KR101445175B1 - 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도를 위한 티아졸기를 함유하는 우레아 화합물 - Google Patents

중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도를 위한 티아졸기를 함유하는 우레아 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도를 위한 티아졸기를 함유하는 우레아 화합물 및 이의 의약적 용도를 제공한다. 상기 우레아 화합물로 처리된 중간엽 줄기세포는 혈관내피세포로 특이적으로 분화 유도되므로 이를 이용하면 풍선확장술 등에 의한 혈관내피세포 손상과 같은 혈관질환을 효과적으로 치료할 수 있게 된다.

Description

중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도를 위한 티아졸기를 함유하는 우레아 화합물{Urea compounds with thiazol group for inducing differentiation of mesenchymal stem cells to endothelial cells}
본 발명은 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도를 위한 티아졸기를 함유하는 우레아 화합물 및 이의 의약적 용도에 관한 것이다.
자가 혈관 내피전구세포(endothelial progenitor cells, EPCs)는 혈관신생 및 재내피세포화를 위해 유용할 수 있다. 많은 수의 골수-유래 세포는 내피-유사 세포로 분화될 잠재력을 갖고 있다. 최근 동물과 인간에서의 연구는 골수 유래의 전구세포인 EPCs가 혈관신생 및 재내피화를 촉진할 잠재력을 갖고 있다고 제안하였으나, 혈액-유래의 EPCs를 이용할 때 이들 세포를 충분한 수로 얻기가 쉽지 않다. 또한, 성인 혈액으로부터 얻은 EPCs는 제대혈-유래의 EPCs에 비해 증식능이 제한적이다. 혈관 복구를 위한 대안으로서, 중간엽 줄기 세포(MSCs)에 대한 연구가 진행되고 있다. 다양한 혈관 내피전구세포 중에서, MSCs는 자가 또는 동종 세포 치료에 대해 제조하기 쉽고 유연성이 높은 장점을 갖는다. 또한, MSCs에서의 유전자 발현 패턴의 계열적 분석은 MSCs의 인비트로 분화 잠재력이 중배엽 계열로 제한되지 않고, MSCs가 인비트로 및 인비보에서 내피세포와 같은 다른 계열로도 전이분화할 수 있음을 밝혔다. 주입된 MSCs의 일부는 또한 새로운 혈관으로 도입되거나 측분비 메커니즘(paracrine mechanism)에 의한 측부 혈관 형성을 자극하는 것으로 나타났다.
이에 본 발명자들은 골수 유래 중간엽 줄기세포를 활성화 시켜 특이적으로 내피세포로의 분화를 유도하는 저분자 화합물에 대해 연구하던 중, 신규한 티아졸우레아기를 가지는 화합물을 합성하였으며, 이 화합물이 MSCs의 내피세포로의 분화 유도로 재내피세포화 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
Research Journal of Biological Sciences 2(3): 307-310, 2007 Stem Cells 22:377-384, 2004
본 발명의 목적은 골수 유래 중간엽 줄기세포의 혈관질환에 대한 세포치료제로서의 활용을 위해 중간엽 줄기세포로부터 혈관내피세포로의 분화를 유도하는 신규한 저분자 화합물 및 이의 약학적 용도를 제공하는 것이다.
이식된 세포와 조직 간의 이종성을 줄인다면 이식된 세포의 생착율을 증가시킬 수 있을 것이다. 이러한 점에 착안하여 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 유도할 수 있는 방법에 대해 지속적으로 연구하였다. 그 결과, 하기 화학식 1 또는 2의 티아졸우레아기를 함유하는 우레아 화합물이 중간엽 줄기세포를 혈관내피세포로 분화 유도할 수 있음을 밝혔다.
하기 실시예에서는 화학식 1 또는 2의 화합물에 의해 엑스 비보(ex vivo) 상에서 변형된 랫트의 골수 유래의 중간엽 줄기세포가 혈관내피세포로 분화함을 보여준다.
따라서, 본 발명은 일 관점에 있어서, 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도를 위한 신규한 화학식 1의 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112012075175226-pat00001

상기 식에서,
R1은 수소, 할로겐, 니트로기 또는 탄소수 1 내지 12의 알킬기이고,
X는 질소 원자 또는 탄소 원자를 나타내거나 존재하지 않으며,
n은 0 내지 3의 정수를 나타내며,
여기서, R1이 수소인 경우 X가 질소 원자이고 n이 1인 화합물, R1이 니트로기인 경우 X가 질소 또는 산소 원자이고 n이 0 또는 1인 화합물, 또는 R1이 탄소수 1 내지 12의 알킬기인 경우 X가 질소 원자이고 n이 1인 화합물은 제외된다.
본 발명의 화합물의 치환체 정의에 사용된 용어는 하기와 같다.
"할로겐"은 -F, -Cl, -Br 또는 -I이다.
여기에서, "알킬"은 일반적으로 명시된 수의 탄소원자 (예컨대, 1 내지 12개의 탄소원자)를 갖는 직쇄 및 분지형 포화 탄화수소 기를 의미한다. 알킬기의 예는 제한없이 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 3-메틸부트-1-일, 3-메틸부트-2-일, 2-메틸부트-2-일, 2,2,2-트리메틸에트-1-일, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸 등을 포함한다.
한 구체예에서, 화학식 1의 화합물은 R1은 수소, Br, 니트로기 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
X는 질소 원자를 나타내며,
n은 1 내지 2의 정수를 나타내는 화합물일 수 있다.
다른 구체예에서, 화학식 1의 화합물은 1-1 내지 1-5의 화합물일 수 있다:
[화학식 1-1]
Figure 112012075175226-pat00002

[화학식 1-2]
Figure 112012075175226-pat00003

[화학식 1-3]
Figure 112012075175226-pat00004

[화학식 1-4]
Figure 112012075175226-pat00005

[화학식 1-5]
Figure 112012075175226-pat00006
바람직하게는, 화학식 1의 화합물은 상기 화학식 1-1 또는 1-2로 표시되는 화합물일 수 있다.
본 발명은 또한 다른 관점에 있어서, 화학식 2의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도용 조성물 및 화학식 2의 화합물을 중간엽 줄기세포에 처리하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법을 제공한다:
[화학식 2]
Figure 112012075175226-pat00007

상기 식에서,
R1은 수소, 할로겐, 니트로기 또는 탄소수 1 내지 12의 알킬기이고,
X는 질소 원자 또는 탄소 원자를 나타내거나 존재하지 않으며,
n은 0 내지 3의 정수를 나타낸다.
한 구체예에서, 화학식 2의 화합물은 R1은 수소, Br, 니트로기 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
X는 질소 원자이며,
n은 0 내지 2의 정수를 나타내는 화합물일 수 있다.
다른 구체예에서, 화학식 2의 화합물은 R1은 니트로기 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
X는 질소 원자이며,
n은 1 내지 2의 정수를 나타내는 화합물일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 화학식 2의 화합물은
1-(4-메톡시벤질)-3-(5-메틸티아졸-2-일)우레아(1-(4-methoxybenzyl)-3-(5-methylthiazol-2-yl)urea), 1-(4-메톡시페네틸)-3-(5-니트로티아졸-2-일)우레아(1-(4-methoxyphenethyl)-3-(5-nitrothiazol-2-yl)urea) 또는 1-(4-메톡시페네틸)-3-(5-메틸티아졸-2-일)우레아(1-(4-methoxyphenethyl)-3-(5-methylthiazol-2-yl)urea)일 수 있다.
상기 화학식 2의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염은 유기산 또는 무기산을 이용하여 형성된 산 부가염일 수 있으며, 상기 유기산은, 예를 들면 포름산, 아세트산, 프로피온산, 락트산, 부티르산, 이소부티르산, 트리플루오로아세트산, 말산, 말레산, 말론산, 푸마르산, 숙신산, 숙신산 모노아미드, 글루탐산, 타르타르산, 옥살산, 시트르산, 글리콜산, 글루쿠론산, 아스코르브산, 벤조산, 프탈산, 살리실산, 안트라닐산, 디클로로아세트산, 아미노옥시 아세트산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 및 메탄술폰산계 염을 포함하며 무기산은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 탄산 및 붕산계 염을 포함한다.　바람직하게는 염산염 또는 아세트산염 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 염산염 형태일 수 있다.
상기 언급된 산 부가염은 a) 상기 화학식 2의 화합물 및 산을 직접 혼합하거나, b) 이들 중 한 가지를 용매 또는 함수 용매 중에 용해시키고 혼합시키거나, 또는 c) 화학식 2의 화합물을 용매 또는 수하 용매 중의 산에 위치시키고 이들을 혼합하는 일반적인 염 제조방법으로 제조된다.
위와는 별도로 추가적으로 염이 가능한 형태는 가바염, 가바펜틴염, 프레가발린염, 니코틴산염, 아디페이트염, 헤미말론산염, 시스테인염, 아세틸시스테인염, 메티오닌염, 아르기닌염, 라이신염, 오르니틴염, 아스파르트산염 등이 있다.
또한, 본 발명에 있어서 혈관내피세포로의 분화 유도를 위해 사용되는 중간엽 줄기세포의 종류 또한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 중배엽 줄기세포는 그것이 어디로부터 유래한 것인지 관계없이 이용될 수 있다. 중간엽 줄기세포는 공지의 중간엽 줄기세포 공급원, 예를 들어 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻을 수 있다. 골수, 조직 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 혈관내피세포로의 분화가 유도된 중배엽 줄기세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다. 이러한 공지의 중간엽 줄기세포 공급원으로부터 중간엽 줄기세포를 수득하는 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
한편, 중간엽 줄기세포에 대해 화학식 2의 화합물을 처리하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 일정 시간 동안 화학식 2의 화합물과 중간엽 줄기세포를 접촉시켜 중간엽 줄기세포가 혈관내피세포로 분화 유도될 수 있기만 하면 된다.
한 구체예에서, 화학식 2의 화합물의 처리는 중간엽 줄기세포를 화학식 2의 화합물을 포함하는 배지에서 배양함으로써 수행할 수 있다.
중간엽 줄기세포에 처리되는 화학식 2의 화합물의 농도는 구체적인 화학식 2의 화합물의 종류나 중간엽 줄기세포에 처리되는 기간, 또는 혈관내피세포로의 분화 요구 정도 등에 따라 달라질 수 있을 것이다. 한 구체예에서, 화학식 2의 화합물의 농도는 0.01 내지 100 μM의 범위에서 사용될 수 있다.
중간엽 줄기세포의 분화 유도에 일반적으로 요구되는 시간을 고려할 때, 화학식 2의 화합물을 포함하는 배지에서의 배양은 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 중간엽 줄기세포에 대한 화학식 2의 화합물의 처리의 기간은 처리되는 화학식 2의 화합물의 종류 또는 농도에 따라 달라질 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서 "혈관내피세포"는 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포 또는 혈관내피세포로의 분화 과정에 있는 세포를 모두 포함한다. 본 명세서에 있어서, "혈관내피세포", "혈관내피-유사 세포" 및 "내피-유사 세포"는 상호교환적으로 사용된다. 본 발명에 있어서, 화학식 2의 화합물의 처리에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포는 혈관내피세포와 관련된 특이적 마커의 발현을 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 수득한 혈관내피세포는 이러한 특이적 마커의 발현이 중간엽 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 특이적 마커는 이에 제한되는 것은 아니나, CD31일 수 있다.
본 발명은 또한 화학식 2의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다. 화학식 2의 화합물 및 화학식 2의 화합물의 구체예는 앞서 설명한 바와 같다. 상기 조성물은 중배엽 줄기세포의 배양시 일반적으로 사용되는 배지를 포함할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 이러한 배지로는 예컨대, MEM-alpha (Minimum Essential Medium alpha), MSCGM(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium), DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 등이 포함될 수 있다. 다르게는, 화학식 2의 화합물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도용 조성물은 중간엽 줄기세포와는 별도로 체내에 도입될 수도 있을 것이다. 즉, 중간엽 줄기세포의 투여 전이나 후, 또는 중간엽 줄기세포의 투여와 동시에 화학식 2의 화합물을 포함하는 조성물이 별도로 투여될 수도 있다. 이 경우 상기 조성물은 화학식 2의 화합물의 투여에 적합한 공지의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 중간엽 줄기세포로부터 분화 유도된 혈관내피세포를 포함하는 혈관질환 치료용 의약 조성물을 제공한다. 이러한 혈관질환 치료용 의약 조성물은 이제 제한되는 것은 아니나, 풍선확장술 등에 의한 혈관내피세포 손상 등의 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있다. 상기 의약 조성물은 줄기세포의 이식을 위해 당업계에서 사용되고 있는 공지의 담체를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 혈관내피세포의 유효량은 1×104 내지 1×108 세포/㎏일 수 있다. 그러나, 이들의 용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 병변의 정도에 따라 적의 증감될 수 있다. 본 발명에 따른 제제는 비경구 또는 국소투여에 의해 인체에 적용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 유효성분을 통상의 방법에 따라 약제학적으로 허용가능한 담체에 현탁시키거나 용해시키는데, 이 때 수용성 담체를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기 화학식 2의 화합물 및 이의 제조방법을 제공한다. 화학식 2의 화합물의 정의는 상기 기술한 바와 같으며, 예시적인 제조방법은 하기 실시예에 기술되어 있다.
본 발명의 우레아 화합물로 처리된 중간엽 줄기세포는 혈관내피세포로 특이적으로 분화 유도되므로 이를 이용하면 풍선확장술 등에 의한 혈관내피세포 손상과 같은 혈관질환을 효과적으로 치료할 수 있게 된다.
도 1은 본 발명의 화합물에 의해 중간엽 줄기세포에서 내피세포로 분화된 세포에서 capillary-like tube 형성 여부를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 화합물에 의해 중간엽 줄기세포에서 내피세포로 분화된 세포에서 cell-migration를 확인한 결과이다.
도 3 내지 5는 동물실험계에서 본 발명의 화합물에 의한 재내피세포화 실험 결과를 나타낸 것으로, 창상의 단면적 변화(도 3) 및 조직병리학적 관찰 결과(도 4 및 5)이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
실시예 1 : 1-(4-메톡시벤질)-3-(티아졸-2-일) 유레아 (1-(4- methoxybenzyl )-3-(thiazol-2-yl)urea)의 제조
Figure 112012075175226-pat00008

2-아미노티아졸 화합물(100 mg, 0.998 mmol)의 무수 N,N-디메틸포름아미드 0.1M 용액에 4-메톡시벤질 이소시아네이트(0.157 mL, 1.10 mmol)을 교반상태에서 주입한 후 100oC에서 12시간 가열하였다. 생성 혼합물을 실온상태로 식힌 후 에틸아세테이트로 희석하고 물로 세척하여 주었다. 유기층을 무수 황산마그네슘으로 건조하고 에틸아세테이트로 여과한 다음 감압농축하였다. 얻어진 일차 화합물을 디클로메탄과 헥산 1:1 비율의 용매로 재결정하여 목적화합물을 81.8%의 수율 (215mg)로 얻었다.
1H NMR (400MHz, DMSO-d 6) δ 10.5 (s, 1H), 7.30-7.16 (m, 3H), 7.02-6.89 (m, 3H), 4.26 (s, 2H), 3.73 (s, 3H). * NH peak was not observed.
실시예 2 내지 10
상기 실시예 1에 기재된 제조방법과 유사한 제조방법으로, 실시예 2~10의 화합물을 제조하였다. 제조된 화합물들의 화학구조 및 물성치는 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112012075175226-pat00009
실험예 1 : 실시예 8의 화합물에 의한 중간엽 줄기세포의 내피 세포로의 분화 확인
골수 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
10%의 소태아 혈청 (fetal bovine serum), 1%의 penicillin과 streptomycin 용액이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)로 구성된 배지 10ml로 4주령의 수컷 Sprague-Dawley rat(약 100g)의 대퇴골과 경골에서 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 추출하여 수집하였다. 1.073g/ml의 percoll의 상층에 분리된 골수를 넣고 원심분리하여 경계면에서 얻은 단핵세포를 두 번 세척 후 10% FBS-DMEM에 섞어 flask에 1×106cells/100cm2로 분주하였다. 배양은 37℃로 유지되고 95% air, 5% CO2가 있는 Forma Scientific 배양기에서 이루어졌다. 48-72 시간 후 비흡착성 세포들은 제거되고 흡착성 세포들은 PBS로 두 번 세척하였다. 새 배지를 첨가하고 약 10일 동안 3-4일 간격으로 배지를 갈아주면서 배양하였고, 간엽줄기세포만 얻기 위하여 isolex magnetic cell 분리 시스템을 사용하였다. 요약하면 선택된 세포는 anti-CD34 monoclonal antibody를 가진 혼합된 배양액에 배양하여 부착하지 않은 항체는 제거하고, anti-CD34 antibody인 anti-Mouse IgG로 coating된 Dynabeads M-450을 세포 부유물에 혼합한 후 magnetic 부분은 챔버에 연결시키고 CD34+ cell-bead는 세포 혼합물의 부분으로부터 자기를 띄어 분리할 수 있게 한다. 세포는 37℃에서 5분 동안 0.25% 트립신과 1mM EDTA로 걷어드리는데 이것은 100cm의 플레이트에서 반복하고 10일 동안 다시 배양한다.
화합물 처리에 의한 중간엽 줄기세포의 엑스 비보 변형
2계대에서, 중간엽 줄기세포를 60 mm 플레이트에 2×105 cells/ml로 위와 동일한 배지를 이용하여 분주하고, 실시예의 화합물들을 최종농도 1μM 또는 10μM로 처리하고 매 3일에 한번씩 화학식 2의 화합물을 신선한 배지로 교체하여 16일간 배양하였다.
RT - PCR
다양한 유전자의 발현 수준은 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 분석하였다. 전체 RNA를 UltraspectTM-II RNA system(Biotecx Laboratories, Inc., USA) 및 easy-BLUETM(Intron Biotechnology, Seoul, South Korea)에 의해 제조하였다. 분리된 전체 RNA로부터 Avian Myeloblastosis virus (AMV) 역전사효소(Powver cDNA Synthesis Kit, Intron Biotechnology)에 의해 단일가닥 cDNA를 합성하였다. 1㎕의 전체 RNA, 1×역전사 완충액 (10mM Tris-HCl, pH 9.0, 50mM KCl, 0.1% Triton X-100), 1mM 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트(dNTPs), 0.5유닛의 RNase 저해제, 0.5㎍의 oligo(dT)15, 및 15유닛의 AMV 역전사효소를 함유하는 20㎕의 역전사 반응 혼합물을 42℃에서 15분간 인큐베이션하고, 99℃에서 5분 동안 가열한 다음, 0 내지 5℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. PCR은 Tap 폴리머라아제(i-MaxTM DNA polymerase, Intron Biotechnology)로 표준 절차를 이용하여 수행하였다. 94℃에서 30초 동안 변성, 58℃ 내지 65℃에서 30초 동안 어닐링, 그리고 72℃에서 30초 동안 연장하는 것으로 하여 사이클 수는 25 내지 45 사이클로 변동되었다. 사용된 프라이머는 다음과 같다.
CD31: 5’-caacagacatggcaacaagg-3’, 5’-ttctggatggtgaagttggc-3’ (280bp); vWF: 5’-cattggtcaggatggagtcc-3’, 5’-agcactggtctgcattctgg-3’ (188bp)
GAPDH 프라이머(5'-ctcccaacgtgtctgttgtg-3', 5'-tgagcttgacaaagtggtcg-3' (450bp) 및 5'-accacagtccatgccatca-3', 5'-tccaccaccctgttgctgta-3'(450bp))를 내부 표준(internal standard)으로 사용하였다.
증폭 산물들의 신호 강도는 각각의 GAPDH 신호 강도에 대한 그들의 상대적인 강도로 정상화되었다(normalized).
CD31과 vWF는 내피세포 특이적 마커로 골수유래 중간엽 줄기세포가 내피세포로 분화하면 발현이 높아진다. 따라서 CD31과 vWF의 발현변화를 RT-PCR로 확인하여 대조군과 비교하였다.
상기 실시예에서 제조된 화합물들의 내피세포로의 분화 유도 정도를 하기 표 2 및 3에 나타내었다.
Figure 112012075175226-pat00010
Figure 112012075175226-pat00011
상기 표 2 및 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물은 골수 유래 중간엽 줄기세포의 내피세포로 분화를 유도함을 알 수 있다.
Capillary - like tube formation
내피세포는 특이적으로 capillary-like tube를 형성하는 성향을 가지고 있다. in vitro angiogenesis kit(MILLIPORE®)를 사용하여 화합물에 의해 중간엽 줄기세포에서 내피세포로 분화된 세포가 capillary-like tube를 형성하는지 확인하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 용매 대조군과 비교하여 본 발명의 화합물 시료 (실시예 8) 1μM 투여군에서 31.74%의 capillary-like tube 형성이 관찰되었다.
Cell - migration assay
Cell-migration 역시 capillary-like tube formation과 같이 내피세포에서 특이적으로 나타난다. Trans-well system을 사용하여 화합물에 의해 중간엽 줄기세포에서 내피세포로 분화된 세포에서 cell-migration이 증가되는지 확인하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 용매 대조군과 비교하여 본 발명의 화합물 시료 (실시예 8) 1μM 투여군에서 1.4배의 cell-migration이 증가되었다.
실험예 2: 동물실험계의 재내피세포화 실험
건강한 마우스 20마리를 무작위로 4개의 군으로 분류한 뒤, 정상대조군(control, PBS injection, n=5)은 창상유발 후 관찰하고, 상기 실시예 8 (n=5)은 0.1mg/kg의 농도로 PBS에 녹여 제조한 화합물을 미정맥으로 투여하여 창상의 상피화(wound epithelialization), 세포내용 (cellular content), 육아조직형성(granulation tissue formation)등의 항목을 확인하여 창상치유의 정도를 비교하였다.
창상은 창상 유발 지역에 소독을 실시한 다음, 지름 6 mm punch로 등에 근막층까지 일정한 깊이의 원형창상(wound)을 만든 후 각각 5일째 창상의 단면적을 확인하였으며(wound closure), sacrifice하여 조직병리학적 관찰을 실시하였다. 미세 혈관(CD31), granulation tissue formation 확인(H&E staining), 창상 지역에서의 관련 인자 확인(CD68, PDGF-β, SDF-1α, CXCR4)을 통하여 활성을 평가하였다.
창상의 단면적 변화는 도 3에 나타내었고, 조직병리학적 관찰은 도 4 및 도 5에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 (실시예 8)을 미정맥 투여한 마우스는 용매 대조군과 비교하여 원형창상이 더 빨리 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 실험 최종일(5일째)에 마우스를 희생시켜 창상 부위를 절제한 후 조직병리학적 관찰로 microvessel density를 CD31 염색을 통해서 확인하고, histological analysis를 통해서 육아조직형성(granulation tissue formation)을 확인하였다. 본 발명에 따른 화합물(실시예 8)을 미정맥 투여한 마우스는 용매 대조군과 비교하여 microvessle density가 조금 더 형성되었고, 육아조직이 창상부위로 이동하고 증식하여 창상 부위의 세포를 재형성하는 것을 관찰할 수 있었다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112014009074087-pat00022


    상기 식에서,
    R1은 니트로기 또는 탄소수 1 내지 12의 알킬기이고,
    n은 2를 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 1의 화합물은
    R1은 니트로기 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
    n은 2인 화합물.
  3. 제1항에 있어서,
    화학식 1의 화합물은 하기 화학식 1-1 또는 1-2로 표시되는 것인 화합물:
    [화학식 1-1]
    Figure 112012075175226-pat00013


    [화학식 1-2]
    Figure 112012075175226-pat00014

  4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112014009074087-pat00023


    상기 식에서,
    R1은 니트로기 또는 탄소수 1 내지 12의 알킬기이고,
    n은 2를 나타낸다.
  5. 제4항에 있어서, 화학식 1의 화합물은
    R1은 니트로기 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
    n은 2를 나타내는 화합물인 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도용 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 화학식 1의 화합물은
    하기 화학식 1-1 또는 1-2로 표시되는 화합물인 중간엽 줄기세포의 내피세포로의 분화 유도용 조성물:
    [화학식 1-1]
    Figure 112014009074087-pat00024


    [화학식 1-2]
    Figure 112014009074087-pat00025

  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112014009074087-pat00026


    상기 식에서,
    R1은 니트로기 또는 탄소수 1 내지 12의 알킬기이고,
    n은 2를 나타낸다.
  8. 제7항에 있어서, 화학식 1의 화합물은
    R1은 니트로기 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고,
    n은 2를 나타내는 화합물인 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.
  9. 제7항에 있어서, 화학식 1의 화합물은
    하기 화학식 1-1 또는 1-2로 표시되는 화합물인 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법:
    [화학식 1-1]
    Figure 112014009074087-pat00027


    [화학식 1-2]
    Figure 112014009074087-pat00028

  10. 제7항에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포는 골수, 조직, 배아, 제대혈, 혈액 또는 체액으로부터 얻은 것인 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.
  11. 삭제
  12. 제7항에 있어서,
    배양은 5일 내지 15일 동안 수행되는 것인 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.
  13. 제7항에 있어서,
    혈관내피세포는 CD31의 발현이 줄기세포에 비해 증가되어 있는 것인 중간엽 줄기세포의 혈관내피세포로의 분화 유도 방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
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