JP5713006B2 - チオスルホナート化合物、タンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤並びに可溶化方法 - Google Patents
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Description
しかし、TAPS−sulfonate(図3参照)は1価のカチオン化試薬であり、1ヶ所のCys残基に1つのカチオンしか導入できないため、図2に示すSolubility Index(SI)の点から、より多くのタンパク質の溶解性を充分なものとし得ない場合もあった。
また、特許文献1〜2等に記載のPEI誘導体は、多数のカチオンを導入できることから、疎水性の高い(難溶性)タンパク質のカチオン化に有用と考えられている。しかし、PEI−SPDP等の試薬は、多価の正電荷を導入するのに非常に有用であるが、高分子化合物の誘導体であるために、分子量・構造(分岐度)が均一でなく、カチオン化後のタンパク質の電荷分布がヘテロになる、立体障害により完全にカチオン化することができず微量のSH基が残存する、等の問題があった。また、定量的なカチオン化が困難であることに加えて、凍結乾燥した際に凝縮傾向があるという問題もあった。
(1)疎水性のタンパク質の可溶化が容易になり、より広範な変性状態のタンパク質にも高い溶解性を付与することができる。
(2)本発明の新規化合物は、構造上、一分子あたりのカチオンの数が明確であり、かつ構造上立体障害等を受けにくく、全Cys残基と反応することが可能であるため、電荷が明確で定量的な処理が可能で、タンパク質やペプチドのシステイン残基に正確にカチオンを導入してカチオン化でき、可溶化することが可能である。
(3)従来法により可逆的にカチオン化された変性タンパク質は、純水中では比較的高い溶解性を示すが、溶媒のイオン強度が上がると充分な溶解性を示さなかった。しかし、本発明の新規化合物を用いて得られるカチオン化変性タンパク質は、生理食塩水等の生理的な塩溶液中でも高い溶解性を示し、かつ、凍結乾燥等の濃縮工程にも耐え得る。
(4)本発明の新規化合物を用いることにより(好ましくは、更に逆相HPLC等の高度可溶化プロトコルと組み合わせて)、核酸を含まない細胞内総タンパク質(好ましくは変性状態の細胞内総タンパク質)を可逆的に可溶化することが可能である。また、上記(3)に記載のとおり、カチオン化タンパク質は生理食塩水中でも高い溶解性を示すため、生理的な条件下でのタンパク質の高純度な精製、回収等が可能である。また、凍結乾燥後の可逆的な水和等の操作にも耐え得る。
本発明はまた、タンパク質及び/又はペプチドを可逆的にカチオン化するための可逆的カチオン化剤であって、該可逆的カチオン化剤は、上記チオスルホナート化合物を含むタンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤でもある。
本発明は更に、タンパク質及び/又はペプチドを可溶化する方法であって、該可溶化方法は、上記タンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤を用いるタンパク質及び/又はペプチドの可溶化方法でもある。
本発明はそして、培養細胞及び/又は生体組織から抽出した変性状態の総タンパク質の混合物を生理的な塩溶液中に可溶化する方法であって、該可溶化方法は、上記タンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤を用いる可溶化方法でもある。
以下に本発明を詳述する。
本発明のチオスルホナート化合物は、1分子内に、第4級アンモニウム基に由来するカチオンを3個以上有し、かつ、チオスルホナート基を有する化合物である。また、対アニオンとして、ハロゲンイオン等を有する形態が好適である。なお、本発明の化合物の構造は、NMRや元素分析等により確認することができる。
上記チオスルホナート化合物は、好ましくは、下記一般式(1):
上記R2で表される低級アルキル基としては、メチル基が好ましい。
ここでいう分子量は、構成する元素の原子量の総和として計算された値である。
本発明のタンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤は、上述した本発明のチオスルホナート化合物を含む。すなわち、本発明のチオスルホナート化合物をタンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤に用いることになる。このような可逆的カチオン化剤は、従来の試薬に比べ、疎水性の高い変性タンパク質やペプチドの可逆的カチオン化に非常に有効である。また、構造上、一分子あたりのカチオンの数が明確であり、かつ立体障害等を受けにくいことから、全Cys残基と反応することが可能である。このように、本発明の可逆的カチオン化剤は電荷が明確で定量的な処理が可能であることから、タンパク質やペプチドのシステイン残基に正確にカチオンを導入してカチオン化し、可溶化することが可能となる。更に、おそらくこれらの利点に関連して、水以外の生理食塩水のような変性状態のタンパク質や疎水性の高いペプチド等の可溶化が困難な条件下でも可溶化させることができるうえ、細胞や組織の、核酸不含の変性状態の全タンパク質やペプチドを、生理食塩水中で可溶化、精製、回収することができる。つまり、必要に応じて、試験管内又は細胞内でリフォールディングし、目的のタンパク質又はペプチドを単離、精製することができる。そのため、生化学の研究、医療、その他、応用範囲は広いと考えられる。例えば、脊髄等の組織への投与、癌細胞又は癌組織と樹状細胞を用いる癌の免疫療法等において、より効率よく目的の樹状細胞を調製し、治療効果の向上に寄与することができると考えられる。特に癌の免疫治療においては、癌抗原タンパク質を効率的に可溶化することが望ましいが、従来の凍結融解法ではその全てを可溶化することは容易ではない。例えば、マウスメラノーマ細胞を凍結融解法で処理した場合、をモデルとして実施した例では、癌抗原タンパク質であるgp100の約50%が凍結融解後に不溶性となることが確認されている(図9参照)。この課題に対し、本発明により開発した可溶化技術を活用すれば、細胞内の総タンパク質の可溶化が可能で、実際にがん抗原となり得るEGF受容体、TRP2及びgp100の各タンパク質を、定量的に、生理食塩水中に可溶化できることが確認されている(図8参照)。
なお、本発明のタンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤は、本発明のチオスルホナート化合物を含む限り、更に該チオスルホナート化合物以外の他の成分を1種又は2種以上含んでもよく、含まなくてもよい。
本発明のタンパク質及び/又はペプチドの可溶化方法では、上記タンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤を用いることになる。上記可溶化方法は特に、変性状態のタンパク質及び/又はペプチドを可溶化する方法であることが好適である。すなわち、上記可溶化方法が可溶化しようとするタンパク質及び/又はペプチドが、変性状態のタンパク質及び/又はペプチド(変性タンパク質及び/又は変性ペプチド)であることが好ましい。これによって、上述した効果の発現をより確認することができる。なお、変性剤として、例えば、尿素、塩酸グアニジンを用いることができる。
すなわち、培養細胞及び/又は生体組織から抽出した変性状態の総タンパク質の混合物を生理的な塩溶液中に可溶化する方法であって、該可溶化方法は、上記タンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤を用いる可溶化方法もまた、本発明の1つである。
上記チオスルホナート化合物は、一般式(1)中のR2がメチル基であるチオスルホナート化合物であることが好ましい。また、上記可溶化方法は、必要に応じて1又は2以上の上記精製プロトコルを組み合わせて用いることが好適である。
本発明の新規化合物であるTAP3S−Sulfonateの合成は、下記式(i)〜(iii)示すスキームに従って行った。以下に具体的に説明する。
TAP−Br((3−bromopropyl)trimethylammonium bromide,J.Biochem.,116,852−857(1994))を35.1g(134mmol)量りとり、500mlのエタノールに溶解し、N,N,N’,N’−tetramethyl−1,3−diaminopropaneを87.5g(672mmol)加え、85℃で20時間還流しながら反応し(CH3)3 N+CH2CH2CH2N+(CH3)2CH2CH2CH2N(CH3)2・2Br−を得た。収量113mmol(収率86%)。
(CH3)3 N+CH2CH2CH2N+(CH3)2CH2CH2CH2N(CH3)2・2Br−を40.89g(104.5mmol)量り500mlのエタノールに溶かし、100ml(979mmol)の1,3−dibromopropaneを加え85℃で還流させながら2日反応させTAP3−Brを得た。収量68.8mmol(収率66%)。
TAP3−Brを31.37g(52.9mmol)量りとり、500mlのエタノールに溶かし、CH3SO2SNaを7.096g(52.9mmol)加え85℃で還流させながら2日反応させTAP3S−Sulfonateを得た。生成物はNMRにより確認した。
1H−NMR(300MHz,D2O):δ 3.57−3.33(m,10H),3.50(s,3H),3.30(t,J=6.8Hz,2H),3.15(s,6H),3.14(ds,15H),2.40−2.18(m,6H)
収量30mmol(収率56%)
ニワトリ卵白リゾチーム(HEL、分子量14.3kDa、8Cys残基/mol)をモデルタンパク質とし、TAPS−sulfonate(非特許文献3〜4等に記載の従来のカチオン化試薬)と、実施例1で調製したTAP3S−Sulfonate(新規カチオン化剤)との性能比較を行った。
10mgのHELを1mlの6Mグアニジン塩酸塩、0.1M Tris−HCl、1mM EDTA pH8.5に溶解し、脱気、窒素置換を行った。次に、5mg(0.03 mmol)のDithiothreitol(DTT)を添加し、37℃で90分間の還元反応後、TAPS−sulfonate又はTAP3S−Sulfonateを、DTTの3倍モル量になるようにそれぞれ添加し、37℃で30分間反応した。得られた反応液は純水に対して充分に透析を行い、可溶性画分に得られた可逆的変性カチオン化HELを用いて物性評価を行った。各サンプルをSDS−PAGEにより解析を行った結果、TAPS−sulfonate及びTAP3S−Sulfonateともに、SS結合を介して定量的にタンパク質と結合していることが確認された(図4A参照)。
※1:活性構造の卵白リゾチームは1分子内に4組のSS結合が存在し、正しい組み合わせに巻き戻す必要があるが、活性構造の卵白リゾチームは自由エネルギーが最も低い(=安定な)構造になるため、最終的にカチオン化剤が解離して正しい4組のSS結合を形成した分子が生理活性を発現する。なお、本実験での「巻き戻し率」は、リゾチームが示す溶菌活性(酵素活性)で評価した。
図2に記載のSolubility Indexからも予想されるとおり、疎水性残基が多数含まれるタンパク質は、変性状態での溶解性が極めて低い。このようなモデルタンパク質の1つとして、ヒトβActin(表1参照)モデルとして可逆的変性カチオン化による可溶化の検証実験を進めた。表1に、ヒトβActinタンパク質のアミノ酸組成を示す。
未修飾:SI=(48−49)/72=−0.014
T1(TAPS化):SI(TAPS化)=(48−49+6)/72=+0.07
T3(TAP3化):SI(TAP3化)=(48−49+18)/72=+0.236
大腸菌で発現させたヒトβActinは超音波破砕による溶菌の後、遠心分離を行うと、不溶性画分(インクルージョンボディ)として回収され、SDS−PAGEによる解析では、この時点で90%以上の純度であることが確認された。このヒトβActinを6M塩酸グアニジン中で溶解し、終濃度30mMになるようにDTTを添加して37℃で2時間処理することでタンパク質を完全に還元した。次にTAPS−sulfonate及びTAP3S−Sulfonateを、それぞれ終濃度が90mMになるように添加し、37℃で30分反応した後、純水に対して充分に透析を行い、可逆的変性カチオン化βActinとした。
がん細胞等の含まれる総タンパク質を丸ごと可溶化するための手法を開発するために、本試薬の有効性を検証した。がん細胞等の生体組織を材料として、その中に含まれるタンパク質をカチオン化する場合には、生体組織内に多量に含まれる核酸が強い負電荷を持つため、カチオン化タンパク質と静電的に会合して不溶化することは明白であった。
そこで、生体組織から定量的に核酸とタンパク質を分離・精製することが可能なTrizol試薬(Invitrogen社製、フェノール/グアニジンイソチオシアナート)を活用して核酸フリーの総タンパク質を抽出することとした。この手法で取得した変性タンパク質の可溶化条件を検討するため、図5に示した手法で総タンパク質を処理したところ、未修飾の変性タンパク質の混合物が、水中でよく溶解することが判明した。このような変性タンパク質の溶解性に関する知見は報告されていないと思われるが、真核生物の細胞内タンパク質が示す本質的な性質であるものと推定され、タンパク質科学的にも非常に興味深い知見である。なお、図5の培養細胞として、マウスB16メラノーマを使用したが、他のヒトのがん細胞(HeLa、A431等)を用いた場合も結果はほぼ同じであった。
(1)ヒト上皮様細胞がん由来細胞株A431とマウスメラノーマB16−F10細胞に含有する総タンパク質を、図6に示した手順でTAP3S−Sulfonateを用いてカチオン化し、生理食塩水中で溶解したライセートを調製した。それぞれのライセート中に含まれるタンパク質を抗β−tubulin抗体(Cell signaling Technology:#2146)、抗EGF受容体抗体(Sigma社製:E2760)、抗TRP2抗体(Santa cruz biotechnology社製:SC−25544)、抗gp100抗体(Santa cruz biotechnology社製:SC−33590)を用いたウエスタンブロッティング(W.B.)により定量した。その結果、これらの抗体に対応する抗原タンパク質が溶解していることが確認された(図8参照)。本手法を活用して、がん細胞内に含まれる総タンパク質を生理食塩水中に完全溶解させることが可能で、実際に癌抗原タンパク質として知られているEGF受容体、TRP2、gp100の各抗原が溶解していることが確認された。本手法はがん細胞からがん治療用のワクチンを調製する上でも強力な手法と言える。
Claims (9)
- 1分子内に、第4級アンモニウム基に由来するカチオンを3個以上有し、下記一般式(1):
- 前記一般式(1)中のR1が、炭素原子数2〜6の直鎖状アルキレン基であることを特徴とする請求項1に記載のチオスルホナート化合物。
- 前記R1が、プロピレン基であることを特徴とする請求項2に記載のチオスルホナート化合物。
- 前記一般式(1)中のnが3であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載のチオスルホナート化合物。
- 前記一般式(1)中のR2がメチル基であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のチオスルホナート化合物。
- タンパク質及び/又はペプチドを可逆的にカチオン化するための可逆的カチオン化剤であって、該可逆的カチオン化剤は、請求項1〜5のいずれかに記載のチオスルホナート化合物を含むことを特徴とするタンパク質及び/又はペプチドの可逆的カチオン化剤。
- 請求項6に記載の可逆的カチオン化剤を用いることを特徴とするタンパク質及び/又はペプチドの可溶化方法。
- 前記タンパク質及び/又はペプチドは、変性状態のタンパク質及び/又はペプチドであることを特徴とする請求項7に記載のタンパク質及び/又はペプチドの可溶化方法。
- 培養細胞及び/又は生体組織から抽出した変性状態の総タンパク質の混合物を生理的な塩溶液中に可溶化する方法であって、
該可溶化方法は、請求項6に記載の可逆的カチオン化剤を用いることを特徴とする可溶化方法。
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