낸다:
예상된 바와 같이, 각각의 개별 모 항-TSLP mAb(H4H30206P2, H4H30217P2, H4H30230P2)는 등몰비에서 조합될 때 hTSLP와 캐노니컬 1:1 및 1:2 복합체를 형성하였다(피크 3, 약 179 kDa, 도 7, 표 5-5).
그러나, 2개의 모 mAb의 상이한 조합(H4H30206P2 + H4H30217P2 및 H4H30217P2 + H4H30230P2)을 등몰 양의 hTSLP와 혼합할 때, 헤테로량체 복합체의 불균질한 분포를 관찰하였고, 이는 각각의 모 mAb가 hTSLP의 동일한 분자와 연계(engage)하여 "페이퍼-돌링"이라고 하는 과정에서 연장된 항체-항원 격자를 형성할 수 있음을 나타낸다(도 8). 이들 시료에서, 대략 342 kDa의 몰 질량을 갖는 별개의 피크(피크 4)를 관찰하였고, 뒤이어 대략 650 내지 5000 kDa 범위의 광범위한 몰 질량 분포를 갖는 일련의 넓은, 불량하게-분해된 화학종(피크 5)을 관찰하였다. 개별 구성요소의 계산된 몰 질량에 기초하여, 피크 4는 2:2 mAb:hTLSP 복합체를 나타내는 경향이 있는 반면, 피크 5는 hTSLP의 ≥3 분자와 배위하는 mAb의 ≥4 분자로 이루어진 더 고차의 헤테로량체 복합체의 불균질한 분포에 상응한다(표 5-6).
이에 더하여, hTSLP와, 인간 Fc 도메인의 C-말단에 부착된 상기 시험된 동일한 모 mAb 조합(Fc-Fab)으로부터 유래된 2개의 독특한 Fab 도메인을 갖는 신규 이중특이적 항체의 세트(TS-FC1-eL1, TS-FC6-eL2) 사이에서 형성된 복합체를 또한 검사하였다. 모 mAb 농도로 수득된 결과와 달리, 각각의 Fc-Fab 이중특이적 항체(bsAb)는 주로 hTLSP와 함께 별개의 1:1 복합체를 형성하였고(피크 3, 약 178 kDa; 도 9, 표 5-7), 추가의 더 고차의 복합체("페이퍼-돌링")는 거의 관찰되지 않거나 전혀 관찰되지 않았다.
이는, 각각의 Fc-Fab bsAb 상의 Fab 도메인 둘 다 일자일웅(monogamous), 2가 상호작용을 형성하는 hTSLP의 동일한 분자와 연계하는 것을 선호하고, 따라서 "페이퍼-돌링"의 과정을 배제함을 시사한다.
각각의 결합 아암(arm) 상에 잉여의 외부 Fab 도메인(2+2 탠덤 Fab; TS-CL2-eL2, TS-CL3-eL2) 또는 각각의 아암 상에 잉여의 내부 비-결합 Fab(클램프; TS-CL4-eL1, TS-CL6-eL1)를 갖는 개시내용의 ABM 형식의 2개의 추가 세트를 또한, 유사한 방식으로 hTSLP와의 복합체 형성에 대해 평가하였다. 일반적으로, 각각의 클램프 ABM은 hTSLP와 소정의 정도의 1:1 복합체를 형성하는 것으로 보였고(피크 3, 약 272 kDa; 도 10, 표 5-8); 그러나, 다양한 수준의 "페이퍼-돌링"을 나타내는 더 고차의 복합체(피크 5, 약 650-7000 kDa; 도 10, 표 5-8)의 넓은 불균질한 분포를 또한 이들 시료에서 검출할 수 있었다.
마지막으로, 등몰 양의 hTLSP와 혼합하였을 때, 각각의 2+2 탠덤 Fab bsAb는 시험된 모든 신규 이중특이적 형식의 "페이퍼-돌링"에 대한 최고의 성향을 나타내었다. 이들 시료에서, 유리(free) 2+2 탠덤 Fab bsAb(피크 2; 대략 255 kDa)와 일관되는 별도의 피크를 관찰할 수 있었고, 뒤이어 십(10) 메가달톤을 초과하는 몰 질량을 갖는 매우 큰 복합체에서 종결되는 점점 더 큰 화학종의 불균질한 분포를 나타내는 일련의 넓은, 불량하게-분해된 피크를 관찰할 수 있었다(피크 4 내지 5, 대략 500-14,000 kDa; 도 11, 표 5-9).
7.5. 실시예 5: 항-hTSLP Fc-Fab에서 링커의 최적화
2개 아미노산 GS 링커 내지 30개 아미노산 6xG4S 링커(SEQ ID NO:38)의 상이한 링커를 사용하여 일련의 항-hTSLP 30217x30230 이중특이적 Fc-Fab를 작제하였다. 이들 Fc-Fab의 활성을 hTSLP STAT3-루시퍼라제 리포터 검정에서 평가하였다(도 12). 최상의 차단 활성은 2-5xG4S(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨) 사이의 링커 길이를 갖는 Fc-Fa에서 나타났다. 30217x30230 이중특이적 Fc-Fab를 예로서 사용하여 상이한 힌지 형식을 또한 평가하였다(도 13). 형식 #1에서, 힌지 서열은 Fc-Fab의 N-말단 단부에 존재하는데, 이것이 S228P(EU) 치환과 함께 네이티브 hIgG4 서열에서 발생하기 때문이다(도 13a). 형식 #2에서, 동일한 힌지 서열을 Fc-Fab의 N-말단 단부로부터 제거하고, Fc CH3 도메인의 C-말단과 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨) 사이에 삽입한다(도 13b). 형식 #3에서, 힌지를 또한 CH3 도메인과 (G4S)n 링커(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨) 사이에 위치시킨다. 그러나, 상위(upper) 힌지 서열을 G4S 서열(G4S는 SEQ ID NO:3으로서 개시됨)로 대체한다(도 13c). 모든 3개의 힌지 형식을 1xG4S(SEQ ID NO:3) 또는 4xG4S 링커(SEQ ID NO:19)와 조합하여, 항-hTSLP 30217x30230 이중특이적 Fc-Fab를 작제하였다. 이들 Fc-Fab의 활성을 hTSLP STAT3-루시퍼라제 리포터 검정에서 평가하였다(도 13d). 4xG4S 링커(SEQ ID NO:19)를 갖는 Fc-Fab에 대해, 상이한 힌지 형식은 이의 TSLP 차단 활성에 최소의 영향을 가졌고, 힌지 형식 #1은 최상의 활성을 보여주었다. 1xG4S 링커(SEQ ID NO:3)를 갖는 Fc-Fab에 대해, 힌지 형식 #1은 다른 2개의 힌지 형식보다 5배 내지 10배 더 양호한 IC50을 가졌다.
7.6. 실시예 6: Fc 수용체에의 Fc-Fab 결합의 바이오코어 분석
실시간 표면 플라즈몬 공명-기초 MASS-2(Bruker)/ Biacore 3000(GE Healthcare) 바이오센서를 사용하여, 인간으로부터의 정제된 재조합 인간 FcγR 및 FcRn 수용체 서브유형에의 상이한 항-TSLP Fc-Fab 항체 결합에 대한 평형 해리 상수(KD 값)를 결정하였다. 검정된 Fc-Fab 작제물은 항-FelD1(-)- IgG1 및 IgG4 이소타입 대조군(각각 REGN1932 및 REGN1945로 지칭됨)과 더불어, TSLP 30206x30217 Fc_Fab 2xG4S("2xG4S"는 SEQ ID NO:18로서 개시됨)(REGN8759로도 지칭됨) 및 TSLP 30230x30217 Fc_Fab 2xG4S("2xG4S"는 SEQ ID NO:18로서 개시됨)(REGN7860으로도 지칭됨)였다. 검정된 Fc 수용체는 인간 FcγRIIA(H131)-myc.6xHis, 인간 FcγRIIA(R167)-10xHis, 인간 FcγRIIB-myc.6xHis, 인간 FcγRIIIA(F176)-myc.6xHis, 인간 FcγRIIIB-mmh, 인간 FcRn-mmh, 및 인간 FcγRI-6xHis이었다.
7.6.1. 재료 및 방법
모든 결합 연구를 25℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH 7.4(HBS-ET) 또는 PBS, 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH 6.0(PBS-T-pH6.0) 전개 완충액에서 수행하였다. MASS-2/Biacore 3000 CM5 센서 표면을, 마우스 항-펜타-히스티딘 단일클론 항체("펜타-히스티딘"은 SEQ ID NO:34로서 개시됨)(GE Healthcare) 또는 항-myc 단일클론 항체(REGN642)와의 아민 커플링에 의해 유도체화하여, C-말단 myc-myc-헥사히스티딘("헥사히스티딘"은 SEQ ID NO:35로서 개시됨) 또는 히스티딘 영역과 함께 발현되는 FcγR 및 FcRn 수용체 세포외 도메인을 포착하였다. 상이한 항-TSLP Fc-Fab 및 야생형 Fc 이소타입 대조군 상에서 결합 연구를 수행하였다. HBS-ET 또는 PBS-T pH 7.4 및 pH 6.0 전개 완충액에서 제조된 상이한 농도의 항-TSLP Fc-Fab(5 μM 내지 0.3125 μM 범위, 2-배 희석)를 FcγR 및 FcRn 수용체 포착된 표면에 걸쳐 50 μL/분의 유속으로 주입하였다. 각각의 포착된 FcγR 및 FcRn 수용체에의 모든 항-TSLP Fc-Fab의 회합을 1.5분 내지 2분 동안 모니터링하고, HBST 전개 완충액에서의 이들의 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 각각의 사이클의 종료 시, 마우스 항-펜타-히스티딘 단일클론 항체("펜타-히스티딘"은 SEQ ID NO:34로서 개시됨) 또는 항-myc 단일클론 항체에 대해 10 mM 글리신-HCl pH 1.5의 20-30초 주입을 사용하여 FcγR 및 FcRn 수용체 포착 표면을 재생시켰다. 모든 결합 동역학 실험을 25℃에서 수행하였다.
7.6.2. 데이터 분석
결합 해리 평형 상수(KD) 및 해리 반감기(t½)를 하기와 같이 동역학 속도로부터 계산하였다:
7.6.3. 결과
25℃에서 개시내용의 상이한 FcγR 및 FcRn 수용체에의 상이한 항-TSLP Fc-Fab 및 대조군 항체 결합에 대한 결합 동역학 매개변수를 각각 표 5-10 및 표 5-11에 나타낸다. 표 5-10에서, NT는 시험되지 않음을 의미하고, IC는 결정적이지 않음(Inconclusive)을 의미한다. 표 5-11에서, NB는 결합이 없음을 의미하고, IC는 결정적이지 않음을 의미한다.
7.7. 실시예 7: 야생형 마우스에서 항-TSLP Fc-Fab 이중특이적 항체의 약물동력학적 평가
7.7.1. 개요
항-fel d 1 IgG4 이소타입 대조군, REGN1945, 관련이 없는 종래의 이중특이적 IgG4 대조군, H4H21237D 및 hFcγ 호모이량체, REGN1627과 비교하여, 2개의 항-TSLP Fc-Fab 이중특이적 결합 분자, (1) REGN8759로도 지칭되는 2xG4S 링커(SEQ ID NO:18)를 갖는 30206 x 30217 IgG4 Fc-Fab 이중특이적, 및 (2) REGN 8760으로도 지칭되는 2xG4S 링커(SEQ ID NO:18)를 갖는 30230 x 30217 IgG4 Fc-Fab 이중특이적의 약물동력학적 프로파일의 평가를 C57BL/6 야생형(WT) 마우스에서 시행하였다.
7.7.2. 재료 및 방법
코호트는 시험된 항체당 5 마리의 마우스를 함유하였다. REGN8759, REGN8760, REGN1945, 및 H4H21237D로 투약된 마우스는 단일 피하(SC) 1 mg/kg 용량을 받았다. hFcγ 호모이량체, REGN1627이 투약된 마우스는 연구에서 다른 항체와 몰 당량(molar equivalence)(0.35 mg/kg)에 기초하여 정규화된 SC 용량을 받았다. 혈액 시료를 투약후 6시간째 및 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 및 21일째에 수집하였다. 혈액을 혈청 내로 가공하고, 분석 시까지 -80℃에서 냉동하였다. GyroLab xPlore 플랫폼(Gyros)을 사용하여, REGN8759 및 REGN8760의 총 혈청 농도와 기능적 혈청 농도 및 REGN1945, H4H21237D, 및 REGN1627의 총 혈청 농도를 측정하였다.
Gyros 기술은 레이저-유도 형광 검출을 이용하는 자동화된 면역검정을 위해 친화도 플로우-스루(flow-through) 형식을 사용한다. 시료를, 다수의 방사상으로 배열된 나노리터-규모의 친화도 포착 컬럼을 함유하는 컴팩트 디스크(CD) 상으로 로딩한다. 액체 유동(flow)을 원심분리 및 모세관 힘에 의해 제어한다.
혈청 중 전체 및 기능적 REGN8759, REGN8760의 측정을 위해, 그리고 총 REGN1945, H4H21237D 및 REGN1627의 측정을 위해, 100 μg/mL의 시험 물품 또는 대조군 물품-특이적 비오틴화된 포착 시약(표 5-11)을, 스트렙타비딘-코팅된 비드(Dynospheres)로 예비로딩된 친화도 컬럼을 함유하는 Gyrolab Bioaffy 200 CD 상으로 첨가하였다. 보정에 사용되는 표준(표 5-11)을 0.488 - 2000 ng/mL 범위의 농도에서 전개시켰다. 혈청 시료의 일련의 희석물을, 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBS)에서 제조하였다. 표준의 일련의 희석물을, 2% 정상 마우스 혈청(NMS)을 함유하는 PBS + 0.5% BSA에서 제조하였다. 1:50에서 희석된 혈청 시료의 단일항(singlet) 및 표준의 이중항(duplicate)을 실온에서 포착 시약-코팅된 친화도 컬럼 상으로 첨가하였다. Rexxip F 완충액(Gyros)에서 희석된 Alexa-647-접합된 마우스 항-인간 IgG1/hIgG4 단일클론 항체(REGN2567 @ 0.5 μg/mL)를 사용하여, 포착된 인간 IgG를 검출하였고; 생성된 형광 신호를 GyroLab xPlore 기기에 의해 반응 단위(RU)로 기록하였다. 각각의 검정의 정량 하한(LLOQ; lower limit of quantitation)을 표준 곡선 상의 최저 농도로서 정의하였고, 이에 대해 품질 관리(QC) 시료는 예상된 농도로부터 25% 미만에서 일관적으로 일탈하는 것으로 결정되었다(표 5-12). Gyrolab Evaluator 소프트웨어에서 4-매개변수 로지스틱 곡선 맞춤(logistic curve fit)을 사용하여 작제한 표준 곡선으로부터의 내삽(interpolation)에 의해 시료 농도를 결정하였다. 2개의 복제 실험으로부터의 평균 농도를 사용하여, 최종 농도를 계산하였다.
Phoenix®WinNonlin® 소프트웨어 버전 6.3(Certara, L.P., Princeton, NJ) 및 혈관외 투약 모델을 사용하여 비구획적 분석(NCA; non-compartmental analysis)에 의해 PK 매개변수를 결정하였다. 각각의 항체에 대한 각각의 평균 농도 값(총 약물)을 사용하여, 관찰된 혈청 중 최대 농도(C최대), 관찰된 추정 반감기(t1/2), 마지막 측정 가능한 농도까지의 시간 대 농도 곡선 아래 면적(AUC마지막) 및 항체 청소율(clearance rate)(Cl)을 포함한 모든 PK 매개변수를, 선형 내삽 및 균일 가중(uniform weighting)과 함께 선형 사다리꼴 규칙(linear trapezoidal rule)을 사용하여 결정하였다.
7.7.3. 결과
WT 마우스에서 항-TSLP Fc-Fab 이중특이적 항체 및 대조군의 1 mg/kg SC 투여 후, REGN8759 및 REGN8760은 혈청에서 약물의 유사한 최대 총 농도(C최대 = 각각 11.7 및 10.7 μg/mL)를 나타낸 한편, hIgG4 이소타입 대조군, REGN1945, 관련이 없는 종래의 이중특이적 IgG4 대조군, H4H21237D, 및 hFcγ 호모이량체, REGN1627(정규화된 C최대 용량)은 대략 1.5-2-배 더 낮은 농도(C최대 = 각각 8.2, 7.8 및 6.4 μg/mL)를 가졌다.
이에 더하여, REGN8759, REGN8760, REGN1945, 및 H4H21237D는 모두 유사한 반감기 값(T1/2= 각각 12.1, 12.2, 10.9 및 11.2일)을 나타낸 한편, REGN1627은 모든 다른 시험된 약물과 비교하여 더 신속한 반감기(6.4일)를 가졌다. 추가로, REGN8759 및 REGN8760은 REGN1945, H4H21237D, 및 REGN1627(AUC마지막 = 각각 88.0, 84.1, 및 19.7, AUC마지막/D = 각각 56.2 (d*μg/mL)/ (mg/kg); Cl = 각각 9.5, 8.2, 및 45.2 mL/일/kg)과 비교하였을 때, 더 양호한 약물 노출(AUC마지막 = 각각 131, 및 122 (d*μg/mL)/ (mg/kg)) 및 더 느린 청소율(Cl = 각각 5.2, 5.5 mL/일/kg)을 나타내었다.
더욱이, REGN8759 및 REGN8760의 총 TSLP-결합 농도 및 기능적 TSLP-결합 농도는 시험된 모든 시점에서 유사하였으며, 이는 이들 Fc-Fab 분자가 21일에서 여전히 무손상임을 시사한다. 전반적으로, PK 프로파일은 hIgG4 이소타입 대조군, 관련이 없는 종래의 이중특이적 IgG4 대조군, 또는 hFcγ 호모이량체와 비교하여 REGN8759 및 REGN8760에 대해 유사하거나 더 양호하다.
총 REGN8759 및 REGN8760 약물 농도, 기능적 REGN8759 및 REGN8760 약물 농도 및 총 REGN1945, H4H21237D, 및 REGN1627 약물 농도에 대한 데이터의 요약을 표 5-13에 요약하고, 평균 PK 매개변수를 표 5-14에 기재하고, 평균 총 항체 농도 대 시간을 도 14 및 도 15에 도시한다.
PK 매개변수는 평균 농도 대(versus) 총 약물 농도의 시간 프로파일로부터 유래되었다. T1/2 및 AUC마지막은 제21일까지의 농도에 기초한다. 각각의 PK 매개변수에 대한 평균 ± SEM 값은 모든 용량 그룹에 대해 나타나 있다.
약어: AUC마지막 = 투약 시점으로부터 마지막 측정 가능한 농도까지 곡선 아래 면적; AUC마지막/D = 1 mg/kg 투약으로 정규화된 AUC 마지막 용량; t½ = 말단 소실 반감기; C최대 = 피크 농도; C최대/d = 1 mg/kg 투약으로 정규화된 C최대 용량; t최대 = C최대가 관찰되는 시간; Cl = 시간 경과에 따른 항체의 청소율; SEM = 평균의 표준 오차.
7.8. 실시예 8: 리간드 X에의 항-리간드 X Fc-Fab 결합의 바이오코어 분석
인간 리간드 X, mAbX1, mAbX2, 및 mAbX3에 대한 3개의 비-경쟁적 mAb로부터의 Fab 단편을 사용하여, 인간 리간드 X, 15-20 kDa 범위의 분자량을 갖는 가용성 단량체성 단백질에 대한 이중특이적 Fc-Fab를 만들었으며, 여기서 링커는 G4S2(즉, GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18))이다. Fc-Fab는 도 13a에 도시된 힌지 형식을 가졌다.
정제된 항-리간드 X 항체에의 리간드 X 결합에 대한 평형 해리 상수(KD 값)를, Biacore T200 기기 상에서 실시간 표면 플라즈몬 공명 바이오센서 검정을 사용하여 결정하였다. 단일클론 마우스 항-인간 Fc 항체(REGN2567)와의 아민 커플링에 의해 Biacore 센서 표면을 유도체화하여, 인간 Fc 불변 영역과 함께 발현된 항-리간드 X 항체를 포착하였다. Biacore 결합 연구를 HBST 전개 완충액(0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% v/v 계면활성제 P20)에서 시행하였다. 인간 리간드 X를 인하우스 공급원(REGN138)으로부터 수득하였다. HBST 전개 완충액에서 제조된 상이한 농도의 인간 리간드 X(90 nM 내지 0.12 nM 범위, 3-배 희석)를 항-리간드 X 항체 포착된 표면에 걸쳐 50 μL/분의 유속으로 주입하였다. 각각의 포착된 단일클론 항체에의 모든 리간드 X 시약의 회합을 4분 동안 모니터링하고, HBST 전개 완충액에서의 이들의 해리를 10분 동안 모니터링하였다. 모든 결합 동역학 실험을 37℃에서 수행하였다. 비아이밸류에이션(biaevaluation) 곡선 맞춤 소프트웨어를 사용하여 실시간 센서그램(sensorgram)을 1:1 결합 모델로 맞춤으로써 동역학 회합(ka) 및 해리(kd) 속도 상수를 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(KD) 및 해리 반감기(t½)를 하기와 같이 동역학 속도 상수로부터 계산하였다:
37℃에서 항-리간드 X 항체에의 인간 리간드 X 결합에 대한 결합 동역학 매개변수를 표 5-15에 나타낸다. 37℃에서, 표 5-15에 나타낸 바와 같이, 개시내용의 항-리간드 X Fc-Fab는 인간 리간드 X에 0.25 pM 내지 18.4 pM 범위의 KD 값으로 결합한 한편, 모 mAb는 인간 리간드 X에 0.56 pM 및 557 pM의 각각의 KD 값으로 결합하였다.
7.9. 실시예 9: 생물검정에서 항-인간 리간드 X 이중특이적 Fc-Fab의 활성
정제된 항-인간 리간드 X 이중특이적 Fc-Fab를 수용체 X 신호전달 생물검정에서 인간 리간드 X를 저해하는 이의 능력에 대해 평가하였다. 조작된 루시퍼라제 리포터 세포주를 사용하여, 수용체 X를 통한 리간드 X 신호전달에 대한 생물검정을 수행하였다. 리포터 세포를 0.1% 우태 혈청(Seradigm)과 함께 Opti-MEM(Gibco)에 10,000개 세포/웰로 평판배양하고, 밤새 인큐베이션하였다. 리간드 X 용량 반응 곡선에 대해, 1:3의 일련으로 희석된 리간드 X를 각각의 웰에 첨가하고, 리간드 X의 최종 농도는 2 nM에서 시작하였다. 항-리간드 X 모 mAb 및 이중특이적 Fc-Fab의 차단 활성을 결정하기 위해, 항체 및 리간드 X를 리포터 세포에 동시에 첨가하는 "레이스 형식" 차단 검정을 사용하였다. 항-리간드 X 항체를 1:3으로 일련으로 희석시켰고, 최종 농도는 100 nM에서 시작하였다. 인간 리간드 X를 10 pM, 100 pM 또는 1 nM의 불변 농도까지 첨가하였다. 5.5시간 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 실온에서 15분 동안 평형화시켰다. 100 μl의 One-Glo 기질(Promega)을 각각의 웰에 첨가하였다. 실온에서 5분 인큐베이션 후, 발광을 Envision 상에서 측정하였다.
수용체 X 생물검정에서 3개의 항-인간 리간드 X 이중특이적 Fc-Fab의 활성을 도 16a 내지 도 16c(mAbX1 x mAbX2), 도 17a 내지 도 17c(mAbX2 x mAbX3), 및 도 18a 내지 도 18c(mAbX1 x mAbX3)에 도시한다. 이들의 활성을 동일한 검정에서 상응하는 항-인간 리간드 X 모 mAb와 비교하였다. mAbX1 x mAbX2 Fc-Fab는 최상의 차단 활성을 가지며, 이는 모 항-리간드 X mAb를 능가하는 유의하게 향상된 IC50 값을 나타낸다. 모 mAb 중 하나인 mAbX3은, 심지어 mAb가 인간 리간드 X에 대해 100-배 내지 1000-배 몰 과량으로 존재할 때에도 생물검정에서 리간드 X 활성을 기준선까지 차단하지 않는다. 흥미롭게는, mAbX3 Fab를 사용하는 2개의 Fc-Fab는 리간드 X 활성을 기준선까지 차단할 수 있다(도 17a 내지 도 17c 및 도 18a 내지 도 18c). 이들 결과는, 이의 모 항-리간드 X mAb와 비교할 때 이중특이적 Fc-Fab의 우수한 활성을 실증한다. 이들 항-리간드 X 항체의 IC50 값을 표 5-16에 요약한다.
7.10. 실시예 10: 다각도 레이저 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALLS)에 의한 항-리간드 X 헤테로이량체와 재조합 리간드 X 사이에서 형성된 시험관내 복합체의 크기 분석
모 mAb와의 복합체와 비교하여 Fc-Fab, 클램프 및 2+2 탠덤 Fab 헤테로이량체 형식에서 재조합 리간드 X와 이중특이적 mAbX1 x mAbX2 사이에서 형성된 시험관내 복합체의 크기 분석을, 섹션 7.4에 기재된 바와 같이 다각도 레이저 광산란과 커플링된 비대칭 유동 필드-유동 분획화(A4F-MALLS)를 사용하여 수행하였다. 이 분석의 결과를 도 19a 내지 도 19e에 도시한다. 도 19a 및 도 19b는 리간드 X와 모 mAb와의 복합체(단일 또는 조합)의 시험관내 분석의 결과를 도시하며; 도 19c는 리간드 X와 mAbX1 x mAbX2 Fc-Fab와의 복합체의 시험관내 분석의 결과를 도시하고; 도 19d는 리간드 X와 mAbX1 x mAbX2 클램프와의 복합체의 시험관내 분석의 결과를 도시하며; 도 19e는 리간드 X와 mAbX1 x mAbX2 2+2 탠덤 Fab 헤테로이량체와의 복합체의 시험관내 분석의 결과를 도시한다. 도 19c에 도시된 바와 같이, Fc-Fab 형식은 최소량의 페이퍼 돌링 또는 응집을 보여준다.
7.11. 실시예 11: Fc-Fab는 세포 표면 표적에의 결합을 유지시킨다
작은 가용성 항원에 더하여, 세포 표면 단백질을 Fc-Fab에 대한 표적으로서 시험하였다. hIgG1 불변 영역(도 20a) 또는 감소된 이펙터 기능을 갖는 hIgG4 불변 영역(US9359437B2)(hIgG4s로서 도시됨, 도 20b, 도 20c, 도 20d)을 사용하여, 세포 표면 항원인 항원 Y에 대한 IgG 항체를, 단일특이적 Fc-Fab(도 1b에 도시된 바와 같음, 도 13a에 도시된 힌지 형식을 가짐) 내로 개량(reformat)하였다. 3개의 상이한 링커인 1xG4S(SEQ ID NO:3), 2xG4S(SEQ ID NO:18), 및 3xG4S(SEQ ID NO:4)를 각각의 항-항원 Y Fc-Fab에 대해 시험하였다. 이들 Fc-Fab를 유세포분석(FACS) 결합 검정에서 세포 표면 항원 Y에의 결합에 대해 평가하였다. 항원 Y-발현 세포를 수집하고, 저온 FACS 세척 완충액(PBS + 1% FBS)에 재현탁시켰다. 각각의 결합 검정에 대해, 50,000 내지 100,000개 세포를 FACS 세척 완충액 중 1차 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 냉각 FACS 세척 완충액으로 2회 세척하고, APC-F(ab)'2 항-인간 IgG Fcγ 단편(Jackson ImmunoResearch Laboratories)의 1:200 희석물과 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 종료 시, 세포를 냉각 FACS 세척 완충액으로 2회 세척하고, FACS Canto(BD Biosciences) 상에서 분석하였다.
모든 Fc-Fab는 세포 표면 항원 Y에의 강한 결합을 유지시켰다. Fc-Fab의 2개 세트는 이의 모 mAb와 유사한 결합 활성을 가졌다(도 20a 및 도 20b). Fc-Fab의 다른 2개 세트는 이의 모 mAb와 비교할 때 항원 Y에 대해 중간 정도로(moderately) 감소된 결합을 나타내었다(도 20c 및 도 20d). 1xG4S(SEQ ID NO:3)와 3xG4S(SEQ ID NO:4) 사이의 링커 길이의 변동은 항-항원 Y Fc-Fab의 표적 결합에 미미한 영향을 가졌다.
추가의 세포 표면 단백질을, CD3 및 세포 표면 종양 관련 항원인 항원 Z를 포함하여 Fc-Fab에 대한 표적으로서 시험하였다. Fc-Fab는 도 13a에 도시된 힌지 형식을 가졌다. FACS 결합 검정에서, 항-CD3 hIgG1 Fc-Fab는 CD3+ Jurkat 세포에 대해 특이적인 결합을 나타낸 한편(도 21a), 항-항원 Z hIgG1 Fc-Fab는 항원 Z+ 세포주에 대해 특이적인 결합을 나타내었다(도 21b). 1xG4S(SEQ ID NO:3)와 5xG4S (SEQ ID NO:39) 사이의 링커 길이의 변동은 이들 Fc-Fab의 표적 결합에 미미한 영향을 가졌고, 최단 링커는 CD3과 항원 Z 둘 다에 대해 중간 정도로 더 약한 결합 활성을 초래하였다.
7.12. 실시예 12: 이중특이적 CD3 x 항원 Z Fc-Fab는 T 세포를 이펙터 세포로서 사용하는 생물검정에서 활성이다
CD3 및 항원 Z(세포 표면 종양 관련 항원)에 대한 이중특이적 Fc-Fab를, 실시예 1에 기재된 바와 같이 hIgG1의 불변 영역을 사용하여 생산하였다. 3개의 상이한 링커인 1xG4S(SEQ ID NO:3), 2xG4S(SEQ ID NO:18), 및 3xG4S(SEQ ID NO:4)를 도 13a에 도시된 힌지 형식을 갖는 이중특이적 Fc-Fab에 대해 시험하였다. 이중특이적 Fc-Fab의 활성을 Jurkat NFAT-루시퍼라제 리포터 검정(도 22a) 및 시험관내 세포독성 검정(도 22b)에서 평가하였다. Jurkat NFAT-루시퍼라제 리포터 검정에서, Jurkat/NFAT-Luc 리포터 세포주를 96-웰 플레이트에서 항원 Z+ 세포주(각각 50,000개 세포)와 1:1 비로 혼합하였다. CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab를 각각의 웰에 100 μl의 최종 부피까지 첨가하였다. 반응을 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 실온에서 10분 동안 평형화시킨 후, 100 μl의 One-Glo 기질(Promega)을 각각의 웰에 첨가하였다. 발광을 Victor 상에서 측정하였다. 세포독성 검정에서, 7일 동안 CD3/CD28 비드 및 IL-2로 활성화된 인간 공여자 PBMC를 사용하여, 예비-활성화된 인간 T 세포를 제조하였다. 세포독성 검정일에, 항원 Z+ 세포를 수합하고, 8 μM 칼세인-AM(Invitrogen)으로 30분 동안 표지하였다. 표지된 표적 세포를 2회 세척하고, 예비-활성화된 인간 T 세포를 1:10 비로 혼합하였고, 이때 대략 10,000개 표적 세포/웰이었다. CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab의 일련의 희석물을 200 μl의 최종 부피까지 첨가하였다. 반응을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리하고, 형광 판독을 위해 100 μl의 상층액을 반투명의 검정색 투명 바닥 플레이트로 이전시켰다. CD3 x 항원 Z 이중특이적 Fc-Fab는 Jurkat 리포터 검정(도 22a)과 세포독성 검정(도 22b) 둘 다에서 활성이었다. 검정 둘 다에서, 더 긴 링커를 갖는 Fc-Fab는 더 강한 활성을 보여주었다.
8. 구체적인 구현예
본 개시내용은 아래의 그룹 A 및 그룹 B 구체적인 구현예에 의해 예시된다.
아래의 구체적인 구현예 및 후속하는 청구항의 바람직한 양태에서, 항원 결합 도메인(예를 들어, Fab)은 인간화 또는 인간 VH 및 VL 서열을 함유하며; Fc 도메인은 인간 CH2 및/또는 CH3 도메인 및 이의 변이체, 예를 들어 이러한 인간 서열과 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이체를 포함한다. 추가의 Fab 도메인은 2개의 폴리펩타이드 사슬, 본원에 기재된 바와 같은 VH 폴리펩타이드 사슬 및 VL 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 Fab 도메인, 또는 VH 및 VL이 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 단일 사슬 Fab("scFab")일 수 있다. 다르게 분명하게 언급되지 않는 한, Fab 도메인은 또한 도메인 스왑(swap), 예를 들어 Crossmab 형식에 존재하는 도메인 스왑을 포함할 수 있다.
8.1. 그룹 A 구체적인 구현예
1. 항원-결합 분자로서,
(a) 제1 표적 분자에 결합하고,
(i) 2개의 Fc 도메인을 포함하는 Fc 영역; 및
(ii) 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인
을 포함하며, 상기 Fc 영역, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인은 비-네이티브 면역글로불린 배치로 존재하며;
제1 Fab 도메인 및/또는 제2 Fab 도메인은 제1 표적 분자에 결합할 수 있고;
(b) 항원-결합 분자는 적어도 2개의 Fab 도메인을 포함하는 네이티브 면역글로불린보다 더 큰 친화도 및/또는 결합력으로 제1 표적 분자에 결합하는, 항원-결합 분자.
2. 항원-결합 분자로서, 선택적으로 구현예 1에 따른 항원 결합 분자이며, 제1 표적 분자에 결합하고,
(a) 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
(i) 제1 Fc 도메인; 및
(ii) 제1 경쇄 가변 영역(VL)과 회합된 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 Fab 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
(b) 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
(i) 제2 Fc 도메인; 및
(ii) 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성하고, 선택적으로 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 것인, 항원-결합 분자.
3. 구현예 2에 있어서, 제1 Fc 도메인과 제1 VH 사이에 제1 링커를 포함하는, 항원-결합 분자.
4. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 5개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
5. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 10개 아미노산 내지 60개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
6. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 5개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
7. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 5개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
8. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 10개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
9. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 10개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
10. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 20개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
11. 구현예 3에 있어서, 제1 링커는 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
12. 구현예 3 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커는 GnS 또는 SGn의 다량체를 포함하며, 선택적으로 n은 1 내지 7의 정수인, 항원-결합 분자.
13. 구현예 12에 있어서, 제1 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 다량체를 포함하는, 항원-결합 분자.
14. 구현예 13에 있어서, 제1 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 2개 내지 6개 반복을 포함하는, 항원-결합 분자.
15. 구현예 14에 있어서, 제1 링커는 (G4S)2(SEQ ID NO:18), (G4S)3(SEQ ID NO:4), 또는 (G4S)4(SEQ ID NO:19)를 포함하는, 항원-결합 분자.
16. 구현예 3 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 Fc 도메인과 제2 VH 사이에 제2 링커를 포함하는, 항원-결합 분자.
17. 구현예 16에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원-결합 분자.
18. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제2 링커는 5개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
19. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제2 링커는 10개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
20. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제1 링커는 5개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
21. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제1 링커는 5개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
22. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제1 링커는 10개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
23. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제1 링커는 10개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이인, 항원-결합 분자.
24. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제2 링커는 20개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
25. 구현예 16 또는 구현예 17에 있어서, 제2 링커는 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
26. 구현예 16 내지 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 링커는 GnS 또는 SGn의 다량체를 포함하며, 선택적으로 n은 1 내지 7의 정수인, 항원-결합 분자.
27. 구현예 26에 있어서, 제2 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 다량체를 포함하는, 항원-결합 분자.
28. 구현예 27에 있어서, 제2 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 2개 내지 6개 반복을 포함하는, 항원-결합 분자.
29. 구현예 28에 있어서, 제2 링커는 (G4S)2(SEQ ID NO:18), (G4S)3(SEQ ID NO:4), 또는 (G4S)4(SEQ ID NO:19)를 포함하는, 항원-결합 분자.
30. 구현예 2 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 도메인에 대해 N-말단에 제1 힌지 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제2 Fc 도메인에 대해 N-말단에 제2 힌지 도메인을 포함하는, 항원-결합 분자.
31. 구현예 30에 있어서, 제1 힌지 도메인과 제2 힌지 도메인은 이황화 결합을 통해 연결되는, 항원-결합 분자.
32. 구현예 30에 있어서, 제1 힌지 도메인과 제2 힌지 도메인은 이황화 결합을 통해 연결되지 않는, 항원-결합 분자.
33. 구현예 2 내지 32 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 도메인에 대해 N-말단에 VH를 포함하지 않는, 항원-결합 분자.
34. 구현예 2 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 폴리펩타이드는 제2 Fc 도메인에 대해 N-말단에 VH를 포함하지 않는, 항원-결합 분자.
35. 구현예 2 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나의 힌지 영역을 갖는, 항원-결합 분자.
36. 구현예 35에 있어서, 도 13a에 예시된 힌지 형식을 갖는, 항원-결합 분자.
37. 구현예 35에 있어서, 도 13c에 예시된 힌지 형식을 갖는, 항원-결합 분자.
38. 구현예 2 내지 29 중 어느 한 구현예에 있어서, 2개의 힌지 영역을 갖는, 항원-결합 분자.
39. 구현예 38에 있어서, 도 13b에 예시된 힌지 형식을 갖는, 항원-결합 분자.
40. 구현예 2 내지 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일하지 않은 것인, 항원-결합 분자.
41. 구현예 2 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 VL 및 제2 VL은 유니버셜 경쇄인, 항원-결합 분자.
42. 구현예 2 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 도메인 또는 제2 Fab 도메인의 경쇄 불변 영역 및 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 Crossmab 배열로 존재하는, 항원-결합 분자.
43. 구현예 1 내지 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 2가인, 항원-결합 분자.
44. 항원-결합 분자로서, 선택적으로 구현예 1에 따른 항원 결합 분자이며,
(a) 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
(i) 제1 VL과 회합된 제1 VH를 포함하는 제1 Fab 도메인;
(ii) 제1 스페이서 도메인; 및
(iii) 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및
(b) 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
(i) 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab 도메인;
(ii) 제2 스페이서 도메인; 및
(iii) 제2 Fc 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드
를 포함하며, 상기 제1 Fab 도메인 및/또는 제2 Fab 도메인은 제1 표적 분자에 결합할 수 있고, 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성하며, 선택적으로 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 것인, 항원-결합 분자.
45. 구현예 44에 있어서, 제1 스페이서 도메인과 제1 Fc 도메인 사이에 그리고 제2 스페이서 도메인과 제2 Fc 도메인 사이에 힌지 도메인을 포함하는, 항원-결합 분자.
46. 구현예 44 또는 구현예 45에 있어서, 힌지 도메인은 이황화 결합을 통해 연결되는, 항원-결합 분자.
47. 구현예 44 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 VL 및 제2 VL은 유니버셜 경쇄인, 항원-결합 분자.
48. 구현예 44 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 도메인 또는 제2 Fab 도메인의 경쇄 불변 영역 및 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 Crossmab 배열로 존재하는, 항원-결합 분자.
49. 구현예 44 내지 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 스페이서 도메인 및 제2 스페이서 도메인은 각각 연장된 링커를 포함하는, 항원-결합 분자.
50. 구현예 49에 있어서, 각각의 연장된 링커는 적어도 30개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
51. 구현예 49 또는 구현예 50에 있어서, 각각의 연장된 링커는 30개 아미노산 잔기 내지 70개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
52. 구현예 49 또는 구현예 50에 있어서, 각각의 연장된 링커는 30개 아미노산 잔기 내지 55개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
53. 구현예 49 또는 구현예 50에 있어서, 각각의 연장된 링커는 30개 아미노산 잔기 내지 40개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
54. 구현예 49 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 각각의 연장된 링커는 GnS 또는 SGn의 다량체를 포함하며, 선택적으로 n은 1 내지 7의 정수인, 항원-결합 분자.
55. 구현예 54에 있어서, 각각의 연장된 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 다량체를 포함하는, 항원-결합 분자.
56. 구현예 55에 있어서, 각각의 연장된 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 5개 내지 12개 반복을 포함하는, 항원-결합 분자.
57. 구현예 56에 있어서, 각각의 연장된 링커는 (G4S)6(SEQ ID NO:38), (G4S)7(SEQ ID NO:36) 또는 (G4S)8(SEQ ID NO:37)을 포함하는, 항원-결합 분자.
58. 구현예 44 내지 57 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 스페이서 도메인 및 제2 스페이서 도메인은 동일한 것인, 항원-결합 분자.
59. 구현예 44 내지 58 중 어느 한 구현예에 있어서, 2가인, 항원-결합 분자.
60. 구현예 44에 있어서, 제1 스페이서 도메인은 제3 VL과 회합된 제3 VH를 포함하는 제3 Fab 도메인을 포함하고, 제2 스페이서 도메인은 제4 VL과 회합된 제4 VH를 포함하는 제4 Fab 도메인을 포함하는, 항원-결합 분자.
61. 구현예 60에 있어서, 제3 VL 및 제4 VL은 Fc 영역 내의 유니버셜 경쇄인, 항원-결합 분자.
62. 구현예 60 또는 구현예 61에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 VH와 제3 VH 사이에 제1 링커를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제2 VH와 제4 VH 사이에 제2 링커를 포함하는, 항원-결합 분자.
63. 구현예 62에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 10개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
64. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 20개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
65. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
66. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 GnS 또는 SGn의 다량체를 포함하며, 선택적으로 n은 1 내지 7의 정수인, 항원-결합 분자.
67. 구현예 66에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 G4S(SEQ ID NO:3)의 다량체를 포함하는, 항원-결합 분자.
68. 구현예 67에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 G4S(SEQ ID NO:3)의 2개 내지 6개 반복을 포함하는, 항원-결합 분자.
69. 구현예 68에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 (G4S)2(SEQ ID NO:18), (G4S)3(SEQ ID NO:4), 또는 (G4S)4(SEQ ID NO:19)를 포함하는, 항원-결합 분자.
70. 구현예 62 내지 69 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원-결합 분자.
71. 구현예 60 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 비-결합적인, 항원-결합 분자.
72. 구현예 71에 있어서, 제3 VH 및 제4 VH는 유니버셜 중쇄인, 항원-결합 분자.
73. 구현예 71 또는 구현예 72에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인은 각각 제1 표적 분자 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
74. 구현예 60 내지 73 중 어느 한 구현예에 있어서, 2가인, 항원-결합 분자.
75. 구현예 60 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 각각 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
76. 구현예 75에 있어서, 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 각각 동일한 표적 분자에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
77. 구현예 76에 있어서, 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 각각 제1 표적 분자에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
78. 구현예 75 내지 77 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인은 동일한 에피토프에 결합하는, 항원-결합 분자.
79. 구현예 78에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인은 동일한 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
80. 구현예 75 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 동일한 에피토프에 결합하는, 항원-결합 분자.
81. 구현예 80에 있어서, 제3 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 동일한 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
82. 구현예 75 내지 77 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제3 Fab 도메인은 동일한 에피토프에 결합하는, 항원-결합 분자.
83. 구현예 82에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제3 Fab 도메인은 동일한 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
84. 구현예 75 내지 77, 82 및 83 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 동일한 에피토프에 결합하는, 항원-결합 분자.
85. 구현예 84에 있어서, 제2 Fab 도메인 및 제4 Fab 도메인은 동일한 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
86. 구현예 60 내지 70 및 구현예 75 내지 85 중 어느 한 구현예에 있어서, 4가인, 항원-결합 분자.
87. 구현예 1 내지 86 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자의 길항제인, 항원-결합 분자.
88. 구현예 1 내지 87 중 어느 한 구현예에 있어서, 결합 파트너에의 제1 표적 분자의 결합을 저해하며, 선택적으로 상기 결합 파트너는 제1 표적 분자의 수용체인, 항원-결합 분자.
89. 구현예 1 내지 88 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 인간 Fc 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
90. 구현예 1 내지 89 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 Fc 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
91. 구현예 1 내지 90 중 어느 한 구현예에 있어서, Fc 영역은 Fc 헤테로이량체를 포함하는, 항원-결합 분자.
92. 구현예 89에 있어서, Fc 헤테로이량체 내 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 노브-인-홀 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
93. 구현예 92에 있어서, 제1 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 노브 돌연변이를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 홀 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
94. 구현예 92에 있어서, 제2 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 노브 돌연변이를 포함하고, 제1 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 홀 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
95. 구현예 89에 있어서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 스타(star) 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
96. 구현예 89에 있어서, 제1 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 H435R 돌연변이 및 Y436F 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
97. 구현예 89에 있어서, 제2 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 H435R 돌연변이 및 Y436F 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
98. 구현예 1 내지 97 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 도메인 내 CL 및 CH1은 이황화 결합에 의해 연결되는, 항원-결합 분자.
99. 구현예 1 내지 98 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 Fab 도메인 내 CL 및 CH1은 이황화 결합에 의해 연결되는, 항원-결합 분자.
100. 구현예 1 내지 99 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인은 제1 표적 분자에 결합되는, 항원-결합 분자.
101. 구현예 1 내지 100 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 저분자 리간드인, 항원-결합 분자.
102. 구현예 1 내지 101 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 사이토카인 또는 케모카인인, 항원-결합 분자.
103. 구현예 1 내지 100 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 세포 표면 단백질인, 항원-결합 분자.
104. 구현예 1 내지 100 및 103 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 종양 관련 항원인, 항원-결합 분자.
105. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 배제하여 100 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
106. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 포함하여 100 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
107. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 배제하여 75 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
108. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 포함하여 75 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
109. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 배제하여 60 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
110. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 포함하여 60 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
111. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 배제하여 45 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
112. 구현예 1 내지 104 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 포함하여 45 kDa 미만의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
113. 구현예 1 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 배제하여 적어도 5 kDa의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
114. 구현예 1 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 포함하여 적어도 5 kDa의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
115. 구현예 1 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 배제하여 적어도 5 kDa의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
116. 구현예 1 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 포함하여 적어도 5 kDa의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
117. 구현예 1 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 배제하여 적어도 10 kDa의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
118. 구현예 1 내지 112 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 번역후 변형을 포함하여 적어도 10 kDa의 분자량을 갖는 분자를 갖는, 항원-결합 분자.
119. 구현예 1 내지 118 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 글리코실화되는, 항원-결합 분자.
120. 구현예 1 내지 118 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 글리코실화되지 않는, 항원-결합 분자.
121. 구현예 1 내지 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 단량체인, 항원-결합 분자.
122. 구현예 1 내지 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 이량체인, 항원-결합 분자.
123. 구현예 122에 있어서, 제1 표적 분자는 호모이량체인, 항원-결합 분자.
124. 구현예 122에 있어서, 제1 표적 분자는 헤테로이량체인, 항원-결합 분자.
125. 구현예 1 내지 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 삼량체인, 항원-결합 분자.
126. 구현예 125에 있어서, 제1 표적 분자는 호모삼량체인, 항원-결합 분자.
127. 구현예 1 내지 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 표적 분자는 사량체인, 항원-결합 분자.
128. 구현예 127에 있어서, 제1 표적 분자는 호모사량체인, 항원-결합 분자.
129. 구현예 1 내지 128 중 어느 한 구현예에 있어서, 단일특이적인, 항원-결합 분자.
130. 구현예 1 내지 128 중 어느 한 구현예에 있어서, 이중특이적인, 항원-결합 분자.
131. 구현예 130에 있어서, 제1 표적 분자 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
132. 구현예 131에 있어서, 제1 표적 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인 및 제2 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함하는, 항원-결합 분자.
133. 구현예 132에 있어서, 제1 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
134. 구현예 130에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
135. 구현예 134에 있어서, 제1 표적 분자에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인 및 제2 표적 분자에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함하는, 항원-결합 분자.
136. 구현예 135에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 동시에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
137. 구현예 1 내지 136 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 및 제2 Fab를 포함하는 인간 IgG 항체에 비해 더 낮은 IC50에서, 표적 분자의 수용체에의 상기 표적 분자의 결합을 차단하는, 항원-결합 분자.
138. 구현예 1 내지 137 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 Fab 및 제2 Fab를 포함하는 인간 IgG 항체보다 더 큰 친화도로 표적 분자에 결합하는, 항원-결합 분자.
139. 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자 및 세포독성제 또는 세포증식억제제를 포함하는 접합체.
140. 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자 또는 구현예 139에 따른 접합체 및 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
141. 표적 분자의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련된 병태를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자, 구현예 139의 접합체, 또는 구현예 140의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
142. 대상체에서 표적 분자와 관련된 분자 경로를 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자, 구현예 139의 접합체, 또는 구현예 140의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
143. 항원-결합 분자, 접합체, 또는 약학적 조성물 내 항원-결합 분자 또는 접합체 각각에 의해 결합되는 표적 분자와 관련된 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자, 구현예 139의 접합체, 또는 구현예 140의 약학적 조성물의 용도.
144. 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예의 항원-결합 분자를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 복수의 핵산 분자들.
145. 구현예 144에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 각각 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되는, 핵산 분자 또는 복수의 핵산 분자들.
146. 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자를 발현하도록 조작된 세포.
147. 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질주입된 세포.
148. 구현예 1 내지 138 중 어느 한 구현예에 따른 항원-결합 분자를 생성하는 방법으로서,
(a) 항원-결합 분자가 발현되는 조건 하에 구현예 146 또는 구현예 147의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 항원-결합 분자를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
149. 구현예 148에 있어서, 항원-결합 분자를 농화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
150. 구현예 148 또는 구현예 149에 있어서, 항원-결합 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
8.2. 그룹 B 구체적인 구현예
1. 항원-결합 분자로서,
(a) 제1 중쇄 폴리펩타이드로서, 제1 중쇄 폴리펩타이드는 제1 CH 아미노산 서열; 제1 VH 아미노산 서열; 및 제2 CH 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 VH 아미노산 서열은 제1 CH 아미노산 서열과 제2 CH 아미노산 서열 사이에 존재하는, 제1 중쇄 폴리펩타이드; 및
(b) 제2 중쇄 폴리펩타이드로서, 제2 중쇄 폴리펩타이드는 제3 CH 아미노산 서열; 제2 VH 아미노산 서열; 및 제4 CH 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 VH 아미노산 서열은 제3 CH 아미노산 서열과 제4 CH 아미노산 서열 사이에 존재하는, 제2 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는, 항원-결합 분자.
2. 구현예 1에 있어서, 제1 CH 아미노산 서열은 제1 VH 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제1 CH3 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
3. 구현예 2에 있어서, 제1 CH3은 H435R 돌연변이 및 Y436F 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
4. 구현예 2 또는 구현예 3에 있어서, 제1 VH 아미노산 서열의 N-말단 단부를 제1 CH3 아미노산 서열의 C-말단 단부에 연결하는 제1 링커를 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
5. 구현예 1 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서, 제3 CH 아미노산 서열은 제2 VH 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제2 CH3 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
6. 구현예 5에 있어서, 제2 VH 아미노산 서열의 N-말단 단부를 제2 CH3 아미노산 서열의 C-말단 단부에 연결하는 제2 링커를 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
7. 구현예 1 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 CH 아미노산 서열은 제1 VH 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치하는 제1 CH1 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
8. 구현예 1 내지 7 중 어느 한 구현예에 있어서, 제4 CH 아미노산 서열은 제2 VH 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치하는 제2 CH2 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
9. 구현예 1 내지 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 CH3 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제1 CH2 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
10. 구현예 1 내지 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 CH3 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제2 CH2 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
11. 구현예 1 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 힌지 영역 이황화 결합을 포함하지 않는, 항원-결합 분자.
12. 구현예 1 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 경쇄 폴리펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 제1 경쇄 폴리펩타이드는 제1 VL 아미노산 서열; 및 제1 CL 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
13. 구현예 12에 있어서, 제1 CL을 제1 CH1에 연결하는 이황화 결합을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 경쇄 폴리펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 제2 경쇄 폴리펩타이드는 제2 VL 아미노산 서열; 및 제2 CL 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
15. 구현예 14에 있어서, 제2 CL을 제2 CH1에 연결하는 이황화 결합을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
16. 구현예 6 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 폴리펩타이드를 포함하는, 항원-결합 분자.
17. 구현예 16에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 0 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 항원-결합 분자.
18. 구현예 16 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원-결합 분자.
19. 구현예 16 내지 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 폴리 글리신 및 세린 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
20. 구현예 19에 있어서, 폴리 글리신 및 세린 아미노산 서열은 2개 내지 6개 반복된 GGGGS(SEQ ID NO:3) 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
21. 구현예 20에 있어서, 폴리 글리신 및 세린 아미노산 서열은 (G4S)2(SEQ ID NO:18), (G4S)3(SEQ ID NO:4), 또는 (G4S)4(SEQ ID NO:19)를 포함하는, 항원-결합 분자.
22. 구현예 14 내지 21 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 경쇄 폴리펩타이드 및 제2 경쇄 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
23. 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제2 중쇄 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
24. 구현예 1 내지 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제2 중쇄 폴리펩타이드는 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
25. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRLI, ADORA2A, 아그레칸(aggrecan), AGR2, AICDA, AIF1, AIG1, AKAP1, AKAP2, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOC1, AR, AZGP1(아연-a-당단백질), ART-4, B7, B7.1, B7.2, BAD, BAFF, BAGI, BAIi, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLRl (MDRlS), BlyS, BMPl, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMPS, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1(플렉틴), BRCA1, Ba-733, BAGE, BrE3- 항원, CA125, CAMEL, CAP-I, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CDI-IA, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, C19orf10(IL27w), C3, C4A, CS, CSR1, CANT1, CASPI, CASP4, CAV1, CCBP2 (D6/JAB61), CCLI(I-309), CCLII(에오탁신(eotaxin)), CCL13(MCP-4), CCLIS(MIP-1d), CCL16(HCC- 4), CCL17(TARC), CCLIS(PARC), CCL19(MIP-3b), CCL2(MCP-1), MCAF, CCL20(MIP-3a), CCL21(MIP- 2), SLC, 엑소두스(exodus)-2, CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF- 1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL2S(TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27(CTACK/ILC), CCL2S, CCL3(MIP1a), CCL4(MIP-1b), CCLS(RANTES), CCL7(MCP-3), CCLS(mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1(CKR1/HM14S), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCRS(CMKBRSI ChemR13), CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EB1), CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI), CCR9(GPR-9-6), CCRLI(VSHK1), CCRL2(L-CCR), CD164, CDlC, CD200, CD-22, CD24, CD2S, CD3S, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD44, CD4SRB, CD47, CD4S, CDS2, CD69, CD72, CD79A, CD79B, CDSO, CDS1, CDS3, CDS6, CD137, CD13S, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CDH1(E-캐드헤린(cadherin)), CDH10, CDH12, CDH13, CDHlS, CDH19, CDH20, CDHS, CDH7, CDHS, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDKS, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A(p21 Wap1/Cip1), CDKN1B(p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A(p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CER1, CHGA, CHGB, 키티나제(chitinase), CHST1O, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSFS, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSFS, CLDN3, CLDN7(클라우딘(claudin)-7), CLN3, CLU(클러스테린(clusterin)), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CNR1, COLISA1, COLIA1, COL4A3, COL6Al, CR2, CRP, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(GCSF), CTLA-4, CTNNB1(b-카테닌), CTSB(카텝신(cathepsin) B), CX3CLI(SCYD1), CX3CR1(V2S), CXCLI(GRO1), CXCLIO(IP-10), CXCL11(I-TAC/IP-9), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCLS(ENA-7S/LIX), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/ STRL33/Bonzo), CYBS, CYC1, CYSLTR1, HIF-1-a, 결장-특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAB2IP, DES, DKFZp4S1J011S, DNCLI, DPP4, DAM, EGFR, EGFRvlll, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, E2F1, ECGF1, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, EN01, EN02, EN03, EPHB4, EPO, EREG, ERKS, ESR1, ESR2, F3(TF), FADD, FasL, FASN, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1(aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF1S, FGF19, FGF2(bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3(int-2), FGF4(HST), FGFS, FGF7(KGF), FGFS, FGF9, FGFR3, FIGF(VEGFD), FILI(EPSILON), FILI(ZETA), FLJ12SS4, FLJ2SS30, FLRT1(피브로넥틴), FOS, FOSLI(FRA- 1 ), FY(DARC), Flt-I, Flt-3, 폴레이트 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GDFS, GFil, GGTl, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPR2(CCR10), GPR31, GPR44, GPRS1(FKSGSO), GRCC10(C10), GRP, GSN(겔솔린(gelsolin)), GSTP1, HAVCR2, HDAC4, HDACS, HDAC7A, HDAC9, HGF, HIP1 히스타민 및 히스타민 수용체, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOX1, HUMCYT2A, HLA-DR, HMI 24, 인간 융모성 생식선 자극호르몬(HCG; human chorionic gonadotropin) 및 이의 서브단위, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자(HIF-1; hypoxia inducible factor-1), HSP70-2M, HST-2 또는 1a, IGF-IR, IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, IGBP1, IGF1, IGF1R, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, IL-1, IL-10, IL-10RA, IL-10RB, IL-11, IL-11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL-13RA1, IL-13RA2, IL-14, IL-1S, IL-1SRA, IL-16, IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17R, IL-18, IL-18BP, IL-18R1, IL-18RAP, IL-19, IL-IA, IL-1B, IL-1F10, IL-1FS, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1HY1, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAP, IL-1RAPL1, IL-1RAPL2, IL-1RL1, IL-1RL2 IL-1RN, IL-2, IL-20, IL-20RA, IL-21R, IL-22, IL-22R, IL-22RA2, IL-23, IL-24, IL-2S, IL-26, IL-27, IL-28A, IL-28B, IL-29, IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG, IL-3, IL-30, IL-3RA, IL-4, IL-4R, IL-S, IL-5RA, IL-6, IL-6R, IL-6ST(당단백질 130), IL-7, IL-7R, IL-S, IL-SRA, IL-SRB, IL-9, IL-9R, IL-K, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6(a6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4(b 4 인테그린), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-1), ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4 IFNAS, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNW1,, JAG1, JAK1, JAK3, JUN, K6HF, KAi1, KDR, KITLG, KLFS(GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK1S, KLK3, KLK4, KLKS, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19(케라틴 19), KRT2A, KRTHB6(모발-특이적 유형 II 케라틴), KC4-항원, KS-1-항원, KS 1-4, Le-Y, LDR/FUT, LAMAS, LEP(렙틴), Lingo-p7S, Lingo-Troy, LPS, LTA(TNF-b), LTB, LTB4R(GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG 또는 Omgp, MAP2K7(c-Jun), MDK, MIB1, 미드카인(midkine), MIF, MIP-2, MKI67(Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3(메탈로티오넥틴-III), MTSS1, MUC1(뮤신), MYC, MYD88, 대식세포 이동 저해 인자(MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ES0-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, NCK2, 뉴로칸(neurocan), NFKB1, NFKB2, NGFB(NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgR-Nogo66(Noga), NgRp7S, NgR-Troy, NME1(NM23A), NOXS, NPPB, NROB1, NROB2, NR1D1, NR1D2, NRIH2, NRIH3, NRIH4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NRSA1, NRSA2, NR6A1, NRP1, NRP2, NTSE, NTN4, ODZ1, OPRD1, PCSK9, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, PCA3, PCNA, PD-1, PD-L1, 알파4베타7, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDFS, CGRP, Lingo-I, 인자 IXa, 인자 X, ICOS, GARP, BTLA, CD160, RORI, 2B4, KIR, CD27, OX40, A2aR, PDGFA, PDGFB, PECAM1, PF4(CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸(phosphacan), PIAS2, PIK3CG, PLAU(uPA), PLG, PLXDC1, PPBP(CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2(COX-2), PTN, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 프로스타틱 산 포스파타제(prostatic acid phosphatase), PSA, PRAME, PSMA, 10 PIGF, ILGF, ILGF-IR, IL-6, RS5, RANTES, RAC2(p21Rac2), RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFl10(ZNF144), ROB02, S100A2, SCGB1D2(리포필린(lipophilin) B), SCGB2A1(맘마글로빈(mammaglobin) 2), SCGB2A2(맘마글로빈 1), SCYE1(내피 단핵구-활성화 사이토카인), SDF2, SERPINA1, SERPINA3, SERPINBS(마스핀(maspin)), SERPINE1(PAI-1), SERPINF1, SHBG, SLA2, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPP1, SPRR1B(Sprl), ST6GAL1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TIOI, SAGE, 5100, 서바이빈(survivin), 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신(tenascin), TRAIL 수용체, TNF-α, Tn-항원, 톰슨프라이덴리히(ThomsonFriedenreich) 항원, 종양 괴사 항원, TB4R2, TBX21, TCP10, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFBlil, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, THBS1(트롬보스폰딘(thrombospondin)-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE(Tie-1), TIMP3, 조직 인자, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLRS, TLR6, TLR7, TLRS, TLR9, TNF, TNF-a, TNFAIP2(B94), TNFAIP3, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSFS, TNFRSF6(Fas), TNFRSF7, TNFRSFS, TNFRSF9, TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(AP03L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF1S(VEGI), TNFSF18, TNFSF4(OX40 리간드), TNFSFS(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSFS(CD30 리간드), TNFSF9(4-lBB 리간드), TOLLIP, Toll-유사(Toll-like) 수용체, TOP2A(토포이소머라제(topoisomerase) Iia), TPS3, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAPS, TRAF6, TREM1, TREM2, TRPC6, TSLP, TWEAK, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-IA 항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, CS, 혈관신생 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, CD19/CD3, BCMA/CD3, EGFR, HER3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL1/ IL-8, IL-6, IL-6R/IL-21, IL-21R, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용기(acceptor) 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, VEGFB, VEGFC, 베르시칸(versican), VHL CS, VLA-4, c-FMS/CSFIR, RET, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린, MMPs VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 앤지오포이에틴(angiopoietin), ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 l/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-IR, IL 25 17A/F, EGF 수용체 l/CD3, 및 CD19/CD16, KHI, Tn-항원, TF-항원, CD44, 당지질, 당스핑고지질(glycosphingolipid), 예컨대 30 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알릴테트라오실레라마이드(sialyltetraosylceramide), XCL1(림포탁신(lymphotactin)), XCL2(SCM-1b), XCR1(GPRS/ CCXCR1), YY1, 및 ZFPM2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항원에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
26. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 CD137과 CD20, CD137과 EGFR, CD137과 Her-2, CD137과 PD-1, CD137과 PDL-1, VEGF와 PD-L1, Lag-3과 TIM-3, OX40과 PD-1, TIM-3과 PD-1, TIM-3과 PDL-1, EGFR과 DLL-4, CD138과 CD20, CDI 38과 CD40, CDI 9와 CD20, CD20과 CD3, CD3과 CD33, CD3과 CD133, CD47과 CD20, CD38과 CD138, CD38과 CD20, CD20과 CD22, CD38과 CD40, CD40과 CD20, CD-8과 IL-6, CSPGs와 RGM A, CTLA-4와 BTN02, IGF1과 IGF2, IGF1/2와 Erb2B, IGF-1R과 EGFR, EGFR과 CD13, IGF-1R과 ErbB3, EGFR-2과 IGFR, VEGFR-2와 Met, VEGF-A와 앤지오포이에틴-2(Ang-2), IL-12와 TWEAK, IL-13과 IL-1 베타, PDGFR과 VEGF, EpCAM과 CD3, Her2와 CD3, CD19와 CD3, EGFR과 Her3, CD16a와 CD30, CD30과 PSMA, EGFR과 CD3, CEA와 CD3, TROP-2와 HSG, TROP-2와 CD3, MAG와 RGM A, NgR과 RGM A, NogoA와 RGM A, OMGp와 RGM A, PDL-1과 CTLA-4, CTLA-4와 PD-1, PD-1과 TIM-3, RGMA와 RGM B, Te38과 TNFa, TNFa와 Blys, TNFa와 CD-22, TNFa와 CTLA-4 도메인, TNFa와 GP130, TNFa와 IL-12p40, 및 TNFa와 RANK 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
27. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 BMP1, BMP2, BMP3B(GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(G-CSF), EPO, FGF1(aFGF), FGF2(bFGF), FGF3(int-2), FGF4(HST), FGF5, FGF6(HST-2), FGF7(KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNG, IFNW1, FILI, FILI(EPSILON), FILI(ZETA), ILIA, ILIB, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILIO, ILi1, ILI2A, ILI2B, ILI3, ILI4, ILI5, ILI6, ILI7, ILI7B, ILI8, ILI9, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, FGER1, FGFR2, FGFR3, EGFR, RORI, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L, A2aR, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70, CD40, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA(TNF-b), LTB, TNF(TNF-a), TNFSF4(OX40 리간드), TNFSF5(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSF8(CD30 리간드), TNFSF9(4-1BB 리간드), TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(AP03L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF15(VEGI), TNFSF18, FIGF(VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, ILIR2, ILIRLI, ILIRL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL 7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL11RA, ILI2RB1, ILI2RB2, ILI3RA1, ILI3RA2, ILI5RA, ILI7R, ILI8R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRN, IL6ST, ILI8BP, ILI8RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP(렙틴), PTN, 및 THPO로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및/또는 사이토카인 수용체에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
28. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 CCLI(I-309), CCL2(MCP-1/MCAF), CCL3(MIP1a), CCL4(MIP-1b), CCL5(RANTES), CCL7(MCP-3), CCL8(mcp-2), CCLII(에오탁신), CCLI3(MCP-4), CCLI5(MIP-1 d), CCLI 6(HCC-4 ), CCLI 7(TARC), CCLI 8(PARC), CCLI9(MIP-3b), CCL20(MIP-3a), CCL21(SLC/ 엑소두스-2), CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF-1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL25(TECK), CCL26(에오탁신- 3), CCL27(CTACK/ILC), CCL28, CXCLI(GRO1), CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCL5(ENA-78), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCLIO(IP 10), CXCL11(I-TAC), CXCL12(SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4(CXCL4), PPBP(CXCL7), CX3CL1(SCYD1), SCYE1, XCL1(림포탁틴(lymphotactin)), XCL2(SCM-1b), BLR1(MDR15), CCBP2(D6/JAB61), CCR1(CKR1/ HM145), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6(CMKBR6/ CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EBI1), CCRS(CMKBR8/TER1/CKR-L1), CCR9(GPR-9-6), CCRL1(VSHK1), CCRL2(L-CCR), XCR1(GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CX3CR1(V28), CXCR4, GPR2(CCR10), GPR31, GPR81(FKSGSO), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, ILSRA(IL8Ra), ILSRB(IL8Rb), LTB4R(GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSFS, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10(C10), EPO, FY(DARC), GDF5, HIF1A, ILS, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 케모카인, 케모카인 수용체, 및 케모카인-관련 단백질에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
29. 구현예 1 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 결합할 수 있으며, 이중특이적 항원-결합 분자는 사이토카인의 쌍에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
30. 구현예 29에 있어서, 이중특이적 항원-결합 분자는 TSLP, IL-1a와 IL-Ιβ, IL-12와 IL-18, TNFa와 IL-23, TNFa와 IL-13, TNF와 IL-18, TNF와 IL-12, TNF와 IL-1베타, TNF와 MIF, TNF와 IL-6, TNF와 IL-6 수용체, TNF와 IL-17, IL-17과 IL-20, IL-17과 IL-23, TNF와 IL-15, TNF와 VEGF, VEGFR과 EGFR, PDGFR과 VEGF, IL-13과 IL-9, IL-13과 IL-4, IL-13과 IL-5, IL-13과 IL-25, IL-13과 TARC, IL-13과 MDC, IL-13과 MIF, IL-13과 TGF-β, IL-13과 LHR 작용제, IL-13과 CL25, IL-13과 SPRR2a, IL-13과 SPRR2b, IL-13과 ADAM 8, 및 TNFa와 PGE4, IL-13과 PED2, 및 TNF와 PEG2로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인의 쌍에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
31. 구현예 1 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 결합할 수 있으며, 이중특이적 항원-결합 분자는 각각의 에피토프에 대한 단일특이적 항체 또는 항체 단편에 비해 유사한 또는 더 큰 친화도로 각각의 에피토프에 결합하는, 항원-결합 분자.
32. 구현예 1 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 작용제 기능을 갖는, 항원-결합 분자.
33. 구현예 1 내지 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 모 항체에 비해 유사한 또는 더 낮은 IC50을 갖는 차단 기능을 가지며, 선택적으로 모 항체는 IgG 이소타입의 인간 항체인, 항원-결합 분자.
34. 구현예 1 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 단일 리간드에 대해 이중특이적이고, 모 항체 또는 항체들에 비해 더 높은 수준에서 1:1 리간드 복합체를 형성하는, 항원-결합 분자.
35. 항원-결합 분자로서,
제1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 Fab 도메인;
제1 에피토프와 별개인 제2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 Fab 도메인;
제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제2 중쇄 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 도메인;
제1 항원-결합 Fab 도메인의 중쇄의 N-말단 단부를 제1 중쇄 폴리펩타이드의 C-말단 단부에 연결하는 제1 링커; 및
제2 항원-결합 Fab 도메인의 중쇄의 N-말단 단부를 제2 중쇄 폴리펩타이드의 C-말단 단부에 연결하는 제2 링커를 포함하는, 항원-결합 분자.
36. 구현예 35에 있어서, 제1 중쇄 폴리펩타이드는
제1 CH 아미노산 서열;
제1 VH 아미노산 서열; 및
제2 CH 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 VH 아미노산 서열은 제1 CH 아미노산 서열과 제2 CH 아미노산 서열 사이에 존재하는, 항원-결합 분자.
37. 구현예 36에 있어서, 제1 CH 아미노산 서열은 제1 VH 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제1 CH3 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
38. 구현예 36에 있어서, 제1 CH3은 H435R 돌연변이 및 Y436F 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
39. 구현예 35 내지 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 중쇄 폴리펩타이드는
제3 CH 아미노산 서열;
제2 VH 아미노산 서열; 및
제4 CH 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 VH 아미노산 서열은 제3 CH 아미노산 서열과 제4 CH 아미노산 서열 사이에 존재하는, 항원-결합 분자.
40. 구현예 39에 있어서, 제1 CH 아미노산 서열은 제1 VH 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제1 CH3 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
41. 구현예 40에 있어서, 제1 CH3은 H435R 돌연변이 및 Y436F 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
42. 구현예 40 또는 구현예 41에 있어서, 제1 VH 아미노산 서열의 N-말단 단부를 제1 CH3 아미노산 서열의 C-말단 단부에 연결하는 제1 링커를 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
43. 구현예 35 내지 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 제3 CH 아미노산 서열은 제2 VH 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제2 CH3 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
44. 구현예 43에 있어서, 제2 VH 아미노산 서열의 N-말단 단부를 제2 CH3 아미노산 서열의 C-말단 단부에 연결하는 제2 링커를 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
45. 구현예 35 내지 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 CH 아미노산 서열은 제1 VH 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치하는 제1 CH1 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
46. 구현예 35 내지 45 중 어느 한 구현예에 있어서, 제4 CH 아미노산 서열은 제2 VH 아미노산 서열에 대해 C-말단에 위치하는 제2 CH1 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
47. 구현예 35 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 CH3 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제1 CH2 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
48. 구현예 35 내지 47 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 CH3 아미노산 서열에 대해 N-말단에 위치하는 제2 CH2 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
49. 구현예 35 내지 48 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 힌지 영역 이황화 결합을 포함하지 않는, 항원-결합 분자.
50. 구현예 35 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 경쇄 폴리펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 제1 경쇄 폴리펩타이드는 제1 VL 아미노산 서열; 및 제1 CL 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
51. 구현예 50에 있어서, 제1 CL을 제1 CH1에 연결하는 이황화 결합을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
52. 구현예 35 내지 51 중 어느 한 구현예에 있어서, 제2 경쇄 폴리펩타이드를 추가로 포함하고, 상기 제2 경쇄 폴리펩타이드는 제2 VL 아미노산 서열; 및 제2 CL 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
53. 구현예 521에 있어서, 제2 CL을 제2 CH1에 연결하는 이황화 결합을 추가로 포함하는, 항원-결합 분자.
54. 구현예 44 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 폴리펩타이드를 포함하는, 항원-결합 분자.
55. 구현예 54에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 0 내지 50개 아미노산의 길이를 갖는 것인, 항원-결합 분자.
56. 구현예 54 내지 55 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원-결합 분자.
57. 구현예 54 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 링커 및 제2 링커는 각각 폴리 글리신 및 세린 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
58. 구현예 57에 있어서, 폴리 글리신 및 세린 아미노산 서열은 2개 내지 6개 반복된 GGGGS(SEQ ID NO:3) 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
59. 구현예 58에 있어서, 폴리 글리신 및 세린 아미노산 서열은 (G4S)2(SEQ ID NO:18), (G4S)3(SEQ ID NO:4), 또는 (G4S)4(SEQ ID NO:19)를 포함하는, 항원-결합 분자.
60. 구현예 52 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 경쇄 폴리펩타이드 및 제2 경쇄 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
61. 구현예 35 내지 60 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제2 중쇄 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
62. 구현예 35 내지 60 중 어느 한 구현예에 있어서, 제1 중쇄 폴리펩타이드 및 제2 중쇄 폴리펩타이드는 동일하지 않은 아미노산 서열을 갖는, 항원-결합 분자.
63. 구현예 35 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 ABCF1, ACVR1, ACVR1B, ACVR2, ACVR2B, ACVRLI, ADORA2A, 아그레칸(aggrecan), AGR2, AICDA, AIF1, AIG1, AKAP1, AKAP2, AMH, AMHR2, ANGPT1, ANGPT2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANPEP, APC, APOC1, AR, AZGP1(아연-a-당단백질), ART-4, B7, B7.1, B7.2, BAD, BAFF, BAGI, BAIi, BCL2, BCL6, BDNF, BLNK, BLRl (MDRlS), BlyS, BMPl, BMP2, BMP3B (GDF10), BMP4, BMP6, BMPS, BMPR1A, BMPR1B, BMPR2, BPAG1(플렉틴), BRCA1, Ba-733, BAGE, BrE3- 항원, CA125, CAMEL, CAP-I, CASP-8/m, CCCL19, CCCL21, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CDS, CD8, CDI-IA, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74, CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CDC27, CDK-4/m, CDKN2A, CXCR4, CXCR7, CXCL12, C19orf10(IL27w), C3, C4A, CS, CSR1, CANT1, CASPI, CASP4, CAV1, CCBP2(D6/JAB61), CCLI(I-309), CCLII(에오탁신), CCL13(MCP-4), CCLIS(MIP-1d), CCL16(HCC- 4), CCL17(TARC), CCLIS(PARC), CCL19(MIP-3b), CCL2(MCP-1), MCAF, CCL20(MIP-3a), CCL21(MIP- 2), SLC, 엑소두스-2, CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF- 1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL2S(TECK), CCL26(에오탁신-3), CCL27(CTACK/ILC), CCL2S, CCL3(MIP1a), CCL4(MIP-1b), CCLS(RANTES), CCL7(MCP-3), CCLS(mcp-2), CCNA1, CCNA2, CCND1, CCNE1, CCNE2, CCR1(CKR1/HM14S), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCRS(CMKBRSI ChemR13), CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EB1), CCRS(CMKBRS/TER1/CKR-LI), CCR9(GPR-9-6), CCRLI(VSHK1), CCRL2(L-CCR), CD164, CDlC, CD200, CD-22, CD24, CD2S, CD3S, CD3E, CD3G, CD3Z, CD4, CD44, CD4SRB, CD47, CD4S, CDS2, CD69, CD72, CD79A, CD79B, CDSO, CDS1, CDS3, CDS6, CD137, CD13S, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CDH1(E-캐드헤린), CDH10, CDH12, CDH13, CDHlS, CDH19, CDH20, CDHS, CDH7, CDHS, CDH9, CDK2, CDK3, CDK4, CDKS, CDK6, CDK7, CDK9, CDKN1A(p21 Wap1/Cip1), CDKN1B(p27Kip1), CDKN1C, CDKN2A(p16INK4a), CDKN2B, CDKN2C, CDKN3, CEBPB, CER1, CHGA, CHGB, 키티나제, CHST1O, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSFS, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSFS, CLDN3, CLDN7(클라우딘-7), CLN3, CLU(클러스테린), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CNR1, COLISA1, COLIA1, COL4A3, COL6Al, CR2, CRP, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(GCSF), CTLA-4, CTNNB1(b-카테닌), CTSB(카텝신 B), CX3CLI(SCYD1), CX3CR1(V2S), CXCLI(GRO1), CXCLIO(IP-10), CXCL11(I-TAC/IP-9), CXCL13, CXCL14, CXCL16, CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCLS(ENA-7S/LIX), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/ STRL33/Bonzo), CYBS, CYC1, CYSLTR1, HIF-1-a, 결장-특이적 항원-p(CSAp), CEA(CEACAM5), CEACAM6, c-met, DAB2IP, DES, DKFZp4S1J011S, DNCLI, DPP4, DAM, EGFR, EGFRvlll, EGP-1, EGP-2, ELF2-M, Ep-CAM, E2F1, ECGF1, EDG1, EFNA1, EFNA3, EFNB2, EGF, EGFR, ELAC2, ENG, EN01, EN02, EN03, EPHB4, EPO, EREG, ERKS, ESR1, ESR2, F3(TF), FADD, FasL, FASN, FCER1A, FCER2, FCGR3A, FGF, FGF1(aFGF), FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF13, FGF14, FGF16, FGF17, FGF1S, FGF19, FGF2(bFGF), FGF20, FGF21, FGF22, FGF23, FGF3(int-2), FGF4(HST), FGFS, FGF7(KGF), FGFS, FGF9, FGFR3, FIGF(VEGFD), FILI(EPSILON), FILI(ZETA), FLJ12SS4, FLJ2SS30, FLRT1(피브로넥틴), FOS, FOSLI(FRA- 1 ), FY(DARC), Flt-I, Flt-3, 폴레이트 수용체, G250 항원, GAGE, GROB, GABRP (GABAa), GAGEB1, GAGEC1, GALNAC4S-6ST, GATA3, GDFS, GFil, GGTl, GM-CSF, GNAS1, GNRH1, GPR2(CCR10), GPR31, GPR44, GPRS1(FKSGSO), GRCC10(C10), GRP, GSN(겔솔린), GSTP1, HAVCR2, HDAC4, HDACS, HDAC7A, HDAC9, HGF, HIP1 히스타민 및 히스타민 수용체, HLA-A, HLA-DRA, HM74, HMOX1, HUMCYT2A, HLA-DR, HMI 24, 인간 융모성 생식선 자극호르몬(HCG) 및 이의 서브단위, HER2/neu, HMGB-1, 저산소증 유도 인자(HIF-1), HSP70-2M, HST-2 또는 1a, IGF-IR, IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, IGBP1, IGF1, IGF1R, IGF2, IGFBP2, IGFBP3, IGFBP6, IL-1, IL-10, IL-10RA, IL-10RB, IL-11, IL-11RA, IL-12, IL-12A, IL-12B, IL-12RB1, IL-12RB2, IL-13, IL-13RA1, IL-13RA2, IL-14, IL-1S, IL-1SRA, IL-16, IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17R, IL-18, IL-18BP, IL-18R1, IL-18RAP, IL-19, IL-IA, IL-1B, IL-1F10, IL-1FS, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1HY1, IL-1R1, IL-1R2, IL-1RAP, IL-1RAPL1, IL-1RAPL2, IL-1RL1, IL-1RL2 IL-1RN, IL-2, IL-20, IL-20RA, IL-21R, IL-22, IL-22R, IL-22RA2, IL-23, IL-24, IL-2S, IL-26, IL-27, IL-28A, IL-28B, IL-29, IL-2RA, IL-2RB, IL-2RG, IL-3, IL-30, IL-3RA, IL-4, IL-4R, IL-S, IL-5RA, IL-6, IL-6R, IL-6ST(당단백질 130), IL-7, IL-7R, IL-S, IL-SRA, IL-SRB, IL-9, IL-9R, IL-K, INHA, INHBA, INSL3, INSL4, IRAK1, IRAK2, ITGA1, ITGA2, ITGA3, ITGA6(a6 인테그린), ITGAV, ITGB3, ITGB4(b 4 인테그린), 인슐린-유사 성장 인자-I(IGF-1), ICEBERG, ICOSL, ID2, IFN-a, IFNA1, IFNA2, IFNA4 IFNAS, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNW1,, JAG1, JAK1, JAK3, JUN, K6HF, KAi1, KDR, KITLG, KLFS(GC Box BP), KLF6, KLK10, KLK12, KLK13, KLK14, KLK1S, KLK3, KLK4, KLKS, KLK6, KLK9, KRT1, KRT19(케라틴 19), KRT2A, KRTHB6(모발-특이적 유형 II 케라틴), KC4-항원, KS-1-항원, KS 1-4, Le-Y, LDR/FUT, LAMAS, LEP(렙틴), Lingo-p7S, Lingo-Troy, LPS, LTA(TNF-b), LTB, LTB4R(GPR16), LTB4R2, LTBR, MACMARCKS, MAG 또는 Omgp, MAP2K7(c-Jun), MDK, MIB1, 미드카인, MIF, MIP-2, MKI67(Ki-67), MMP2, MMP9, MS4A1, MSMB, MT3(메탈로티오넥틴-III), MTSS1, MUC1(뮤신), MYC, MYD88, 대식세포 이동 저해 인자(MIF), MAGE, MAGE-3, MART-1, MART-2, NY-ES0-1, TRAG-3, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUM-1/2, MUM-3, NCA66, NCA95, NCA90, NCK2, 뉴로칸, NFKB1, NFKB2, NGFB(NGF), NGFR, NgR-Lingo, NgR-Nogo66(Noga), NgRp7S, NgR-Troy, NME1(NM23A), NOXS, NPPB, NROB1, NROB2, NR1D1, NR1D2, NRIH2, NRIH3, NRIH4, NR1I2, NR1I3, NR2C1, NR2C2, NR2E1, NR2E3, NR2F1, NR2F2, NR2F6, NR3C1, NR3C2, NR4A1, NR4A2, NR4A3, NRSA1, NRSA2, NR6A1, NRP1, NRP2, NTSE, NTN4, ODZ1, OPRD1, PCSK9, P2RX7, PAP, PART1, PATE, PAWR, PCA3, PCNA, PD-1, PD-L1, 알파4베타7, OX40, GITR, TIM-3, Lag-3, B7-H3, B7-H4, GDFS, CGRP, Lingo-I, 인자 IXa, 인자 X, ICOS, GARP, BTLA, CD160, RORI, 2B4, KIR, CD27, OX40, A2aR, PDGFA, PDGFB, PECAM1, PF4(CXCL4), PGF, PGR, 포스파칸, PIAS2, PIK3CG, PLAU(uPA), PLG, PLXDC1, PPBP(CXCL7), PPID, PR1, PRKCQ, PRKD1, PRL, PROC, PROK2, PSAP, PSCA, PTAFR, PTEN, PTGS2(COX-2), PTN, 췌장암 뮤신, 태반 성장 인자, p53, PLAGL2, 프로스타틱 산 포스파타제, PSA, PRAME, PSMA, 10 PIGF, ILGF, ILGF-IR, IL-6, RS5, RANTES, RAC2(p21Rac2), RARB, RGS1, RGS13, RGS3, RNFl10(ZNF144), ROB02, S100A2, SCGB1D2(리포필린 B), SCGB2A1(맘마글로빈 2), SCGB2A2(맘마글로빈 1), SCYE1(내피 단핵구-활성화 사이토카인), SDF2, SERPINA1, SERPINA3, SERPINBS(마스핀), SERPINE1(PAI-1), SERPINF1, SHBG, SLA2, SLC2A2, SLC33A1, SLC43A1, SLIT2, SPP1, SPRR1B(Sprl), ST6GAL1, STAB1, STATE, STEAP, STEAP2, TIOI, SAGE, 5100, 서바이빈, 서바이빈-2B, TAC, TAG-72, 테나신, TRAIL 수용체, TNF-α, Tn-항원, 톰슨프라이덴리히 항원, 종양 괴사 항원, TB4R2, TBX21, TCP10, TDGF1, TEK, TGFA, TGFB1, TGFBlil, TGFB2, TGFB3, TGFBI, TGFBR1, TGFBR2, TGFBR3, TH1L, THBS1(트롬보스폰딘-1), THBS2, THBS4, THPO, TIE(Tie-1), TIMP3, 조직 인자, TLR10, TLR2, TLR3, TLR4, TLRS, TLR6, TLR7, TLRS, TLR9, TNF, TNF-a, TNFAIP2(B94), TNFAIP3, TNFRSF11A, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF21, TNFRSFS, TNFRSF6(Fas), TNFRSF7, TNFRSFS, TNFRSF9, TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(AP03L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF1S(VEGI), TNFSF18, TNFSF4(OX40 리간드), TNFSFS(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSFS(CD30 리간드), TNFSF9(4-lBB 리간드), TOLLIP, Toll-유사 수용체, TOP2A(토포이소머라제 Iia), TPS3, TPM1, TPM2, TRADD, TRAF1, TRAF2, TRAF3, TRAF4, TRAPS, TRAF6, TREM1, TREM2, TRPC6, TSLP, TWEAK, VEGFR, ED-B 피브로넥틴, WT-1, 17-IA 항원, 보체 인자 C3, C3a, C3b, C5a, CS, 혈관신생 마커, bcl-2, bcl-6, Kras, cMET, CD19/CD3, BCMA/CD3, EGFR, HER3, IL17RA/IL7R, IL-6/IL-23, IL1/ IL-8, IL-6, IL-6R/IL-21, IL-21R, ANG2/VEGF, VEGF/PDGFR-베타, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용기 2/CD3, PSMA/CD3, EPCAM/CD3, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, VEGFB, VEGFC, 베르시칸, VHL CS, VLA-4, c-FMS/CSFIR, RET, HER3, HER4, IGFR, PDGFR, c-KIT, BCR, 인테그린, MMPs VEGF, EGF, PIGF, PDGF, HGF, 앤지오포이에틴, ERBB-3/C-MET, ERBB-2/C-MET, EGF 수용체 l/CD3, EGFR/HER3, PSCA/CD3, C-MET/CD3, ENDOSIALIN/CD3, EPCAM/CD3, IGF-1R/CD3, FAPALPHA/CD3, EGFR/IGF-IR, IL 25 17A/F, EGF 수용체 l/CD3, 및 CD19/CD16, KHI, Tn-항원, TF-항원, CD44, 당지질, 당스핑고지질, 예컨대 30 Gg3, Gb3, GD3, GD2, Gb5, Gm1, Gm2, 시알릴테트라오실레라마이드, XCL1(림포탁신), XCL2(SCM-1b), XCR1(GPRS/ CCXCR1), YY1, 및 ZFPM2로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 항원에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
64. 구현예 35 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 CD137과 CD20, CD137과 EGFR, CD137과 Her-2, CD137과 PD-1, CD137과 PDL-1, VEGF와 PD-L1, Lag-3과 TIM-3, OX40과 PD-1, TIM-3과 PD-1, TIM-3과 PDL-1, EGFR과 DLL-4, CD138과 CD20, CDI 38과 CD40, CDI 9와 CD20, CD20과 CD3, CD3과 CD33, CD3과 CD133, CD47과 CD20, CD38과 CD138, CD38과 CD20, CD20과 CD22, CD38과 CD40, CD40과 CD20, CD-8과 IL-6, CSPGs와 RGM A, CTLA-4와 BTN02, IGF1과 IGF2, IGF1/2와 Erb2B, IGF-1R과 EGFR, EGFR과 CD13, IGF-1R과 ErbB3, EGFR-2과 IGFR, VEGFR-2와 Met, VEGF-A와 앤지오포이에틴-2(Ang-2), IL-12와 TWEAK, IL-13과 IL-1 베타, PDGFR과 VEGF, EpCAM과 CD3, Her2와 CD3, CD19와 CD3, EGFR과 Her3, CD16a와 CD30, CD30과 PSMA, EGFR과 CD3, CEA와 CD3, TROP-2와 HSG, TROP-2와 CD3, MAG와 RGM A, NgR과 RGM A, NogoA와 RGM A, OMGp와 RGM A, PDL-1과 CTLA-4, CTLA-4와 PD-1, PD-1과 TIM-3, RGMA와 RGM B, Te38과 TNFa, TNFa와 Blys, TNFa와 CD-22, TNFa와 CTLA-4 도메인, TNFa와 GP130, TNFa와 IL-12p40, 및 TNFa와 RANK 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 항원의 쌍에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
65. 구현예 35 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 BMP1, BMP2, BMP3B(GDF10), BMP4, BMP6, BMP8, CSF1(M-CSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(G-CSF), EPO, FGF1(aFGF), FGF2(bFGF), FGF3(int-2), FGF4(HST), FGF5, FGF6(HST-2), FGF7(KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNB1, IFNG, IFNW1, FILI, FILI(EPSILON), FILI(ZETA), ILIA, ILIB, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, ILIO, ILi1, ILI2A, ILI2B, ILI3, ILI4, ILI5, ILI6, ILI7, ILI7B, ILI8, ILI9, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, FGER1, FGFR2, FGFR3, EGFR, RORI, 2B4, KIR, CD137, CD27, OX40, CD40L, A2aR, CD48, B7-1, B7-2, ICOSL, B7-H3, B7-H4, CD137L, OX40L, CD70, CD40, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, LTA(TNF-b), LTB, TNF(TNF-a), TNFSF4(OX40 리간드), TNFSF5(CD40 리간드), TNFSF6(FasL), TNFSF7(CD27 리간드), TNFSF8(CD30 리간드), TNFSF9(4-1BB 리간드), TNFSF10(TRAIL), TNFSF11(TRANCE), TNFSF12(AP03L), TNFSF13(April), TNFSF13B, TNFSF14(HVEM-L), TNFSF15(VEGI), TNFSF18, FIGF(VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, ILIR1, ILIR2, ILIRLI, ILIRL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL 7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, ILIORA, ILIORB, IL11RA, ILI2RB1, ILI2RB2, ILI3RA1, ILI3RA2, ILI5RA, ILI7R, ILI8R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, ILIRAP, ILIRAPLI, ILIRAPL2, ILIRN, IL6ST, ILI8BP, ILI8RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP(렙틴), PTN, 및 THPO로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개의 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및/또는 사이토카인 수용체에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
66. 구현예 35 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 CCLI(I-309), CCL2(MCP-1/MCAF), CCL3(MIP1a), CCL4(MIP-1b), CCL5(RANTES), CCL7(MCP-3), CCL8(mcp-2), CCLII(에오탁신), CCLI3(MCP-4), CCLI5(MIP-1 d), CCLI 6(HCC-4 ), CCLI 7(TARC), CCLI 8(PARC), CCLI9(MIP-3b), CCL20(MIP-3a), CCL21(SLC/ 엑소두스-2), CCL22(MDC/STC-1), CCL23(MPIF-1), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2), CCL25(TECK), CCL26(에오탁신- 3), CCL27(CTACK/ILC), CCL28, CXCLI(GRO1), CXCL2(GR02), CXCL3(GR03), CXCL5(ENA-78), CXCL6(GCP-2), CXCL9(MIG), CXCLIO(IP 10), CXCL11(I-TAC), CXCL12(SDF1), CXCL13, CXCL14, CXCL16, PF4(CXCL4), PPBP(CXCL7), CX3CL1(SCYD1), SCYE1, XCL1(림포탁틴(lymphotactin)), XCL2(SCM-1b), BLR1(MDR15), CCBP2(D6/JAB61), CCR1(CKR1/ HM145), CCR2(mcp-1RB/RA), CCR3(CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5(CMKBR5/ChemR13), CCR6(CMKBR6/ CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7(CKR7/EBI1), CCRS(CMKBR8/TER1/CKR-L1), CCR9(GPR-9-6), CCRL1(VSHK1), CCRL2(L-CCR), XCR1(GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1(RDC1), CX3CR1(V28), CXCR4, GPR2(CCR10), GPR31, GPR81(FKSGSO), CXCR3(GPR9/CKR-L2), CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, ILSRA(IL8Ra), ILSRB(IL8Rb), LTB4R(GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSFS, BDNF, C5R1, CSF3, GRCC10(C10), EPO, FY(DARC), GDF5, HIF1A, ILS, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 케모카인, 케모카인 수용체, 및 케모카인-관련 단백질에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
67. 구현예 35 내지 61 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 결합할 수 있으며, 항원-결합 분자는 사이토카인의 쌍에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
68. 구현예 67에 있어서, 항원-결합 분자는 TSLP, IL-1a와 IL-Ιβ, IL-12와 IL-18, TNFa와 IL-23, TNFa와 IL-13, TNF와 IL-18, TNF와 IL-12, TNF와 IL-1베타, TNF와 MIF, TNF와 IL-6, TNF와 IL-6 수용체, TNF와 IL-17, IL-17과 IL-20, IL-17과 IL-23, TNF와 IL-15, TNF와 VEGF, VEGFR과 EGFR, PDGFR과 VEGF, IL-13과 IL-9, IL-13과 IL-4, IL-13과 IL-5, IL-13과 IL-25, IL-13과 TARC, IL-13과 MDC, IL-13과 MIF, IL-13과 TGF-β, IL-13과 LHR 작용제, IL-13과 CL25, IL-13과 SPRR2a, IL-13과 SPRR2b, IL-13과 ADAM 8, 및 TNFa와 PGE4, IL-13과 PED2, 및 TNF와 PEG2로 이루어진 군으로부터 선택되는 사이토카인의 쌍에 결합할 수 있는, 항원-결합 분자.
69. 구현예 35 내지 68 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 결합할 수 있으며, 항원-결합 분자는 각각의 에피토프에 대한 단일특이적 항체 또는 항체 단편에 비해 유사한 또는 더 큰 친화도로 각각의 에피토프에 결합하는, 항원-결합 분자.
70. 구현예 35 내지 69 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 작용제 기능을 갖는, 항원-결합 분자.
71. 구현예 35 내지 70 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 모 항체에 비해 유사한 또는 더 낮은 IC50을 갖는 차단 기능을 가지며, 선택적으로 모 항체는 IgG 이소타입의 인간 항체인, 항원-결합 분자.
72. 구현예 35 내지 71 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 단일 리간드에 대해 이중특이적이고, 모 항체 또는 항체들에 비해 더 높은 수준에서 1:1 리간드 복합체를 형성하는, 항원-결합 분자.
73. 구현예 35 내지 72 중 어느 한 구현예에 있어서, 항원-결합 분자는 면역부착소(immunoadhesin) 분자, 조영제, 치료제, 및 세포독성제로 이루어진 군으로부터 선택되는 제제에 접합되는, 항원-결합 분자.
74. 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예의 항원-결합 분자, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
75. 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예의 항원-결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자.
76. 구현예 74에 있어서, 핵산 분자는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되는, 핵산 분자.
77. 구현예 75 또는 76의 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
78. 구현예 75 또는 76의 핵산 분자 또는 구현예 77의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
79. 구현예 78에 있어서, 세포는 진핵 세포인, 숙주 세포.
80. 구현예 78 또는 79에 있어서, 세포는 동물 세포인, 숙주 세포.
81. 구현예 78 내지 79 중 어느 한 구현예에 있어서, 세포는 포유류 세포, 선택적으로 CHO 세포인, 숙주 세포.
82. 구현예 63에서 언급된 임의의 하나 이상의 항원과 관련된 병태를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예의 항원-결합 분자를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
83. 대상체에서 분자 경로를 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예의 항원-결합 분자를 상기 대상체에게 투여하여 상기 분자 경로를 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
84. 대상체에서 분자 경로를 활성화시키는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예의 항원-결합 분자를 상기 대상체에게 투여하여 상기 분자 경로를 활성화시키는 단계를 포함하는, 방법.
85. 구현예 63에서 언급된 임의의 하나 이상의 항원과 관련된 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 구현예 1 내지 73 중 어느 한 구현예의 항원-결합 분자의 용도.
9. 참조문헌의 인용
본 출원에서 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 다른 문헌은, 각각의 개별 공보, 특허, 특허 출원 또는 다른 문헌이 모든 목적을 위해 참조로서 개별적으로 포함되는 것으로 지시된 것과 동일한 정도까지 모든 목적을 위해 그 전문이 참조로서 본원에 포함된다. 본원에 포함된 하나 이상의 참조문헌의 교시와 본 개시내용 사이에 불일치가 존재하는 경우에, 본 명세서의 교시가 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
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210 215 220
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
Claims (61)
- 항원-결합 분자로서, 제1 표적 분자에 결합하고,
(a) 제1 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
(i) 제1 Fc 도메인; 및
(ii) 제1 경쇄 가변 영역(VL)과 회합된 제1 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하는 제1 Fab 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및
(b) 제2 폴리펩타이드로서, N-으로부터-C 말단 배향으로
(i) 제2 Fc 도메인; 및
(ii) 제2 VL과 회합된 제2 VH를 포함하는 제2 Fab 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드
를 포함하며, 상기 제1 Fc 도메인 및 제2 Fc 도메인은 서로 회합되어 Fc 영역을 형성하는, 항원-결합 분자. - 제1항에 있어서, 제1 Fc 도메인과 제1 VH 사이에 제1 링커를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제2항에 있어서, 제1 링커는 5개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이, 10개 아미노산 내지 60개 아미노산 잔기 길이, 5개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이, 5개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이, 10개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이, 10개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이, 20개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이, 또는 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
- 제2항 또는 제3항에 있어서, 제1 링커는 GnS 또는 SGn의 다량체를 포함하며, 선택적으로 n은 1 내지 7의 정수인, 항원-결합 분자.
- 제4항에 있어서, 제1 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 다량체를 포함하며, 선택적으로 제1 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 2개 내지 6개의 반복(repeat)을 포함하고, 선택적으로 제1 링커는 (G4S)2(SEQ ID NO:18), (G4S)3(SEQ ID NO:4), 또는 (G4S)4(SEQ ID NO:19)를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 Fc 도메인과 제2 VH 사이에 제2 링커를 포함하고, 선택적으로 제1 링커 및 제2 링커는 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인, 항원-결합 분자.
- 제6항에 있어서, 제2 링커는 5개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이, 10개 아미노산 내지 60개 아미노산 길이, 5개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이, 5개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이, 10개 아미노산 내지 30개 아미노산 잔기 길이, 10개 아미노산 내지 20개 아미노산 잔기 길이, 20개 아미노산 내지 50개 아미노산 길이, 또는 25개 아미노산 내지 35개 아미노산 길이인, 항원-결합 분자.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 제2 링커는 GnS 또는 SGn의 다량체를 포함하며, 선택적으로 n은 1 내지 7의 정수인, 항원-결합 분자.
- 제8항에 있어서, 제2 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 다량체를 포함하며, 선택적으로 제2 링커는 G4S(SEQ ID NO:3)의 2개 내지 6개의 반복을 포함하고, 선택적으로 제2 링커는 (G4S)2(SEQ ID NO:18), (G4S)3(SEQ ID NO:4), 또는 (G4S)4(SEQ ID NO:19)를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 도메인에 대해 N-말단에 제1 힌지(hinge) 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제2 Fc 도메인에 대해 N-말단에 제2 힌지 도메인을 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제10항에 있어서, 제1 힌지 도메인과 제2 힌지 도메인은 이황화 결합을 통해 연결되는, 항원-결합 분자.
- 제10항에 있어서, 제1 힌지 도메인과 제2 힌지 도메인은 이황화 결합을 통해 연결되지 않는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 도메인에 대해 N-말단에 VH를 포함하지 않고/거나 제2 폴리펩타이드는 제2 Fc 도메인에 대해 N-말단에 VH를 포함하지 않는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 힌지 영역을 갖는, 항원-결합 분자.
- 제14항에 있어서, 도 13a 또는 도 13c에 예시된 힌지 형식을 갖는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 힌지 영역을 갖는, 항원-결합 분자.
- 제16항에 있어서, 도 13b에 예시된 힌지 형식을 갖는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 것인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 동일하지 않은 것인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 VL 및 제2 VL은 유니버셜(universal) 경쇄이거나, 제1 Fab 도메인 또는 제2 Fab 도메인의 경쇄 불변 영역 및 제1 중쇄 불변 영역(CH1)은 Crossmab 배열로 존재하는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인은 단일 사슬 Fab의 형태로 존재하지 않는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인을 포함하는 네이티브(native) 면역글로불린보다 더 큰 친화도 및/또는 결합력(avidity)으로 제1 표적 분자에 결합하는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 2가(bivalent)인 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자의 길항제인 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 분자가 결합 파트너에의 제1 표적 분자의 결합을 저해하며, 선택적으로 상기 결합 파트너는 제1 표적 분자의 수용체인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 인간 Fc 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 인간 IgG1 또는 인간 IgG4 Fc 서열을 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 영역은 Fc 헤테로이량체를 포함하며, 선택적으로 Fc 헤테로이량체 내 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인과 비교하여 노브-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제28항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 노브(knob) 돌연변이를 포함하고, 제2 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 홀(hole) 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제28항에 있어서, 제2 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 노브 돌연변이를 포함하고, 제1 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 홀 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제26항에 있어서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역과 비교하여 스타(star) 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제26항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 H435R 돌연변이 및 Y436F 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제26항에 있어서, 제2 폴리펩타이드 내 Fc 도메인은 H435R 돌연변이 및 Y436F 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 도메인 내 CL 및 CH1은 이황화 결합에 의해 연결되고/거나 제2 Fab 도메인 내 CL 및 CH1은 이황화 결합에 의해 연결되는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 도메인 및 제2 Fab 도메인은 제1 표적 분자에 결합되는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 작은 가용성 리간드이며, 선택적으로 상기 제1 표적 분자는 사이토카인 또는 케모카인인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 세포 표면 단백질이며, 선택적으로 상기 제1 표적 분자는 종양 관련 항원인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 (i) 번역후 변형을 배제하여 100 kDa 미만, 번역후 변형을 포함하여 100 kDa 미만, 번역후 변형을 배제하여 75 kDa 미만, 번역후 변형을 포함하여 75 kDa 미만, 번역후 변형을 배제하여 60 kDa 미만, 번역후 변형을 포함하여 60 kDa 미만, 번역후 변형을 배제하여 45 kDa 미만, 또는 번역후 변형을 포함하여 45 kDa 미만의 분자량을 갖고/거나, (ii) 번역후 변형을 배제하여 적어도 5 kDa, 번역후 변형을 포함하여 적어도 5 kDa, 번역후 변형을 배제하여 적어도 10 kDa, 또는 번역후 변형을 포함하여 적어도 10 kDa의 분자량을 갖는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 글리코실화되는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 글리코실화되지 않는, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 단량체인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 이량체이며, 상기 이량체는 선택적으로 호모이량체(homodimer) 또는 헤테로이량체(heterodimer)인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 삼량체이며, 상기 삼량체는 선택적으로 호모삼량체(homotrimer)인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 분자는 사량체이며, 상기 사량체는 선택적으로 호모사량체(homotetramer)인, 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적인 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적인 항원-결합 분자.
- 제46항에 있어서, 제1 표적 분자 상의 제1 에피토프 및 제2 에피토프에 결합할 수 있으며, 선택적으로 제1 표적 분자 상의 제1 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인 및 제2 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함하고, 선택적으로 제1 표적 분자 상의 상이한 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항원-결합 분자.
- 제46항에 있어서, 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 결합할 수 있는 항원-결합 분자.
- 제48항에 있어서, 제1 표적 분자에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인 및 제2 표적 분자에 결합하는 적어도 하나의 Fab 도메인을 포함하며, 선택적으로 제1 표적 분자 및 제2 표적 분자에 동시에 결합할 수 있는 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 및 제2 Fab를 포함하는 인간 IgG 항체에 비해 더 낮은 IC50에서, 표적 분자의 수용체에의 상기 표적 분자의 결합을 차단하는 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fab 및 제2 Fab를 포함하는 인간 IgG 항체보다 더 큰 친화도로 표적 분자에 결합하는 항원-결합 분자.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자 및 세포독성제(cytotoxic agent) 또는 세포증식억제제(cytostatic agent)를 포함하는 접합체(conjugate).
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자 또는 제52항에 따른 접합체 및 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
- 표적 분자의 비정상적인(aberrant) 발현 또는 활성과 관련된 병태를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 제52항의 접합체, 또는 제53항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 대상체에서 표적 분자와 관련된 분자 경로를 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 유효량의 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자, 제52항의 접합체, 또는 제53항의 약학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
- 표적 분자의 비정상적인 발현 또는 활성과 관련된 병태의 치료 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 항원-결합 분자, 제52항에 따른 접합체, 또는 제53항에 따른 약학적 조성물.
- 표적 분자와 관련된 분자 경로를 저해하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 항원-결합 분자, 제52항에 따른 접합체, 또는 제53항에 따른 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 복수의 핵산 분자들로서, 선택적으로 상기 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열은 각각 발현 제어 서열에 작동적으로 연결되는, 핵산 분자 또는 복수의 핵산 분자들.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자를 발현하도록 조작된 세포.
- 하나 이상의 프로모터의 제어 하에 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 발현 벡터로 형질주입된 세포.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 따른 항원-결합 분자를 생성하는 방법으로서,
(a) 항원-결합 분자가 발현되는 조건 하에 제59항 또는 제60항의 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 항원-결합 분자를 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하고; 선택적으로 상기 항원-결합 분자를 농화시키고/거나 항원-결합 분자를 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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