JP6445971B2 - ヒト羊水由来細胞からの機能的かつ耐久性のある内皮細胞の生成 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年5月30日に出願された米国仮出願第61/653,185号及び2012年10月4日に出願された米国仮出願第61/709,431号(これら両方の内容全体が参照により本明細書に加入される)に基づく優先権の利益を主張する。
本発明は、国立心肺血液研究所(National Heart Lung and Blood Institute)に認められたR01HL097797の下での政府支援を受けて為されたものであった。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、機能的かつ耐久性のある内皮細胞を生成するための方法に関する。特に、本発明は、TGFβシグナル伝達経路の抑制と併せたETS-TFの強制発現により羊水細胞(AC)を再プログラムすることにより、ACから相当量の信頼できる内皮細胞を生成することに関する。
に公開でバンクに保存される(banked)。ACは様々な細胞型を生じ得、これらとしては、上皮細胞、間葉細胞及び神経細胞が挙げられる(非特許文献19;非特許文献20)。AC集団の0.2〜2%を構成するc-Kit+(CD117+)ACの稀なサブセットは、上皮細胞、間葉細胞及び神経細胞を含む様々な細胞型を生じ得る多分化能羊水幹細胞(AFS)を代表する(非特許文献21;非特許文献19)。これらのc-Kit+細胞のいくつかは多能性Oct-4遺伝子を発現すると考えられているが(非特許文献19;非特許文献22)、これらの細胞が本当に多能性(pluripotent)であるか、又は一次的に多能性(multipotent)の細胞であるかは不明である。実際に、ACの大部分は系列特異的(lineage-committed)細胞であると考えられている。系列特異的ACの3つのサブクラスが同定されている:類上皮(E型)、羊水(AF型)及び線維芽細胞(F型)(非特許文献23)。E型ACは胎仔皮膚が起源であると推測されるが、F型細胞は結合組織由来である(非特許文献24)。
本発明に従って、羊水細胞(AC)におけるTGFβシグナル伝達経路の抑制と併せたETS-TFの強制発現が、インビボで灌流する脈管構造を形成して肝臓類洞内皮へ生着する能力を有するrAC-VEC(「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」)と呼ばれる安定な血管ECの増殖性集団にACを再プログラムするということが見出された。従って、本発明は、羊水細胞から相当量の内皮細胞を再現性良く生成するための方法を提供する。本発明の方法論に従って生成された内皮細胞、さらにはこれらの細胞を利用する治療方法もまた提供される。
本発明者らは、羊水細胞(AC)におけるTGFβシグナル伝達経路の抑制と関連するETS-TFの強制発現が、灌流された脈管構造を形成することができかつインビボで肝臓類洞内皮へと生着する能力を有する安定なrAC-VEC(「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」)の増殖性集団へとACを再プログラミングすることを実証した。例となる実施態様において、ACにおけるETV2の一過性発現及びTGFβ経路阻害と組み合わせたFLI1/ERG1の恒常的発現は、EC特異的遺伝子の大部分の発現を作動してロックするだけでなく、非血管遺伝子の発現も抑制するということが本明細書において開示される。TGFβシグナル伝達の減弱はVEGFR2シグナル伝達経路の機能化を可能にし、これはECアイデンティティを失うことなく多数のrAC-VECの増殖を生じる。本明細書において生成されたrAC-VECは、ゲノム全体での転写プロフィール解析により示されたように、成体ECに類似した完全血管新生レパートリーを表す。本明細書において生成されたrAC-VECはまた、連続継代の際にそれらの血管アイデンティティを維持することができ、そして免疫無防備状態のマウスにおいて機能的な開存性の持続性血管を樹立することができる。従って、本発明は、羊水細胞から相当量の機能的かつ安定な内皮細胞を再現可能に生成するための方法、生成された内皮細胞、及び生成された内皮細胞の治療上の使用を提供する。
本明細書で使用される用語「羊水細胞(amniotic cells)」(又は「AC」)は羊水から抽出された細胞であり、それ故、本明細書では「羊水細胞(amniotic fluid cells)」とも呼ばれる。
本明細書に開示されるように、ACは安定なrAC-VEC(「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」)の増殖性集団に再プログラムされ得る。再プログラミングは、TGFβシグナル伝達経路の抑制と関連したACにおけるETSファミリーからの転写因子(ETS-TF)の強制発現を含む。
本発明に従って、再プログラミングに関与するETS-TFとしては、ETV2(ER71又はEstrpとしても知られるヒトETV2)、FLI1、及びERGが挙げられる。ERGの特定の有用なアイソフォームとしてはERG1及びERG2が挙げられるが、他のERG3及びERG4のような他のアイソフォームも適切であるかもしれない。これらのETS-TFは当該分野において記載されており(LEE et al., Cell stem cell, 2:497-507 (2008); SUMANAS et al., Blood, 111:4500-4510 (2008));LIU et al., Current Bio. 18:1234-1240 (2008); MCLAUGHLIN et al., Blood, 98:3332-3339 (2001))、そしてそれらの核酸配列及びタンパク質配列もGenBankから入手可能である(ETV2:NCBI受入番号NM_014209.2, GI:153791177; ERG1:受入番号NM_182918.3; GI:209954798; ERG4:受入番号NM_001136155.1;GI:209954807)。
Research 61(2):474-7 (2001) (HIV Tat)、WO03/059940 (ヒトSIM-2)、WO03/059941(Mph)、Rothbard et al.(Nature Med. 6(11):1253-7 (2000)に記載される。
FLI1及びERGに対するETV2の制御された発現が、成熟かつ増殖性のrAC-VECを生成するために重要であるということが本発明者により発見された。例えば、クローン分析は、FLI1及びERG1に対するETV2の化学量論比が成熟かつ増殖性のrAC-VECの生成のために重要であることを明らかにする。特定の実施例において、FLI1及びERG1の両方が、CD31のような成熟ECマーカーを発現する望ましいrAC-VECクローンで発現され、そしてETV2発現はCD31に反比例するようである。さらに、初期の一過性ETV2発現後のETV2発現の抑制は、成熟ECのパーセンテージを実際に増加させる。従って、成熟ECのより不均一な集団を得るようにETV2の発現を制御するように、再プログラミングアプローチを微調整し得る。
本発明の再プログラミングアプローチは、ETS-TFの強制発現と関連したTGFβシグナル伝達の阻害を含む。少なくとも短期間のTGFβシグナル伝達の阻害は、VEGFR2シグナル伝達を機能化し、そしてrAC-VECへのACの特異化を増強する。「短期間」は、再プログラミングの開始後少なくとも2週間;特定の実施態様では少なくとも18〜19日;そして他の実施態様では少なくとも20〜21日、例えば20〜24日、又は約21日の期間を意味する。TGFβ阻害のタイミングは、広範なTGFβ阻害剤分子又はTGFβリガンドに対して特異的な抗体のいずれかを培地に添加することにより容易に制御される。細胞表面でのVEGFR2及びVE-カドヘリンタンパク質発現(FACSにより測定可能)は、rAC-VEC生成を同定するために調べることができる2つの主な細胞の特徴である。rAC-VECの運命が確立されると(例えば約21日目に)、TGFβ阻害はもはや必要ない。
A1及びUS 20040220230 A1に開示されるピリジル置換イミダゾール類、US 20040152738 A1に開示されるピリジル置換トリアゾール類、US 20040266842 A1に開示されるチアゾリル置換トリアゾール類、US 20040063745 A1に開示される2-アミノ-4-(ピリジン-2-イル)-チアゾール誘導体、US 20040039198 A1に開示される2-ピリジン置換ジアリールイミダゾール類、US 20050014938 A1に開示されるフェニル置換トリアゾール類、US 20050165011 A1に開示されるベンゾオキサジン及びベンゾオキサジノン置換トリアゾール類、US 20070072901 A1に開示されるイソキノリン誘導体、US 20070154428 A1に開示されるチアゾリルイミダゾール誘導体、米国特許第7,417,041号に開示される少なくとも1つの2-ピリジル部分で置換されたヘテロ芳香族化合物ヘテロ芳香族化合物、さらには、Yingling et al., Nature Reviews (Drug Discovery) 3:1011-1022 (2004)により概説されるものが挙げられ、これらの刊行物の全ての内容は参照により本明細書に加入される。小分子阻害剤は様々な商業的供給源を通して入手可能である。例えば、以下の表に列挙される化合物はTocris Bioscience (Missouri, USA)から入手可能であり、そして本発明の方法における使用に適した阻害剤である。さらなる小分子阻害剤はEMD4Bisciences (New Jersey, USA)を通して入手可能である。
ACは、羊水から新たに抽出されたものであろうと、凍結保存ストックから解凍したものであろうと、再プログラミング前に培養で例えば3〜4週間維持され得る。ACを培養するために適した培地としては、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、DMEM/F-15、Liebovitz L-15、RPMI 1640、イスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、及びOpti-MEM SFM (Invitrogen Inc.)が挙げられる。
用語「血管内皮細胞に再プログラムされた羊水細胞」又は「rAC-VEC」は、rAC-VECと成体ECが類似した形態学的特徴、細胞表面表現型、及び転写プロフィールを共有するという事実にも関わらず、哺乳動物被験体から単離された成体血管内皮細胞、例えばヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)及び成体肝臓類洞EC(「LSEC」)と区別される、本明細書に開示される再プログラミングスキームを使用してACから生成された血管内皮細胞を指すために使用される。例えば、rAC-VECは、HUVECのように、長さ約10μmであり、「目玉焼き」又は敷石形状である。rAC-VECに特徴的な細胞表面マーカーとしては、少なくともVE-カドヘリン+、VEGFR2+、及びCD31+が挙げられ、そしてまた場合により、EC-選択的接着分子(ESAM)及び接合部接着分子A(JAM-A)も挙げられ、これらは全て成体ECで発現される。rAC-VECの転写プロフィールは、VE-カドヘリン、VEGFR2、CD31+の発現、BMP、Notch-リガンド、IGF、CSF、Kit-リガンド、セマフォリン、及びEGFL7を含むアンジオクライン因子の発現;平滑筋アクチン、筋肉、カルポニン-1、及びナトリウム利尿ペプチドBの発現の欠如;並びにCD45、CD15、Pu.1、TPO-受容体、Flt3受容体又はLhx2を含む造血(hemapoietic)マーカーに対してネガティブであることにより特徴づけられる。
本明細書に開示される再プログラミングアプローチは、多数の機能的かつ安定なrAC-VECの再現可能な製造を可能にし、このrAC-VECはバンク保存可能(bankable)であり、そしてHLA型で有り得、従って損傷した組織の治療的血管新生に有用であるだろう。
細胞培養
本研究において使用されたヒト胚性幹細胞(hESC)は、主にRUES1 hESC(Dr. Ali Brivanlou, Rockefeller Universityにより提供された)であった。これらの細胞株の使用許可を、コーネル・ロックフェラー・スローンケタリングESCRO委員会(Cornell-Rockefeller-Sloan Kettering Institute ESCRO committee)による包括的レビューの後に得た。これらの研究の実行のための財源は、認証された非連邦資金源から確保された。ヒトESC培地(KOSR)は、20%ノックアウト血清代替物(Invitrogen:#10828-028)を補われたAdvanced DMEM/F12(Invitrogen:#12634-028)、1X非必須アミノ酸(Gibco:#11140050)、1X L-グルタミン(Invitrogen:#25030-081)、1Xペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen:# 15240-062)、1X β-メルカプトエタノール(Gibco:#21985023)、及び4ng/ml FGF-2(Invitrogen)からなるものであった。ヒトESCを、37℃及び5%CO2でマウス胚線維芽細胞(MEF、Chemicon)で馴化したhESC培地を使用してMatrigelTM上で維持した。
小分子SB431542(Tocris:#SB431542)を5μMの最終濃度で使用した。ETV2の誘導性発現/抑制(図7)については、ドキシサイクリン(Clonetech:#631311)を2μg/mlの最終濃度で使用した。TGFβ実験(図5)については、TGFβリガンドβ1(R&D:#8915)及びβ3(R&D:#8425)を示された時間の間10ng/mlの最終濃度で使用した。TGFβリガンド中和モノクローナル抗体(TGFβmAb-R&D:#MAB1835)を10μg/mlの最終濃度で使用した。VEGFR2リン酸化実験(図5)については、細胞を5分間50ng/ml VEGF-A(Peprotech)で処理した。アセチル化-LDL取り込みアッセイ(図6)については、DiI-標識Ac-LDL(Biomedical Technical Inc.:#BT-902)を10μg/mlの最終濃度で使用した。
ETV2、ERG1、及びFLI1をコードするcDNAを、pCCL-PGKレンチウイルスベクターに個々にクローンした。三連Flag-タグをETV2構築物にアミノ末端にQuick-Change部位特異的変異誘発キット(Stratagene:#200521)によりサブクローンした。条件付き発現/抑制実験のために、Flag-タグETV2をpLVX-Tight-Puroベクター(Clontech:#632163)に再サブクローンし、そしてpLVX-Tet-Offベクターで同時形質導入した。Flag-タグETV2の抑制を、ドキシサイクリン(2μg/ml)処理により達成した。スクランブルshRNA構築物を、対照としての使用のためにpLKOベクターにクローンした。レンチウイルスを、我々の目的の遺伝子レンチウイルスベクター15μg、pENV/VSV-G 3μg、pRRE 5μg、及びpRSV-REV 2.5μgを293T細胞において(8〜10継代;サブコンフルエント(subconfluent)、100mmディッシュ)カルシウム沈降法による同時形質導入により生成した。上清を、以前に記載されたように(NALDINI et al., Science, 272:263-267 (1996))トランスフェクションの40時間後及び64時間後に採取した。ウイルス上清をLenti-X濃縮試薬(Clontech:#631232)により濃縮し、そしてウイルス力価を、Lenti-X p24 Rapid Titerキット(Clontech:#632200)を使用して決定した。他に示されていなければ、感染多重度(MOI)5をAC、さらには未分化RUES1及びWMC-2 hESCを形質導入するために使用した。
フローサイトメトリー(FACS)をBecton Dickenson LSRII SORPで行い、そして流動選別をAria II SORPで行った。使用した抗体はヒトVEGFR2(R&D:FAB357P)、CD31 (eBiosciences:#11-0319-42)、VE-カドヘリン(eBiosciences:#17-1449-42)、c-Kit(BD:#339206)、EpCam(BD:#347198)、E-カドヘリン(BD:#612130)、Tra1-60(BD:#560071)、Tra1-81(BD:#560793)、CD24(eBiosciences:#14-0247-82)及びSSEA3 (BD:#560237)に特異的であった。全ての電圧及び補償をCompBeads(BD Pharmingen)を用いて行い、そしてゲーティングはフルオロフォアマイナスワン(FMO)対照で行った。
総RNAを、RNeasy抽出キット(Qiagen:#74106)を使用して培養した細胞から製造し、そしてQuantiTect逆転写キット(Qiagen:#205313)を使用して製造者の指示書に従って逆転写した。相対定量的PCRを、SYBR Green PCRミックス(Applied Biosystems)を使用して7500 FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems)で行った。サイクル条件は:50℃で2分間1サイクルの後、95℃で10分間1サイクル、その後95℃15秒そして60℃1分間を40サイクルであった。プライマーを線形範囲で増幅及びプライマー解離についてチェックし、確認した。プライマープローブの閾値サイクルを、ハウスキーピング遺伝子β-アクチンに対して正規化し、そして相対値に変換した。(プライマー配列については表1を参照のこと)。
rAC-VECがインビボで管形成を受ける能力を試験するために、ETS-TFに感染したACを、GFP-レンチウイルスで形質導入し、そしてMatrigel(BD:#354234)、VEGF-A 100ng/ml、及びFGF-2 50ng/mlと混合し、そしてNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)マウス(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)の側腹部に皮下移植した。rAC-VECが再生肝臓類洞脈管構造を機能的に組み入れる能力を試験するために、GFP-標識rAC-VECを、以前に記載されたように(Ding et al.,2010)、70%部分的肝切除術を受けた2日後にNSGマウスに脾臓内注射した。rAC-VEC注射の2週後(Matrigelプラグ)又は3ヶ月後(脾臓内)に、マウスにAlexa568(Invitrogen:#I21412)と結合体化したイソレクチン-B4(2mg/kg)を静脈内注射し、そして10分後に屠殺した。次いでMatrigelプラグ又は肝臓を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、続いて30%スクロース中で48時間飽和させた。20μm凍結切片を作製し、そしてHoechst 33342で対比染色した。GFP-標識rAC-VECの取り込みを確認し、そして宿主血管への機能的生着がイソレクチン-B4蛍光との共染色により明らかとなった。rAC-VECと宿主マウスECとを区別するために抗ヒトCD31(BD)染色も行った。蛍光シグナルを共焦点顕微鏡(710 META Zeiss)により分析した。GFP陽性領域の面積をImageJにより定量し、そしてイソレクチン陽性機能性血管の数を、無作為に取った3つの視界に存在する細胞を計数することにより決定した。インビトロアッセイについては、200μl Matrigelを12ウェルTCプレート上にコーティングし、そして200,000 rAC-VECをMatrigel上に播種し、そして管形成を以前に記載されたように決定した(KOBAYASHI et al., Nature cell biology, 12:1046-1056 (2010))。
サンプルを以前に記載されたように(James et al., 2010)染色した。手短には、サンプルをPBST中で透過性にし、そして5%ロバ血清中でブロックした。サンプルを1時間ブロッキング溶液中で結合体化抗体と共にインキュベートし、洗浄し、そして共焦点顕微鏡による画像化のために核酸についてDAPI又はToPro3(Invitrogen)により対比染色した。免疫染色のために使用した一次抗体は、VE-カドヘリン(R&D:#AF938)、CD31(eBiosciences:#11-0319-42)、VEGFR1(R&D:#AF321)、VEGFR2(R&D:#FAB357P)、ESAM(R&D:#AF2688)、JAM-A(R&D:AF1103)、EpCam(BD:#347198)、平滑筋アクチン(R&D:# MAB1420)及びOct4(R&D:#AF1759)であった。使用した全ての抗体はヒト抗原に対して特異的であった。全ての画像化を、Zeiss 510又は共焦点顕微鏡のいずれかを使用して行った。ウェスタンブロット分析を、以前に記載されたように(Kobayashi et al., 2010)行った。ウェスタンブロットアッセイにおいて使用した抗体:Flag(Sigma:#F1804-5MG-1:1000)、VEGFR2(細胞シグナル伝達:#2479S - 1:2000)、pVEGFR2(細胞シグナル伝達:#4991 - 1:300)、SMAD2(細胞シグナル伝達:#3102S-1:1000)、pSMAD2(細胞シグナル伝達:#3108S - 1:300)、GAPDH(細胞シグナル伝達:#2118L-1:5000)、ERG(BioCare Medical:#CM421C-1:1000)、及びFLI1(Epitomics:#3645-1 - 1:3000)。
総RNAを、Qiagen RNeasy抽出キットを使用して培養した細胞から調製し、そして品質をAgilent Technologies 2100 Bioanalyzerでチェックした。高品質総RNA 1μgを、提供された試薬を使用してIllumina TruSeq RNAサンプル調製キット(San Diego, CA)で、その後のクラスター生成及び配列決定のためのテンプレート分子のライブラリへとmRNAを変換するためのインプットとして使用した。ポリ-Tオリゴ結合磁気ビーズを使用したポリ-A含有mRNA分子の精製後、mRNAを、高温下で二価カチオンを使用して小塊に断片化した。切断されたRNAフラグメントを、逆転写酵素及びランダムプライマーを使用して第一鎖cDNAにコピーした。この後、DNAポリメラーゼI及びRNase Hを使用して第二鎖cDNAを合成した。次いでこれらのcDNAフラグメントに、末端修復プロセスを経て、単一「A」塩基を加え、次いでアダプターを連結した。次いで生成物を精製して、最終cDNAライブラリを作製するためにPCRで濃縮した。生成物のサイズ及び純度を定量しチェックした後、多重DNAライブラリを、10nMに対して正規化し、次いで2つのサンプルライブラリを等体積で一緒にプールした。7pMの各々のプールしたDNAライブラリテンプレートを、固定化及び3’伸長、ブリッジ増幅、直線化及びハイブリダイゼーションを含めてIllumina cBot機器で増幅、次いでIllumina HiSeq2000配列決定装置の1つのレーンで、ペアドエンド(pair end)モジュールを使用して2x58bp長リードを生成して配列決定した。Illuminaパイプラインを使用したQCの後に、リードをTopHat(TRAPNELL et al., Bioinformatics, 25:1105-1111 (2009))をデフォルトパラメータと共に使用してヒトゲノム(hg18)に位置づけた。次いで、RefSeq (June 2010)転写レベル(FPKMs)を、CuffLinks (TRAPNELL et al., Nat Biotechnol, 28:511-515 (2010))を使用して、上位四分位数正規化及び配列特異的バイアス補正を用いて定量した。ヒートマップ生成のために、示されたサンプルにわたる各転写の最大FPKMを決定した;次いでFPKMをこの数で割って、スケーリングした(scaled)発現値を生じた。次いで、ヒートマップを、緑〜赤のカラースケールを使用してプロットした。多次元尺度構成法(MDS)を、R統計ソフトウエアにおいて利用可能なcmdscale関数を使用して行った。階層的クラスタリングを、平均連結法アプローチを使用して、hclust R関数を使用して行った。MDS及び階層的クラスタリングの両方のために、1−ピアソン相関を、ゲノム全体でのトランスクリプトームプロフィール間の相違点尺度として使用した。
ゲノムDNAを、DNeasy回収キット(Qiagen:#69506)を使用してサンプルから抽出した。DNA完全性を1%アガロースゲルでチェックした。次いでDNA 3μgを消化し、ランダムプライミングによりBioprimeキット(Invitrogen)及びCy3又はCy5-dUTPを使用して標識した。標識したDNAをAgilent 1M CGHアレイに40時間60℃でハイブリダイズさせた。製造者の指示に従って洗浄した後、スライドをAgilent DNAマイクロアレイスキャナーでスキャンし、そして画像をFeature Extraction 10.7(Agilent)を使用して定量した。
ECの血管性特異化に必須なETS-TFを同定するために、本発明者らは、胚性ECへのhESC分化の確立されたモデル(JAMES et al., Nat Biotechnol, 28:161-166 (2010))を使用した。マイクロアレイプロファイリングを使用して、本発明者らは、ETV2、FLI1及びERGが、hESCのECへの分化の間に発現される鍵となるETS-TFであることを見出した。ERG1アイソフォームは、ERG2アイソフォームと比較してプロトタイプのECにおいて一貫した発現を示したので、ERG1をhESCからのECの生成のためのプロトコルにおいて使用した。
hESC由来胚性ECは、限定された増殖能を有し、そして継代の際には非血管細胞に「ドリフトする(drift)」ので、本発明者らは、血管細胞へと再プログラムされ得る容易に入手しうるヒト細胞の供給源を探した。成体ヒト線維芽細胞及び間葉細胞を再プログラムする試みは成功しなかった(データは示していない)。多数のヒト胎仔及び成体組織をスクリーニングした後、本発明者らは、妊娠中期の羊水細胞(AC)由来の間葉細胞及び上皮細胞が予想外に高い効率で血管内皮細胞への再プログラミング(rAC-VEC)に適しているということを観察した。この目的のために、AC(「前培養されたAC」-方法を参照のこと)をレンチウイルスETS-TF(ETV2、FLI1、ERG1)で単独で、及び組み合わせて形質導入し、これらの細胞がrAC-VECに再プログラムされ得るかどうかを決定した(図1a)。TGFβ阻害は、hESC由来の胚性ECの間葉移行(Endo-MT)がECに起きるのを防ぐ際に重大であるので(JAMES et al., Nat Biotechnol, 28:161-166 (2010))、ACはまた、TGFβ受容体阻害剤SB431542又はTGFβリガンドに対する中和モノクローナル抗体(mAb)の存在下でも培養された。
AC由来rAC-VECが既存のEC前駆体細胞から生じたか否かを評価するために、本発明者らは、ETS-TFの不在下でEC増殖に十分な条件でACを培養することによりrAC-VECが生成され得るかどうかを試験した。ACを、TGFβ阻害剤SB431542の存在下及び不在下で、正常酸素圧条件下にて、VEFG-A、FGF-2、EGF、及びIGFを含有する最適EC増殖培地(EM)中で成長させた(SIMON et al., Nature reviews Molecular cell biology, 9:285-296 (2008))。14日まで、VE-カドヘリン及びCD31発現はこれらの非形質導入ACにおいてまだ存在していなかった。EC増殖を助長する培養条件での21日間及びそれを超すさらなる処理は細胞死をもたらした(データは示していない)。従って、rAC-VECは既存のEC前駆細胞の産物ではない。AC集団の約0.2〜2%を構成する、c-Kit+細胞のようなACのサブセットは、多能性であることが示されている(DE COPPI et al., Nature biotechnology, 25:100-106 (2007))。rAC-VECがACの多能性亜集団からのみ裏付けられるという可能性を排除するために、本発明者らは、ACにおける多能性(pluripotency)マーカーOCT4の存在を評価した。AC集団の圧倒的多数はOCT4タンパク質に関してネガティブであり(図2a)、他のグループからの同様の結果を裏付けた(JEZIERSKI et al., Stem cell reviews, 6:199-214 (2010))。OCT4(図2b-上パネル)及びSOX2(図2b-下パネル)に加えてNANOG(データは示していない)についてのほとんど検出不可能なmRNA発現レベルは、c-Kit+細胞の可能性のある小さなサブセットを除いて、少数のACが多能性であることをさらに示唆する。従って、ACの大多数は、ETS-TFでの形質導入なしに豊富な信頼のおける血管細胞に自然に分化し得るEC前駆体又は多能性細胞を欠いている。
ACは、表現型的にはE-カドヘリン+(E-Cad、CD324)、EpCAM+(CD326)、及びCD24+細胞と示される系列特異的細胞に加えて、c-Kit、Tra1-60、Tra1-81、SSEA-3及びSSEA-4を発現する未分化細胞の両方から構成される(図2c)。特に、c-Kit+はACの<1%を構成するが(DE COPPI et al., Nature biotechnology, 25:100-106 (2007))、CD31+細胞は存在しなかった。
rAC-VECが血管特徴を獲得する程度を評価するために、本発明者らは、新たに生じるrAC-VECでのVE-カドヘリン及びVEGFR2の表面発現を測定した(図3a)。TGF-β阻害ACをETS-TFで形質導入した4日後に、VE-カドヘリン+細胞、及びより少ない程度でVEGFR2+細胞が生成された(図3a-枠ii.)。これらのマーカーを発現している細胞のパーセンテージは、数週間にわたって有意に増加し(図3a-枠iv.及びvi.)、その結果再プログラミングの4週後に、形質導入されたACの集団全体(約99%)がVE-カドヘリン+(図3b-枠ii.)であり、そのほぼ3分の2はVEGFR2発現も示した。さらに、これらの切り替わった細胞は今や形態的にHUVECに類似している(図3b-枠iv.〜ix.)。再プログラミングアプローチはcDNAの宿主ゲノムへのレンチウイルス依存性組み込みを利用したので、本発明者らは、28日rAC-VECのゲノム完全性を評価するために比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)分析を行った。この分析によりゲノム異常が無いことが明らかとなり、増殖するrAC-VECが遺伝的に安定であることを実証した。
d21 rAC-VECの大部分はVE-カドヘリン+であるが、これらの細胞が成熟及び未成熟rAC-VECのクローン集団から構成されるか又は不均一集団から構成されるかは不明であった。完全ECプログラムを発現する成熟rAC-VECの均一な集団を生成するために、本発明者らは、再プログラミングプロセスの開始時にクローン分析を行った。ETV2/ERG1/FLI1での形質導入及びTGFβ阻害によりACからrAC-VECを生成し、そして21日間培養した。次いでVE-カドヘリン、VEGFR2及びCD31を発現した単細胞(VE-cad+VEGFR2+CD31+)を単離し、そしてクローン増殖のために96ウェルプレートに1ウェルあたり1細胞の密度でプレーティングした(図3c)。21日以内に、単細胞クローンの20〜25%が増殖能を示し(図3d)、個々のクローンは非同一表現型で後代を生じた(図3e-枠i.〜iv.)。クローン-1、クローン-2、及びクローン-3は全てほぼ99% VE-カドヘリン+であったが、CD31発現は大きく変化した。特に、クローン-3細胞はCD31を発現したが、一方でクローン-1はCD31+細胞を生じず、そしてクローン-2はCD31+(18%)及びCD31-細胞の両方を産生した。CD31発現にもかかわらず、3つの全てのクローンが4週を越えて増殖することができた(図3e-枠v.)。
rAC-VECが、非血管遺伝子の発現の抹消を同時に示しながら、EC特異的遺伝子のレパートリー全体を発現したか否かを評価するために、本発明者らは、AC由来のrAC-VEC(クローン及び非クローンの両方)に対してトランスクリプトーム配列解析(RNA-seq)を行った。次いで、rAC-VECのこれらのゲノム全体での解析を、プロトタイプ成熟EC、例えばヒト臍帯静脈EC(「HUVEC」)及び成体肝臓類洞EC(「LSEC」)のトランスクリプトーム、さらにはCD34+造血細胞(「CD34+」)、骨髄間質細胞(「BMS」)、肺由来小気道上皮細胞(Hackett et al., 2012)及びナイーブ対照AC(「Amni ctrl」)を含む非内皮細胞型と比較した。相当数の血管遺伝子が、ナイーブACと比較して、非クローン(「rAC-VEC」)及びクローン(「rAC-VECクローン-3’及び「rAC-VECクローン-4」)由来rAC-VECにおいて上方調節された(図4b)。さらに、これらの誘導されたEC遺伝子の発現レベルは、インビトロで培養されたHUVEC及びLSECにおいて見られる発現レベルに匹敵するものであり、rAC-VECが完全ECアイデンティティを獲得したという考えを実証した。BMP、Notchリガンド、IGF、CSF、Kitリガンド、及びセマフォリンを含む、EC駆動器官再生(BUTLER et al., Cell Stem Cell, 6:251-264 (2010b); DING et al., Nature, 468:310-315 (2010); DING et al., Cell, 147:539-553 (2011); KOBAYASHI et al., Nature cell biology, 12:1046-1056 (2010))及び腫瘍成(BUTLER et al., Nat Rev Cancer, 10:138-146 (2010a))を調節するアンジオクライン(Angiocrine)因子も全て同様にrAC-VECにおいて切り替わった。重要な事には、ACにおいて通常発現される非EC遺伝子の一群、例えば平滑筋アクチン、ムスクリン(musclin)、及びカルポニン-1はrAC-VECにおいて発現停止された。
ETS-TF形質導入ACはTGFβ及びその受容体の両方を産生し(図4b)、自己分泌/接触分泌ループが、Endo-MTを支持しそしてrAC-VEC生成を妨げることによりTGFβ依存性細胞運命移行を調節し得るという可能性を生じさせた(MEDICI et al., Nat Med 16:1400-1406 (2011); ZEISBERG et al., Nat Med, 13:952-961 (2007))。従って、ETV2/FLI1/ERG1形質導入ACを、TGFβリガンドに対する中和mAb、又はTGFβ小分子阻害剤(SB431542)の存在下及び不在下で21日間培養した。外因性TGFβリガンドの不在下でさえ、TGFβシグナル伝達についての読み出しとしてのリン酸化SMAD2(P-SMAD2)の基礎レベルが対照及びETV2/FLI1/ERG1形質導入ACの両方でなお活性であるということが観察された(図5a-レーン1、2)。これは、これらのTGFβ活性化対照及びETV2/FLI1/ERG1形質導入ACにおいて全及びリン酸化VEGFR2タンパク質が存在しないこととと相関性があった(図5b-レーン1、2、3、4)。しかし、TGFβリガンドに対するmAbの添加は、rAC-VECにおけるP-SMAD2発現を抑制し(図5a-レーン7、8)、VEGFR2タンパク質を上方調節した(図5b-レーン11、12)。重要なことには、TGFβリガンドに対するmAbで処理されたrAC-VECは、VEGFR2のリン酸化により示されるように、VEGF-A刺激の原因であった(図5b-レーン12)。TGFβリガンドの補充(図5a-レーン3〜6)又はパルス化TGFβリガンド刺激(図5a-レーン11〜16)を用いても、TGFβ阻害剤の存在はSMAD-2リン酸化を妨げ、VEGFR2タンパク質(図5b-レーン7、8、9、10)及びVEGF-A依存性リン酸化(図5b-レーン8、10)の上方調節を可能にした。特に、TGFβ活性化rAC-VECはEC形態を獲得しなかったが(図5c-枠ii. 対 枠vi.)、TGFβシグナル伝達の阻害(図5c-枠iii.、iv.、v.)はEC単層の典型的な敷石形態をrAC-VECにもたらした(図5c-枠vi.)。従って、TGFβシグナル伝達の阻害は、VEGFR2を機能させてrAC-VECの血管アイデンティティを維持する。
rAC-VECにおいて機能性VEGFR2タンパク質を生成するために、ACのETS-TF形質導入の開始からTGFβシグナル伝達を阻害することが必須であった(図5d)。TGFβシグナル伝達の持続的な抑制が長期rAC-VEC安定性を持続するために必要かどうかを決定するために、本発明者らは、ETS-TF形質導入後のいくつかの時点でTGFβ阻害を逐次除いた(図5e-左パネル)。ETV2/FLI1/ERG1での形質導入後14日目にTGFβ阻害を除くと、VEGFR2+細胞の減少が細胞増殖の次の7日間の間に観察された(図5e-左パネル、白色バー)。しかし、TGFβ阻害をETV2/FLI1/ERG1での形質導入の21日後に除いた場合、VEGFR2+細胞のパーセンテージは維持された(図5e-左パネル、灰色バー)。特に、TGFβ経路の操作はrAC-VECにおけるVE-カドヘリン発現に対する効果を有していなかった(図5e-右グラフ)。従って、3週間のTGFβシグナル伝達の抑止は、VEGFR2シグナル伝達を機能させるために十分であり、安定かつ増殖性のrAC-VECの長期血管アイデンティティを維持した。
次に、本発明者らは、rAC-VECが完全な血管新生能を獲得したかどうかを評価するためにインビトロ及びインビボモデルを使用した。Matrigelを支持体として使用する管形成アッセイを、TGFβ阻害剤で処理された21日rAC-VECに対して行った(図6a)。rAC-VECはHUVEC管形成と同程度にインビトロで管を形成することができたが、ナイーブACはできなかった。別のECがアセチル化-LDL(Ac-LDL)取り込みの原因であると実証するために、第二のインビトロアッセイをrAC-VECに対して行った(図6b)。21日rAC-VECのAc-LDLとのインキュベーションは、HUVECにおいて見られたAc-LDL取り込みと同様のこのリポタンパク質の有意な蓄積を示した。
ETV2は血管発生の初期において一時的に発現し、そしてその発現はおそらく成体ECにおいて止まる(KATAOKA et al., Blood, 118:6975-6986 (2011))。これは、低いETV2レベル及び適切なERG1及びFLI1レベルを有するrAC-VECクローンが成熟血管運命を達成したrAC-VECの集団に相当し得るという本明細書における観察と一致する。従って、FLI1及びERG1の持続した発現と併せたETV2の一過性発現は、ACの再プログラミングを開始し、次いで最適rAC-VECアイデンティティを確定するために十分であり得る。ETV2産生を制御するためにドキシサイクリン依存性誘導性(「Tet-off」)発現システムを使用して(誘導性ETV2:「iETV2」)、iETV2/FLI1/ERG1をACにおいて形質導入し、そしてTGFβ阻害と共に14日間培養してECアイデンティティへの移行を可能にした(図7a)。次に、FLI1及びERG1の発現を妨害することなく、iETV2発現を抑制するために、細胞をドキシサイクリンで処理した。iETV2/FLI1/ERG1で形質導入されたACは、ドキシサイクリン(Doxy)処理(iETV2抑制)及び未処理細胞の両方において4週を超えてVE-カドヘリン及びCD31の存在を示した。特に、iETV2の発現が停止されたドキシサイクリンでの処理の7日後及び14日後に、未処理のrAC-VECと比較してより高いパーセンテージのVE-カドヘリン+CD31+ rAC-VECが存在した(図7b)。ウェスタンブロット分析により、iETV2がドキシサイクリン処理細胞において発現停止されていたことが確認され(図7c)、ETV2がrAC-VECにおけるVE-カドヘリン発現を維持するためにもはや必要ではないということを示した。
ERG1は、rAC-VECの成熟化の際にFLI1と相乗作用してCD31発現を増強及び持続し、さらには他の血管特異的遺伝子とも相乗作用することが示された(図3c及び図7b)。従って、再プログラミングにおけるその重要性を、ERG1が存在しない場合にTGFβ阻害ACをiETV2/FLI1で形質導入することによりアッセイした。次いでこれらの細胞を14日目に2つのフラクションに分け、そのうちの1つをドキシサイクリンで処理して、FLI1発現を撹乱することなくiETV2発現を抑制した。有意な増加が、ERG1形質導入を欠いたACと比較して、iETV2/FLI1/ERG1で形質導入されたACから生成されたVE-カドヘリン+CD31+ rAC-VECにおいて観察された。iETV2発現が2週間抑制されていた28日目のiETV2/FLI1/ERG1形質導入ACの免疫細胞染色(Immunocytostaining)は、VE-カドヘリン及びCD31の細胞膜における共局在を示したが、これらの細胞のqPCR分析は成熟EC表現型を示す多数のマーカーの発現を示した。これらの細胞の機能性は、インビボ管形成アッセイにより実証された。GFP標識iETV2/FLI1/ERG1形質導入ACを14日間培養し、その時点でiETV2発現を抑制した。その後、これらの細胞をさらに28日間増殖させ(d42 rAC-VEC)、次いでMatrigelプラグにロードした。プラグをNSGマウスに2週間注入した。Alexa568-イソレクチン-B4の静脈内注射による脈管構造の生体内標識後に、Matrigelプラグを分析のために取り出した(図7d)。免疫蛍光研究は、GFP、ヒトCD31(hCD31)、及びイソレクチン標識細胞が共局在化していることを示し、もはやiETV2を発現しないrAC-VECがなお宿主脈管構造に吻合することができるということが確認された。従って、ECアイデンティティを獲得すると、rAC-VECの血管表現型は、胎仔発生の間のその生理的発現パターンを模倣する調節機構である、ETV2の抑制と併用されるFLI1及びERG1の持続性発現により永久に樹立される。
新規ETS-TF駆動プラットフォームはACを耐久性で高度に増殖可能なrAC-VECへと再プログラムする
脈管構造の機能不全は、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、虚血四肢及び糖尿病を含む無数の病理的異常を生じ得る。従って、豊富な生着可能なヒトECの誘導及び増殖は、虚血性疾患及び損傷した器官を有する患者の利益になり得る。しかし、成体ECの精製及び増殖は技術的に煩雑である。さらに、hESCからECを誘導するための現在のストラテジーは、ETS-TFでの形質導入の後でさえ、後生的に不安定であり、かつ限定された増殖能を有するECの生成を生じる(図1e〜1g)。本発明者らは、本明細書において、本明細書ではrAC-VECと呼ばれる高度に増殖性の機能性ECへと再プログラムされ得るヒト系列特異的ACの多用途の代替供給源を同定した。本発明者らは、ETV2の一過性発現及びTGFβ阻害を併用したFLI1/ERG1の強制発現がACをrAC-VECに再プログラムし、このrAC-VECが成熟ECの形態及び持続性の血管新生レパートリーを有していることを示す(図7e)。
。rAC-VECは高度に増殖性で安定であり、それらの完全な血管新生レパートリーを維持しながら、50日で6x104倍の増殖を受けることができる。世界中で行われている羊水穿刺の数が増えるにつれて、遺伝的に適合するACが同種適合性rAC-VECを生成するために入手可能になるだろう。従って、HLA型の凍結保存された公開でバンクに保存され得るACは、耐久性があり増殖性かつ生着可能なECへと再プログラムされ得る非血管細胞の理想的な供給源である。
ACの細胞不均一性は特異的細胞マーカーを用いた染色により主に研究されてきた(JEZIERSKI et al., Stem cell reviews, 6:199-214 (2010); ZHANG et al., Stem cells and development, 18:1299-1308 (2009))。c-Kit+細胞は多能性である希少なACの亜集団(1%〜2%)を占めると考えられる(DE COPPI et al., Nature biotechnology, 25:100-106 (2007))。完全ACプールの本明細書での分析は、希少c-Kit+亜集団(<0.5%)の所見を支持するが、ACの大部分(すなわちc-Kit-細胞)は、系列特異的及び非特異的細胞型の両方を示す様々なマーカーを発現する(図2c)。さらに、本発明者らは、多能性遺伝子OCT4、NANOG、及びSOX2のいずれの機能性発現も観察しなかった。
ETV2/FLI1/ERG1での形質導入がEC特異的遺伝子の完全な補体(complement)の発現を生じるだけでなく、再プログラミングが非血管AC発現遺伝子を発現停止させるということが本明細書において示された。ゲノム全体の規模では、rAC-VECのトランスクリプトームはプロトタイプの胎仔(HUVEC)及び成体(LSEC)成熟ECと高度に類似しており、そして非血管細胞とは大きく異なるということが、3D-MDS及び階層的樹状図クラスタリング解析により本明細書において示された。
形及び血栓形成しやすくし得る。これに関して、Matrigelプラグ又は再生マウス肝臓類洞血管へのrAC-VECの3ヶ月間の生着は、明らかな血栓症のない開存血管の生成をもたらすことが示された。従って、生着可能なrAC-VECは、凝固促進(pro-coagulation)及び炎症メディエーターを発現停止させ、耐久性のある血管の生成を可能にした。
TGFβ阻害を伴わないETV2/FLI1/ERG1のACへの形質導入は、機能的な増殖性rAC-VECを生成しなかった。LSECのような特定の型の臓器特異的成体ECと同様に、rAC-VECはTGFβ1、β2、β3及びLTBPだけでなく、TGFβRII及びTGFβRIも発現して恒常的SMAD2リン酸化を生じる。TGFβ受容体シグナル伝達経路の活性化は、rAC-VEC生成を拮抗し得る。TGFβ受容体シグナル伝達はEndo-MTを引き起こし(MEDICI et al., Nat Med 16:1400-1406 (2011); ZEISBERG et al., Nat Med, 13:952-961 (2007))、それによりrAC-VECの形成を妨害する。TGFβはまたFLI1タンパク質のアセチル化を調節し、FLI1の安定性及びDNAに結合するその能力の減少をもたらす(ASANO et al., Mol Cell Biol 29:1882-1894 (2009))。特に、TGFβシグナル伝達は、成体ECにおけるVEGFR2発現を抑制し(MANDRIOTA et al., J Biol Chem, 271:11500-11505 (1996))、増殖及び血管原性の機能を損なう。従って、rAC-VECの生成は、VEGFR2及びおそらくFLI1、さらには他の未知のEC特異的標的を機能させるためにTGFβ阻害を最初に必要とする(図5)。
大部分の成体ECはETV2を発現しないが、FLI1、ERG1を恒常的に発現する(DE VAL et al., Dev Cell, 16:180-195 (2009))。同様に、2週間のACにおける一過性ETV2発現は、FLI1及びERG1を除いてこれらの下流EC特異的ETS転写の全てを作動させるために十分であった。従って、ETV2は、血管原性遺伝子の完全な誘導を生じるEC特異化の主要制御因子である。14日間のETV2の一過性発現がACにおけるEC特異的遺伝子の永久的特異化を生じる不可逆的な後生的機構は興味深く、成体線維芽細胞の他の再プログラミングアプローチにより報告されていない。ETV2の発現停止の際に、FLI1/ERG1の強制同時発現及び他のEC特異的ETS転写因子の恒常的発現がEC特異的遺伝子の長期発現を維持するということが妥当と思われる。
ETV2により作動された遺伝子は、VEGFR2、VE-カドヘリン、TIE1、TIE2、EDG-1、VEGFR1及びNotchシグナル伝達経路遺伝子を含む機能的ECへのACの特異化のために必須の因子であった。しかし、ETV2単独では全てのEC遺伝子を作動させるために不十分であった。一方で、FLI1及びERG1は、CD31、ECM、及びアンジオクライン因子のような成熟度と関連するEC遺伝子を作動させる。それ故、FLI1がERG1と共同してこれらの前駆細胞を成熟機能性ECにする遺伝子を誘導する一方で、ETV2は未成熟内皮前駆細胞へとACを特異化する(図7e)。
FLI1の異常な発現は白血病(CUI et al., Leukemia, 23:1311-1319 (2009))及びユーイング肉腫(ZHANG et al., Oncogene, 8:1621-1630 (1993))を誘導し得る。ERG過剰発現及び融合タンパク質はまた、白血病を含む様々な悪性疾患と関連があった(MARTENS et al.,
Int J Biochem Cell Biol, 43:1413-1416 (2012))。しかし、本明細書において示されるように、Matrigelプラグにおける14日間又は再生肝臓における3ヶ月間のFLI1及びERG1を発現するrAC-VECのインビボ移植は、悪性疾患の発生と関連していなかった。CGHを使用して、我々はまた、28日を超えるrAC-VECの増殖がいずれの染色体異常とも関連がないということを示した。80日を超えるrAC-VECの長期増殖は、悪性変換、血管腫又は血管肉腫の発生のいずれの証拠も示さなかった。従って、rAC-VECは、治療的介入のための血管細胞の安全な供給源を提供する安定かつ増殖可能な細胞集団を表す。
FLI1及び/又はERG1での1つだけの形質導入は、ECアイデンティティをACに付与しないだけでなく、これらの細胞の増殖の支持において効果がない。クローン分析に基づいて(図3c〜3e)、Fil1及びERG1に対するETV2の適切な化学量論比が、培養において80日間増殖する能力に恵まれた成熟かつ増殖性のrAC-VECの生成に対する鍵であることが見出された。
臓器特異的ECは独特の分子及び表現型特徴に恵まれている。微小環境の合図は、ECに臓器特異性を付与するための主要な役割を果たし得るが、TFもまたこのプロセスにおいて役割を果たし得る。ACから生成された再プログラムされたrAC-VECは、成熟成体ECの分子プロフィールを有する。再プログラムされたrAC-VECの遺伝子レパートリーは、HUVEC及LSECのような一般的なインビトロ培養ECの遺伝子レパートリーに近い。実際に、静的培養条件でのいずれかの臓器特異的ECのインビトロ増殖は、内因性臓器特異的血管表現型の部分的抹消を生じる。そのため、他の成体ECと同様に、再プログラムされたrAC-VECは、所定の臓器の微小環境中に再導入されるとさらなる組織特異的特異化を受けるかもしれない。最終的に、ECに組織特異的特徴を付与する特定の転写因子の同定は、その特定の臓器の生理的必要性に適合するrAC-VECの生成を可能にするだろう。本発明者らは、HLA型及び同種適合の可能性を有し、豊富な機能性rAC-VECへの再プログラミングを受けやすいヒト系列特異的増殖性細胞の容易に入手可能な供給源を同定した。rAC-VECの生成は、虚血組織の血管新生に門戸を開く。米国のみで毎年何千件もの羊水穿刺が行われ、このことは、十分な遺伝的に適合するACが、民族的に多様性の集団の広範な断面に利益になり得るrAC-VECへの再プログラミングに利用可能であることを確実にする。HLA適合ACの公開バンク保存の可能性を考えると、これらの細胞は、血管障害を有する患者の遺伝的に多様な集団の処置のための豊富な血管細胞を生成するための細胞目録を確立し得る。
Claims (12)
- TGFβシグナル伝達阻害剤の存在下で少なくとも20〜21日間羊水細胞を培養し、ここで羊水細胞は、転写因子ETV2、FLI1及びERGの発現を達成するように該転写因子をコードする核酸を含むベクターを用いて形質導入され、羊水細胞は、最初の13〜15日間ETV2を発現し、そしてFLI1及びERGは、恒常的に発現し、それにより内皮細胞を得ることを含む、内皮細胞を生成する方法。
- TGFβシグナル伝達阻害剤が、I型TGFβ受容体に特異的な阻害剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記阻害剤が、I型TGFβ受容体の可溶性形態を含むポリペプチド、I型TGFβ受容体若しくはリガンドに特異的な抗体、又は小分子化合物である、請求項2に記載の方法。
- 前記阻害剤が、SB−431542、A 83−01、D 4476、LY 364947、SB 525334、SD 208、及びSJN 2511から選択される小分子化合物である、請求項3に記載の方法。
- 前記阻害剤がSB−431542である、請求項4に記載の方法。
- 羊水細胞が少なくとも28日間の総期間の間培養される、請求項1に記載の方法。
- 羊水細胞が少なくとも42日間の総期間の間培養される、請求項1に記載の方法。
- ERGがERG1である、請求項1に記載の方法。
- 表面マーカーVE−カドヘリン、CD31及びVEGFR2の発現を特徴とする内皮細胞が単離される、請求項1に記載の方法。
- 表面マーカーVE−カドヘリン、CD31及びVEGFR2の発現を特徴とし、FLI
1、ETV2及びERGをコードする外因的に導入された核酸を含む、羊水細胞由来内皮細胞の集団。 - ヒト被験体において損傷した組織を修復するための請求項10に記載の羊水細胞由来内皮細胞の集団及び少なくとも1つの薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む組成物。
- ヒト被験体において腫瘍を処置するための請求項10に記載の羊水細胞由来内皮細胞の集団及び少なくとも1つの薬学的に許容しうる担体又は希釈剤を含む組成物。
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