CN116218781A - Robo1 car-nk92细胞复苏培养基，试剂盒及复苏培养方法 - Google Patents

Robo1 car-nk92细胞复苏培养基，试剂盒及复苏培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞生物学的技术领域，提供了一种ROBO1CAR‑NK92细胞复苏培养基，试剂盒及复苏培养方法。该ROBO1CAR‑NK92细胞复苏培养基包括基础培养基和添加剂；所述添加剂由细胞生长因子和B族维生素组成。在基础培养基HIPPTM‑T009中添加IL‑2和烟酰胺能够明显提升ROBO1CAR‑NK92细胞的复苏活率和缩短细胞活率恢复至80％的传代时间，易于规模化培养。

Description

ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，试剂盒及复苏培养方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学的技术领域，具体涉及一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，试剂盒及复苏培养方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞类型，主要分布在外周血中。NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其杀伤衰老细胞，病变细胞以及恶性转化的肿瘤细胞的能力，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和趋化因子来调节机体获得性免疫应答反应，是机体发挥免疫效应不可或缺的重要效应细胞。NK细胞缺乏T细胞受体(TCR)，不易引起移植物抗宿主反应，是可用于同种异体病人回输治疗的重要免疫细胞类型，基于NK细胞的基因修饰细胞治疗产品具有较好的临床应用前景。
目前，NK细胞的制备方法主要是利用细胞因子以及饲养层细胞(aAPC)的激活来扩增NK细胞，但这种方法扩增的NK细胞与临床需求量仍存在较大的差距，不能满足更多同种异体临床病人的使用需求因此，研究者们开始关注使用NK细胞系(如NK-92、YTS、KHYG-1等)代替外周血来源的原代NK细胞进行相关研究。并且，与原代NK细胞不同的是，细胞系来源的NK细胞易于在体外扩增，易于基因修饰和改造，培养制备工艺路线相对简单，并且与原代NK细胞具有同等效力的抑瘤作用，对包括血液瘤和实体瘤肿瘤细胞均具有较强的杀伤效果。
申请人的已授权专利CN109810995B公开了一种ROBO1 CAR-NK92细胞，通过大量的体外和体内实验验证了其具有特异性杀伤ROBO1高表达实体肿瘤细胞的能力，并且毒副作用较小，安全性较高。在此基础上制备了ROBO1 CAR-NK92细胞库，并且初步建立了细胞复苏和初步培养的方法。但原有的ROBO1 CAR-NK92细胞复苏及培养方法还存在以下缺点：经复苏的ROBO1 CAR-NK92细胞活率偏低，仅为10％左右，细胞需培养15-20天左右才能将细胞活率提升至80％左右，导致培养时间过长，不利于后期规模化培养制备细胞。
因此，如何提升ROBO1 CAR-NK92细胞复苏活率和缩短细胞活率恢复至80％的时间是亟需解决的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述问题，提供一种ROBO1CAR-NK92细胞复苏培养基，含有该复苏培养基的试剂盒，及使用该复苏培养基的ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养方法。使用本发明提供的复苏培养基，以及结合本发明提供的ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养方法，能够快速提升ROBO1 CAR-NK92细胞复苏活率和缩短细胞活率恢复至80％的传代时间。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，该复苏培养基包括基础培养基和添加剂；其中，所述添加剂由细胞生长因子和B族维生素组成。
本发明第二方面提供了一种用于ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养的试剂盒，其包括本发明第一方面所述的复苏培养基。
本发明第三方面提供了一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养方法，其采用本发明第一方面所述的复苏培养基，或本发明第二方面所述的试剂盒对ROBO1 CAR-NK92细胞进行复苏培养。
本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明提供的ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基和ROBO1CAR-NK92细胞复苏培养方法，能够快速提升ROBO1 CAR-NK92细胞复苏活率和缩短细胞活率恢复至80％的传代时间，易于快速规模化培养；
(2)本发明提供的ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，该培养基中不含动物源成分，在培养ROBO1 CAR-NK92细胞之后，后续细胞收获分装和检测过程不会太复杂；并且避免动物源成份的引入对人体安全性产生影响。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
附图说明
图1所示为ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养标准流程图。
图2所示为细胞因子对ROBO1 CAR-NK92细胞生长活性影响。
图3所示为细胞因子对ROBO1 CAR-NK92细胞杀伤活性的影响。
图4所示为不同海藻糖浓度对ROBO1 CAR-NK92细胞密度的影响。
图5所示为不同海藻糖浓度对ROBO1 CAR-NK92细胞活率的影响。
图6所示为ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养的细胞密度变化图。
图7所示为ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养的细胞活率变化图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
本发明第一方面提供了一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，该复苏培养基包括基础培养基和添加剂；其中，所述添加剂由细胞生长因子和B族维生素组成。
为了更好地提升ROBO1 CAR-NK92细胞复苏活率和缩短细胞活率恢复至80％的传代时间，可以对其中一个或多个技术特征做进一步优选。
在一实例中，所述细胞生长因子包括IL-2、IL-15、IL-18、IL-21和GM-CSF中的至少一种。
在一优选实例中，所述细胞生长因子为IL-2。
在一实例中，所述B族维生素包括烟酰胺(维生素B3衍生物)、硫胺素(维生素B1)、核黄素(维生素B2)、泛酸(维生素B5)、吡哆醇(维生素B6)、生物素(维生素B7)、叶酸(维生素B9)、维生素B12中的至少一种。
在一优选实例中，所述B族维生素为烟酰胺。
本发明中，所述的细胞生长因子和B族维生素均采用药用级，药用级的添加剂加入至复苏培养基中可避免引入杂质或杂菌对细胞复苏产生不良影响，并且保证培养的细胞产品的用药安全性。
对基础培养基的种类不作具体限定，可以选择本领域常规使用的复苏和培养NK细胞的基础培养基。
在一优选实例中，所述基础培养基为HIPPTM-T009(GMP级，简称T009培养基)，其为无血清培养基。
在一优选实例中，所述添加剂包括IL-2和烟酰胺；
在一实例中，所述IL-2的浓度为10-1000IU/mL，例如可以为10IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、300IU/mL、400IU/mL、500IU/mL、600IU/mL、700IU/mL、800IU/mL、900IU/mL或1000IU/mL。
在一优选实例中，所述IL-2的浓度为450-550IU/mL。
在一实例中，所述烟酰胺的浓度为1-10mM，例如可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。
在一优选实例中，所述烟酰胺的浓度为4-6mM。
在一优选实例中，一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，包括HIPPTM-T009(GMP级)、浓度为500IU/mL的IL-2和浓度为4-6mM的烟酰胺。
本发明的发明人研究发现，在基础培养基HIPPTM-T009中添加IL-2和烟酰胺，并调整IL-2的浓度为500IU/mL左右时和烟酰胺的浓度为5mM左右时获得的复苏培养基能够明显提升ROBO1 CAR-NK92细胞的复苏活率和缩短细胞活率恢复至80％的传代时间。
本发明的发明人进一步研究发现，虽然添加多种细胞生长因子(例如IL-15、IL-18、IL-21和GM-CSF)也能提升ROBO1 CAR-NK92细胞复苏活率，但效果与单独添加IL-2效果相比，差异较小，而且经过实验验证证实了单独添加IL-2与添加其他细胞因子(IL-15、IL-18和GM-CSF)复苏培养的ROBO1 CAR-NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤效果相差不大。
本发明的发明人还研究了在所述复苏培养基中添加海藻糖，一些文献中提到了海藻糖对细胞复苏和培养有促进作用，例如：Jiang等认为海藻糖对细胞冻存和复苏过程的生物保护作用是多种保护机制协同作用的结果，一方面海藻糖可通过渗透调节作用抵御低渗透压、化学作用以及低氧等因素对细胞的影响，另一方面可减轻甚至避免细胞复苏过程中渗透性保护剂所导致的细胞过度肿胀和渗透性休克(PMID:24997279)，同时Fabbrocini等在4℃的环境中，分别使用7％二甲基亚砜、7％丙三醇、7％甲醇配伍0.04mol/L海藻糖保存海胆精子，解冻后二甲基亚砜配伍海藻糖组的快速运动精子所占比例较其他两组显著升高，说明海藻糖在细胞冻存和解冻后对细胞具有明显保护作用(PMID:23329384)。但本发明经过实验研究发现，添加海藻糖对ROBO1CAR-NK92细胞的复苏没有促进作用。
本发明第二方面提供了一种用于ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养的试剂盒，其包括本发明第一方面所述的复苏培养基。
本发明第二方面所述的用于ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养的试剂盒具有与本发明第一方面所述的ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基相同的优点，在此不作赘述。
本发明第三方面提供了一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养方法，其采用本发明第一方面所述的复苏培养基，或本发明第二方面所述的试剂盒对ROBO1 CAR-NK92细胞进行复苏培养。
在一实例中，所述的ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养方法，包括以下步骤：
(a)细胞解冻：将冻存的细胞解冻获得细胞悬浮液，再加入预冷的清洗液进行离心，去除上清后获得细胞沉淀；
(b)细胞接种：将部分预热的所述复苏培养基加入步骤(a)的细胞沉淀中，混合均匀后接种于剩余的复苏培养基中，进行培养；
(c)换液培养：将步骤(b)的细胞培养20-27h后更换新鲜的所述复苏培养基，继续进行培养；
其中，所述步骤(a)中，所述清洗液为基础培养基。
步骤(a)细胞解冻
在一实例中，冻存的细胞在37℃恒温水浴条件下解冻获得细胞悬浮液。
在一实例中，所述清洗液的预冷温度为0-5℃，优选4℃。
在一实例中，所述清洗液与细胞悬浮液的体积比为(3-6):1，例如可以为3:1、4:1、5:1、6:1，优选体积比为4:1。
在一实例中，所述离心的条件包括：向心加速度为500-800g，离心时间为3-5mim。
在一具体实例中，所述清洗液使用方法包括以下步骤：
(1)预冷离心管，预冷温度为0-5℃；
(2)将解冻后的细胞悬液缓慢完全转移到预冷的离心管中，然后再逐滴加入预冷(预冷温度为0-5℃)的清洗液，盖上离心管盖，上下缓慢颠倒混匀。
步骤(b)细胞接种
在一实例中，所述复苏培养基的预热温度为35-38℃，优选为37℃。
在一实例中，所述接种的接种密度为(1.5-2.5)×106个/mL。
在一实例中，所述细胞培养温度为37℃，CO2的浓度为5％，饱和湿度。
步骤(c)换液培养
在一实例中，接种后细胞培养20-27h需离心换液(例如离心条件包括175g，离心5min)，补充原体积的新鲜复苏培养基。
在一实例中，所述细胞培养温度为37℃，CO2的浓度为5％，饱和湿度。
在一实例中，所述换液的条件包括：
(i)当细胞活率<80％，活细胞密度<1×106个/mL时，换新鲜培养基，并维持原体积不变；
(ii)当细胞活率<80％，活细胞密度>1×106个/mL时，换新鲜培养基，液体积扩大；
(iii)若细胞活率≥80％时，按(2.5-3.5)×105个/mL的活细胞接种密度扩大培养。
在一实例中，若培养体系大于20mL时，无需添加烟酰胺。培养体系大于20mL时，细胞培养密度为(2.5-3.5)×105cells/ml，活率≥80％，细胞进入后续扩增培养阶段。此阶段，细胞活率一般已经达到80％以上，已经完成了细胞复苏阶段，进入细胞扩增阶段，不需要再添加烟酰胺。
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
下述实施例中所用的材料、试剂等参见表1-表3，如无特殊说明，没有提及的材料或试剂均可从商业途径得到。
表1细胞信息
Figure BDA0004029154800000091
表2主要试剂耗材信息
Figure BDA0004029154800000092
表3主要设备信息
Figure BDA0004029154800000093
Figure BDA0004029154800000101
A组实施例A1-A14
实施例A1-A14和对比例DA1-DA3分别提供ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，包括基础培养基HIPPTM-T009和添加剂，添加剂的具体的组分和浓度见表4。
表4
Figure BDA0004029154800000102
Figure BDA0004029154800000111
利用上述实施例A1-A14和对比例DA1-DA3提供的复苏培养基进行ROBO1 CAR-NK92细胞复苏和培养，具体包括以下步骤：
1、ROBO1 CAR-NK92细胞复苏
1.2、将C级洁净区的水浴锅温度调至37℃，等待温度到达37℃；
1.3、吸取4mL T009无血清培养基于15mL离心管中，混匀后置于4℃冰箱预冷获得清洗液(T009无血清培养)，同时预冷一支空的15mL离心管；
1.4、吸取5mL T009无血清培养基于细胞培养瓶中，添加2.5μL的IL-2(终浓度500IU/mL)，30.5μL烟酰胺(终浓度5mM)，轻拍混匀后，置于二氧化碳培养箱预温；
1.5、用镊子从液氮罐指定位置小心取出细胞冻存管(记录冻存位置、冻存日期及操作人员)，迅速置于已达37℃的恒温水浴锅内，轻轻摇晃，注意保持冻存管盖始终在水平面以上；
1.6、当冻存管中细胞融化至黄豆大小时，迅速取出冻存管，用移液器缓慢将细胞悬液转移至新的预冷15mL离心管内，吸取100μL细胞悬液进行细胞计数并在倒置显微镜下观察细胞状态；
1.7、将细胞悬液轻拍混匀后，用移液枪吸取40μL，并与40μL 0.2％台盼蓝染液混合均匀，吸取20μL混合液于细胞计数板，三复孔，使用细胞计数仪检测ROBO1 CAR-NK92的活细胞密度和细胞活率；
1.8、将预冷的培养基(清洗液)缓缓滴加至上述细胞悬液中，轻轻混匀，745g，离心3min；
1.9、弃尽上清，用提前预温的培养基轻轻重悬细胞沉淀，混匀后转入T25细胞培养瓶中，将培养瓶放入37℃，5％二氧化碳培养箱培养，培养24±3h。
2、ROBO1 CAR-NK92细胞培养
2.1、按照上述细胞复苏标准操作规程，在细胞复苏24h后，从二氧化碳培养箱取出复苏的细胞，在倒置显微镜下观察细胞状态，同时进行计数细胞；
2.2、准备无菌1.5mL EP管并标记，使用10mL移液管轻柔均匀吹打培养瓶中的细胞悬液，并吸取约0.2mL细胞悬液，转移至对应EP管中；
2.3、将细胞悬液轻拍混匀后，用移液枪吸取40μL，并与0.2％台盼蓝染液混合均匀，吸取20μL混合液于细胞计数板，三复孔，使用细胞计数仪检测ROBO1 CAR-NK92的活细胞密度和细胞活率；
2.4、175g，离心5min，离心结束后，弃掉上清，加入5mL预热的培养基重悬细胞沉淀，然后将细胞全部转移到新的T25培养瓶中；
2.5、按照每2-3天的细胞处理间隔时间，检测T25细胞培养瓶中的活细胞密度和细胞活率(例如第4天、7天、9天、12天和15天)，部分数据记录于表5和表6中，根据活细胞密度和细胞活率的情况进行不同的处理：
(2.5.1)当T25细胞培养瓶中细胞活率<80％，活细胞密度<1×106个/mL时，换液时维持原体积不变时，将细胞进行离心换液，加入新鲜培养基，保持细胞培养体积为5mL；
(2.5.2)当T25细胞培养瓶中细胞活率<80％，活细胞密度>1×106个/mL时，将细胞进行离心换液，加入新鲜培养基，扩大细胞培养体积至10ml；
(2.5.3)当T25细胞培养瓶中细胞活率≥80％时，对细胞进行离心换液处理，加入新鲜培养基，将细胞培养体积进行扩大(按照3×105个/mL活细胞接种密度进行扩大培养)。
图1所示为ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养标准流程图。此标准流程共需时8天，包括将ROBO1 CAR-NK92复苏接种的当天及后期培养至细胞活率80％以上的7天。每次细胞处理时需检测细胞数及细胞活率。
表5
Figure BDA0004029154800000131
上述实施例实施例A8-A14中，分别在不同时间检测细胞培养瓶中的活细胞密度和细胞活率(例如第0天、2天、4天和6天)，实验结果如图2所示。
测试例测试ROBO1 CAR-NK92细胞的杀伤活性
测试方法如下：
检测上述实施例A1、实施例A8-A15和对比例DA3复苏培养获得的ROBO1 CAR-NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤活性检测。
本发明所有涉及到细胞杀伤活性检测的方法都采用RTCA(Real TimeCellularAnalysis)方法进行检测，具体方法和操作包括以下的步骤：
1.靶细胞悬液准备：
(1)在超净工作台内，于无菌条件下，吸除培养瓶内旧培养液；
(2)以PBS液清洗2次，于培养皿内加入0.5ml(T75培养瓶)含EDTA的胰蛋白酶溶液，置37℃温箱中温育1min后，在倒置显微镜下观察细胞被消化的情况，若细胞质回缩，细胞间歇增大，终止消化；
(3)加入培养基10ml/培养瓶，用移液管反复轻轻吹打贴壁的细胞，使它们形成细胞悬液。将细胞悬液转移到15ml离心管中，800g离心5min，去除上清，加入5ml新鲜培养基，并用移液管将细胞吹打均匀，800g离心5min，去除上清，加入2ml新鲜培养基。用细胞计数仪检测细胞密度和细胞活率，然后加入培养基，配制成实验需要的细胞浓度5×105cells/ml。
2.Schedule设置:
Step Sweeps Interval Unit Total time
Step 1 1 1 分钟 1min
Step 2 20 10 小时 15
3.E-Plate 16检测电极板准备和靶细胞铺板：
(1)在E-Plate 16的孔中加入50μl培养基；
(2)将E-Plate 16放到xCELLigence RTCA Instrument上；
(3)RTCA系统会自动进行扫描(“Scan Plate”)->检查是否接触良好(在“Message”页面显示Connection OK)；
(4)开始Step1，检测基线(Background)，确定所选择的孔接触正常，所有孔的CellIndex低于0.063；
(5)取出E-Plate 16，在孔中加入100μl混合均匀的靶细胞悬液，使每孔中细胞数目为50000个；
(6)将E-Plate 16置于超净台中室温放置30min；
(7)将E-Plate 16放到培养箱中的xCELLigence RTCA Instrument上；
(8)RTCA系统会自动进行扫描(“Scan Plate”)->检查是否接触良好(在“Message”页面，显示Connection OK)；
(9)开始Step2(检测细胞增殖曲线)，24h后，待靶细胞Cell Index达到1-3时，准备开始进行下一步操作。
4.加入效应细胞：
(1)取效应细胞，根据细胞活率和活细胞数目，配制成合适的效应细胞密度；
(2)终止Step2，取出E-Plate 16，置于超净台中；
(3)将80μl的效应细胞悬液(或等体积的培养基：空白对照)以效靶比5：1加入培养板孔内；
(4)将E-Plate 16置于xCELLigence RTCA Instrument上；
(5)RTCA系统会自动进行扫描(“Scan Plate”)->检查是否接触良好(在“Message”页面显示Connection OK)；
(6)继续开始Step2，观察效应细胞对靶细胞生长的影响，记录效靶作用时间为2h时效应细胞的杀伤活性。
实验结果见图3，从图3可以看出，单独添加细胞因子IL-2与添加其他细胞因子(IL-15、IL-18和GM-CSF)对肿瘤细胞的杀伤效果相差不大，各组之间没有存在明显的差异。本发明单独添加细胞因子IL-2和烟酰胺即可实现快速提升ROBO1 CAR-NK92细胞复苏活率和缩短细胞活率恢复至80％的传代时间，并且不会影响ROBO1 CAR-NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
利用本发明提供的复苏培养方法体外培养的ROBO1 CAR-NK92细胞，其杀伤肿瘤细胞的活性较好，其体外增殖能力明显增强(活细胞密度最高)，细胞活率保持在90％以上水平，易于后续体外扩增和大规模培养，生产成本低且易于后期规模化生产。
B组实施例B1-B5
实施例B1-B5分别提供ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养方法，均采用实施例A1提供的复苏培养基。
实施例B1
实施例B1的方法与A组实施例中ROBO1 CAR-NK92细胞复苏和培养方法相同。
实施例B2
与实施例B1的不同之处在于，清洗液与细胞悬浮液的体积比为1:1。
实施例B3
与实施例B1的不同之处在于，所述清洗液不进行预冷。
实施例B4
与实施例B1的不同之处在于，所述复苏培养基不进行预热。
实施例B5
与实施例B1的不同之处在于，所述接种的接种密度为5×106个/mL。
上述实施例B1-B5中，分别检测T25细胞培养瓶中的活细胞密度和细胞活率(例如第4天、7天、9天、12天和15天)，部分数据记录于表6中。
表6
Figure BDA0004029154800000171
从表6的结果可以看出，本发明提供的细胞复苏方法和具体操作步骤对ROBO1CAR-NK92细胞复苏活率和活细胞密度的提高具有重要的促进作用。
C组实施例海藻糖添加实验
实施例C1-C5单独添加海藻糖
与实施例A1的区别在于，步骤1.3的清洗液中分别添加终浓度为1250mM、625mM、312.5mM、156.3mM、0mM的海藻糖，复苏培养基中除含500IU/ml IL-2和5mM烟酰胺外，再分别添加终浓度为1250mM、625mM、312.5mM、156.3mM、0mM的海藻糖，以进一步提高ROBO1 CARNK92细胞的复苏效果。
实施例C6-C9
与实施例A1的区别在于，复苏培养基中的添加剂组成浓度不同或者清洗液成份不同，具体组分如表7所示：
表7
Figure BDA0004029154800000181
上述实施例C1-C9中，分别在不同时间检测活细胞密度和细胞活率(例如第0天、1天、4天、7天、9天和12天)。其中，实施例C1-C5的结果图4和图5所示，实施例C6-C9的结果图6和图7所示
图4-7的结果表明添加海藻糖对ROBO1 CAR-NK92细胞的复苏不仅没有促进作用，反而会影响ROBO1 CAR-NK92细胞的活细胞密度和细胞活率，与文献报道其在细胞解冻复苏过程中的作用有一定差异。分析原因，一方面可能是针对的细胞不同，本身ROBO1CAR-NK92细胞对渗透压的瞬时提高较为敏感，另一方面过量的海藻糖对ROBO1CAR-NK92细胞存在一定毒性作用，导致细胞凋亡，具体原因需要后续进一步分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；其中，所述添加剂由细胞生长因子和B族维生素组成。
2.根据权利要求1所述的复苏培养基，其中，所述细胞生长因子包括IL-2、IL-15、IL-18、IL-21和GM-CSF中的至少一种，优选为IL-2；
优选地，所述B族维生素包括烟酰胺、硫胺素、核黄素、泛酸、吡哆醇、生物素、维生素B12、叶酸和生物素中的至少一种，更优选为烟酰胺；
优选地，所述基础培养基为HIPPTM-T009。
3.根据权利要求1或2所述的复苏培养基，其中，所述添加剂包括IL-2和烟酰胺；
优选地，所述IL-2的浓度为10-1000IU/mL；
优选地，所述烟酰胺的浓度为1-10mM。
4.根据权利要求3所述的复苏培养基，其中，所述IL-2的浓度为450-550IU/mL；和/或，所述烟酰胺的浓度为4-6mM。
5.一种用于ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-4中任一项所述的复苏培养基。
6.一种ROBO1 CAR-NK92细胞复苏培养方法，其特征在于，采用权利要求1-4中任一项所述的复苏培养基，或采用权利要求5所述的试剂盒对ROBO1CAR-NK92细胞进行复苏培养。
7.根据权利要求6所述的复苏培养方法，其中，包括以下步骤：
(a)细胞解冻：将冻存的细胞解冻获得细胞悬浮液，再加入预冷的清洗液进行离心，去除上清后获得细胞沉淀；
(b)细胞接种：将部分预热的所述复苏培养基加入至步骤(a)的细胞沉淀中，混合均匀后接种于剩余的复苏培养基中，进行培养；
(c)换液培养：将步骤(b)的细胞培养20-27h后更换新鲜的所述复苏培养基，继续进行培养；
其中，所述步骤(a)中，所述清洗液为基础培养基。
8.根据权利要求7所述的复苏培养方法，其中，所述步骤(a)中，所述清洗液与所述细胞悬浮液的体积比为(3-6):1；
优选地，所述清洗液的预冷温度为0-5℃；
优选地，所述离心的条件包括：向心加速度为500-800g，离心时间为3-5mim。
9.根据权利要求7所述的复苏培养方法，其中，所述步骤(b)中，所述复苏培养基的预热温度为35-38℃；
优选地，所述接种的接种密度为(1.5-2.5)×106个/mL。
10.根据权利要求7所述的复苏培养方法，其中，所述步骤(c)中，换液的条件包括：
(i)当细胞活率<80％，活细胞密度<1×106个/mL时，换新鲜培养基，并维持原体积不变；
(ii)当细胞活率<80％，活细胞密度>1×106个/mL时，换新鲜培养基，液体积扩大到8-12mL；
(iii)若细胞活率≥80％时，按(2.5-3.5)×105个/mL的活细胞接种密度扩大培养。
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