CN111808806A - 一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法，培养基中含有CXCR7激动剂。CXCR7是CXC趋化因子受体家族中的一员，CXCR7高表达可以促进多种肿瘤细胞的增殖并促进其转移，CXCR7高表达还可以促进间充质干细胞的增殖和迁移活性。本发明发现，CXCR7蛋白激动剂可以有效促进hUCMSCs的体外增殖，异柚葡糖苷为有效的CXCR7蛋白激动剂，且异柚葡糖苷在促进hUCMSCs增殖的同时不会降低其干细胞特性。

Description

一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法
技术领域
本发明属于医药领域，涉及干细胞，具体涉及促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法。
背景技术
间充质干细胞凭其自我更新能力与多向分化潜能，目前已被广泛应用于组织工程与再生医学领域，来源广泛，体外易于操作，因此间充质干细胞治疗具有广阔前景，其中，人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)被认为是具备更高可塑性和更低免疫原性的原始间充质干细胞群，方便易取。大量研究证实hUCMSCs经诱导培养能向多种成体细胞分化，在体外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞等，在体内可以分化为多巴胺能神经元、骨骼肌细胞、内皮细胞、胰岛细胞等。hUCMSCs在新兴转化医学中展现出广阔的应用前景。
CXCR(CXC趋化因子受体)是完整的膜蛋白，其特异性结合并可调制CXC趋化因子家族的细胞因子，它们是代表趋化因子受体的一个亚家族。CXCR7是其中一员。研究表明，CXCR7在细胞增殖、迁移方面发挥了重要作用，比如CXCR7高表达可以促进多种肿瘤细胞的增殖并促进其转移。
毛雨红在体外探讨了CXCR4/CXCR7在SDF-1诱导MSCs增殖和迁移中的作用，发现SDF-1可能通过上调CXCR4的表达并与之结合在促进MSCs的体外增殖和迁移中起关键作用，而CXCR7对增殖有一定作用，但对迁移无明显影响(CXCR4/CXCR7在SDF-1诱导间充质干细胞增殖、迁移中的作用及信号转导机制研究，桂林医学院硕士学位论文，2013)。
李娅莎等探讨SDF-1/CXCR4及SDF-1/CXCR7对人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)迁移和增殖活性的影响，结果发现CXCR4/CXCR7均参与介导了SDF-1诱导的hUCMSCs细胞迁移作用，同时CXCR7还介导了SDF-1诱导的hUCMSCs增殖和H2O2处理损伤的保护(过表达CXCR4/CXCR7影响人脐带间充质干细胞迁移和增殖，基础医学与临床，2016)。
可见CXCR7在间充质干细胞的增殖、迁移方面扮演着重要角色，CXCR7激动剂有望开发成促进间充质干细胞增殖的成分。
发明内容
本发明的意图在于提供一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法。
技术方案如下：
一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法，培养基中含有CXCR7激动剂。
进一步地，所述CXCR7激动剂为异柚葡糖苷。在具体实施方式中，与对照组增殖率100％相比，0.2mg/mL、0.5mg/mL异柚葡糖苷的实验组的增殖率高达155.60％、257.58％。
一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并维持干细胞特性的方法，脐带间充质干细胞的培养基中含有CXCR7激动剂。
进一步地，所述CXCR7激动剂为异柚葡糖苷。在具体实施方式中，与对照组增殖率100％相比，0.2mg/mL、0.5mg/mL异柚葡糖苷的实验组的增殖率高达155.60％、257.58％；而且，不同浓度实验组的脐带间充质干细胞表面的各标记表达水平与对照组基本一致，仍然符合hUCMSCs的表面标记特点。
技术效果：
CXCR7是CXC趋化因子受体家族中的一员，CXCR7高表达可以促进多种肿瘤细胞的增殖并促进其转移，CXCR7高表达还可以促进间充质干细胞的增殖和迁移活性。本发明发现，CXCR7蛋白激动剂可以有效促进hUCMSCs的体外增殖，异柚葡糖苷为有效的CXCR7蛋白激动剂，且异柚葡糖苷在促进hUCMSCs增殖的同时不会降低其干细胞特性。
附图说明
图1为第5代hUCMSCs的倒置显微镜下观察结果图，可见hUCMSCs贴壁生长，呈梭形，大小较均等，呈平行或旋涡状生长，符合hUCMSCs的细胞生物学特点。
图2为第5代hUCMSCs的流式细胞仪检测结果图，CD90、CD105、CD73阳性表达，CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR阴性表达，符合hUCMSCs的表面标记特点。
图3为对照组和不同浓度实验组的OD值和增殖率，不同浓度实验组的OD值均显著高于对照组，不同浓度异柚葡糖苷可以有效促进脐带间充质干细胞体外增殖，与对照组增殖率100％相比，0.2mg/mL、0.5mg/mL异柚葡糖苷的实验组的增殖率高达155.60％、257.58％。
图4为对照组和不同浓度实验组hUCMSCs中CXCR7蛋白表达结果图，与对照组相比，0.2mg/mL、0.5mg/mL异柚葡糖苷的实验组的CXCR7蛋白表达量显著升高，说明异柚葡糖苷可以显著促进hUCMSCs中CXCR7蛋白的表达，异柚葡糖苷为有效的CXCR7蛋白激动剂。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图介绍本发明的实质性内容，但不作为本发明保护范围的限制。
一、试验材料
人脐带组织取自健康足月顺产胎儿，置于含有1％双抗的无菌PBS溶液中，8h内使用。
α-MEM培养基、胎牛血清FBS和0.25％胰蛋白酶购自美国Gibco公司。
FITC或PE标记的小鼠抗人CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR抗体及各相关同型对照购自美国eBioscince公司。
MTT试验试剂购自碧云天。
异柚葡糖苷(CAS号：3682-02-8)纯度≥98％。
二、试验方法
1、脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定
hUCMSCs的分离和培养：将10～15cm足月新生儿脐带置于含有1％双抗的无菌PBS溶液中，转移至超净工作台，用含有1％双抗的无菌PBS溶液反复冲洗，洗净血管内污血，然后移至Hank's溶液中，去除两条脐静脉和一条脐动脉，剥离外皮，暴露中间的胶冻样的华通胶，剪成小段，晾干，剪成1mm3大小，铺至T75培养瓶底部，反转培养瓶，在组织块对侧加入10mL含有10％FBS和1％双抗的α-MEM培养基，于37℃、5％CO2、饱和湿度条件培养。12h后将培养瓶反转使培养基漫过组织块，继续培养约14d至组织块周围有细胞爬出时，去除组织块，用0.25％胰蛋白酶消化约30～60s，中止消化后1000r/min离心5min，重悬后接种至培养皿中，每3d换一次液，取第5代细胞在倒置显微镜下观察，用于后续实验。
hUCMSCs的鉴定：取第5代hUCMSCs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1×106个/mL，每离心管中加入1mL细胞悬液，无菌PBS洗涤2次，1000×g离心5min，弃上清，100μLPBS重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入适量CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000×g离心5min，PBS洗涤2次，加入500μLPBS重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。
2、MTT法测定脐带间充质干细胞体外增殖活性
取第5代hUCMSCs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔200μL，分为对照组及实验组，实验组更换为含不同浓度异柚葡糖苷(0.2mg/mL、0.5mg/mL，溶媒为DMSO)的完全培养基，对照组更换为含等体积溶媒的完全培养基，对照组和实验组的各浓度均分别设置5个平行复孔，继续培养48h后，每孔加入20μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，培养4h，去上清液，加入150μL DMSO轻轻震荡，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(OD值)，通过OD值按照如下公式计算实验组hUCMSCs增殖率，对照组hUCMSCs增殖率计为100％。实验组增殖率＝实验组OD值/对照组OD值×100％。
3、蛋白质免疫印迹法测定脐带间充质干细胞中CXCR7蛋白表达的影响
取第5代hUCMSCs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1×106个/mL，接种于12孔板，每孔2mL，分为对照组及实验组，实验组更换为含不同浓度异柚葡糖苷(0.2mg/mL、0.5mg/mL，溶媒为DMSO)的完全培养基，对照组更换为含等体积溶媒的完全培养基，继续培养48h后，去上清液，PBS洗涤，收集细胞，加入适量RIPA裂解液(100mmol/LPMSF)，冰上裂解30min，BCA法测定蛋白浓度，调整蛋白浓度一致后，加入5×上样缓冲液，100℃煮沸10min，10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭2h，加入CXCR7(1:1000)、β-actin(1:2000)一抗，4℃孵育过夜。TBST反复洗膜后，HRP标记二抗孵育1h，洗膜后化学发光试剂显色，用凝胶成像系统拍照，Image J软件分析灰度值。
4、流式法测定脐带间充质干细胞的干细胞特性
取第5代hUCMSCs，0.25％胰酶消化并调整细胞密度为1×106个/mL，接种于12孔板，每孔2mL，分为对照组及实验组，实验组更换为含不同浓度异柚葡糖苷(0.2mg/mL、0.5mg/mL，溶媒为DMSO)的完全培养基，对照组更换为含等体积溶媒的完全培养基，继续培养48h后，去上清液，PBS洗涤，收集细胞，制成1×106个/mL浓度的细胞悬液，每离心管中加入1mL细胞悬液，无菌PBS洗涤2次，1000×g离心5min，弃上清，100μL PBS重悬细胞后，向各管单细胞悬液中加入适量CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR抗体以及各同型对照，室温避光孵育30min，1000×g离心5min，PBS洗涤2次，加入500μL PBS重悬，制成单细胞悬液，流式细胞仪检测。
5、统计学分析
采用SPSS 17.0统计学软件分析所有数据并以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
三、试验结果
1、脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定结果
倒置显微镜下观察结果如图1所示，可见hUCMSCs贴壁生长，呈梭形，大小较均等，呈平行或旋涡状生长，符合hUCMSCs的细胞生物学特点。流式细胞仪检测结果如图2所示，CD90、CD105、CD73阳性表达，CD14、CD19、CD34、CD45和HLA-DR阴性表达，符合hUCMSCs的表面标记特点。
2、脐带间充质干细胞体外增殖活性测定结果
对照组和不同浓度实验组的OD值如表1和图3所示，不同浓度实验组的OD值均显著高于对照组，不同浓度异柚葡糖苷可以有效促进脐带间充质干细胞体外增殖，与对照组增殖率100％相比，0.2mg/mL、0.5mg/mL异柚葡糖苷的实验组的增殖率高达155.60％、257.58％。
表1对照组和不同浓度实验组的OD值和增殖率
Figure BDA0002592975740000041
3、Western Blot测定结果
对照组和不同浓度实验组的CXCR7蛋白表达结果如图4所示，与对照组相比，0.2mg/mL、0.5mg/mL异柚葡糖苷的实验组的CXCR7蛋白表达量显著升高，说明异柚葡糖苷可以显著促进脐带间充质干细胞中CXCR7蛋白的表达，异柚葡糖苷为有效的CXCR7蛋白激动剂。
4、脐带间充质干细胞的干细胞特性测定结果
对照组和不同浓度实验组的流式细胞仪检测结果如表2所示，不同浓度实验组的脐带间充质干细胞表面的各标记表达水平与对照组基本一致，仍然符合hUCMSCs的表面标记特点。该结果表明，异柚葡糖苷在促进hUCMSCs增殖的同时不会降低其干细胞特性。
表2对照组和不同浓度实验组的流式细胞仪检测结果
Figure BDA0002592975740000051
综上可见，CXCR7蛋白激动剂可以有效促进hUCMSCs的体外增殖，异柚葡糖苷为有效的CXCR7蛋白激动剂，且异柚葡糖苷在促进hUCMSCs增殖的同时不会降低其干细胞特性。
上述实施例和附图用于具体介绍本发明的实质性内容，但不作为本发明保护范围的限制。

Claims (4)

1.一种促进脐带间充质干细胞体外增殖的方法，其特征在于：脐带间充质干细胞的培养基中含有CXCR7激动剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CXCR7激动剂为异柚葡糖苷。
3.一种促进脐带间充质干细胞体外增殖并维持干细胞特性的方法，其特征在于：脐带间充质干细胞的培养基中含有CXCR7激动剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CXCR7激动剂为异柚葡糖苷。
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