CN110129429A - 核酸分子在制备诊断骨科疾病的产品中的应用 - Google Patents

核酸分子在制备诊断骨科疾病的产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及核酸分子在制备诊断骨科疾病的产品中的应用。本发明公开了骨质疏松症诊断标志物。本发明通过芯片筛选在男性骨质疏松症患者和正常人中存在差异表达的非编码RNA，后经大样本QPCR验证证明LOC105374848在男性骨质疏松症患者血液中的含量比正常人高。据此可将LOC105374848作为诊断男性骨质疏松症的生物标志物。本发明的研究成果为临床上进行男性骨质疏松症的早期诊断提供了一种无创的方法，适于临床推广。

Description

核酸分子在制备诊断骨科疾病的产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及核酸分子在制备诊断骨科疾病的产品中的应用，具体涉及LOC105374848在诊断男性骨质疏松症中的用途。
背景技术
人类基因组DNA核苷酸序列中只有不到2％的基因用于编码蛋白质，至少75％的基因转录为非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。而根据核苷酸序列的长度，又可以将其分为两类，大于200nt的为长链非编码RNA(long non-coding RNAs，1ncRNAs)，小于200nt者为短链非编码RNA。根据1ncRNAs相对于编码基因的位置关系将其分为正义、反义、双向、基因内、基因间五种类型。它们种类丰富而且活跃于细胞生物功能的各个水平，如细胞分化、细胞增殖、DNA损伤应答、剂量补偿、染色体印记等。研究结果显示它们确实在机体的基因表达调控等生理过程中发挥着重要的作用，多种疾病中lncRNA表达谱的改变奠定了其作为新兴疾病诊断治疗靶点的地位。
男性骨质疏松症(osteoporosis in men)的发病率大大低于绝经后的女性，故以往对男性骨质疏松症远不及对女性的重视。近几年的研究成果表明，青年时期的男性比女性虽能达到更高的峰值骨量，骨量丢失的起始时间也明显晚于女性，但男女两性都有一个与年龄增长相位的骨丢失过程，即老年性骨质疏松症(Ⅱ型)。男性骨质疏松症与女性骨质疏松症有很多相似之处，但在病因学、病理学和澈地病学等方面仍有明显的性别差别。65岁以上的男性普遍存在程度不等的骨质疏松，其严重并发症是骨折。
在美国，大于65岁的男性髋骨骨折的发生率为4‰-5‰，相应年龄的女性发生率为8‰-10‰。在北欧的髋骨骨折发生率为男∶女＝1∶2，在南欧及其他地区，髋骨骨折的发生率在两性中均相对较低。在世界范围内所有髋骨骨折的病人中，约30％为男性，1990年为51万，预计到2025年男性髋骨骨折的人数将增加到116万人，而这一上升趋势在亚洲将更加突出。
Cooper报告50岁以上男性在一生中的髋部、椎体和前臂骨折危险度为13.1％，而女性为39.7％。Neill报道，经欧洲19个国家36个中心15570例50-79岁人群椎体骨折的男性患病率为20％。我国有关男性骨质疏松症的患病率，据上海地区徐尚忠报道，60岁以上男性为13.9％；北京地区吴青报道为13.4％(腰椎)；沈惠良报道为23.8％(腰椎)。
骨质疏松性骨折给患者造成生活能力的丧失及生命危险，Poor报道骨折的死亡率和发病率男性高于女性。
在分子水平上对骨质疏松症进行诊断已成为未来的发展趋势，越来越多的发明人在该领域进行了专利布局，如专利：201510627056.4、201510628042.4、201711468712.6、201711469092.8、201510725389.0等。上述专利研究方向为基因与骨质疏松症诊断的关系，但还未见研究非编码RNA与骨质疏松症诊断的关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种早期诊断男性骨质疏松症的分子标志物。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测LOC105374848的试剂在制备诊断男性骨质疏松症的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交或微阵列芯片检测LOC105374848使用的试剂。
进一步，所述通过反转录PCR检测LOC105374848的试剂至少包括一对特异扩增LOC105374848的引物；所述通过实时定量PCR检测LOC105374848的试剂至少包括一对特异扩增LOC105374848的引物；所述通过原位杂交检测LOC105374848的试剂包括：与LOC105374848的核酸序列杂交的探针；所述用微阵列芯片检测LOC105374848的试剂包括：与LOC105374848的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施例中，所述特异扩增LOC105374848的引物序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。
本发明还提供了一种诊断男性骨质疏松症的产品，所述产品能够通过检测样品中LOC105374848的水平来诊断男性骨质疏松症。
进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒。
所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括针对LOC105374848的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括用于检测LOC105374848的试剂。
进一步，所述试剂盒中用于检测LOC105374848的试剂包括特异性扩增LOC105374848的引物。
在本发明的具体实施例中，所述特异性扩增LOC105374848的引物序列如SEQ IDNO.1和SEQID NO.2所示。
在本发明中，术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。
在本发明中，术语“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。
各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如，DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则，可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片，其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如，来自个体或群体，例如，包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时，样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交，有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中，由此确定核酸中发现的标志物是否存在。
上述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
在本发明的上下文中，“LOC105374848”包括人LOC105374848序列及其变体。所述序列的“变体”是生物活性的序列，其因为在天然序列中一个或多个核苷酸的插入、缺失、修饰和/或替换具有与天然序列或野生型序列(或其补体)不同的核苷酸序列。这种变体通常与天然序列或其补体的序列一致性小于100％。然而，生物活性的变体通常与对应的天然存在的序列或其补体具有至少约70％的序列一致性，通常至少约75％、更通常至少约80％、甚至更通常至少约85％、甚至更通常至少约90％、且甚至更通常至少约95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。任何长度的变体核苷酸片段保留对应天然序列的生物活性。变体还包括其中在5’或3’端或在天然序列或其补体内添加一个或多个核苷酸的序列。变体还包括其中一些核苷酸被删除和任选地被一个或多个不同核苷酸替换的序列。
LOC105374848，gene ID为105374848，目前GeneBank中LOC105374848转录本为XR_940324.2。
本发明的LOC105374848可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达LOC105374848的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺__病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
在本发明的上下文中，“诊断男性骨质疏松症”既包括判断受试者是否已经患有男性骨质疏松症、也包括判断受试者是否存在患有男性骨质疏松症的风险。
术语“样品”，可以是血液、组织、尿液、血清、血浆、羊水、脑脊液、胎盘细胞或者组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞。样品可以得自患者或对象直接使用，或者进行预处理，如通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、失活干扰成分、加入试剂等方式处理，以如本文所述或者本领域已知的一些方式修饰样品的特性。
在本发明的具体实施例中，所述样品是血液。
如本文所用，术语“LncRNA”、“长链非编码RNA”、“Long non-coding RNA”含义相同，互换使用，都是指一种由RNA聚合酶II转录、不编码蛋白的、一般长度大于200bp的RNA片段。
附图说明
图1显示利用QPCR检测LOC105374848的差异表达情况的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选差异表达非长链编码RNA
1、病例收集
收集医院体检行DXA测定BMD的年龄50岁以上男性6人，排除继发性骨质疏松症和已接受抗骨质疏松治疗的患者。另收集5例体检健康男性作为对照。
BMD测量使用美国Hologic公司ASY-00409型DXA测量左侧股骨颈(不能测量者测量右侧股骨颈)和腰椎L1-4 BMD。骨质疏松症使用《原发性骨质疏松诊治指南(2011年)》的诊断标准：BMD值低于同性别、同种族正常成人的骨峰值不足1个标准差(T值≥-1)属正常，降低1～2.5个标准差(-2.5＜T值＜-1)为骨量低下，降低程度等于和大于2.5个标准差(T值≤-2.5)为骨质疏松，腰椎以L1-4中的最低值计算。
2、血液总RNA提取
使用Promega公司的RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
1)取1ml收集在肝素或EDTA处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中；
2)3000rpm离心5min，小心地从样品顶部吸走上清；
3)加1ml血细胞裂解液，小心吸放4-5次，重悬沉淀物，3000rpm离心5min；
4)重复步骤3两次；
5)避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留100μl上清液；确认一下BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μl RNA裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞；
6)加350μl RNA稀释液，颠倒混合3-4次，室温下13000g离心10min，将清亮裂解物转移到一支无菌离心管中；
7)向澄清裂解液中加入200μl95％乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合；将此混合物转移到离心柱装配体中，13000g离心1min；
8)从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，加600μl RNA洗涤液于离心柱装配体，13000g离心1min；
9)弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，将50μl新鲜制备的DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上；
10)室温下孵育15min，向离心柱中加入200μl DNA酶终止缓冲液，13000g离心1min；
11)加入600μl RNA洗涤液，13000g，离心1min；
12)清空收集管，向离心柱内加入250μl RNA洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min；
13)将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μl无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000g离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于-70℃。
3、RNA样品的质量分析
利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。浓度≥200ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间。
4、使用QuickAmp Labeling Kit，One-Color(Agilent p/n 5190-0442)合成、标记双链cDNA。
5、标记的双链cDNA纯化后杂交于Arraystar公司的Human8x60K LncRNAexpression array information芯片。
6、杂交漂洗之后由Agilent Microarray Scanner(Agilent p/n G2565BA)扫描仪进行扫描分析。
7、原始数据分析由Agilent Feature Extraction Software软件完成，差异基因的筛选使用配对随机方差模型的方法，差异基因的标准为变化表达2倍以上及P值≤0.05。
8、结果
测序结果显示：与健康男性相比，男性骨质疏松症患者血液中存在的差异表达LncRNA为256个，其中上调的为175个，下调的为81个。
实施例2大样本验证筛选出的差异表达LncRNA
基于前期芯片测序的结果，根据P value的大小，我们选择LOC105374848进行验证。
1、样本收集
按照实施例1的方法收集骨质疏松症患者和男性健康对照各30例。
2、在RNA水平上进行验证
试剂：反转录试剂盒(DDR037A)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction)所用的SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)试剂盒为日本Takara公司生产。
2.1提取血液总RNA
步骤同实施例1。
2.2逆转录
以提取的总RNA(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：Buffer4μL，RT Enzyme Mix1μL，Oligo dT Primer(50μM)1μL，Random6mers(100μM)1μL，以无RNA酶的ddH2O将反应体积补足为20μL。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。
2.3 QPCR
按照日本Takara公司的Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书进行操作。反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)25μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，PCR上游引物(10μM)1μL，PCR下游引物(10μM)1μL，cDNA 4μL，灭菌ddH2O18μL。反应程序：95℃20s预变性，按95℃10s变性、46.5℃20s退火、70℃10s延伸过程循环43次，获得Ct值。
结果釆用相对定量法，运用公式2-△△ct计算。实验重复3次。
引物设计：根据LOC105374848转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(PRIMERBLAST)设计引物，引物序列如下所示：上游引物：5’-CATTAGTTAAGAGATGGA-3’(SEQ IDNO.1)；下游引物：5’-TTATGATGAAGACTGTAG-3’(SEQ ID NO.2)。根据GAPDH(内参基因)序列设计引物，上游引物：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(SEQ ID NO.3)；5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(SEQ ID NO.4)。
3、结果
结果显示，与健康男性的平均水平相比，30例男性骨质疏松症患者中有30例患者血液中LOC105374848水平显著高于健康对照。统计结果如图1所示，与健康男性相比，男性骨质疏松症患者血液中LOC105374848水平明显升高，差异具有统计学意义(*P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 昌乐县人民医院
<120> 核酸分子在制备诊断骨科疾病的产品中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cattagttaa gagatgga 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttatgatgaa gactgtag 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (10)

1.检测LOC105374848的试剂在制备诊断男性骨质疏松症的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交或微阵列芯片检测LOC105374848使用的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述通过实时定量PCR检测LOC105374848的试剂至少包括一对特异扩增LOC105374848的引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异扩增LOC105374848基因的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。
6.一种诊断男性骨质疏松症的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测样品中LOC105374848的水平来诊断男性骨质疏松症。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性扩增LOC105374848的引物。
9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述特异性扩增LOC105374848的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求6-9任一项所述的产品，其特征在于，所述样品来源是血液。
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