JP2013534908A - 骨障害及び/又は心血管障害の治療又は診断に使用する組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
この技術的な問題は、本明細書で提供する態様と請求項で提供する解決案によって解決された。
(a)配列番号1(すなわちmiR−31)のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)(a)のポリヌクレオチドとすくなくとも80%同一なポリヌクレオチド、
(c)配列番号2のヌクレオチド配列(すなわちmiR−31のシード配列:GGCAAGAU)を含むポリヌクレオチド、及び
(d)配列番号2のヌクレオチド配列(すなわちmiR−31のシード配列:GGCAAGAU)を含む(b)のポリヌクレオチド、からなる群より選択されてもよい。
そのようなハイブリダイズする配列(又はその機能性断片やイソ型)を、FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに特異的な拮抗剤/阻害剤として、及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型に特異的な拮抗剤/阻害剤として使用してもよい。そのようなハイブリダイズする配列(又は機能性断片若しくはそのイソ型)は、マイクロRNA、siRNA、模倣マイクロRNA、長鎖非コードRNA、snRNA、stRNA、fRNA、snRNA、snoRNA、piRNA、tasiRNA、aRNA及びそのようなRNAの前駆体などの、本明細書で記述した、拮抗される又は阻害される全ての種のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
表3:miR−31の5’及び3’イソ型の例。
同一性はさらに、好ましくは、対応するヌクレオチド配列間に、機能的等価性及び/又は構造的等価性があることを意味する。本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの特定の核酸配列に対して所定の同一性レベルを有する核酸配列は、これら配列の誘導体/変異型を表しているかも知れず、これらの核酸配列は好ましくは同じ生物学的機能を有する。本発明においては、本発明の文脈で阻害されるポリヌクレオチドの生物学的機能は、例えば、FZD3のmRNAにハイブリダイズし、それによってFZD3のmRNAの翻訳を劣化又は抑制することで、FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制する能力である。FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現が低下又は抑制されたか否かは、当該分野で周知の方法やさらに本明細書で記述した方法によって、容易に試験することができる。FZD3や生物学的に活性な誘導体の発現が低下又は抑制されたか否かを決定するのに適したそのような方法の例としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動や、発色色素を用いたタンパク質の検出技術(銀染色やクーマシーブルー染色など)を用いた関連するブロット技術(例えばウェスタンブロット)、又は溶液中、ゲル上、ブロット上、及びマイクロアレイ上のタンパク質を検出するための、蛍光や発光を用いた検出法(免疫染色など)、並びに免疫沈降、ELISA、マイクロアレイ及び質量分析が挙げられる。所定のポリヌクレオチドがFZD3のmRNAにハイブリダイズしたか否かの決定もまた、当該分野で周知の方法やさらに本明細書で記述した方法によって試験することができる。所定のポリヌクレオチドが別の核酸(例えばFZD3のmRNAやその生物学的に活性な誘導体)にハイブリダイズしたか否かを決定するのに適したそのような方法の例としては、用いられるレポーター遺伝子が通常、蛍光タンパク質(GFP、eGFP、YFP、eYFP、BFP、eBFPなど)、発光タンパク質(酵素であるウミシイタケやホタルルシフェラーゼ、及びlacZ遺伝子にコードされているβ−ガラクトシダーゼなど)である、レポーター遺伝子アッセイ(Inui, Nat Rev Mol Cell Biol (2010), 11 : 252-63)がある。FZD3のmRNAが分解されたか或いはその翻訳が抑制されたか否かもまた、当該分野で公知の方法やさらに本明細書で記述した方法で試験することができる。mRNAが分解されているか否かを決定するのに適したそのような方法の例としては、qPCR、RT−PCR、qRT−PCR、RT−qPCR、ライトサイクラー(Light Cycler)(登録商標)、タックマン(TaqMan)(登録商標)プラットフォームとアッセイ、又はクアンチジン(quantigene)アッセイ(Zhou, Anal Biochem (2000), 282: 46-53)、ノザンブロット、ドットブロット、RNAseプロテクションアッセイ、マイクロアレイ、次世代シークエンシング(VanGuilder, Biotechniques (2008), 44(5): 619-26; Elvidge, Pharmacogenomics (2006), 7: 123-134; Metzker, Nat Rev Genet (2010), 11 : 31-46; Kafatos, NAR (1979), 7: 1541-1552)が挙げられる。
(a)配列番号5の核酸配列又は配列番号5を含む核酸配列;
(b)配列番号6の核酸配列又は配列番号6を含む核酸配列;
(c)配列番号7の核酸配列又は配列番号7を含む核酸配列;
(d)配列番号8の核酸配列又は配列番号8を含む核酸配列;及び
(e)(a)〜(d)のいずれか1種の核酸配列と少なくとも90%又は少なくとも95%同一の核酸配列、
からなる群より選択される核酸分子又は核酸配列を含んでいてもよい。
前項の組成物の文脈では、配列番号1〜3のいずれか1種で示す核酸配列からなるポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子は、ホスホロチオアート結合とコレステロール尾部を有する2’−0−メチル−RNAオリゴヌクレオチドである。
(a)上述のFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド、及び/又は
(b)上述のFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子、及び/又は
(c)上述のFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに結合する薬剤を含み、
対象の骨障害及び/又は心血管障害(例えば骨粗鬆症、骨減少症、骨折、骨恒常性の不全、又は発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心臓及び腎不全又はアテローム性動脈硬化症などの心血管疾患)の診断に使用する組成物に関する。
(a)FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと特異的に相互作用する(例えば結合する)ことが可能な薬剤、及び/又は
(b)FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと、好ましくは厳しい条件下でハイブリダイズする核酸分子を含み、
本明細書に記載の対象の骨障害及び/又は心血管障害の診断、又は骨障害及び/又は心血管障害の治療成功の生体外での監視に使用する組成物に関する。
(a)前記対象から、上述のFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドを含む生体試料を得る工程、
(b)前記試料を、(a)のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸分子又は(a)のポリヌクレオチドと結合する薬剤に接触させる工程、
(c)(b)の核酸分子又は(b)の薬剤と(a)のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション又は結合シグナルを検出・評価する工程、及び
(d)(c)の検出・評価されたハイブリダイゼーション又は結合シグナルと、対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーション又は結合シグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルよりも、対象の試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルが強いことが、骨障害及び/又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
(a)(i)前記対象由来の生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと(好ましくは厳しい条件下で)でハイブリダイズする核酸分子、及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型と(好ましくは厳しい条件下で)でハイブリダイズする核酸分子と接触させる工程、又は
(ii)前記生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能な前記ポリヌクレオチドに結合する薬剤及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型に結合する薬剤と接触させる工程、
(b)(a)(i)の核酸分子と前記ポリヌクレオチド及び/又は前記miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型とのハイブリダイゼーションシグナルを検出・評価する工程、又は(a)(ii)の薬剤と前記ポリヌクレオチド及び/又は前記miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型との結合シグナルを検出・評価する工程、及び
(c)(b)(a)(i)の検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナル又は(b)(a)(ii)の検出・評価された結合シグナルと、対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーション又は結合シグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルよりも、対象の試料中のハイブリダイゼーション又は結合シグナルが強いことが、骨障害及び/又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
(a)前記対象由来の生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと(好ましくは厳しい条件下で)ハイブリダイズする核酸分子及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型と(好ましくは厳しい条件下で)ハイブリダイズする核酸分子と接触させる工程、
(b)(a)の核酸分子と前記ポリヌクレオチド及び/又は前記miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型のハイブリダイゼーションシグナルを検出・評価する工程、及び
(c)(b)の検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナルと、対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中のハイブリダイゼーションよりも、対象の試料中のハイブリダイゼーションが強いことが、骨障害及び/又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
(a)前記対象由来の生体試料を、前記FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドに結合する薬剤及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型と結合する薬剤と接触させる工程、
(b)(a)の、薬剤と前記ポリヌクレオチド及び/又は前記miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型との結合シグナルを検出・評価する工程、及び
(c)(b)の検出・評価された結合シグナルと、対照試料中の対応する検出・評価された結合シグナルを比較する工程を含み、前記対照試料中の結合シグナルよりも、対象の試料中の結合シグナルが強いことが、骨障害及び/又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
(a)生体試験試料中のmiR−31(並びに本明細書に記載のそのイソ型及び変異型)の発現レベル及び/又は量をPCR法によって検出する工程、及び
(b)前記生体試料中の前記miR−31(並びに本明細書で定義しているイソ型及び変異型)の検出された発現レベル及び/又は量を、対照試料中の対応する前記miR−31の発現レベル及び/又は量と比較する工程を含む。
本発明はまた、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチド及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズするポリヌクレオチドの検出方法を提供する。簡便な方法はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく方法である。なぜならば、この方法は迅速で、特異的、かつ、感度が高いためである。PCRには、標的核酸に特異的にハイブリダイズするプライマーが必要とされる。さらに、プライマーのアニーリング、プライマーの伸長、及びプライマーの変性工程を繰り返すことによってPCR産物を生成するための、第二のプライマーも必要とされる。プライマーは、標的核酸へのハイブリダイゼーションが最大になり、試料中に含まれる他の核酸への交差ハイブリダイゼーションが最小になるように選択される。プライマー配列の例と、選択された任意のプライマーについて、最適なハイブリダイゼーション温度や他の条件を計算する例を以下に示す。
(a)前記対象由来の生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドとハイブリダイズする第一のプライマー分子及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型とハイブリダイズする第一のプライマー分子と接触させ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程、
(b)工程(a)のハイブリダイゼーション複合体を、第二のプライマーと該プライマーを伸長させることが可能なポリメラーゼと接触させる工程、
(c)ポリメラーゼによって伸長されるプライマー、変性する産物、及び変性したポリメラーゼ伸長の産物にハイブリダイズするプライマーを繰り返し生じさせる工程、
(d)工程(c)の産物を検出・評価し、第一のプライマー核酸がハイブリダイズした、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの量及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を反映している値を得る工程、
(e)(d)で検出・評価された値を、対照試料の対応する検出・評価された値と比較する工程を含み、前記対照試料から得られた値よりも、対象の試料から得られた値が高いことが、骨障害及び/又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる。
ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)
内皮細胞をヒトの臍帯から、以下の文献に記載されている通りに単離した(Chang, Exp Cell Res (2005), 309: 121-136; Jaffe, J Clin Invest (1973), 52: 2745-2756)。ゼラチンで予めコーティングしたフラスコに、4mMのグルタミン、15%のウシ胎仔血清(FCS)及び170U/mlのヘパリン含有10%内皮細胞増殖サプリメント(ECGS)を補填した、アール塩を含むM199培地を入れ、HUVECを37℃、湿潤環境、5%CO2で培養した。細胞を週に1回か2回継代した。継代時の分割比は、成長速度に応じて1:2〜1:4とした。HUVECを老化するまで培養し、老化関連βガラクトシダーゼ(SA−β−gal)活性を、既に記載されている通りに染色した(Chang、上記)。上清の回収には、接触阻止した(静止した、PD19)細胞と老化した(PD53、95%SA−β−gal陽性)細胞を、実験によって、ASC培地又はHUVEC培地中で48時間分泌させた。その後上清を回収し、1900g、4℃で遠心分離し、直ちにエキソソームの調製に用いるか或いは−80℃で保存した。上清の容積は、上清を回収した時点で1本のフラスコに分泌されたHUVECの数に基づいて標準化した。37℃で48時間インキュベートした細胞培地をさらなる対照として用いた。
腫脹部脂肪吸引の外来患者から、局所麻酔をして皮下の脂肪組織を得た。ASCをこれまでに記述されているように単離し(Wolbank, Tissue Eng (2007), 13: 1173-1183; Wolbank, Tissue Eng Part A (2009))、4mMのL−グルタミン、10%のウシ胎仔血清(FCS、PAA)と1ng/mLの組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子(rhFGF、R&Dシステムズ)を補填したDMEM−低グルコース/ハムF−12培地中で、37℃、5%CO2、95%大気湿度で培養した。細胞を週に1回か2回継代した。継代時の分割比は、成長速度に応じて1:2とした。特異的表面マーカー(CD13、CD14、CD34、CD45、CD73、CD90、HLA ABC、HLA DR)の発現に基づき、フローサイトメトリー(FACS Calibur、ベクトン・ディッキンソン)を標準的な手順で使用して、ASCの特性を評価した。
全ての分化手順は24穴の細胞培養プレートで行った。骨形成分化のために、ASCを1穴当たり2×103個の細胞密度で播種した。播種後72時間目から最大4週間、細胞を骨形成分化培地(DMEM−低グルコース、10%のFCS、4mMのL−グルタミン、10nΜのデキサメタゾン、150μΜのアスコルビン酸−2−リン酸、10mMのβ−グリセロールリン酸及び10nΜのビタミンD3)でインキュベートした。
石灰化した構造をアリザリンレッドで染色するために、細胞を1時間、70%エタノール中、−20℃で固定した。簡単に濯いだあと、細胞を40mMアリザリンレッド溶液(シグマ)で20分間染色し、その後PBSで洗浄した。定量するために、200μlのHCl(0.1M)/SDS(0.5%)溶液で30分間、アリザリンレッドを抽出した。抽出した色素を425nmで測定した。
ASCを、siPORT(商標)NeoFX(商標)形質転換試薬(アプライドバイオシステムズ)を用いて形質転換した。細胞を、10nMの前駆hsa−miR−31、100nMの抗miR−31又は10nMの陰性対照2#(アンビオン)で、製造業者によるプロトコールに従って形質転換した。細胞を、24時間後、48時間後、又は、前述したように形質転換して3日後の分化が始まった時点で回収した。
HUVECを12穴の細胞培養プレートに播種し、ASC培地中で48時間分泌させた。その後細胞を50mMのEDTAで分離し、製造業者の説明に従ってアネキシンV−FITCとPI(ロシュ)で染色した。FACS-CaliburとCellQuestソフトウェア(ベクトン・ディッキンソン)により、アポトーシス細胞とネクローシス細胞/アポトーシスの進行した細胞の百分率を解析した。
別の骨形成分化マーカー遺伝子によってアリザリンレッド染色を確認した。そのため、骨形成が起こる前及び骨形成の最中の様々な時点のASCから、総RNAをトリゾール(インビトロジェン)を用いて単離した。DyNAmo cDNA合成キット(バイオザイム)で逆転写し、RotorGene2000(コーベット)でqPCRを行った。miRNAの解析には、特定のタックマン(TaqMan)アッセイ(アプライドバイオシステムズ)を製造業者の手順に従って行った。
老化したHUVECに、GFPタンパク質を含むレンチウイルスベクターを形質導入した。ベクターは、Institute for Biomedical Aging Research,インスブルック、オーストリアのPidder Jansen-Durrから好意により提供された(Muck, Rejuvenation Res (2008), 11 : 449-453)。簡単に説明すると、老化したHUVECと老化前のHUVECを用いて、レンチウイルスの形質導入を行った。一般的に、100000〜150000個の老化したHUVECと50000個の老化前のHUVECを6穴プレートに薄く広げ、一晩インキュベートした。安定に形質導入された細胞を生成するために、2〜8の感染多重(MOI)を、感染効率を上昇させる8μg/mlのポリブレンを加えて行った。選択圧として、10μg/mlのブラストサイジンを培地に添加した。6〜8日後、クローンは安定し、レンチウイルス粒子の混入を、ヒーラ細胞とSNを4日間インキュベートすることで試験した。その後SNを回収し、前述のようにエキソソームの精製に用いた。
エキソソームを、ろ過及び分画遠心法により、既に記載されているように精製した(Lehmann, Cancer Res (2008), 68: 7864-7871)。簡単に説明すると、48時間インキュベートした後に上清を回収した。この馴化培地を、細胞を沈殿させるために500gで10分間、残渣を除去するために14000gで15分間遠心分離し、その後、アポトーシス小体の画分を除去しながら、0.22μmフィルターを通す。その後、100000gで60分間超遠心してエキソソームを沈降させ、得られたペレットをPBSで洗浄する。エキソソームを新鮮な標本として電子顕微鏡法に用いるか、或いはその後の解析用に−80℃で保存する。分化試験用には、1ウェルのASCにつき、50μlのPBSに溶解した2×104個のHUVEC由来エキソソームを加えた。
精製したエキソソームをニッケルのカバーグラス(200メッシュ、六法晶形、ピオロフォームでコーティングされたアテネ銅グリッド)上で安定するまで放置した。4%のホルムアルデヒドで固定した後、エキソソームを2%の酢酸ウラニルで30秒間染色し、乾燥させるためにカバーグラスを取り、その後、透過型電子顕微鏡(TEM)、フィリップスモデルCM12電子顕微鏡(フィリップス、アイントホーフェン、オランダ)で可視化した。
総タンパク質を抽出し、ポリアクリルアミドゲル状で分離し、その後PVDF膜(ロス、ドイツ)に移した。膜を5%の脱脂粉乳でブロッキングし、CD63抗体(H−193、サンタクルズ)、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とインキュベートし、その後Chemidoc(バイオラッド)で行う、ECLウェスタンブロット基質(ピアス)を用いた増強化学発光(enhanced chemiluminescence)にかけた。
幹細胞の全身環境の阻害(Conboy, Nature (2005), 433: 760-764)に老化内皮細胞が寄与する可能性があるかについて試験するために、十分に特性が評価された老化前のHUVECと老化したHUVEC(PDLがPD13〜PD53)を、既に確立されたものとして用いた(Chang, Exp Cell Res (2005), 309: 121-136)。老化細胞は大きくて扁平な形態を示し、SA−β−gal活性陽性に染色された(図1A)。内皮から分布される因子をASC培地中で生成するために、内皮細胞をASC培地に48時間曝露した。過剰な細胞死が「セクレトーム」に及ぼす影響を排除するために、アネキシンV染色とPI染色で、「回収」している間の内皮細胞の細胞死の基礎レベルを試験した。老化前のHUVECと老化したHUVECの間に有意差は見られなかった(図1B)。
エキソソームは膜で覆われた小胞であり、その直径は40〜100nmで、細胞内の多小胞体に由来する(Pap, Inflamm Res (2009), 58: 1-8)。近年になって、エキソソームが様々な環境での傍分泌のシグナル伝達分子として記載されてきたため(Deregibus, Blood (2007), 110: 2440-2448; Hunter, PLoS ONE (2008), 3 : e3694; Lehmann、上記; Pap、上記)、エキソソームがASCの挙動の変化に寄与する可能性があるか否かを試験した。そのために、連続遠心分離工程(Deregibus、上記)によって、エキソソームをHUVEC上清から単離した。エキソソームの同一性を確認するために電子顕微鏡法を行った。粒度分布は、我々のエキソソーム調整物中にアポトーシス小胞が見られないことを強く示している(図3A)。なぜならば、アポトーシス小体の大きさは500nmを上回るためである(Reich, Exp Cell Res (2009), 315: 760-768)。さらに、エキソソームのマーカーとして一般的に用いられるCD63表面タンパク質(Valadi, Nat Cell Biol (2007), 9: 654-9)に対する抗体を用いたウェスタンブロット解析(図3B)と免疫金標識(図3C)は、エキソソームの単離が成功したことを示唆している(図3A〜3C)。
種々のタンパク質に加えて、miRNAもエキソソーム中に詰め込まれることが示された(Valadi、上記)。miR−31が老化HUVECで亢進することが示された(図4A)。さらに、HUVECの培養上清(図4B)及び老化前の内皮細胞由来のエキソソームに対して、老化内皮細胞由来のエキソソーム(図4C)中にもそれらが存在しているか否かについて試験した。qPCRで最大12倍の変化が検出されたため、電子顕微鏡を用いたその場ハイブリダイゼーション(EM−ISH)によりエキソソーム内でのmiRNAの局在を確認した。これまでは、生化学的な試験だけがmiRNAがエキソソーム内にあることを示唆していたが、本発明において、miRNAが実際にエキソソーム内に詰め込まれていることの顕微鏡による初めての証拠が提供される(図4D)。
内皮由来miR−31がASCによって取り込まれるか否かを試験するために、ASCをHUVEC由来のSNやエキソソームと共にインキュベートした。確かに48時間後のASC内で、miR−31の4〜5倍の上昇が観察された(図5A)。これらのデータからは、エキソソームがASCによって取り込まれるのか、又はエキソソーム調整物に含まれる他の成分がASC内でのmiR−31の新規の転写を誘導するのかは分からなかった。そこで、近年GFPがエキソソーム内に詰め込まれることが発表されたことから(Deregibus、上記)、GFPを発現している安定な形質転換老化内皮細胞(図5B)を準備した。GFP陽性のエキソソームとインキュベートして2日後のASCでは細胞質内がGFPのシグナルで強調されたが、GFP−エキソソームが枯渇した上清で処理したASCではシグナルは示されなかった(図5C)。エキソソームの取り込みをさらに確認するために、ASCを優性阻害ダイナミン構築物(K44A)と対照としてダイナミンの野生型構築物(Cao, Mol Biol Cell (1998), 9: 2595-2609; Cao, J Cell Sci (2000), 113 (Pt 11): 1993-2002)で形質転換した。ダイナミンが真核細胞でのエンドサイトーシスに関与していること(Cao, 1998、上記; Cao, 2000、上記)、及びエンドサイトーシスがエキソソームの取り込みに関与していること(Valadi、上記)が示された。実際に、図5Dで示すように、miR−31レベルは優性阻害ダイナミン構築物(K44A)で形質転換したASCで低下した。
miR−31が単独で分化に及ぼす影響を研究するために、ASCをmiR−31で一過的に形質転換した。タックマン(TaqMan)アッセイにより、miR−31レベルの上昇を確認した(図6A)。ASCの分化能に及ぼすmiR−31の影響を研究し、ASCをmiR31で一過的に形質転換すると、骨形成分化はおよそ1/2に有意に阻害された(図6B)。これはエキソソーム単独で見られたのと同様の範囲である。これらのデータは、miR−31が、内皮細胞、特に老化した内皮細胞から分泌される可能性のある、骨形成分化の阻害剤であることを示している。
骨形成条件では、FZD3のmRNAレベルがMSCで上昇することが示された(Baksh, J Cell Biochem (2007), 101 : 1 109-1124)。本発明においては、FZD3のmRNAレベルは対照培地で処理した細胞と比較して4日後に亢進した(図7A)。さらにFZD3レベルは、幼若エキソソームや対照で処理した細胞と比較して、老化エキソソームでの処理後に有意に下方制御された(図7B)。miR−31を形質転換して24時間後にも、FDZ3は下方制御されたが、有意なレベルには達しなかった。このことは、細胞が分化していない時点では、FDZ3のmRNAレベルが非常に低い(図7C)ことで説明できると考えられる。従って、FZD3はマーカーのみでなく、骨形成分化に必須の因子に相当し、ASCでもmiR−31の直接の標的である可能性がある。
電子顕微鏡法によって、エキソソームが血漿中に存在することを確認した(図8A)。次に、21人の健康な若年提供者(19〜47才)と27人の高齢提供者(50〜91才)の血清からRNAを単離し、miR−31レベルを解析した。本発明において明らかになったように、miR−31レベルは高齢者で有意に上昇し、かつ、若年提供者に比べて変動が大きかった(図8B)。さらに、1mlの培地に、1mlの血漿由来エキソソームを加えて細胞を72時間処理すると分化が始まった。異なる4人の提供者からの「高齢」エキソソームで処理したASCでは、骨形成分化が約1/3に有意に低下したことが分かった(図8C)。対照試料で分化が非常に少ないことは、血清由来エキソソームで処理した細胞での分化が非常に早いことで説明できる。加えて本明細書では、骨減少症患者由来の血漿でのmiR−31レベルが、健康な年齢を適合させた対照と比較して高かったことが示された(図8D)。
酸化ストレスが内皮の老化と機能不全に関係があることが知られている(Seals, Clin Sci (Lond) (2011), 120(9): 357-375)。酸化ストレスがmiR−31の分泌を誘導するか否かを試験するために、HUVECを連続して5日間、1日当たり1時間、培地中のtBHPを最終濃度が75μΜ、50μΜ又は35μMになるまで加えるtBHP処理で、SIPS(ストレス誘導未成熟老化)を誘導した。永久的な成長停止は75μΜのtBHPによって誘導された。Unterluggauer, Exp Gerontol (2003), 38: 1149-1160に記載されている手順に従って、顕微鏡法によって14日間評価した。
miR−31の阻害が骨形成分化を改善するか否かを試験するために、miR−31を拮抗する固定核酸(LNA)(アンビオン、製品ID:AM11465; P/N AM17000)を解析した。ASCの形質転換の実験手順は、上述した実施例2で行ったのと同様に実施した。
miR−31がヒトの系においてだけでなく、骨形成の一般的な制御因子であることを確認するために、C3Ht10 1/2細胞株、すなわちBMP2の添加で骨形成分化を誘導することができるマウス間葉多能性細胞株(Richard, PLoS Genetic (2005), 1(6): e74)を用いた。読出しとして、オステオカルシンプロモーターの制御下でルシフェラーゼをコードしているレポーター構築物(Feichtinger, Tissue Eng Part C Methods (2010), 17(4): 401-410)と共に、細胞を形質転換した。
骨減少症と診断された10人の男性患者の血漿を、年齢を適合させた対照(P. Pietschmann, Department of Pathophysiology, General hospital、ウィーンから提供された)と比較した。本試験は組織の倫理委員会によって承認され、かつ、書面による同意書を各対象から得た。
アプライドバイオシステムズ
cDNA合成:
16℃:30分
42℃:60分
85℃:5分
4℃:一時停止
タックマンプライマー:
アプライドバイオシステムズ
Rotor-Gene 6000;Rotor-Gene Software 6000、Series Software 1.7
Claims (23)
- (a)ポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤であって、該ポリヌクレオチドはFZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能である、ポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤、及び/又は
(b)miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型の拮抗剤/阻害剤
を含む、対象の骨障害及び/又は心血管障害を治療又は予防するための組成物。 - 対象の骨障害及び/又は心血管障害を治療又は予防する方法であって、対象に、
(a)FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤を含む組成物を有効量投与すること、及び/又は
(b)miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型の拮抗剤/阻害剤を含む組成物を有効量投与すること、を含む前記方法。 - 前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドが、FZD3又は生物学的に活性なその誘導体のmRNAにハイブリダイズすることが可能な、請求項1に記載の組成物又は請求項2に記載の方法。
- 前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドが、マイクロRNA、siRNA、模倣マイクロRNA、長鎖非コードRNA、snRNA、stRNA、fRNA、snRNA、snoRNA.piRNA、tasiRNA、aRNA及びそれらのポリヌクレオチドの前駆体からなる群より選択される、請求項1若しくは3に記載の組成物又は請求項2若しくは3に記載の方法。
- 前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドの長さが、約15〜約100、好ましくは約18〜約27ヌクレオチド、また最も好ましくは20〜24ヌクレオチドである、請求項1、3若しくは4のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチド又は前記miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型が、
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)(a)のポリヌクレオチドと少なくとも80%同一なポリヌクレオチド、
(c)配列番号2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及び
(d)配列番号2のヌクレオチド配列を含む(b)のポリヌクレオチド
からなる群より選択される、請求項1若しくは3〜5のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 前記組成物が、ポリヌクレオチド(a)〜(d)のいずれか1種、2種、又は3種以上に対する阻害剤を1種、2種、又は3種以上含む、請求項6に記載の組成物又は方法。
- 前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドがFZD3又はその生物学的に活性な誘導体のmRNAの3’−UTRにハイブリダイズする、請求項1若しくは3〜7のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記拮抗される/阻害されるポリヌクレオチドがmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型である、請求項1若しくは3〜8のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物が体重1kg当たり約1ng〜約10mgの前記拮抗剤/阻害剤を含む、請求項1若しくは3〜9のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1若しくは3〜10のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜10のいずれか1項に記載の方法であって、
FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能な、前記ポリヌクレオチドの拮抗剤/阻害剤、及び/又は
前記miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型の拮抗剤/阻害剤が、脂質組成、エキソソーム又はリポソーム中に含まれている、前記組成物又は方法。 - 前記組成物が薬学上許容可能な担体をさらに含む、請求項1若しくは3〜11のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組成物を、注入、吸入、経口、直腸、経膣、局所及び/又は局部投与用に調製する、請求項1若しくは3〜12のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記拮抗剤/阻害剤がmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズすることが可能な、請求項1若しくは3〜13のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記拮抗剤/阻害剤が、アンタゴmiR、miRCURY LNA(商標)マイクロRNA阻害剤、インビボLNA(商標)miR阻害剤、tiny LNA、又はmiR−デコイ若しくはmiR−スポンジからなる群より選択される、請求項1若しくは3〜14のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記アンタゴmiR、miRCURY LNA(商標)マイクロRNA阻害剤、インビボLNA(商標)miR阻害剤、tiny LNA、又はmiR−デコイ若しくはmiR−スポンジが、
(a)配列番号5の核酸配列又は配列番号5を含む核酸配列、
(b)配列番号6の核酸配列又は配列番号6を含む核酸配列、
(c)配列番号7の核酸配列又は配列番号7を含む核酸配列、
(d)配列番号8の核酸配列又は配列番号8を含む核酸配列、及び
(e)(a)〜(d)のいずれか1種の核酸配列とすくなくとも90%同一の核酸配列、
からなる群より選択される核酸分子又は核酸配列を含む、請求項15に記載の組成物又は方法。 - (a)FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと特異的に相互作用することが可能な薬剤、及び/又は
(b)FZD3又はその生物学的に活性な誘導体の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸分子を含み、
対象の骨障害及び/又は心血管障害の診断又は骨障害及び/又は心血管障害の治療成功の生体内での監視に使用する組成物。 - 対象の骨障害及び/又は心血管障害を診断する方法であって、
(a)前記対象の生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドにハイブリダイズする核酸分子及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型にハイブリダイズする核酸分子と接触させる工程、又は
前記生体試料を、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能な前記ポリヌクレオチドと結合する薬剤及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型と結合する薬剤に接触させる工程、
(b)(a)の該核酸分子の該ハイブリダイゼーションシグナルを検出・評価するか、又は、(a)の該薬剤と前記ポリヌクレオチド及び/又は前記miR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型との該結合シグナルを検出・評価する工程、及び
(c)(b)の該検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナルを比較するか、又は、(b)の該検出・評価された該結合シグナルを対照試料中の対応する検出・評価されたハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルと比較する工程を含み、
前記対照試料のハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルよりも、該対象の該試料中のハイブリダイゼーションシグナル又は結合シグナルが強いことが、骨障害及び/又は心血管障害を発症する又は患っている可能性の指標となる、診断方法。 - 対象の骨障害及び/又は心血管障害を診断する方法であって、
(a)PCR法により、生体試験試料中のmiR−31(又はそのイソ型若しくは変異型の)の該発現レベル及び/又は量を検出する工程、及び
(b)前記生体試料中の前記miR−31(又は前記イソ型及び変異型)の該検出された発現レベル及び/又は量を、対照試料中の対応する前記miR−31の発現レベル及び/又は量と比較する工程を含む、診断方法。 - 前記ハイブリダイズする核酸分子又は前記結合剤が、マーカー分子及び/又はタグ付け分子と結合されている、請求項17に記載の組成物又は請求項18に記載の方法。
- 前記使用される薬剤が特定のタンパク質又はタンパク質断片である、請求項17若しくは20に記載の組成物又は請求項18若しくは20に記載の方法。
- 前記特定のタンパク質又はタンパク質断片が、抗体若しくはその断片、又は、FZD3の発現を低下又は抑制することが可能なポリヌクレオチドと結合及び/又は相互作用することが可能な、及び/又はmiR−31又はその5’若しくは3’イソ型若しくは変異型と結合及び/又は相互作用することが可能な、修飾された転写因子である、請求項21に記載の組成物又は方法。
- 前記骨障害が、骨粗鬆症、骨減少症、骨折、及び骨恒常性の不全からなる群より選択され、前記心血管障害が、心血管疾患、発作、梗塞、高血圧、血栓症、血管狭窄症、冠不全症候群、血管性認知症、心不全、腎不全、ストレス性心血管障害及びアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、請求項1若しくは3〜17若しくは20〜22のいずれか1項に記載の組成物又は請求項2〜16若しくは18〜22のいずれか1項に記載の方法。
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Cited By (1)
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Families Citing this family (16)
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CN111118139B (zh) * | 2020-01-13 | 2021-06-18 | 北京市创伤骨科研究所 | 一种骨质疏松的分子靶标及其应用 |
CN111599476B (zh) * | 2020-05-15 | 2023-08-11 | 中南大学湘雅医院 | 一种高血压的预测模型及其建立方法以及用于预测高血压的生物标记物 |
CN112746101B (zh) * | 2020-12-25 | 2023-02-28 | 深圳市人民医院 | 一种骨质疏松诊断标志物及促进骨质疏松骨再生的核酸药物 |
CN114426950B (zh) * | 2022-01-25 | 2023-08-04 | 北京大学口腔医学院 | 一种高成骨成血管的血清外泌体及其制备方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11253183A (ja) * | 1998-03-10 | 1999-09-21 | Smithkline Beecham Plc | Frizzled−3ポリペプチドおよびポリヌクレオチド |
JP2006512911A (ja) * | 2002-12-05 | 2006-04-20 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ アーカンソー システム | 骨髄腫骨疾患の分子決定因子およびその用途 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4711955A (en) | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
US5792608A (en) | 1991-12-12 | 1998-08-11 | Gilead Sciences, Inc. | Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
US5998424A (en) | 1997-06-19 | 1999-12-07 | Dupont Pharmaceuticals Company | Inhibitors of factor Xa with a neutral P1 specificity group |
US7655785B1 (en) * | 2002-11-14 | 2010-02-02 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof |
US7135493B2 (en) | 2003-01-13 | 2006-11-14 | Astellas Pharma Inc. | HDAC inhibitor |
AR043507A1 (es) | 2003-03-14 | 2005-08-03 | Lundbeck & Co As H | Derivados de anilina sustituidos y composiciones farmaceuticas |
EP2530157B1 (en) * | 2003-07-31 | 2016-09-28 | Regulus Therapeutics Inc. | Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of miRNAs |
WO2005079397A2 (en) * | 2004-02-13 | 2005-09-01 | Rockefeller University | Anti-microrna oligonucleotide molecules |
US8354427B2 (en) | 2004-06-24 | 2013-01-15 | Vertex Pharmaceutical Incorporated | Modulators of ATP-binding cassette transporters |
WO2007112753A2 (en) | 2006-04-03 | 2007-10-11 | Santaris Pharma A/S | Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides |
US9102622B2 (en) | 2006-07-28 | 2015-08-11 | University Of Connecticut | Fatty acid amide hydrolase inhibitors |
US7993831B2 (en) * | 2007-09-14 | 2011-08-09 | Asuragen, Inc. | Methods of normalization in microRNA detection assays |
US8993509B2 (en) | 2009-03-31 | 2015-03-31 | Robert Zimmerman | Method for treatment of cachexia by administering inhibitors of adipose triglyceride lipase expression or activity |
US20130210883A1 (en) | 2010-05-21 | 2013-08-15 | Johannes Grillari | Lipase inhibitors |
-
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2013
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-
2014
- 2014-12-05 US US14/561,585 patent/US9212362B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11253183A (ja) * | 1998-03-10 | 1999-09-21 | Smithkline Beecham Plc | Frizzled−3ポリペプチドおよびポリヌクレオチド |
JP2006512911A (ja) * | 2002-12-05 | 2006-04-20 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ アーカンソー システム | 骨髄腫骨疾患の分子決定因子およびその用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JPN6015017809; Molecular and Cellular Biology Vol.28, No.7 (2008), 2368-2379 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016144439A (ja) * | 2015-01-30 | 2016-08-12 | ロート製薬株式会社 | 細胞の品質を評価する方法、及び細胞の品質判定キット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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US9212362B2 (en) | 2015-12-15 |
US20140162265A1 (en) | 2014-06-12 |
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