CN115478050A - 一种提高干细胞体外扩增能力的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种提高干细胞体外扩增能力的方法，属于干细胞技术领域。本发明所提供的方法在培养基中添加紫花前胡苷来促进人脐血间充质干细胞的生长，紫花前胡苷可以通过调控细胞周期蛋白来促进人脐血间充质干细胞的生长。同时，本发明发现紫花前胡苷可以促进脐血间充质干细胞的成管能力，从而可将其用于制备促进脐血间充质干细胞血管形成的药物并用于治疗心血管疾病。

Description

一种提高干细胞体外扩增能力的方法
技术领域
本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种提供干细胞体外扩增能力的方法。
背景技术
间充质干细胞是一类来源于中胚层的干细胞，其具有自我更新和多向分化的能力。在体外，间充质干细胞可以被诱导分化为成骨细胞，神经细胞，心肌细胞，皮肤细胞等多种类型，因此是组织工程种子细胞的重要来源，具有良好的应用前景。
人脐血间充质干细胞是存在于新生儿脐带血中的一类间充质干细胞，其同样具有多向分化的潜能，可以分化为心肌，内皮，软骨，神经等多种类型的细胞。而且，人脐血间充质干细胞相较于骨髓间充质干细胞具有取材方便和无伦理争议的优点，而且人脐血间充质干细胞的细胞含量更多，增殖能力更强。
然而，从人体直接获取的人脐血间充质干细胞数量有限，为了达到使用的需求，需要对其进行体外扩增，因此有效的提高人脐血间充质干细胞的扩增能力将有助于短时间获取大量的细胞用于后续的组织工程。
紫花前胡苷是紫花前胡根中提取出的一种有效成分，其分子式为C20H2409,CAS号为: 495-31-8，其具有镇痛、抗炎、抗肿瘤和神经保护的作用，但是关于紫花前胡苷在干细胞中的作用则尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高干细胞体外扩增能力的方法,从而在体外有效的快速扩增人脐血间充质干细胞。
为了实现上述的目的，本发明提供了如下的技术方案：
其一，本发明提供了一种提高人脐血间充质干细胞体外扩增能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）将第三代的人脐血间充质干细胞使用胰酶消化后接种在细胞培养板中；
2）待人脐血间充质干细胞完全贴壁后，吸除培养基，根据细胞培养量加入含有紫花前胡苷的DMEM培养基；
3）将细胞培养板放入到细胞培养箱中，设定培养条件37℃ 5%CO2进行培养，即可快速扩增人脐血间充质干细胞。
优选地，所述紫花前胡苷在培养基中的浓度为25mmol/L或50mmol/L。
其二，本发明提供了一种提高干细胞体外扩增能力的培养基，所述培养基包括有效剂量的紫花前胡苷和DMEM培养基。
优选地，所述紫花前胡苷在培养基中的浓度为25mmol/L或50mmol/L。
优选地，所述干细胞为人脐血间充质干细胞。
其三，本发明提供了紫花前胡苷在制备促进人脐血间充质干细胞快速扩增的培养基中应用。
其四，本发明提供了紫花前胡苷在制备人脐血间充质干细胞的细胞周期蛋白表达调节剂中的应用，其特征在于，所述调节剂促进细胞周期促进蛋白Cyclin-D1和Ccyclin-E1的蛋白表达，所述调节剂抑制细胞周期蛋白抑制蛋白P21和P16的蛋白表达。
其五，本发明提供了紫花前胡苷在制备促进人脐血间充质干细胞的成管能力的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种提高脐血间充质干细胞体外扩增能力的新方法，该方法在培养基中添加紫花前胡苷来促进脐血间充质干细胞的生长。同时，本发明发现紫花前胡苷可以促进脐血间充质干细胞的成管能力，从而可将其用于制备促进脐血间充质干细胞血管形成的药物并用于治疗心血管疾病。
附图说明
图1为紫花前胡苷处理后人脐血间充质干细胞的CCK-8检测结果（*表示P＜0.05；**表示P＜0.01）；
图2为紫花前胡苷处理后人脐血间充质干细胞的WesternBlot检测结果；
图3为紫花前胡苷处理后人脐血间充质干细胞的ALP染色和茜素红染色检测结果；
图4为紫花前胡苷处理后人脐血间充质干细胞的的成管形成检测结果。
具体实施方式
下面具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1.将实验室保存的第三代的人脐血间充质干细胞使用胰酶进行消化后，制备成1×105/ml的细胞悬液，将细胞悬液添加到96孔板中，每孔100ul；
2.培养24h使细胞完全贴壁之后，去除培养基，按照如下分组进行处理，对照组（37℃，5%CO2，100ul DMEM培养基），低浓度紫花前胡苷组（37℃，5%CO2，含25mmol/L紫花前胡苷的100ul DMEM培养基），高浓度紫花前胡苷组（37℃，5%CO2，含50mmol/L紫花前胡苷的100ulDMEM培养基）；
3.分别在细胞被处理24h和48h的时候使用CCK-8检测OD值。
实施例2
1.将第三代的人脐血间充质干细胞接种在6孔板，待6孔板基本铺满时，将完全培养基更换为无血清培养基处理过夜；
2.去除无血清培养基，按照如下分组继续处理：对照组（37℃，5%CO2，2000ul DMEM培养基），实验组（37℃，5%CO2，含50mmol/L紫花前胡苷的2000ul DMEM培养基）；
3.处理24h后将培养基去除，加入100ul的蛋白裂解液，同时使用细胞刮刀将细胞轻轻的刮下并将刮下的细胞收集至离心管中；
4.冰上震荡裂解细胞30min后，4℃ 12000rcf离心15min，离心后吸取上清到新的离心管中；
5.使用BCA法测定蛋白浓度，加入Loding buffer后95℃煮10min得到蛋白样品；
6.配置12%的分离胶，选择20ug上样量依次进行上样，80V电泳30min后，切换电压为120V电泳1h左右；
7.安装电转夹，恒流250mA电转1.5h，将膜取出TBST洗5min后，置于5%脱脂奶粉中封闭1h；
8.将膜取出使用TBST洗膜三次后，使用BSA配置一抗稀释液，孵育相应的一抗，放置4℃摇床过夜；
9.回收抗体后，TBST洗膜3次，每次5min，采用脱脂奶粉配置二抗稀释液，常温孵育二抗1h；
10.TBST洗膜3次，每次5min后，进行曝光。
实施例3
1. 将第三代的人脐血间充质干细胞接种在6孔板，待6孔板基本铺满时，按照如下分组继续处理：对照组（37℃，5%CO2，2000ul DMEM培养基），实验组（37℃，5%CO2，含50mmol/L紫花前胡苷的2000ul DMEM培养基）；
2.处理24h后，去除培养基，加入成骨分化培养基进行培养；
3.诱导分化7天后，使用ALP染色液进行ALP染色并拍照；
4.诱导分化14天后，使用茜素红染色液进行染色并拍照。
实施例4
1.将Matrigel基质胶置于4℃冰箱中过夜溶解，同时将枪头盒，离心管，96孔板也置于4℃冰箱中预冷；
2.使用将无血清培养基和Matrigel基质胶按照1:1的比例进行混匀，混匀后加入到96孔板中；
3.将第三代的脐血间充质干细胞使用胰酶消化后，使用含10%FBS的培养基重悬，调整细胞密度为1×106，并按照每孔100ul将细胞重悬液加入到96孔板中；
4.过夜培养后，按照如下分组继续处理：对照组（37℃，5%CO2，100ul DMEM培养基），实验组（37℃，5%CO2，含50mmol/L紫花前胡苷的100ul DMEM培养基），置于细胞培养箱中处理24h后，倒置显微镜下进行拍照。
实施例5
一种提高人脐血间充质干细胞体外扩增能力的方法
1.将第三代的脐血间充质干细胞使用胰酶消化后接种在细胞培养板中；
2.待细胞完全贴壁后，吸除培养基，根据细胞培养量加入含有紫花前胡苷的DMEM培养基；
3.将细胞培养板放入到细胞培养箱中，设定培养条件37℃ 5% CO2进行培养，即可快速扩增人脐血间充质干细胞。
实验结果
实施例1的结果如图1所示，使用25mmol/L紫花前胡苷和50mmol/L紫花前胡苷处理的人脐血间充质干细胞的OD值明显高于对照组，说明紫花前胡苷能够促进人脐血间充质干细胞的生长并且具有一定的剂量依赖，因此可将紫花前胡苷用于制备促进人脐血间充质干细胞生长的药物。
实施例2的结果如图2所示，50mmol/L紫花前胡苷处理的人脐血间充质干细胞中细胞周期促进蛋白Cyclin-D1和Cyclin-E1的蛋白表达升高，同时脐血间充质干细胞中细胞周期抑制蛋白P21和P16的蛋白表达降低，说明紫花前胡苷可以通过调控细胞周期蛋白来调控人脐血间充质干细胞的生长，因此可以将紫花前胡苷制备成促进脐血间充质干细胞细胞周期促进蛋白表达和抑制脐血间充质干细胞细胞周期抑制蛋白表达的药物来调控人脐血间充质干细胞的生长。
实施例3的结果如图3所示，50mmol/L紫花前胡苷处理的人脐血间充质干细胞的ALP染色和茜素红染色相较于对照组均无显著的差异，说明紫花前胡苷处理对于人脐血间充质干细胞的成骨分化无影响。
实施例4的结果如图4所示，50mmol/L紫花前胡苷处理的人脐血间充质干细胞的成管能力明显高于对照组，说明紫花前胡苷可以促进脐血间充质干细胞的血管形成能力，因此可以将紫花前胡苷制备成促进脐血间充质干细胞血管形成的药物。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种提高人脐血间充质干细胞体外扩增能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1）将第三代的人脐血间充质干细胞使用胰酶消化后接种在细胞培养板中；
2）待人脐血间充质干细胞完全贴壁后，吸除培养基，根据细胞培养量加入含有紫花前胡苷的DMEM培养基；
3）将细胞培养板放入到细胞培养箱中，设定培养条件37℃ 5%CO2进行培养，即可快速扩增人脐血间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述紫花前胡苷在培养基中的浓度为25mmol/L或50mmol/L。
3.一种提高干细胞体外扩增能力的培养基，其特征在于，所述培养基包括有效剂量的紫花前胡苷和DMEM培养基，所述干细胞为人脐血间充质干细胞。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述紫花前胡苷在培养基中的浓度为25mmol/L或50mmol/L。
5.紫花前胡苷在制备促进人脐血间充质干细胞快速扩增的培养基中应用。
6.紫花前胡苷在制备人脐血间充质干细胞的细胞周期蛋白表达调节剂中的应用，其特征在于，所述调节剂促进细胞周期促进蛋白Cyclin-D1和Ccyclin-E1的蛋白表达，所述调节剂抑制细胞周期蛋白抑制蛋白P21和P16的蛋白表达。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116083355A (zh) * 2023-03-09 2023-05-09 青岛市中心医院 一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105343052A (zh) * 2015-11-12 2016-02-24 江苏康缘药业股份有限公司 紫花前胡苷元的应用
CN105420182A (zh) * 2015-11-18 2016-03-23 山东景源生物科技有限公司 一种无血清的脐带间充质干细胞培养基
CN105779388A (zh) * 2016-05-20 2016-07-20 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐血间充质干细胞的培养基及其培养方法
CN106361759A (zh) * 2016-10-17 2017-02-01 徐州诺克非医药科技有限公司 一种含有紫花前胡苷的药物在神经修复方面的应用
CN111808806A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 淮安泰凯睿医药科技有限公司 一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法
CN114606186A (zh) * 2022-04-18 2022-06-10 山东卡森细胞治疗工程技术有限公司 一种提高脐带间充质干细胞增殖的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105343052A (zh) * 2015-11-12 2016-02-24 江苏康缘药业股份有限公司 紫花前胡苷元的应用
CN105420182A (zh) * 2015-11-18 2016-03-23 山东景源生物科技有限公司 一种无血清的脐带间充质干细胞培养基
CN105779388A (zh) * 2016-05-20 2016-07-20 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种脐血间充质干细胞的培养基及其培养方法
CN106361759A (zh) * 2016-10-17 2017-02-01 徐州诺克非医药科技有限公司 一种含有紫花前胡苷的药物在神经修复方面的应用
CN111808806A (zh) * 2020-07-20 2020-10-23 淮安泰凯睿医药科技有限公司 一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法
CN114606186A (zh) * 2022-04-18 2022-06-10 山东卡森细胞治疗工程技术有限公司 一种提高脐带间充质干细胞增殖的方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116083355A (zh) * 2023-03-09 2023-05-09 青岛市中心医院 一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法
CN116083355B (zh) * 2023-03-09 2023-12-01 广东赛尔生物科技有限公司 一种提高脐带间充质干细胞治疗能力的方法

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