CN116083355A - 一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法，属于血液干细胞技术领域。本发明所提供的方法首先配置含有岩白菜素的细胞培养基A；然后将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器具中并加入培养基A，置于细胞培养箱中培养48h来增强细胞的旁分泌能力；之后收集培养基，离心并过滤得到培养基B；之后便可以将培养基B用于制备促进伤口修复或血管新生的药物或培养基，从而提高了脐带间充质干细胞的治疗能力。
Description
技术领域
本发明属于血液干细胞技术领域，尤其涉及一种提高间充质干细胞治疗能力的方法。
背景技术
间充质干细胞是一种来源于中胚层和外胚层的多功能干细胞，其具有成体干细胞的自我更新和多向分化潜能。在一定的条件下，可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。
脐带间充质干细胞是间充质干细胞中的一种，其来源于胎儿脐带结扎后残留的血液和遗弃的脐带组织，具有增殖和分化等特性，且还含有免疫特性，适合同种异体基因的治疗。其次，脐带间充质干细胞能够表达、合成、分泌各类生长因子、细胞因子等多种生物活性分子来调节代谢，免疫，血管新生，伤口修复等。因此，提高脐带间充质干细胞的旁分泌能力将能够有效的提高脐带间充质干细胞的治疗能力。
岩白菜素是从虎耳草科岩白菜属植物中分离得到的一种异香豆素类化合物，其分子式为C14H16O9，CAS NO.477-90-7。现有的研究显示，岩白菜素具有抗炎、解热、镇痛等活性作用。但是，到目前为止，尚无研究对岩白菜素在提高脐带间充质干细胞治疗能力方面的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案:
其一，本发明提供了一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)配置含有10-160μg/ml岩白菜素的细胞培养基，添加10％FBS，得到培养基A；
(2)将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器具中，加入培养基A，置于细胞培养箱中培养48h后收集培养基；
(3)离心收集上清，使用0.22μm滤膜进行过滤得到培养基B；
(4)将培养基B用于制备促进伤口修复或血管新生的药物。
其二，本发明提供了岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞旁分泌能力的药物中的应用。
优选地，其特征在于，所述药物促进脐带间充质干细胞分泌VEGF和bFGF。
其三，本发明提供了岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞旁分泌能力的培养基中的应用，所述培养基促进脐带间充质干细胞分泌VEGF和bFGF。
其四，本发明提供了岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞的伤口修复能力的药物中的应用。
优选地，所述药物提高皮肤成纤维细胞的增殖能力，提高血管内皮细胞的血管形成和迁移能力。
其五，岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞的促进血管新生的药物中的应用。
优选地，所述药物提高血管内皮细胞血管形成和迁移能力。
其六，岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞的皮肤成纤维细胞增殖促进能力的培养基中的应用。
其七，岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞的血管内皮细胞的血管形成和迁移能力的培养基中的应用。
优选地，在所述培养基中，所述岩白菜素的浓度为10-160μg/ml。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种提高岩白菜素处理来提高脐带间充质干细胞治疗能力的新方法；
其次，本发明提供了岩白菜素在提高脐带间充质干细胞旁分泌能力，促进皮肤成纤维细胞增殖能力，促进血管内皮细胞血管形成和迁移能力的新功能，扩宽了岩白菜素的应用范围。
附图说明
图1为岩白菜素对于脐带间充质干细胞增殖的影响；
图2为岩白菜素对于脐带间充质干细胞VEGF分泌的影响；
图3为岩白菜素对于脐带间充质干细胞bFGF分泌的影响；
图4为岩白菜素处理的脐带间充质干细胞上清对于皮肤成纤维细胞增殖的影响；
图5为岩白菜素处理的脐带间充质干细胞对于血管内皮细胞的血管形成能力的影响；
图6为岩白菜素处理的脐带间充质干细胞对于血管内皮细胞的细胞迁移能力的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如无特别说明，本发明所涉及的技术均为分子生物学或细胞生物学常规技术手段，其中涉及的酶、试剂以及反应条件均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
实施例1：岩白菜素对于脐带间充质干细胞增殖的影响
将2.5×103/孔的P3代的脐带间充质干细胞接种于96孔板中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；
去除培养基，对照组加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，实验1-3分别加入含10，40，160μg/ml岩白菜素使用和10％胎牛血清的DMEM培养基；
培养48h后，每孔加入10μl CCK-8试剂，孵育4h后，使用酶标仪检测各组细胞的450nm吸光度，实验结果展示于图1中。
根据图1可知，实验组的OD稍高于对照组，但差异并没有统计学意义，因此，岩白菜素对于脐带间充质干细胞的增殖没有显著的促进效果。
实施例2：岩白菜素对于脐带间充质干细胞旁分泌的调控
将1×105/孔的P3代的脐带间充质干细胞接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；
去除培养基，对照组加入无血清DMEM培养基，实验组1-3分别加入含10，40，160μg/ml岩白菜素的无血清DMEM培养基；
培养24h后，收集上清，使用ELASA试剂盒检测血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达变化，实验结果展示于图2和图3中。
根据图2和图3可知，相较于对照组(VEGF：845.4±31.04，bFGF：62.8±5.81)，实验组的VEGF和bFGF的分泌量均显著升高，其中，岩白菜素浓度为40μg/ml时效果最为显著，VEGF为981.7±39.67，bFGF为92.77±4.31。
实施例4：岩白菜素处理的脐带间充质干细胞上清对于皮肤成纤维细胞增殖的影响
制备岩白菜素处理的脐带间充质干细胞上清：
将1×105/孔的P3代的脐带间充质干细胞接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；
去除培养基，a组加入无血清培养基，b组加入40μg/ml岩白菜素，培养24h后，收集上清，1200rpm离心5min，收集上清，使用0.22μm滤膜进行过滤得到培养基a和培养基b；
检测岩白菜素处理的脐带间充质干细胞上清对于皮肤成纤维细胞增殖的影响：
将2.5×103/孔的人皮肤成纤维细胞接种于96孔板中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；
去除培养基，对照组加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，实验组1加入含10％胎牛血清和40μg/ml岩白菜素的DMEM培养基，实验组2加入含10％胎牛血清的培养基a，实验组3加入含10％胎牛血清的培养基b；
培养48h后，每孔加入10μl CCK-8试剂，孵育4h后，使用酶标仪检测各组细胞的450nm吸光度。
根据图4可知，实验组1相较于对照组的OD值没有明显变化，说明单独的岩白菜素不能提高皮肤成纤维细胞的增殖能力；
实验组2相较于对照组的OD值明显升高，说明使用脐带间充质干细胞的上清可以有效的提高皮肤成纤维细胞的增殖能力；
实验组3相较于实验组2的OD值明显升高，说明使用岩白菜素处理的脐带间充质干细胞上清对于皮肤成纤维细胞增殖能力的提高优于未处理的脐带间充质干细胞上清，说明岩白菜素能够提高脐带间充质干细胞促进皮肤成纤维细胞增殖的能力。
实施例5：岩白菜素处理的脐带间充质干细胞对于血管内皮细胞的血管形成能力的影响
将1×105/孔的人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；
去除培养基，对照组加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，实验组1加入含10％胎牛血清和40μg/ml岩白菜素的DMEM培养基，实验组2加入含10％胎牛血清的培养基a，实验组3加入含10％胎牛血清的培养基b；
培养48h后，将对照组和实验组1-3的细胞重悬为1×105个/ml的细胞悬液；
将基质胶置于4℃过夜融化，枪头和96孔板均4℃提前过夜预冷；
在96孔板中，每孔加入50μL基质胶，37℃培养箱内放置2h，待基质胶完全凝固；
分别取每组细胞悬液100μL加入已铺胶的96孔板内，每孔细胞数为1×104个；
将96孔放入培养箱中，孵育4h后，观察小管形成的情况并随机选取5个视野进行拍照和统计，实验结果展示于图5中。
根据图5可知，实验组1相较于对照组的成管数量没有显著变化，说明岩白菜素对于人脐静脉内皮细胞的血管形成能力没有影响；
实验组2相较于对照组的成管数量显著增加，说明使用脐带间充质干细胞的上清能够提高人脐静脉内皮细胞的血管形成能力；
实验组3相较于实验组2的成管数量显著增加，说明使用岩白菜素处理能够提高脐带间充质干细胞上清对于人脐静脉内皮细胞血管形成能力的促进作用。
实施例6：岩白菜素处理的脐带间充质干细胞对于血管内皮细胞的细胞迁移能力的影响
将1×105/孔的人脐静脉内皮细胞接种于6孔板中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；
去除培养基，对照组加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，实验组1加入含10％胎牛血清和40μg/ml岩白菜素的DMEM培养基，实验组2加入含10％胎牛血清的培养基a，实验组3加入含10％胎牛血清的培养基b；
培养48h后，将对照组和实验组1-3的细胞重悬为2.5×105个/ml的细胞悬液；
在Transwell小室的下室加入600μL含10％血清的培养基，上室中加入100μL包含2.5×104个细胞的细胞悬液，继续于细胞培养箱中培养24h；
将Transwell小室取出，吸干上室固定液，转移到预先加入800μL吉姆萨染液的孔中，室温染色20分钟；
染色结束后，使用清水冲洗浸泡3次，吸取上室液体，同时使用棉签小心擦去上室底部膜表面的细胞，置于显微镜随机选取5个视野进行拍照和统计，实验结果展示于图6中。
从图6可知，实验组1相较于对照组细胞迁移数目没有显著变化，说明岩白菜素不能促进人脐静脉内皮细胞的细胞迁移；
实验组2相较于对照组细胞迁移数目显著升高，说明使用脐带间充质干细胞的上清能够提高人脐静脉内皮细胞的细胞迁移能力；
实验组3相较于实验组2细胞迁移说明显著升高，说明使用岩白菜素处理能够提高脐带间充质干细胞上清对于人脐静脉内皮细胞的细胞迁移能力的促进作用。
综合上述结果可以得出，使用岩白菜素处理脐带间充质干细胞可以提高细胞的VEGF和bFGF分泌能力，提高细胞促皮肤成纤维细胞增殖能力，提高血管内皮细胞血管形成和迁移的能力，从而可以用岩白菜素处理来提高脐带间充质干细胞治疗伤口修复和血管新生的能力。
Claims (8)
1.一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)配置含有10-160μg/ml岩白菜素的细胞培养基，添加10％FBS，得到培养基A；
(2)将脐带间充质干细胞接种于细胞培养器具中，加入培养基A，置于细胞培养箱中培养48h后收集培养基；
(3)离心收集上清，使用0.22μm滤膜进行过滤得到培养基B；
(4)将培养基B用于制备促进伤口修复或血管新生的药物。
2.岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞旁分泌能力的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物促进脐带间充质干细胞分泌VEGF和bFGF。
4.岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞旁分泌能力的培养基中的应用，其特征在于，所述培养基促进脐带间充质干细胞分泌VEGF和bFGF。
5.岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞的伤口修复能力的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物提高皮肤成纤维细胞的增殖能力，提高血管内皮细胞的血管形成和迁移能力。
7.岩白菜素在制备提高脐带间充质干细胞的促进血管新生的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物提高血管内皮细胞血管形成和迁移能力。
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