KR20180048617A - 줄기 세포 이식 방법 및 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조혈 줄기 또는 전구 세포의 이식 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 내피 세포와의 공-배양 및 공동-투여를 통해 조혈 줄기 또는 전구 세포의 증식 및 생착을 개선하는 방법, 조성물 및 키트가 제공된다. 이러한 방법, 조성물 및 키트는 질환 또는 골수파괴성 처치에 의해 유발되는 조혈 작용의 결함과 관련있는 다양한 질환들을 치료하는데 유용하다.
Description
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출원에 대한 교차
-참조
본 출원은 2015년 7월 20일자 미국 가출원 번호 62/194,460에 대한 우선권을 주장하며, 그 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
원용에 의한 병합
단순 원용에 의한 병합을 허용하는 법을 가진 국가들에 대해, 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 본원에 인용 또는 언급된 모든 제품에 대한 임의 제조사의 설명서 또는 카탈로그 역시 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본원에 원용에 의해 포함되는 문헌들 또는 포함된 모든 교시 내용들은 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 개선된 줄기 세포 요법을 위한 방법과 조성물에 관한 것이며, 보다 상세하게는 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 증식 및 생착과, 줄기 세포 이식 수여체의 조혈계의 면역 재구성을 촉진하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
조혈 줄기 또는 전구 세포 이식 (HSCT, hematopoietic stem or progenitor cell transplantation)은 광범위한 혈액 장애군을 치료하는데 중요한 요소이다. 일반적으로, 2가지 타입의 HSCT가 존재한다: 자가 이식 및 동종이계 이식. 자가 이식은 골수파괴성 처치 후 수여체 자신의 세포를 주입하는 것이다. 자가 세포 이식은 이식편대숙주 질환 (GVHD)의 위험성을 최소화하여, 합병증을 감소시킨다. 동종이계 이식은 전형적으로는 수여체의 MHC와 일치하는 공여체를 이용해 공여체 줄기 세포를 주입하는 것이다. 그러나, 일치된 비-혈연성 공여체 (MUD) 이식은 또한 보다 강력한 이식편대숙주 반응을 유발하여, 사망율이 높다.
조혈 줄기 및/또는 전구 세포 (HSPC)의 주요 공급원으로는 3가지가 있다: 골수, 말초혈 및 제대혈. 제대혈 (UCB)은 혈연성 및 비-혈연성 동종이계 조혈 줄기 세포 이식에서 다른 조혈 전구체 공급원 (예, 골수 및 동원된 말초혈)을 대체하는 유용한 공급원이다. 그러나, 공교롭게도, 제대혈은 쉽게 이용가능하고 보다 낮은 이식편대숙주 질환 발생률을 보이지만, 성공적이고 임상적으로 의미있는 면역 재건에 모두 중요한 다계통 세포 (예, 호중구, 혈소판, 적혈구)의 생착이 지연되는 특징을 가진다. 이에, 제대혈로부터 수득된 HSPC를 이용한 혈액 장애의 치료 전망은 유망하지만, 느린 조혈 회수 속도가 주요 걸림돌로 남아있으며, Laughlin, et al., N. Eng. J. Med. 351:22; 2265-2275 (2004), 생착 효율이 골수 또는 말초혈 유래의 HSC 보다 여전히 현저하게 낮다. Rocha et al., N. Eng. J. Med. 351:22; 2276-2285 (2004).
조혈 줄기 세포는 사이토카인 혼합물을 포함하는 특수 배지에서 증식시킬 수 있다. 줄기 세포 증식 기법은 미국 특허 6,326,198, 미국 특허 6,338,942; 미국 특허 6,335,195 등의, 당해 기술 분야에 공지되어 있다. Kobayashi et al. 및 Butler et al.은, Akt/Mtor 경로를 최소한으로 활성화하여 전-조혈계 생존 및 증식 신호의 발현을 유도하는 아데노바이러스 E40RF1 유전자를 형질전이함으로써, 일차 인간 내피 세포 (EC)로부터 형성되는 전-조혈성 혈관 니치 (pro-hematopoietic vascular niche)를 구축하는 방법을 최근 발표하였다. Kobayashi et al., Nature Cell Biology 12, 1046-1056 (2010); Butler et al., Blood 120, 1344-1347 (2012). 전형적인 HSPC/EC 증식 공정은 소형 세포-배양 플라스크에 적층된 EC 단층 상에서 초기 EC:HSPC 비율 6:1 내지 3:1을 적용해 HSPC를 공동-배양하는 과정을 포함한다. 24-48시간 후, HSPC를 취하여, 2차 플라스크의 또 다른 EC 단층 위에 배치하여 HSPC를 원하는 수로 수득할 때까지 배양한다. 그러나, 이러한 플라스크를 이용한 증식의 가장 큰 문제는 전형적인 공정의 경우 1,800회나 되는 용기의 개방 횟수가 상당히 빈번하여, 오염 위험성이 매우 높다.
인간 CD34+ HSPC 및 기타 조혈계 요소들을 임상적으로 유용하게 증폭시킬 수 있는 시험관내 배양 방법 및 시스템이 계속적으로 요구되고 있다. 인간 치료에서, 예를 들어, 골수 이식, 수혈가능한 혈액 성분 또는 유전자 테라피에 사용하기 위한 인자들을 충분한 양으로 공급하기 위해, 특정 골수 인자를 다량 생산할 수 있는 시스템이 요구된다. 본원에 언급된 방법은 이러한 필요성과 그외 요구들을 충족시킨다.
본 발명은, 폐쇄계 생물반응조에서 적어도 25:1, 50:1, 100:1 또는 500:1, 더 바람직하게는 1000:1, 2000:1 또는 3000:1의 EC/HSPC 비율로 HSPC를 내피 세포와 공-배양하여 전례없는 수준의 HSPC 증식을 제공함으로써, 당해 기술 분야의 오랜 요구에 응답하여 성공적으로 해결한다. 유의하게는, HSPC와 EC 간의 상호작용은 증식 공정 중에 교란되지 않게 유지되어, HSPC와 EC 간의 세포간 지속적인 교류가 유지되며, 따라서 증식 효율과 전체 수율이 증가된다. 또한, 개방 횟수가 배양 플라스크와 같은 개방 세포 배양 환경과 비교해 줄어들어, 오염 위험성이 상당히 감소한다.
본원의 방법에 따라 증식된 HSPC는, 특히 EC와 조합하여 HSCT 수용체에 투여되었을 때, HSPC와 EC 간에 지속적인 상호작용이 증식 및 투여 단계 내내 유지되여, 유익한 약리학적 효과를 나타낸다. 혈액 순환 및/또는 조직에 이러한 동종이계 내피 세포의 일시적인 존재는, 예를 들어, 호중구 카운트로 측정하였을 때, 다계통 생착 강화 및 긴 생착 기간 뿐만 아니라 상대적으로 빠른 초기 생착과 같이, HSCP에 유익한 생체내 성과를 제공한다. 본원에서 최초로 입증한 바와 같이, 내피 세포가 HSC와의 공-배양 전에 방사선 조사되어 복제불능화 되더라도, 이는 여전히 유효하다.
이에, 본 발명의 일 측면은, (a) 조혈 줄기 또는 전구 세포 (HSPC)를 내피 세포 (EC)와 EC/HSPC 초기 비율로 제1 기간 동안 HSPC의 증식을 허용하는 조건 하에 접촉시켜 HSPC를 증식시킴으로써, HSPC 및 EC를 HSPC/EC 증식 비율로 포함하는 증식된 세포 집단을 생산하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 수득한 증식된 세포 집단을 개체에게 주입하는 단계를 포함하며, 상기 증식 및 주입 단계 내내 HSPC와 EC 간에 지속적인 상호작용이 유지되는, 필요한 개체에 줄기 세포를 이식하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 이식이 필요한 개체에서 본원의 방법을 포함하는 줄기 세포 이식에 사용하기 위한 HSPC 및 EC를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, EC는 본원에 언급 및 기술된 바와 같이, 증식 및 주입 단계 내내 HSPC와 지속적으로 근접한 배치로 존재한다. 더 바람직하게는, EC는 적어도 증식 단계 동안에는 HSPC와 지속적으로 접촉된다.
일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 200:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 300:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 400:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 500:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 600:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 700:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 1000:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 2000:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 3000:1이다.
일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 10:1 내지 약 1:10이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 10:1 내지 약 1:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 9:1 내지 약 2:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 8:1 내지 약 3:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 7:1 내지 약 4:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 6:1 내지 약 5:1이다.
본 발명의 또 다른 측면은 HSPC 및 내피 세포를 본원의 방법에 따라 단리, 증식, 보존 및 투여하기 위한 키트 또는 시스템에 관한 것이다.
당해 기술 분야의 당업자는, 도면이 단순 예시 목적일 뿐이며 어떤 방식으로도 본 발명의 내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음을, 이해할 것이다.
도 1은 E4ORF1+ 조작된 EC에 대한 방사선 노출 효과를 나타낸 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. EC는 표준 배양 조건 하에 회수하고, E4ORF1로 형질전이하였다. 그런 후, 세포를 2개의 플라스크로 나누어 넣고, 100% 컨플루언트가 될 때까지 추가로 배양하였다. 플라스크 하나는 조작하지 않고 두고 (좌측 패널), 다른 플라스크는 세슘 방사선 조사 장치를 사용해 1500cGy로 조사하였다 (우측 패널). 위상 현미경 검경에서 2개의 플라스크 간에 검출가능한 차이는 없었다.
도 2는 1주일간의 배양시 방사선 처리된 (하단) 및 방사선 비-처리된 (상단) E4ORF1+ 조작된 EC의 연속 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. 2개의 플라스크의 세포는 세미-컨플루언스로 배양하였으며, 이때 하나의 플라스크 (하단)에는 세슘 방사선 조사 장치를 사용해 1500cGy로 방사선 처리하였다. 이들 2개의 플라스크를 1주일간 더 배양하였으며, 방사선 처리 후 1, 5 및 7일째에 위상 현미경 사진을 촬영하였다.
도 3은 방사선 처리된 (하단) 및 방사선 비-처리된 (상단) E4ORF1+ 조작된 EC와의 공-배양 중인 HSPC의 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 6웰 플레이트에서 방사선 비-처리된 및 1500cGy로 방사선 처리된 E4ORF1 EC의 컨플루언트 단층과 함께 공-배양하였다. 세포의 11일 증식 및 계대 배양 후, 오리지날 배양 웰 ("마더 웰", 좌측) 및 연속 계대 배양에 의해 생성된 최종 웰 ("엔드 웰", 우측)에 대한 위상 현미경 사진을 촬영하였다.
도 4는 방사선 조사된 (하단 패널) 및 방사선 비-처리된 E4ORF1+ 조작된 EC (상단 패널)과의 HSPC의 공-배양물의 유세포 측정 데이타를 도시한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 6웰 플레이트에서 방사선 처리되거나 비-처리된 E4ORF1 EC의 컨플루언트 단층에서 6웰 플레이트에서 공-배양하였다. 11일간 증식 후, 조혈 세포를 유세포 측정으로 분석하였다. 좌측 컬럼은 CD45의 발현 (pan 조혈 세포 표면 마커)에 대한 세포 염색 결과를 보여준다. 우측 컬럼은 CD34 (HSPC 양성 마커) 및 CD38 (HSPC 음성 마커)의 발현에 대한 세포의 2중 염색 결과를 보여준다.
도 5는 단기간 (좌측 패널) 및 장기간 (우측 패널) HSPC-E4ORF1+ 조작된 EC 공-배양물 및 발생되는 EC 소모 (attrition)에 대한 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 6웰 플레이트에서 EC 컨플루언트 단층과 함께 공-배양하였다. HSPC 집단이 증식됨에 따라, 비-부착성 세포를 조심스럽게 취하여, 더 크고 신선한 EC 층 위에 배치하였다. "마더 웰"로 지칭되는 오리지날 웰에 추가의 배지를 재공급한다. 이 과정은 약 48시간 마다 모든 공-배양 웰에 대해 반복 실시한다. 공-배양 7일간, 마더 웰의 E4ORF1+ 조작된 EC (우측 패널)는 신선한 E4ORF1 EC 상에 접종된 동일하게 증식시킨 HSPC의 공-배양 1일 (좌측 패널)과 비교해, 고갈된다.
도 6은 E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 불연속적으로 접촉시켜 증식한 경우 및 사이토카인 단독 처리하여 증식한 경우와 비교해, E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 지속적으로 접촉시켜 생물반응조에서 증식시킨 전체 조혈 세포를 정량한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 사이토카인을 단독 첨가한 플라스크, E4ORF1+ 조작된 EC의 단일층이 존재하는 플라스크, 또는 E4ORF1+ 조작된 EC가 미리-탑재된 중공사 생물반응조에서 증식시켰다. 사이토카인 단독 처리 증식 및 플라스크에서 E4ORF1+ 조작된 EC 상에서의 증식에서는, 증식 기간 동안 세포를 헹구고 재접종하기 위해 배양 과정의 중단이 필요하다. CD45+ 세포 집단의 세포 카운팅 및 유세포 측정을 배양 6일째에 수행하였다.
도 7은 E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 불연속적으로 접촉시켜 증식한 경우 및 사이토카인 단독 처리하여 증식한 경우와 비교해, E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 지속적으로 접촉시켜 생물반응조에서 증식한 경우의 HSPC 증식의 콜로니 형성 분석 결과를 정량하여 나타낸 것이다. 약어 "CFU"는 콜로니-형성 단위를 지칭한다. 멀티플 현미경 뷰 필드에서 콜로니의 수를 이용해 전체 증식된 집단의 CFU 수를 추정하였다.
도 1은 E4ORF1+ 조작된 EC에 대한 방사선 노출 효과를 나타낸 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. EC는 표준 배양 조건 하에 회수하고, E4ORF1로 형질전이하였다. 그런 후, 세포를 2개의 플라스크로 나누어 넣고, 100% 컨플루언트가 될 때까지 추가로 배양하였다. 플라스크 하나는 조작하지 않고 두고 (좌측 패널), 다른 플라스크는 세슘 방사선 조사 장치를 사용해 1500cGy로 조사하였다 (우측 패널). 위상 현미경 검경에서 2개의 플라스크 간에 검출가능한 차이는 없었다.
도 2는 1주일간의 배양시 방사선 처리된 (하단) 및 방사선 비-처리된 (상단) E4ORF1+ 조작된 EC의 연속 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. 2개의 플라스크의 세포는 세미-컨플루언스로 배양하였으며, 이때 하나의 플라스크 (하단)에는 세슘 방사선 조사 장치를 사용해 1500cGy로 방사선 처리하였다. 이들 2개의 플라스크를 1주일간 더 배양하였으며, 방사선 처리 후 1, 5 및 7일째에 위상 현미경 사진을 촬영하였다.
도 3은 방사선 처리된 (하단) 및 방사선 비-처리된 (상단) E4ORF1+ 조작된 EC와의 공-배양 중인 HSPC의 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 6웰 플레이트에서 방사선 비-처리된 및 1500cGy로 방사선 처리된 E4ORF1 EC의 컨플루언트 단층과 함께 공-배양하였다. 세포의 11일 증식 및 계대 배양 후, 오리지날 배양 웰 ("마더 웰", 좌측) 및 연속 계대 배양에 의해 생성된 최종 웰 ("엔드 웰", 우측)에 대한 위상 현미경 사진을 촬영하였다.
도 4는 방사선 조사된 (하단 패널) 및 방사선 비-처리된 E4ORF1+ 조작된 EC (상단 패널)과의 HSPC의 공-배양물의 유세포 측정 데이타를 도시한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 6웰 플레이트에서 방사선 처리되거나 비-처리된 E4ORF1 EC의 컨플루언트 단층에서 6웰 플레이트에서 공-배양하였다. 11일간 증식 후, 조혈 세포를 유세포 측정으로 분석하였다. 좌측 컬럼은 CD45의 발현 (pan 조혈 세포 표면 마커)에 대한 세포 염색 결과를 보여준다. 우측 컬럼은 CD34 (HSPC 양성 마커) 및 CD38 (HSPC 음성 마커)의 발현에 대한 세포의 2중 염색 결과를 보여준다.
도 5는 단기간 (좌측 패널) 및 장기간 (우측 패널) HSPC-E4ORF1+ 조작된 EC 공-배양물 및 발생되는 EC 소모 (attrition)에 대한 위상 현미경 사진을 도시한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 6웰 플레이트에서 EC 컨플루언트 단층과 함께 공-배양하였다. HSPC 집단이 증식됨에 따라, 비-부착성 세포를 조심스럽게 취하여, 더 크고 신선한 EC 층 위에 배치하였다. "마더 웰"로 지칭되는 오리지날 웰에 추가의 배지를 재공급한다. 이 과정은 약 48시간 마다 모든 공-배양 웰에 대해 반복 실시한다. 공-배양 7일간, 마더 웰의 E4ORF1+ 조작된 EC (우측 패널)는 신선한 E4ORF1 EC 상에 접종된 동일하게 증식시킨 HSPC의 공-배양 1일 (좌측 패널)과 비교해, 고갈된다.
도 6은 E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 불연속적으로 접촉시켜 증식한 경우 및 사이토카인 단독 처리하여 증식한 경우와 비교해, E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 지속적으로 접촉시켜 생물반응조에서 증식시킨 전체 조혈 세포를 정량한 것이다. 제대혈로부터 정제된 HSPC (CD34+)를 사이토카인을 단독 첨가한 플라스크, E4ORF1+ 조작된 EC의 단일층이 존재하는 플라스크, 또는 E4ORF1+ 조작된 EC가 미리-탑재된 중공사 생물반응조에서 증식시켰다. 사이토카인 단독 처리 증식 및 플라스크에서 E4ORF1+ 조작된 EC 상에서의 증식에서는, 증식 기간 동안 세포를 헹구고 재접종하기 위해 배양 과정의 중단이 필요하다. CD45+ 세포 집단의 세포 카운팅 및 유세포 측정을 배양 6일째에 수행하였다.
도 7은 E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 불연속적으로 접촉시켜 증식한 경우 및 사이토카인 단독 처리하여 증식한 경우와 비교해, E4ORF1+ 조작된 EC 및 HSPC를 지속적으로 접촉시켜 생물반응조에서 증식한 경우의 HSPC 증식의 콜로니 형성 분석 결과를 정량하여 나타낸 것이다. 약어 "CFU"는 콜로니-형성 단위를 지칭한다. 멀티플 현미경 뷰 필드에서 콜로니의 수를 이용해 전체 증식된 집단의 CFU 수를 추정하였다.
정의
본원에서, 본원의 설명에 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 구체적으로 달리 정의되지 않은 한 당해 기술 분야의 당업자에게 공통적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 즉, 아래 용어들은 하기 의미를 가지는 것으로 의도된다:
"동종이계"는 동일 종으로부터 유래되거나, 기원하거나 또는 속하는, 유전적으로 관련성이 있거나 또는 유전적으로 관련성은 없지만 유전자 측면에서 비슷한, 구성원을 지칭한다. "동종이계 이식"은 세포 또는 장기를 공여체에서 공여체와 동일 종에 속하는 수여체에게 이식하는 것을 의미한다.
"자가"는 동일 개체 또는 환자에서 유래되거나 기원하는 것을 의미한다. "자가 이식"은 개체 자신의 세포 또는 장기의 수집 및 재-이식을 의미한다.
"운명 결정된 골수 전구 세포 (committed myeloid progenitor cell)" 또는 "골수 전구 세포" 또는 "MP"는 궁극적으로 골수계의 최종 분화된 임의의 세포로 발달할 수 있지만, 림프구계 세포로는 전형적으로 분화하지 않는, 모든 다능성 또는 단분화성 전구 세포를 지칭한다. 그래서, "골수 전구 세포"는 골수계의 모든 전구 세포를 지칭한다. 운명 결정된 골수계 전구 세포로는 본원에 정의된 바와 같이 올리고포턴트 (oligopotent) CMP, GMP 및 MEP 등이 있으며, 또한 단분화성 적혈구 전구 세포, 거핵세포 전구 세포, 과립구 전구 세포 및 대식세포 전구 세포를 포괄한다. 골수 전구 세포의 여러가지 세포 집단들은 이들의 분화 잠재력과 특징적인 세포 마커 세트의 존재에 의해 다른 세포와 구분가능하다.
"공통 골수 전구 세포" 또는 "CMP"는 과립구/단핵세포 (GMP) 전구 세포 및 거핵세포/적혈구 (MEP) 전구 세포로 성장할 수 있는 능력으로 특정되는 세포를 지칭한다. 이들 전구 세포는 제한된 능력을 가지거나 또는 자가-재생력은 없지만, 골수성 수지상, 골수성 적혈구, 적혈구, 거핵세포, 과립구/대식세포, 과립구 및 대식세포로 성장할 수 있다.
"지속적인 상호작용"은 본원에서 본원에 언급된 하나 이상의 공정 단계 중에 HSPC가 EC와 적어도 지속적으로 근접 배치되는 것을 의미한다. 이런 맥락에서 "근접"은 동일 배지에서, 예를 들어 세포 배양 배지, 주입 배지 (transfusion medium) 또는 증식 단계와 주입 단계 사이에 증식된 세포 집단을 회수하는 단계 또는 증식된 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물의 제조 단계와 같은 임의의 선택 단계 중에 사용되는 임의의 배지 중에 HSPC와 EC가 함께 존재하는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, HSPC 및 EC는 조합된 증식 단계 및 주입 단계 중에 지속적으로 근접 배치로 존재한다. 다시 말해, HSPC와 EC는 증식 단계 내내 그리고 주입 단계가 완료될 때까지 동일 배지 중에 동시에 존재한다. 예를 들어, 증식 단계 중 어느 시점에도, 예를 들어, HSPC를 부가적인 EC와 접촉시키기 위해 증식 배지로부터 HSPC가 취해지지 않는다. 아울러, 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은, 내피 세포가 주입 단계 이전에 증식된 HSPC를 포함하는 증식된 세포 집단으로부터 분리되는, 임의의 정제 단계를 포함하지 않는다. 본원에서 "지속적인 상호작용"은 본원에 기술된 하나 이상의 공정 단계 중에 HSPC와 EC 간의 지속적인 접촉을 지칭하는 것일 수 있다. 일부 구현예에서, HSPC와 EC는 증식 단계 동안에 지속적으로 접촉한다. 이런 맥락에서, HSPC와 내피 세포 간의 용어 "접촉"은, HSPC와 EC 간의 거리가 ≤ 500 ㎛인 공간 관계를 지칭한다. 일부 구현예에서, HSPC와 EC 간의 거리는 ≤ 400 ㎛이다. 일부 구현예에서, HSPC와 EC 간의 거리는 ≤ 300 ㎛이다. 일부 구현예에서, HSPC와 EC 간의 거리는 ≤ 200 ㎛이다. 일부 구현예에서 HSPC와 EC 간의 거리는 증식이 수행되는 용기의 내부 크기 이하이다.
"배양"은 다양한 타입의 배지 상 또는 배지내에서의 세포 또는 유기체의 증식을 지칭한다. "공-배양"은 다양한 타입의 배지 상 또는 배지내에서의 2종 이상의 별개 타입의 세포 또는 유기체의 증식을 지칭하며, 예를 들어, 일부 구현예에서, HSPC 및 내피 세포가 공-배양될 수 있다.
용어 "조작된"은, 본원에서 세포와 관련하여 사용되는 경우, 사람에 의해 조작되어 언급된 표현형 (예, E4ORF1+)을 가지거나 또는 언급된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 지칭한다. 용어 "조작된 세포"는 천연적으로 생기는 세포를 포함하는 것을 의도하진 않지만, 대신, 예를 들어, 발현하지 않는 폴리펩타이드를 발현하게 되거나, 또는 비-조작된 내피 세포에서 관찰되는 수준 보다 실질적으로 높은 수준으로 폴리펩타이드를 발현하게 되도록, 예를 들어, 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포 또는 인공적으로 변이된 (예, 유전자 변형에 의해) 세포를 포괄하는 것으로 의도된다.
세포 맥락에서 "증식"은 특징적인 세포 타입 또는 세포 타입들이 동일하거나 또는 동일하지 않을 수 있는 세포의 초기 집단으로부터 수적으로 증가하는 것을 의미한다. 증식에 사용되는 초기 세포는 증식으로 제조되는 세포와 동일하여야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 증식된 세포는 세포의 초기 집단의 생장 및 분화에 의해 생성될 수 있다. 세포의 분화 잠재성을 규명하기 위해 사용되는 제한 희석 분석은 용어 증식에서 배제된다.
"유전자 변형" 또는 "유전자-변형된"은 세포의 정상적인 뉴클레오티드에 대한 임의의 부가, 결손 또는 파괴를 의미한다. 본 발명의 방법은 외인성 또는 외래 유전자 (또는 핵산 서열)을 HSPC 또는 내피 세포내로 전달하는 임의의 유전자 변형 방법을 포괄하는 것으로 의도된다. 용어 "유전자 변형"은 유전자 전달 비히클의 사용을 포괄하며, 비-제한적으로 형질도입 (핵산의 수여체로의 생체내 또는 시험관내 바이러스 매개 전달), 형질감염 (단리된 핵산의 세포로의 흡수), 리포좀 매개 전달 및 기타 당해 기술 분야에 충분히 공지된 수단 등을 포함한다.
"이식 편대 숙주 질환" 또는 "GVH" 또는 "GVHD"는 여러가지 MHC 클래스의 림프구가 숙주내로 도입되어 숙주에 대한 림프구의 반응을 유발할 때 발생하는 세포 반응을 지칭한다.
"과립구/대식세포 전구 세포" 또는 "GMP"는, 공통 골수성 전구 세포로부터 유래되며 과립구 및 대식세포로 생장시키는 능력이 특징적이지만, 전형적으로 골수계의 적혈구 세포 또는 거핵세포로 생장하진 않는, 세포를 지칭한다.
"조혈 질환"은 비-제한적인 예로, 조혈 악성, 이상혈색소증 및 면역결핍 등의 임의의 혈액 장애를 지칭한다.
"조혈 줄기 또는 전구 세포" 또는 "HSPC"는 본원에 정의된 HSC 뿐만 아니라 궁극적으로 조혈계의 모든 세포 타입으로 분화할 수 있는 다능성 비-자가-재생 전구 세포 및 조혈계의 특정 세포 타입으로 분화할 수 있는 올리고포텐트 및 단분화성 전구 세포를 망라한다. HSPC는 본원에 정의된 바와 같이 CMP, MP, MEP 및 GMP를 포함한다.
"조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 B 세포, T 세포, NK 세포, 림프성 수지상 세포, 골수성 수지상 세포, 과립구, 대식세포, 거핵세포 및 적혈구 세포 등의, 조혈계의 모든 세포 타입들로 궁극적으로 분화할 수 있는 클론형성 (clonogenic)을 가진 자가-재생성 만능성 세포를 지칭한다. 조혈계의 다른 세포에서와 같이, HSC는 전형적으로 특징적인 세포 마커 세트의 존재에 의해 정의된다.
"단리된"은 천연 또는 합성에 의해 제조되든 간에 하나 이상의 다른 산물, 화합물 또는 천연적으로 생성되는 상태에서 조합된 조성물로부터 분리된, 산물, 화합물 또는 조성물을 지칭한다.
"마커 표현형 확인"은 표현형 (예, 분화 상태 및/또는 세포 타입)을 확인하기 위한 세포 상의 마커 또는 항원을 동정하는 것을 의미한다. 이는, 세포 상에 존재하는 항원을 인지하는 항체를 사용하는 면역표현형 동정에 의해 행해질 수 있다. 항체는 단일클론 또는 다클론성일 수 있지만, 일반적으로 다른 세포 마커와의 교차반응성이 최소화되도록 선택된다. 특정 세포 분화 또는 세포 표면 마커는 세포가 유래된 동물 종에 고유하며, 다른 세포 마커들은 종들 간에 공통적일 것으로 이해된다. 종들 간의 등가의 세포 타입들을 정의하는 이들 마커들은 구조 (예, 아미노산 서열)에 종 차이가 존재하더라도 동일한 마커로 식별된다. 세포 마커는 특정 상황에서 세포 분화 (CD) 마커로도 지칭되는 세포 표면 분자 및 유전자 발현 마커를 포함한다. 유전자 발현 마커는 세포 타입 또는 분화 상태를 나타내는 발현된 유전자 세트이다. 일부, 유전자 발현 프로파일은 비-세포 표면 분자를 포함할 수도 있지만, 세포 표면 마커를 나타낼 것이다.
"거핵세포/적혈구 전구 세포" 또는 "MEP"는 공통 골수 전구 세포로부터 유래되며 적혈구 세포 및 거핵세포로 생장할 수 있는 능력으로 특정되지만, 전형적으로 과립구, 대식세포 또는 골수성 수지상 세포로 생장하지 못하는, 세포를 지칭한다.
"골수파괴성" 또는 "골수파괴"는 전형적으로 세포독성 물질 또는 방사선에의 노출에 의한 조혈계의 손상 또는 파괴를 의미한다. 골수파괴는 조혈계를 파괴하는 다량의 세포독성 물질에 의해 또는 전신 방사선 조사에 의해 야기되는 완전한 골수 파괴를 포괄한다. 또한, 이는 비-골수파괴성 컨디셔닝화에 의해 유발되는 완전한 골수파괴된 상태에 못 미치는 수준도 포함한다. 따라서, 비-골수파괴성 컨디셔닝은 개체의 조혈계를 완전히 파괴하진 않는 처리이다.
"자가-재생"은 세포가 분화하여 부모 세포와 동일한 (예, 자가-재생) 특징을 가진 하나 이상의 딸 세포를 만들 수 있는 능력을 지칭한다. 제2 딸 세포는 특정 분화 경로로 이행될 수 있으며, 예를 들어, 자가-재생성 조혈 줄기 세포는 분화하여 하나의 딸 줄기 세포와 골수성 또는 림프성 경로로의 운명이 결정된 또 다른 딸 세포를 형성한다. 운명 결정된 전구 세포는 전형적으로 자가-재생력을 상실하며, 세포 분화시 보다 분화된 (즉, 제한된) 표현형을 나타내는 딸 세포 2개를 만든다.
"분류"는 세포에 사용되는 경우 물리적 특징 또는 마커의 존재에 기반한 세포의 분리 또는 세포 마커의 존재에 기초한 세포 분석 (예, 사이드 스캐터 (SSC) 및 포워드 스캐터 (FSC)를 이용한 분류, 또는 표지된 항체를 이용한 형광 활성화 세포 분류 (FACS)), 예를 들어 분류없이 FACS에 기반한 세포의 분리를 지칭한다.
"줄기 세포"는 근육, 상피, 신경 및 골 줄기 세포 등의 다양한 세포 타입의 줄기 세포를 지칭한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 HSPC에 대한 것이다.
"개체" 또는 "환자"는 상호 호환적으로 사용되며, 언급된 경우를 제외하고는 인간 등의 포유류 및 인간을 제외한 영장류 뿐만 아니라 토끼, 랫, 마우스, 염소, 돼지 및 기타 포유류 종들을 지칭한다.
"실질적으로 순수한 세포 집단"은 언급된 세포 마커 특징 및 분화 잠재력을 가진 세포의 집단이 전체 세포 집단을 구성하는 세포들 중 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 약 75-80%, 더 바람직하게는 적어도 약 85-90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%를 차지하는 것을 의미한다. 즉, "실질적으로 순수한 세포 집단"은 지정된 분석 조건에서 명시된 마커 특징 및 분화 잠재력을 나타내지 않는 세포가 약 50% 미만, 바람직하게는 약 20-25% 미만, 더 바람직하게는 약 10-15% 미만, 가장 바람직하게는 약 5% 미만인 세포 집단을 지칭한다.
"치료학적 유전자"는 전체 유전자 또는 그 유전자의 기능적인 활성 단편만을 치징한다. 치료학적 유전자는 내인성 유전자의 결함 또는 부재로 인해 발생하는 환자에서의 결함을 보완할 수 있을 수 있다. 또한, 치료학적 유전자는 감염성 물질의 생성 또는 기능을 길항하거나, 병리학적 과정을 길항하거나 또는 숙주의 유전자 메이크업을 개선하거나, 생착을 촉진하거나 또는 줄기 세포의 치료학적 효능을 개선할 수 있는 것일 수 있다.
"이종성"은 다른 종, 예를 들어, 인간 및 설치류, 인간 및 돼지, 인간 및 침팬지 등에서 유래되거나, 기원하거나 또는 다른 종의 구성원을 치징한다. "이종 이식"은 세포 또는 장기를 공여체에서 공여체와 다른 종의 수여체로 전달하는 것을 의미한다.
조혈 줄기 또는 전구 세포의 증식
본 발명은 HSPC 생착을 촉진하기 위한 방법, 조성물 및 시스템 또는 키트를 기술한다. 일 측면에서, HSPC 및 EC를 계속적으로 지속적인 상호작용을 유지하면서 HSPC와 EC를 공-배양 및 공-주입하는 단계를 포함하는, 필요한 환자에서 HSPC의 생착을 강화하는 방법을 제공한다. 본원에서 처음으로 입증한 바와 같이, HSPC와 EC 간의 지속적인 상호작용을 증식 및 주입 단계 동안에 계속적으로 유지하게 되면, 형성되는 증식된 HSPC의 증식 효율과 생착을 증가시켜, 면역 재건 속도 및 완성도를 개선하고, HSPC 그래프트를 제공받은 이식 환자의 생존성을 향상시킨다.
조혈 줄기 세포는 자가-재생할 수 있는 만능성 줄기 세포이며, 조혈계의 모든 세포 타입으로 허용 조건 (permissive condition)에서 생장하는 능력을 특징으로 한다. HSC 자가-재생은 분열하여, HSC와 동일한 자가-재생력과 분화 잠재력을 가진 하나 이상의 딸 세포를 생산할 수 있는 HSC의 능력을 지칭하며; 즉, 세포 분열로 또 다른 HSC를 만드는 것을 의미한다. 자가-재생은 조혈계를 보충 (replenishment)하기 위한 미-분화된 줄기 세포에 대한 끊임없는 소스를 제공해준다. HSC를 동정하는데 유용한 마커 표현형은 당해 기술 분야에 통상적으로 공지된 것일 것이다. 인간 HSC의 경우, 세포 마커 표현형은, 바람직하게는 CD34+ CD38- CD90(Thy1)+ Lin-을 포함한다. 마우스 HSC의 경우, 예시적인 세포 마커 표현형으로는 Sca-1+ CD90+ (예, Spangrude, G. J. et al., Science 1:661-673 (1988)) 또는 c-kit+ Thylo Lin- Sca-1+ (Uchida, N. et al., J. Clin. Invest. 101(5):961-966 (1998))이 있다. 또 다른 HSC 마커, 예를 들어, 알데하이드 데하이드로게나제 (Storms et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. 96:9118-23 (1999)_, AC133 (Yin et al., Blood 90:5002-12 (1997)) 및 CD150 (SLAM) (Kiel Cell 2005, 121(7) 1109-21) 역시 사용하기 유용할 수 있다.
HSC는 골수, 말초혈, 제대혈 및 간, 특히 태아 간 등의 조혈 및 골수 전구 세포를 보유한 것으로 공지된 기타 소스 등의 다양한 소스로부터 수득될 수 있다. 말초혈 및 제대혈은 HSC가 풍부한 소스이다. 세포는 당해 기술 분야에 공지되고 통상적으로 사용되는 방법을 이용해 수득된다. 예를 들어, 골수 세포의 제조 방법은 Sutherland et al., Bone Marrow Processing and Purging: A Practical Guide (Gee, A. P. ed.), CRC Press Inc. (1991))에 기술되어 있다. HSC는 또한 배아 줄기 세포 (Thomson et al., Science 282:1145 (1998)) 및 생식 세포 (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726 (1998)) 등의 원시 줄기 세포 소스로부터 적절한 증식 및 분화 기법을 이용해 유래될 수 있다.
HSC 세포는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 조혈계를 이용해 임의의 동물 종으로부터 유래된다. 바람직하게는, 적절한 동물은, 비-제한적인 예로, 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 말, 소, 영장류 (예, 인간) 등의 포유류일 것이다.
본 발명의 일 측면은, (a) 조혈 줄기 또는 전구 세포 (HSPC)를 내피 세포 (EC)와 EC/HSPC 초기 비율로 제1 기간 동안 HSPC의 증식을 허용하는 조건 하에 접촉시켜 HSPC를 증식시킴으로써, HSPC 및 EC를 HSPC/EC 증식 비율로 포함하는 증식된 세포 집단을 생산하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 수득한 증식된 세포 집단을 개체에게 주입하는 단계를 포함하며, 상기 증식 및 주입 단계 내내 HSPC와 EC 간에 지속적인 상호작용이 유지되는, 필요한 개체에서 줄기 세포를 이식하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 측면은, 줄기 세포 이식이 (a) HSPC를 EC와 EC/HSPC 초기 비율로 제1 기간 동안 HSPC의 증식을 허용하는 조건 하에 접촉시켜 HSPC를 증식시킴으로써, HSPC 및 EC를 HSPC/EC 증식 비율로 포함하는 증식된 세포 집단을 생산하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 수득한 증식된 세포 집단을 개체에게 주입하는 단계를 포함하며, 상기 증식 및 주입 단계 내내 HSPC와 EC 간에 지속적인 상호작용이 유지되는, 필요한 개체에서 줄기 세포 이식에 사용하기 위한 HSPC 및 EC를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, HSPC는 조혈 줄기 세포이다. 일부 구현예에서, HSPC는 개체에 대해 동종이계이다. 일부 구현예에서, HSPC는 제대혈 HSPC이다. 일부 구현예에서, HSPC는 개체 자신의 것이다. 일부 구현예에서, HSPC는 유전자-변형된 정상 상태 골수 유래의 HSPC (gene-modified steady state bone marrow derived HSPC)이다.
일부 바람직한 구현예에서, 내피 세포는 유전자 변형된다. 아데노바이러스 초기 4 (E4) 영역은 적어도 6개의 오픈 리딩 프래임 (E4ORF)을 포함한다. 전체 E4 영역은 혈관신생을 조절하고, 내피 세포의 생존을 촉진하지만 증식은 촉진하지 않는 것으로 입증된 바 있다 (예, Zhang et al. (2004), J. Biol. Chem. 279(12):11760-66). E40RF들 중 일부는 유해한 효과를 가질 수 있기 때문에, 혈관신생을 유도하거나 또는 내피 세포의 생존 또는 증식을 촉진하기 위해, 전체 E4 영역을 임상적 또는 실험적으로 사용하는 것은 적합하지 않을 수 있다. 예를 들어, E4ORF6 유전자는 세포자살을 유도하는 것으로 알려져 있다 (Yamano et al. (1999) J. Virol. 73:10095-103). 또한, E4ORF는 면역원성이며, 따라서 E4ORF 전체를 개체에게 투여하는 것은 적절하지 않을 수 있다. Rafii et al., (WO2008089448)에서는 혈관신생을 유도하고, 내피 세포의 생존 및 증식을 촉진하기 위해 이용가능한 E40RF 영역내 서열들을 동정하였다.
ETV2 (Lee et al., Cell stem cell, 2: 497-507 (2008); Sumanas et al., Blood, 111: 4500-4510 (2008)), FLU (Liu et al., Current Bio. 18: 1234-1240 (2008)) 및 ERG (McLaughlin et al., Blood, 98: 3332-3339 (2001)) 등의, E-twenty six (ETS)-패밀리의 전사 인자 (TF)들 중 몇 가지는, 혈관 발생 및 혈관신생의 조절과 연루되어 있다 (De Val et al., Dev Cell, 16: 180-195 (2009); Sato et al., Cell Struct Funct, 26: 19-24 (2001)). 이들 TF는 EC 발생 및 기능과 관련된 유전자들의 발현을 직접 조절한다. 성체 EC는 FLU, ERG (이소형 1 및 2), ETS1, ETS2, Elfl, Elkl, VEZF 및 ETV6 등의 수종의 ETS 인자들을 구성적으로 발현하지만, ETV2는 배아 발생 중에 일시적으로 발현되며, 성체 EC에서는 발현되지 않는다 (Kataoka et al., Blood, 118: 6975-6986 (2011); Lelievre et al., The International Journal Of Biochemistry and Cell Biology, 33: 391-407 (2001)).
일부 구현예에서, EC는 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 발현하도록 조작된다 (즉, 이는 E4ORF1+ 조작된 내피 세포임). 일부 구현예에서, 내피 세포는 전술한 인자 등의 하나 이상의 ETS 패밀리 전사 인자를 발현하도록 조작된다 (즉, 이는 ETS+ 조작된 내피 세포임). 일부 구현예에서, 내피 세포는 ETS 패밀리 전사 인자 ETV2를 발현하도록 조작된다 (즉, 이는 ETV2+ 조작된 내피 세포임). 일부 구현예에서, EC는 E4ORF1+ ETV2+ 조작된 내피 세포이다. 일부 구현예에서, EC는 E4ORF1+ ETS+ 조작된 내피 세포이다. 일부 구현예에서, EC는 또한 E4ORF6+이다. 일부 구현예에서, EC는 ETS 패밀리 전사 인자를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, EC는 ETV2 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, EC는 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, EC는 아데노바이러스 E4ORF6 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 플라스미드 벡터내에 존재한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 조작된 EC의 게놈 DNA에 삽입된다. 일부 구현예에서, EC는 분화된 EC이다. 일부 구현예에서, EC는 성체 EC이다. 일부 구현예에서, EC는 배아 EC가 아니다. 일부 구현예에서, EC는 인간 EC이다. 일부 구현예에서, EC는 일차 EC이다. 일부 구현예에서, EC는 인간 제정맥 EC (HUVEC)이다.
일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 200:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 300:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 400:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 500:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 600:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 700:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 800:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 900:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 1000:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 1100:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 1200:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 1300:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 적어도 약 1400:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 약 1500:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 약 2000:1이다. 일부 구현예에서, EC/HSPC 초기 비율은 약 3000:1이다.
일부 구현예에서, 제1 기간은 약 1일 내지 약 24일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 1일 내지 약 12일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 1일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 2일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 3일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 4일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 5일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 6일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 7일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 8일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 9일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 10일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 11일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 12일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 13일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 14일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 15일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 16일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 17일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 18일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 19일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 20일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 22일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 23일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 24일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 25일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 26일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 27일이다. 일부 구현예에서, 제1 기간은 약 28일이다.
일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 10:1 내지 약 1:10이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 9:1 내지 약 1:9이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 8:1 내지 약 1:8이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 7:1 내지 약 1:7이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 6:1 내지 약 1:6이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 5:1 내지 약 1:5이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 4:1 내지 약 1:4이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 3:1 내지 약 1:3이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 2:1 내지 약 1:2이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 10:1 내지 약 1:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 9:1 내지 약 2:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 8:1 내지 약 3:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 7:1 내지 약 4:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 6:1 내지 약 5:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 10:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 9:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 8:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 7:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 6:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 5:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 4:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 3:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 2:1이다. 일부 구현예에서, HSPC/EC 증식 비율은 약 1:1이다.
일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 20배 내지 약 30,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 1,000배 내지 약 10,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 1,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 2,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 3,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 3,500배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 4,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 5,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 6,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 7,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 8,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 9,000배까지 증식한다. 일부 구현예에서, HSPC는 증식 단계에서 약 10,000배까지 증식한다.
일부 구현예에서, HSPC와 EC 간의 지속적인 상호작용은 증식 단계 동안에 HSPC와 EC 간의 지속적인 접촉과, 조합된 증식 및 주입 단계 동안에 HSPC와 EC의 지속적인 근접 배치 (continuous proximity)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 증식된 세포 집단을 회수하는 단계와 주입 단계에서 사용하기 위한 증식된 세포 집단을 포함하는 약학적 조성물을 제조하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, HSPC와 EC 간의 지속적인 상호작용은 전체 증폭, 회수, 약학적 조성물의 제조 및 주입 단계 동안에 HSPC와 EC의 지속적인 근접 배치를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 내피 세포를 주입하기 전에 증식된 HSPC로부터 분리하는 정제 단계를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 기간 동안에 증식에 대한 인간의 개입 (human interaction) 또는 방해는 발생하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 기간에 보충적인 사이토카인이 첨가된다. 일부 구현예에서, 50 ng/mL의 트롬보포이에틴 (TPO), Flt3 (FMS-관련 티로신 키나제 3) 리간드 및 줄기 세포 인자 (SCF)가 제1 기간 동안에 첨가된다. 일부 구현예에서, 증식 단계시 개방 횟수는 6회 이하이다.
증식 단계 이전에, HSPC 및 EC에 대해, 양성 및 음성 선별 방법을 둘다 포함할 수 있는, 선별 및 정제를 수행하여, 실질적으로 순수한 세포 집단을 수득할 수 있다. 일 측면에서, 유세포 측정으로도 지칭되는 형광 활성화된 세포 분류 (FACS)를 사용해, 여러가지 세포 집단을 분류 및 분석한다. HSPC 또는 EC 집단에 특이적인 세포 마커를 가진 세포는, 세포 마커들에 결합하는, 항체, 또는 전형적으로 항체 혼합물로 테깅된다. 서로 다른 마커에 대한 각각의 항체는 검출가능한 분자에, 특히 다른 항체에 커플링된 다른 플루레센트 염료와 구분될 수 있는 플루오레센트 염료에 접합된다. 테깅 또는 "염색된" 세포 스트림에 형광단을 방출하는 광원을 통과시키고, 특정 표지된 항체의 존재를 확인하기 위해 세포의 방출 스펙트럼을 검출한다. 당해 기술 분야에서 다색 형광 세포 분류로 지칭되는 여러가지 형광단들의 동시 검출을 통해, 여러가지 세포 마커 세트를 나타내는 세포를 집단의 다른 세포들로부터 동정 및 단리할 수 있다. 비-제한적인 예로, 사이드 스캐터 (SSC), 포워드 스캐터 (FSC) 및 바이탈 염료 염색 (예, 프로피듐 아이오다이드 사용) 등의 다른 FACS 파라미터들로, 세포를 크기 및 생활성을 토대로 선별할 수 있다. HSPC의 FACS 분류 및 분석은, 특히 미국 특허 5,137,809, 5,750,397, 5,840,580; 6,465,249; Manz, M.G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11872-11877 (2002); 및 Akashi, K. et al., Nature 404(6774):193-197 (2000))에 기술되어 있다. 형광 활성화된 세포 분류에 대한 일반적인 지침은, 예를 들어, Shapiro, H.M., Practical Flow Cytometry, 4th Ed., Wiley-Liss (2003) 및 Ormerod, M.G., Flow Cytometry: A Practical Approach, 3rd Ed., Oxford University Press (2000)에 기술되어 있다.
세포의 정제는 또한 본원에 기술된 방법의 조합을 포함하는 것으로 이해된다. 전형적인 조합은 원치않는 세포 및 세포 물질의 벌크를 제거하는데 효과적인 일차 과정, 예를 들어, 백혈구성분 채집 (leukapharesis)을 포함할 수 있다. 2차 단계는 기판 상에 결합된 항체 상에서 면역흡착에 의해 전구 세포 집단들 중 하나 이상에 공통된 마커를 발현하는 세포의 단리를 포함할 수 있다. 예를 들어, anti-CD34 항체를 포함하는 자기 비드는 CD34 항원을 공통적으로 발현하는 HSC, CMP 및 GMP 세포에 결합하여 이를 포획할 수 있다. 특이적인 세포 마커 세트에 대한 항체를 이용한 FACS 분류 등의 여러가지 세포 타입들에 높은 해상도를 제공하는 추가적인 단계를 이용해, 원하는 세포로 구성된 실질적으로 순수한 집단을 수득할 수 있다. 또 다른 조합은 anti-CD34 항체로 결합된 자기 비드를 이용한 일차 분리 후 FACS를 이용한 부가적인 정제 과정을 포함할 수 있다.
증식을 달성하기 위한 장치는 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 개방 세포 배양 환경, 예를 들어, 배양 플라스크 및 폐쇄된 세포 배양 환경, 예를 들어 세포 부착에 대한 수정이 가미되거나 또는 가미되지 않은 폐쇄계 웨이브 백 생물반응조, 및 폐쇄계 미니-생물반응조, 예를 들어, 원하는 경우 세포를 부착시킬 수 있는 코팅 또는 기타 시스템 또는 중공사를 포함하는 미니-생물반응조 등이 있다. 일부 구현예에서, 증폭 장치는 Quantum® Cell Expansion System (Terumo BCT, Lakewood, CO)이다.
치료학적 효과를 달성하기 위해 필요한 세포의 양은 구체적인 목적에 따라 통례적인 절차에 따라 실험적으로 결정될 것이다. 통상적으로, 치료학적 목적으로 세포를 투여하기 위해, 세포는 약리학적 유효량으로 제공된다. "약제학적 유효량" 또는 "약리학적 유효량"은 원하는 결과, 특히 개체의 생착 또는 생존을 달성할 수 있는 바람직한 생리학적 효과 또는 수준을 발휘하기에 충분한 양을 의미한다. 치료학적 이점은 또한 개선의 구현 여부와 무관하게 기저 질환 또는 장애의 진행을 중단 또는 서행시키는 것을 포함한다. 전술한 바와 같이, 약리학적 유효량은 또한 후술한 바와 같이 세포와 조합하여 사용되는 치료학적 화합물에도 적용될 것이다.
조혈 줄기 세포 이식 그래프트는 환자의 연령, 체중 및 건강 상태, 증상의 특성과 중증도에 따라 광범위하게 달라질 수 있다. HSPC의 적절한 투여량 범위는 이러한 고려 사항에 따라 달라진다. 일부 구현예에서, 그래프트는 개체 kg 당 HSPC 약 1 x 106 내지 약 1.0 x 108개를 포함할 것이다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 1.0 x 106 내지 약 1.0 x 108개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 1.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 2.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 3.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 4.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 5.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 6.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 7.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 8.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 9.0 x 106개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 1.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 2.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 3.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 4.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 5.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 6.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 7.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 8.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 9.0 x 107개를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 증식된 세포 집단은 개체 kg 당 HSPC 약 1.0 x 108개를 포함할 수 있다.
제대혈 유닛은 단일한 태반 및 탯줄에서 채집된 혈액이다. 제대혈 유닛내 유핵 세포의 수는 다양하다. 또한, 제대혈 유닛내 유핵 세포의 수는 냉동 및 해동 후 적어질 수 있다. 따라서, HSPC 투여시, 유핵 세포 카운트는 유닛 해동 전 또는 해동 후 측정되었는 지를 나타내는데 유익하다.
환자내 세포 이식은 당해 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법에 의해 달성된다. 바람직한 투여 방법은 정맥내 주입이다. 전술한 바와 같이, 주입되는 세포의 수는 성별, 나이, 체중, 질환 또는 장애의 타입, 장애 단계, 세포 집단내 원하는 세포의 비율 (예, 세포 집단의 순도) 및 치료학적 효과를 발휘하는데 필요한 세포 수 등의 인자들을 고려해 결정될 것이다.
세포는 한번의 주입으로 또는 치료학적 효과를 형성하는데 충분한 정해진 기간 동안 연속적인 주입을 통해 투여될 수 있다. 치료가 연속적인 주입을 수반하는 경우, 서로 다른 세포 집단이 주입될 수 있다. 추가적으로 후술한 바와 같이, 약제학적으로 허용가능한 담체가 세포를 환자에게 주입하기 위해 사용될 수 있다. 이는 전형적으로, 예를 들어, 완충화된 염수 (예, 포스페이트 완충화된 염수) 또는 비-첨가된 기본 세포 배양 배지 또는 당해 기술 분야에 공지된 배지를 포함할 것이다.
본원에 기술된 조혈 줄기 세포의 이식 방법은 다양한 장애들을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 장애는 질환에 의해 유발되는 조혈 작용의 결함 또는 골수파괴성 처치와 관련있다. 일부 구현예에서, 장애는 조혈 질환 (hematopoietic disease)이다. 일부 구현예에서, 장애는 골수 조혈 줄기 세포 이식이 필요한 장애이다. 일부 구현예에서, 장애는 감염성 또는 유전성 면역결핍 (genetic immunodeficiency)이다. 일부 구현예에서, 장애는 감염성 면역결핍이다. 일부 구현예에서, 장애는 HIV이다. 일부 구현예에서, 장애는 유전성 면역결핍이다. 일부 구현예에서, 장애는 혈액 질환, 예를 들어, T 세포에 작용하는 감염성 질환/유전성 질환 (예, 각각 HIV, SCID) 및 적혈구에 작용하는 유전성 질환 (이상혈색소증)이다. 일부 구현예에서, 장애는 빈혈이다. 일부 구현예에서, 장애는 판코니 빈혈이다. 일부 구현예에서, 장애는 조혈계 악성 (hematopoietic malignancy)이다. 본원에서, "치료"는 질환, 장애 또는 부적절한 병태에 대한 치료학적 또는 예방학적 처치 또는 억제성 처치를 지칭한다. 치료는, 질환 중증도를 낮추거나, 질환의 진행을 중단하거나 또는 질환을 제거하기 위해, 질환 증상의 개시 전 및/또는 임상 징후, 또는 질환 또는 병태의 다른 징후 이후에 적절한 형태로 대상 세포를 투여하는 것을 포괄한다. 질환의 예방은, 바람직하게는 장애에 대한 감수성이 높은 개체에서 장애 또는 질환의 증상 개시를 연장하거나 또는 지연하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다.
본원은 고형 장기, 세포 또는 조직 이식 분야에서 HSCT를 강화하는 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 비-제한적으로, 본원은 심장, 폐, 간, 신장, 섬세포 (islet cell), 피부, 내분비 장기 또는 췌장을 이식하는데 사용하기 위한 내피 세포-증식된 HSPC를 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 15일 내지 약 35일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 20일 내지 약 30일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 20일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 21일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 22일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 23일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 24일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 25일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 26일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 27일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 28일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 29일까지 적어도 약 20,000/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 30일까지 적어도 약 20,000/㎕이다.
일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 5일 내지 약 20일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 5일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 6일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 7일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 8일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 9일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 10일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 11일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 12일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 13일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 14일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 15일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 16일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 17일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 18일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 19일까지 적어도 약 100/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 20일까지 적어도 약 100/㎕이다.
일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 10일 내지 약 25일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 10일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 11일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 12일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 13일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 14일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 15일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 16일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 17일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 18일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 19일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 20일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 21일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 22일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 23일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 24일까지 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 25일까지 적어도 약 500/㎕이다.
일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 100일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 200일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 300일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 400일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 500일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 600일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 700일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 800일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 900일째에 적어도 약 500/㎕이다. 일부 구현예에서, 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치는 증식된 세포 집단을 개체에게 주입한 후 약 1,000일째에 적어도 약 500/㎕이다.
보조적 치료 (Adjunctive Treatment)
다양한 보조적 치료가 본원에 기술된 방법과 함께 사용될 수 있다. 일 측면에서, 보조적 치료는 특히 항-진균제, 항-세균제 및 항-바이러스제를 포함한다.
일 측면에서, 보조적으로 투여되는 물질은 항-진균제이다. 진균 감염은 골수파괴 요법 및 HSCT를 시술받은 환자에서 심각한 문제이다. 생착이 지연된 수여체 및 GVHD가 발병한 환자는, 전형적으로, 진균 감염 위험성이 높다. 진균 감염의 유형들은 다양하며, 특히, 칸디다증 (예, 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis)), 아스페르길루스증 (예, 아스퍼질러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 플라부스 (Aspergillus flavus)), 털곰팡이증 (예, 리조븀 아리주스 (Rhizobium arrhizus), 앱시디아 코림비페라 (Absidia corymbifera), 리조무코르 푸실러스 (Rhizomucor pusillus)), 크립토코커스증 (cryptococcosis), 히스토플라스마 캡슐라툼 (Histoplasma capsulatum) 및 콕시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis) 등이 있다.
보조적 투여용 항-진균제는 일반적으로 전신성 항-진균제일 것이다. 이런 타입의 유용한 항진균제 일종은 폴리엔 마크롤라이드계 항생제에 속하는 암포테리신 B이다. 암포테리신 B는 데옥시콜레이와의 착물로서; 콜레스테아릴 설페이트와의 콜로이드형 현탁물로; 소이 레시틴, 콜레스테롤 및 다이스테아로일포스파티질글리세롤로 제조된 리포좀내의 캡슐화된 형태 등의 다양한 제형으로 이용가능하며, 그외 제형들도 당해 기술 분야에 공지되어 있다.
또 다른 항진균제는 플루오르화 피리미딘인 플루사이토신이다. 진균에 의한 플루사이토신의 탈아민화로 5-플루오로우라실이 생성되는데, 이것은 항-대사산물이자 DNA 합성 저해제이다. 플루사이토신은 전형적으로 크립토코커스 및 칸디다증의 감염들에 사용된다. 플루사이토신은 단독 사용되지만, 일반적으로 암포테리신 B와 조합하여 사용된다.
이미다졸 및 트리아졸은 광의의 아졸계 항진균제 계열이다. 이미다졸 및 트리아졸은 14-α-데메틸라제를 저해하여, 에르고스테롤의 생합성을 손상시키고 세포막에 기반한 활성, 예를 들어 전자 전달을 파괴하는 것으로 보인다. 아졸계 항-진균제는 칸디다 알비칸스 (Candida albicans), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata) 및 칸디다 네오포르만스 (Candida neoformans) 등의 일부 칸디다증 타입에 대해 효과적이다. 전신 투여에 적합한 아졸 항진균제의 예로는, 특히, 케토코나졸 (ketoconzaole), 이트라카나졸 (itracanazole), 플루코나졸 (fluconazole), 에코나졸 (econazole), 보리코나졸 (voriconazole) 및 테르카노졸 (tercanozole) 등이 있다.
진균 감염 뿐만 아니라, 호중구 감소증 환자 역시 다양한 세균성 병원체에 쉽게 감염된다. 골수파괴성 요법 및 HSCT를 시술 중인 환자는 그람 양성 (예, 스트렙토코커스 (Streptococcus) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)) 및 그람 음성 박테리아 (예, E. coli 및 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa))에 의한 세균성 감염 위험성이 높다. 패혈증도 흔히 발생한다. GVHD가 발병한 이식 수용체의 경우, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 또는 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza) 등의 피낭성 박테리아 (encapsulated bacteria)에 대한 면역반응의 회복 손상 및 생착 지연을 나타낼 뿐만 아니라, 이환율도 높다.
보조적 항-세균성 요법은 특정 박테리아 병원체에 적합한 임의의 공지된 항생제를 이용할 수 있다. 이러한 것으로는 광범위 항생제와 보다 타겟화된 항-세균성 화합물 등이 있다. 증식된 골수 세포와 함께 사용하기 적합한 다양한 계열의 항-세균제로는, 비-제한적인 예로, 퀴놀론 및 플루오로퀴놀론, β-락탐 항생제, 아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 마크롤라이드 및 이들의 다양한 동질체 (cogener) 등이 있다. 예시적인 퀴놀론 화합물로는 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 스파르플록사신 (sparfloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin) 및 목시플록사신 (moxifloxacin) 등이 있다. 예시적인 β-락탐 항생제로는 페니실린 (예, 페니실린 G, 페니실린 V), 암피실린, 카르베니실린 (carbenicillin), 메티실린 (methicillin), 카르바페넴 (carbapenem) 및 세팔로스포린 (cephalosporin) (예, 세팔로틴 (cephalothin), 세파만돌 (cefamandole), 세파클로르 (cefaclor), 세포니시드 (cefonicid), 세포테탄 (cefotetan), 세파톡심 (cefatoxime), 세프타지딤 (ceftazidime), 세프티족심 (ceftizoxime), 세페핌 (cefepime)) 등이 있다. 예시적인 아미노글리코시드로는 네오마이신, 스트렙토마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin) 및 네틸마이신 (netilmicin) 등이 있다. 예시적인 마크롤라이드로는 에리트로마이신, 클라리트로마이신, 아지트로마이신 및 솔리트로마이신 등이 있다. 그외 항생제들 역시 당해 기술 분야의 당업자들에게 자명할 것이다.
바이러스 감염 역시 골수파괴성 환자 및 HSCT에 문제가 된다. 일반적으로, 바이러스 감염의 위험성 증가는 골수파괴성 요법에 의해 발생된 세포 매개 면역 손상으로 유발된다. 이들 감염증 다수는 혈청양성 환자 또는 혈청양성 공여체의 세포에 존재하는 잠복기 바이러스의 재활성화로 인해 발생한다. 그중에서도 흔하게 직면하는 바이러스는 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 헤르페스바이러스-6, 엡스타인-바 바이러스, 아데노바이러스 등이 있다. 세포 주입제에 대한 부가물로서, 선택되는 항-바이러스성 화합물은 환자가 당면한 바이러스에 적절한 것이다. 유용한 항-바이러스성 화합물로는, 비-제한적인 예로, 아시클로비르 (acyclovir), 시도포비르 (cidofovir), 간시클로비르 (ganciclovir), 이독수리딘 (idoxuridine), 펜시클로비르 (penciclovir), 발간시클로비르 (valganciclovir), 발아시클로비르 (valacyclovir), 비다라빈 (vidarabine), 아만타딘 (amantadine), 리만타딘 (rimantadine), 자나미비르 (zanamivir), 포미비르센 (fomivirsen), 이미퀴모드 (imiquimod) 및 리바비린 (ribavirin) 등이 있다. 레트로바이러스에 대한 치료제로는, 특히, 뉴클레오시드 역전사효소 저해제 (예, 지도부딘 (zidovudine), 디다노신 (didanosine), 스타부딘 (stavudine), 잘시타빈 (zalcitabine), 라미비두딘 (lamividudine)), 비-뉴클레오시드 역전사효소 저해제 (예, 네비라핀 (nevirapine), 에파비렌즈 (efavirenz), 델비루딘 (delvirudine)), 및 프로테아제 저해제 (예, 사퀴니비르 (saquinivir), 인디나비르 (indinavir), 리토나비르 (ritonavir), 넬피나비르 (nelfinavir), 암프레나비르 (amprenavir) 및 로피나비르 (lopinavir)) 등이 있다.
항-진균제, 항-세균제 및 항-바이러스제는 감염 발생을 줄이기 위해 예방제로서 사용될 수 있거나, 또는 질환 발병시 사용될 수 있다. 예방은 면역억제 환자에서 흔히 발생하는 진균 감염 및 혈청양성 환자 또는 혈청양성 이식 공여체에서의 바이러스 감염에 대해 특히 적절하다. 이에, 치료학적 목적에 대한 구현예들은 HSPC, MP 세포 및 항-진균성, 항-세균성 또는 항-바이러스성 화합물의 조합을 포함한다.
추가적인 구현예에서, 보조적으로 투여되는 물질은 최종적으로 분화된 골수 세포, 특히, 과립구, 대식세포, 거핵세포 및 적혈구 세포의 분화 및 동원성 (mobilization)을 강화하는 사이토카인 또는 성장인자이다. 과립구 발생을 강화하기 위해, 사이토카인 C-CSF 및 GM-CSF가 사용될 수 있다. G-CSF는 HSCT에서 호중구의 생착 및 생산을 가속화하는데 효과적이다. 다른 구현예에서, 사이토카인 또는 성장인자는 트롬보포이에틴이다. TPO의 투여는 이식된 전구 세포의 생착을 강화하고, 거핵세포 및 혈소판의 발생을 촉진한다 (Fox, N et al., J. Clin. Invest. 110:389-394 (2002); Akahori, H. et al., Stem Cells 14(6):678-689 (1996)).
당해 기술 분야의 당업자에게 자명한 바와 같이, 다양한 비히클 및 부형제, 그리고 다양한 투여 경로가 보조 요법에 사용될 수 있다. 대표적인 조제 기법은 특히 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995) 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed, Kibbe, A.H. ed., Washington DC, American Pharmaceutical Association (2000)에 교시되어 있다.
약학적 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 및 약리학적 유효량의 화합물, 또는 이들의 혼합물 또는 이들의 적절한 염을 포함할 것이다. 약학적 조성물은 산제, 과립제, 용액제, 현탁제, 에어로졸, 고형제, 환제, 정제, 캡슐제, 겔제, 국소 크림제, 좌제, 경피 패치 및 기타 당해 기술 분야에 공지된 제형으로서 조제될 수 있다.
본원에서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 약학적 조성물의 조제 분야의 당업자들에게 공지된 약제학적으로 허용가능한 임의의 표준 담체를 포함한다. 따라서, 약제학적으로 허용가능한 염 또는 접합체로서 존재하는 것 등의, 화합물은, 그 자체로, 약제학적으로 허용가능한 희석제; 예를 들어, 식염수, 포스페이트 완충화된 염수 (PBS), 에탄올 수용액, 또는 글루코스 용액, 만니톨 용액, 덱스트란 용액, 프로필렌 글리콜 용액, 오일 (예, 식물성 오일, 동물성 오일, 합성 오일 등), 미세결정 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록실프로필 메틸 셀룰로스, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 포스페이트, 젤라틴, 폴리소르베이트 80 등 중의 제형으로서, 또는 적절한 부형제 중의 고형 제형으로서, 존재할 수 있다.
약학적 조성물은 종종 하나 이상의 완충제 (예, 중성 완충화된 염수 또는 포스페이트 완충화된 염수), 탄수화물 (예, 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들어, 글리신, 항산화제 (예, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트, 부틸화 하이드록시톨루엔, 부틸화 하이드록시아니솔 등), 정균제, 킬레이트제, 예를 들어, EDTA 또는 글루타티온, 제형을 수여체의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약 저장성이게 만드는 용질, 현탁화제, 점증제, 보존제, 착향제, 감미제 및 착색 화합물을 적절한 경우 더 포함할 것이다.
당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의의 적절한 담체들이 조성물에 사용될 수 있으며, 담체의 타입은 전형적으로 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 치료학적 조성물은, 예를 들어, 경구, 코, 점막, 직장, 질, 국소, 정맥내, 복막내, 진피내, 피하 및 근육내 투여 등의 임의의 적절한 투여 방식에 맞게 조제될 수 있다.
본원에 언급된 약학적 조성물은 단위 용량 (unit-dose) 또는 다중-용량 용기, 예를 들어 밀폐된 앰플 또는 바이얼에 넣어 제공될 수 있다. 이러한 용기는 전형적으로 사용할 때까지 제형의 멸균성과 안정성을 보존하기 위한 상기한 방식으로 밀봉된다. 일반적으로, 제형은 현탁제, 용액제 또는 오일성 또는 수성 비히클 중의 유제로서 전술한 바와 같이 보관될 수 있다. 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 사용 직전에 무균성 액체 담체의 첨가만 필요한 동결-건조된 상태로 보관될 수 있다.
숙주에게 투여되는 양은 투여되는 물질, 투여 목적, 예를 들어 예방 또는 치료, 숙주의 상태, 투여 수단, 투여 빈도, 투여 간격 등에 따라 달라질 것이다. 이는 당해 기술 분야의 당업자가 경험적으로 결정할 수 있으며, 치료학적 반응 정도에 맞게 조정될 수 있다. 적절한 용량을 정하는데 고려되는 인자로는, 비-제한적으로, 개체의 신장 및 체중, 개체의 연령과 성별, 증상의 중증도, 질환의 단계, 제제의 전달 방법, 제제의 반감기 및 제제의 효능 등이 있다. 고려되는 질환 단계는 질환이 급성 또는 만성인지, 재발 또는 관해기인지, 그리고 질환의 진행성 (progressiveness)인지 등이다.
투여량 및 치료학적 유효량의 투여 횟수 결정은 당해 기술 분야의 당업자들의 능력으로 충분히 이루어진다. 예를 들어, 초기 유효량을 세포 배양 또는 기타 시험관내 분석으로 추정할 수 있다. 그런 후, 유효량은 동물 모델에서 세포 배양 분석으로 결정되는 바와 같이 IC50 농도 등의 순환 농도 또는 조직 농도를 형성하도록 확립할 수 있다.
키트
본원에 기술된 방법은 HSPC 생착을 강화하기 위한 키트에 의해 실시될 수 있다. 키트는, 비-제한적인 예로, 증식된 및/또는 단리된 세포 등의 HSPC, EC를 비롯한 세포, 및/또는 보조적인 치료학적 화합물, HSPC 및 EC를 단리 또는 증식시키기 위한 수단, 세포를 환자에게 투여하기 위한 수단, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 키트는 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체, 생리학적으로 허용가능한 담체, 사용 설명서, 용기, 투여 바셀, 항체 또는 이들의 임의 조합 중 일부 또는 전체를 포함할 수 있다. 전형적으로 라벨이 키트에 동봉되며, 라벨로는 키트 내용물의 사용 설명 또는 기타 사용 정보를 제공해주는, 전자 또는 컴퓨터 판독가능한 형태 (예, 디스크, 광학 디스크, 메모리 칩 또는 테이프)일 수 있는 임의의 기재 또는 기록 매체 (recorded material) 등이 있다.
본 발명의 실시는 달리 언급되지 않은 한 당해 기술 분야인 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양, 면역학 등에서 통상적인 기법들을 사용할 것이다. 이들 기법은 현 문헌에 충분히 기술되어 있으며, 특히 Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Springs Harbor Laboratory Press, 1989); the series Methods of Enzymology Academic Press, Inc.); and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., eds., (1987)을 참조한다.
실시예
본원의 측면들은 아래 실시예들에서 더 잘 이해될 수 있으며, 이들 실시예들은 어떤 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
1: 방사선
비처리된
EC를 이용한
HSPC의
증식
방사선 비-처리된 E4ORF1+ 조작된 EC는 전통적인 플라스크를 이용한 배양에서 약 15-20회 1:4로 분할하여 계대 배양되는 증식력을 가지고 있다. 이 방법에서, 방사선 비-처리된 E4ORF1+ 조작된 EC는 평평한 표면의 배양 용기에서 컨플루언스까지 충분한 양으로 증식시킬 수 있다. 세포의 접종량은 출발 물질의 양과 증식 기간에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 10일 증식하는 경우, 6웰 디쉬에 해당되는 플레이트 3개가 필요할 수 있다 (각각 직경이 약 35 mm). E4ORF1+ EC를 이들 웰에서 컨플루언스가 될 때까지 완전 배양 배지에서 배양한다. 컨플루언스에서, 배지가 컨디셔닝 배지로 전환된다. 컨디셔닝 배지에서 24시간 후, 예를 들어 제대혈 (UCB)로부터 유래된 CD34+ 정제된 세포를 E4ORF1+ EC가 미리 접종된 웰에, 트롬보포이에틴 (TPO), Fms-관련 티로신 키나제 3 리간드 (Flt-3L) 및 줄기 세포 인자 (SCF) 각각 50ng/ml로 구성된 사이토카인과 함께 접종할 수 있다. 2일 후, 배지를 회수하고, 세포는 펠릿화한 다음 신선한 사이토카인 함유 배지에 재현탁하여, 처음처럼 예비-컨디셔닝화된 2개의 또다른 웰에 분배한다. 첫번째 웰은 "마더 웰" 또는 "마더 플라스크"로 지칭되며, 여기에는 부가적인 사이토카인 함유 배지를 재-공급한다. 이 과정을 10일이 될 때까지 2일 간격으로 반복한다. 이 시기에, 모든 웰에는 증식된 HSPC와 E4ORF1+ EC가 들어 있다. 일부 경우, 중공사 생물반응조와 같은 생물반응조가 이용될 수도 있다. 중공사는 (예를 들어, 제조사의 설명서에 따라) 준비, 코팅, 컨디셔닝화될 수 있으며, 완전 배양 배지 중에 약 5x107 E4ORF1+ EC를 접종할 수 있다. 생물반응조는 세포를 "공급하며", 6일간 증식시킬 수 있다. 이때, 생물반응조를 이용해 거의 컨플루언스일 때, 배지를 사이토카인이 첨가되지 않은 컨디셔닝화된 배지로 교체하여, HSPC의 조기 분화를 유도할 수 있는 혈청 (예, 소 태아 혈청 (FBS))을 대신한다. 24시간 후, E4ORF1+ EC는 HSPC를 공급받을 준비가 된다. UCB 샘플은 다이메틸 설폭사이드 (DMSO) 중의 적혈구 세포 (RBC) 고갈된 산물로서 냉동 보관할 수 있다. 이 세포성 물질은 원시 CD34+ 집단을 정제 및 증식시키기 전에 헹군다. 이를 달성하기 위해, 샘플을 37℃ 비드 조에서 해동시킨다. 육안으로 얼음이 남아있는 것으로 보일 때, 유닛을 Miltenyi Prodigy 디바이스의 유체역학 장치 또는 유사 시스템와 무균적으로 연결한다. 이때, 해동 후 임의의 비-생존 세포의 핵산 내용물이 응집하여 점성을 형성하므로, 세포를 DNAse와 함께 인큐베이션한다. Miltenyi Prodigy 디바이스 또는 유사 디바이스는 세포를 헹구어 동결보존제를 제거할 수 있으며, RBS 샘플을 또한 제거할 수 있다. 여전히 Miltenyi Prodigy 디바이스에서, HSPC를 정제하기 위해 세포를 CD34 마이크로비드와 함께 인큐베이션한다. 마지막으로, 세척 단계를 수행한다. 마이크로비드에 결합된 CD34+ 세포를, 이후 표지된 CD34+ 세포를 자기에 의해 정제하기 위해 Miltenyi CliniMacs 디바이스 또는 유사 장치에 투입한다. 이용가능한 CD34+ 세포의 회수율은 50-70%일 것으로 예상된다.
이후, 정제된 CD34+ 분획을 사이토카인, 즉 SCF, TPO 및 Flt3L이 각각 50ng/ml씩 첨가된 HSPC 증식 배지 총 200 ml에 첨가한다. 그런 다음, 이를 생물반응조에 넣어, E4ORF1+ 조작된 EC (증식 0일)와 동일한 내부 챔버 안에 둔다. 증식 내내, 외부 챔버를 통해 대사산물 교환 속도 약 0.4 ml/min로 계속적으로 HSPC 증식 배지 (사이토카인 무첨가)를 공급하고, 90% N2, 5% O2 및 5% CO2를 공급하는 가스 교환 모듈이 포함된 재순환 루프에서 약 30 ml/min 속도로 순환시킨다. 또한, 증식 2일 및 4일에, 사이토카인, 즉 SCF, TPO 및 Flt3L이 각각 50ng/ml씩 첨가된 HSPC 증식 배지 총 200 ml을 내부 챔버에 첨가한다. 증식 6일 후, 증식을 중단하고, 이때 세포성 물질을 전부 회수한다.
실시예
2: 방사선 조사된 EC를 이용한
HSPC
증식
E4ORF1+ 조작된 EC는 방사선 또는 미토마이신 C와 같은 유사분열 불활성화 자극을 받은 후 HSPC를 증식시키기에 완전히 적절해진다. 유사분열 불활성화 후 세포를 이용하기 위해, 세포가 최종 배양 용기에서 컨플루언스에 도달하였을 때 유사분열 불활성화 자극을 처리하고, 컨디셔닝화된 배지로 전환되기 전까지 완전 배지에서 24시간 회복되게 둔다. 유사분열 불활성화된 세포를 생물반응조에서 이용하는 경우, E4ORF1+ 조작된 EC, 또는 ETV2+ E4ORF1+ 조작된 EC, 또는 E4ORF1+ E4ORF6+ 조작된 EC를, 세포 약 10억개가 될 때까지 배양한다. 세포는 유사분열 불활성화 자극 처리 후 냉동보존할 수 있다. 유사분열 불활성화된 EC 샘플 전체를 생물반응조에 투입하여, 24시간 동안 부착되게 둔다. 배지의 컨디셔닝화를 이후 24시간 동안 수행한다. 예를 들어, UCB 유래의 CD34+ 세포를 이후 사이토카인 (50ng/ml TPO, Flt-3L, SCF)이 보충된 E4ORF1+ 조작된 EC와 동일한 생물반응조 구획에 투입한다. 이후부터, 세포는 서로 분리되지 않는다. 2일 및 4일에, 사이토카인 보충된 배지 200 ml을 공급한다. 회수 조건 및 기타 모든 조건들은 실시예 1과 동일하다.
실시예
3:
CFU
분석
콜로니 형성 단위 또는 "CFU"는 시험관내 모델에서 세포의 줄기능 (stemness)을 판단하기 위한 수단이다. 알고 있는 수의 세포를 메틸셀룰로스 코팅된 배양 플라스크에 지정된 배지 (즉, Methocult)와 함께 접종한다. 2주 후, 지정된 형태를 가진 콜로니들이 추정의 줄기 세포에 의해 형성된다. 이들 콜로니는 정량가능하며, 이를 이용해 HSPC를 소정의 집단으로 확인할 수 있다. HSPC의 증식율은 생물반응조에서 가장 우수하며, 그 다음이 E4ORF1+ EC가 첨가된 플라스크를 이용한 증식이며, 사이토카인 단독 첨가하여 증식한 경우 HSPC 증식율이 가장 낮다 (도 7).
실시예
4:
유세포
측정
신선하게 분리한 제대혈 (가공되지 않음), 6일간 사이토카인 단독 처리하여 증식된 세포, 6일간 플라스크에서 E4ORF1+ EC 상에서 증식된 세포, 또는 6일간 중공사 생물반응조에서 E4ORF1+ EC 상에서 증식된 세포로부터 유래된 조혈 세포를 유세포 측정을 통해 모두 분석하였다. 세포 집단들을 CD34, CD45 및 CD38로 동시 염색하였다. 각 파라미터는 세포 표면 항원에 특이적인 항체에 접합된 고유 형광단을 통해 구분할 수 있었다. CD45- 세포는 E4ORF1+ 조작된 EC로 동정되었다. CD45는 범-조혈 마커 (pan-hematopoietic marker)이다. CD45+ CD34+ 세포는, CD45+ CD34- 세포와 비교해, 전체 CD45+ 집단에서 보다 원시적인 HSPC 집단을 포함한다. CD45+ CD34+ CD38- 세포는 이 보다 더 원시적인 HSPC 집단을 포함한다. 이들 원시적인 집단들의 증식율은 생물반응조에서 늘 가장 우수하였으며, 그 다음이 E4ORF1+ 조작된 EC가 첨가된 플라스크를 이용한 증식이며, 사이토카인 단독 첨가하여 증식한 경우 증식율이 가장 낮다.
실시예
4: 증식된
HSPC의
이식
E4ORF1+ 조작된 EC와 지속적으로 접촉시켜 증식시킨 HSPC는, 예를 들어, HSPC의 연속 계대 배양 및 재-접종을 통해 상호작용이 불연속되는 증식을 통해 수득한 HSPC와 비교해, 우수한 생착성 산물을 생산할 수 있다. 이러한 불연속을 없앰으로써, 새로운 방식으로 증식된 HSPC는 림프성, 골수성 및 적혈구성 계통으로의 빠른 생착을 유도하여, 골수파괴 후 각각의 해당 혈액 카운트를 보다 신속하게 회복시킬 수 있다. 이는, 또한, 증식시 E4ORF1+ 조작된 EC의 사용이 장기간 재증식성 줄기 세포를 유지시키는 것으로 가정되기 때문에, 장기간의 생착을 개선하여야 한다. E4ORF1+ 조작된 EC와의 지속적인 접촉을 통한 증식으로, 또한, 단독 공여체로부터 유래된 단일한 UCB 유닛으로부터 유래된 그래프트를 한명의 성인에게 제공하기에, 또는 심지어 그래프트를 단일 성인에게 여러번 주입하거나 또는 단일 UCB 공여체로부터 유래하여 여러명의 성인에게 다중 주입하기에 충분한 HSPC 물질을 제조할 수 있다. 예상되는 빠른 생착은, 또한, 입원일 감소, 모든 등급의 GVHD의 비율 저하, 재발율 감소, 이식-관련 사망 (TRM) 감소, 감염 위험성 저하, 이식 실패율 감소, 이용할 수 없었던 소량 기증되는 제대혈을 이용할 수 있는 이용성, UCB 은행 (UCB donations)에서 희귀 HLA 타입의 제대혈 입수 증가, 전반적인 치료 비용 감소, 이식 수여체의 수명 증가 및/또는 이식 수여체의 삶의 질 증가 등의, 다양한 기타 성과를 달성할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예들에 대한 전술한 설명들은 예로서, 설명의 목적으로 제공된다. 이는 본 발명을 언급된 내용에 불과하거나 또는 이로 한정하는 것으로 의도되지 않으며, 전술한 교시 내용에 비추어 다수의 수정 및 변형이 자명하게 가능할 수 있다. 구현예들은 본 발명의 원리와 실제적인 활용을 가장 잘 설명하기 위해 선정 및 기술되었기에, 당해 기술 분야의 당업자라면 고려되는 구체적인 용도에 적합한 다양한 수정을 가하여 본 발명 및 다양한 구현예들을 최상으로 활용할 수 있다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 간행물 및 참조문헌들은 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 바와 동일한 수준으로 원용에 의해 본 명세서에 명백하게 포함된다.
Claims (66)
- 이식이 필요한 개체에게 줄기 세포를 이식하는 방법으로서,
(a) 조혈 줄기 또는 전구 세포 (hematopoietic stem or progenitor cell, HSPC)를 내피 세포 (EC)와 EC/HSPC 초기 비율로 제1 기간 동안 HSPC의 증식을 허용하는 조건 하에 접촉시켜 HSPC를 증식시킴으로써, HSPC 및 EC를 HSPC/EC 증식 비율로 포함하는 증식된 세포 집단을 생산하는 단계; 및
(b) 단계 (a)에서 수득되는 증식된 세포 집단을 상기 개체에게 주입하는 단계를 포함하며,
상기 증식 및 이식 단계 내내 상기 HSPC와 상기 EC 간에 지속적인 상호작용이 유지되는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 HSPC가 조혈 줄기 세포인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 HSPC가 상기 개체에 동종이계 (allogeneic)인, 방법. - 제3항에 있어서,
상기 HSPC가 제대혈 HSPC인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 HSPC가 상기 개체의 자가 유래 (autologous)인, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 HSPC가 유전자-변형된 정상 상태 골수 유래 HSPC (gene-modified steady state bone marrow derived HSPC)인, 방법 - 제1항에 있어서,
상기 EC가 혈관 EC (vascular EC)인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 EC가 증식되기 전에 유사분열-불활성화 처리되는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 EC가 E4ORF1+ 조작된 EC인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 EC가 E4ORF1+ ETV2+ 조작된 EC인, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 EC가 또한 E4ORF6+인, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 EC가 ETV2 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 방법. - 제10항에 있어서,
상기 EC가 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 방법. - 제11항에 있어서,
상기 EC가 아데노바이러스 E4ORF6 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자는 플라스미드 벡터 형태에 존재하는, 방법. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자가 상기 조작된 EC의 게놈 DNA에 삽입되는, 방법. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 EC가 분화된 EC인, 방법. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 EC가 성체 EC인, 방법. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 EC가 배아 EC가 아닌, 방법. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 EC가 인간 EC인, 방법. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 EC가 일차 EC (primary EC)인, 방법. - 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 EC가 인간 제정맥 EC (human umbilical vein EC, HUVEC)인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 EC/HSPC 초기 비율이 적어도 약 200:1인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 기간이 약 1일 내지 약 24일인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 증식된 세포 집단이 개체 kg 당 HSPC를 약 1.0 x 106 내지 약 1.0 x 108개 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 HSPC/EC 증식 비율이 약 10:1 내지 약 1:10인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 HSPC와 EC 간의 지속적인 상호작용이 상기 증식 단계 동안의 HSPC와 EC 간의 지속적인 접촉, 및 상기 증식 단계와 주입 단계 동안의 HSPC와 EC 간의 지속적인 근접 배치 (proximity)를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 15일 내지 약 35일까지 상기 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치가 적어도 약 20,000/㎕인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 5일 내지 약 20일까지 상기 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치가 적어도 약 100/㎕인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 10일 내지 약 25일까지 상기 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치가 적어도 약 500/㎕인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 1,000일째에 상기 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치가 적어도 약 500/㎕인, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체는 골수파괴성 처치 (myeloablative treatment)로 인해 유발되는 조혈 작용의 결함 (deficiency in hematopoiesis), 또는 혈액 질환, 골수 조혈 줄기 세포의 이식이 필요한 장애, 감염성 면역결핍, T 세포에 작용하는 감염성 질환 (infectious disease affecting T cell), HIV, 유전성 면역결핍, 중증 복합성 면역결핍 (severe combined immunodeficiency), 적혈구에 작용하는 유전성 질환 (genetic disease affecting erythrocyte), 빈혈 및 판코니 빈혈 (Fanconi anemia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애를 가진, 방법. - 제1항에 있어서,
상기 개체가 인간인, 방법. - 이식이 필요한 개체에게 줄기 세포를 이식하는데 사용하기 위한 조성물로서,
HSPC 및 EC를 포함하며,
상기 줄기 세포 이식이 제1항에 따른 방법을 포함하는, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 HSPC가 조혈 줄기 세포인, 조성물. - 제34항 또는 제35항에 있어서,
상기 HSPC가 상기 개체에 동종이계 (allogeneic)인, 조성물. - 제36항에 있어서,
상기 HSPC가 제대혈 HSPC인, 조성물. - 제34항 또는 제35항에 있어서,
상기 HSPC가 상기 개체의 자가 유래 (autologous)인, 조성물. - 제38항에 있어서,
상기 HSPC가 유전자-변형된 정상 상태 골수 유래 HSPC (gene-modified steady state bone marrow derived HSPC)인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 EC가 혈관 EC (vascular EC)인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 EC가 증식되기 전에 유사분열-불활성화 처리되는, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 EC가 E4ORF1+ 조작된 EC인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 EC가 E4ORF1+ ETV2+ 조작된 EC인, 조성물. - 제43항에 있어서,
상기 EC가 또한 E4ORF6+인, 조성물. - 제43항에 있어서,
상기 EC가 ETV2 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 조성물. - 제43항에 있어서,
상기 EC가 아데노바이러스 E4ORF1 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 조성물. - 제44항에 있어서,
상기 EC가 아데노바이러스 E4ORF6 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 핵산 분자를 포함하는, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 핵산 분자는 플라스미드 벡터 형태에 존재하는, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 핵산 분자가 상기 조작된 EC의 게놈 DNA에 삽입되는, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 EC가 분화된 EC인, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 EC가 성체 EC인, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 EC가 배아 EC가 아닌, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 EC가 인간 EC인, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 EC가 일차 EC (primary EC)인, 조성물. - 제45항에 있어서,
상기 EC가 인간 제정맥 EC (human umbilical vein EC, HUVEC)인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 EC/HSPC 초기 비율이 적어도 약 200:1인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 제1 기간이 약 1일 내지 약 24일인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 증식된 세포 집단이 개체 kg 당 HSPC를 약 1.0 x 106 내지 약 1.0 x 108개 포함하는, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 HSPC/EC 증식 비율이 약 10:1 내지 약 1:10인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 HSPC와 EC 간의 지속적인 상호작용이 상기 증식 단계 동안의 HSPC와 EC 간의 지속적인 접촉, 및 상기 증식 단계와 주입 단계 동안의 HSPC와 EC 간의 지속적인 근접 배치 (proximity)를 포함하는, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 15일 내지 약 35일까지 상기 개체의 순환 혈액내 혈소판 수치가 적어도 약 20,000/㎕인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 5일 내지 약 20일까지 상기 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치가 적어도 약 100/㎕인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 10일 내지 약 25일까지 상기 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치가 적어도 약 500/㎕인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 개체에게 증식된 세포 집단이 주입된 후 약 1,000일째에 상기 개체의 순환 혈액내 호중구 절대 수치가 적어도 약 500/㎕인, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 개체는 골수파괴성 처치 (myeloablative treatment)로 인해 유발되는 조혈 작용의 결함 (deficiency in hematopoiesis), 또는 혈액 질환, 골수 조혈 줄기 세포의 이식이 필요한 장애, 감염성 면역결핍, T 세포에 작용하는 감염성 질환 (infectious disease affecting T cell), HIV, 유전성 면역결핍, 중증 복합성 면역결핍 (severe combined immunodeficiency), 적혈구에 작용하는 유전성 질환 (genetic disease affecting erythrocyte), 빈혈 및 판코니 빈혈 (Fanconi anemia)로 이루어진 군으로부터 선택되는 장애를 가진, 조성물. - 제34항에 있어서,
상기 개체가 인간인, 조성물.
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