JPWO2012141038A1 - ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 - Google Patents
ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2012141038A1 JPWO2012141038A1 JP2013509857A JP2013509857A JPWO2012141038A1 JP WO2012141038 A1 JPWO2012141038 A1 JP WO2012141038A1 JP 2013509857 A JP2013509857 A JP 2013509857A JP 2013509857 A JP2013509857 A JP 2013509857A JP WO2012141038 A1 JPWO2012141038 A1 JP WO2012141038A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- stem cells
- mesenchymal stem
- formula
- cell sheet
- salt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/37—Digestive system
- A61K35/407—Liver; Hepatocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
- C07C251/72—Hydrazones
- C07C251/86—Hydrazones having doubly-bound carbon atoms of hydrazone groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
- C07C43/02—Ethers
- C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
- C07C43/225—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring containing halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
- C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
- C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
- C07D307/52—Radicals substituted by nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D487/04—Ortho-condensed systems
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/28—Materials or treatment for tissue regeneration for liver reconstruction
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Virology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Furan Compounds (AREA)
Abstract
Description
特許文献1〜2では、非肝幹細胞から幹細胞を誘導するための蛋白質について説明されているが、分化誘導剤として蛋白製剤を用いているため、安定性・安全性などの面でさらなる改善の余地があった。
(式中、
R1、R2、R4、R5、及びR6は、同一又は互いに異なって、H、ハロゲン、ニトロ、シアノ、OH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC1〜C6アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール;
R3、及びR7は、H、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル;
環Aは、置換されていてもよいアリール、又は置換されていてもよいヘテロアリール;
m、及びqは、1〜4いずれかの整数;
nは、1〜3いずれかの整数;
p及びrは、1〜5いずれかの整数である。
但し、N−[(5−メチル−2−フリル)メチリデンアミノ]−2−フェノキシ-ベンザミドを除く。)
(式中、
R8、及びR9は、同一又は互いに異なって、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、又は置換されていてもよいC2〜C6アルケニルである。)
<化合物>
本発明の一実施形態に係る化合物は、式(1)及び式(2)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物である。この化合物、その塩またはそれらの溶媒和物は、有機低分子量化合物であるため、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化効率に優れる安全な分化誘導法を実現できる。
本発明の一実施形態に係る間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤は、式(1)〜式(7)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含む分化誘導剤である。または、式(8)及び式(9)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩もしくはそれらの溶媒和物を含む分化誘導剤である。これらの分化誘導剤によれば、有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化効率に優れる安全な分化誘導法を実現できる。
1.肝特異的転写因子発現
2.肝特異的蛋白発現
3.グリコーゲン合成
4.尿素合成
5.TCF活性によるWnt/β−カテニンシグナル経路のシグナル強度をルシフェラーゼ活性で評価
本発明の一実施形態に係るWnt/β−カテニンシグナル経路抑制剤は、式(1)及び式(2)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含むWnt/β−カテニンシグナル経路抑制剤である。または、式(8)に示す化合物、その塩もしくはそれらの溶媒和物を含むWnt/β−カテニンシグナル経路抑制剤である。これらのWnt/β−カテニンシグナル経路抑制剤を用いれば、Wnt/β−カテニンシグナル経路を抑制することが可能であり、且つ有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性または安全性などの面で優れている。
本発明の一実施形態に係る肝細胞を生産する方法は、間葉系幹細胞を式(1)及び式(2)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物で処理する工程を含む、生産方法である。または、間葉系幹細胞を上記の分化誘導剤で処理する工程を含む、生産方法である。これらの方法によれば、有機低分子量化合物を用いるので、蛋白製剤や核酸製剤に比べ安定性・安全性などの面で優れており、間葉系幹細胞から肝細胞への分化誘導を効率よく安全に行うことができる。
このようにして分化誘導された肝細胞は、肝細胞移植などの移植医療、薬の薬効や副作用を評価する創薬などの用途に好適に用いることができる。また、この肝細胞は、有機低分子量化合物を用いて間葉系幹細胞から分化誘導されるので、蛋白製剤や核酸製剤を用いて分化誘導される場合に比べ製造時の安定性・安全性などの面で優れている。
本発明の一実施形態は、上記のようにして分化誘導された肝細胞を含む、細胞シートである。この細胞シートは、後述する実施例で実証されているように、肝障害を抑制することができる。そのため、肝障害治療用として好適に使用できる。
(1)ICG−001の合成
ICG−001は中心骨格に二環性のβ−ターン模倣構造を有するオリゴペプチドであり、β−catenin/Tcf複合体による転写活性化に対する強力なアンタゴニストとして機能することが報告されている(Drug Discov. Today 2005, 10, 1467−1474)。ICG−001の合成は文献(Tetrahedron 2007, 63, 12912−12916)に従い、検討を行なった。
1−naphtaldehyde (和光純薬)(1.56 g, 10 mmol)と 2,2−diethoxyethanamine (東京化成工業)(1.33 g, 10 mmol)を混合し100 oCで20 min撹拌した。室温まで冷却後、EtOH (20 mL)で希釈し、NaBH4 (0.38 g, 10 mmol)を少量ずつ加え、室温下、16 h撹拌した。反応終了後、減圧濃縮によりEtOHを留去し、生成物をAcOEtで抽出した。得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt = 5/1)で精製し、化合物1を得た(2.29 g, 8.5 mmol, 85 %)。
Fmoc−L−Tyr(t−Bu)−OH (0.87 g, 1.9 mmol)のDMF (7 mL)溶液に、縮合剤HATU (0.76 g, 2.0 mmol)とdiisopropylethylamine (DIEA) (0.35 mL, 2.0 mmol)を加え、20 min撹拌後、化合物1 (0.54 g, 2.0 mmol)を加え、室温下、16 h撹拌した。反応後、減圧濃縮によりDMFを留去し、得られた生成物をカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt = 10/1)で精製し、化合物2を得た(1.33 g, 1.9 mmol, 93 %)。得られた化合物2 (1.33 g, 1.9 mmol)をCH2Cl2 (20 mL)に溶解し、diethylamine (DEA) (10 ml, excess)を加え、室温下、2 h撹拌した。TLCで反応終了を確認後、減圧濃縮によりCH2Cl2を留去し、得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(AcOEt)で精製し、化合物3を得た(0.92 g, 1.8 mmol, 92 %)。
Fmoc−β−Ala−OH (0.53 g, 1.7 mmol)のDMF (8 mL)溶液に、縮合剤HATU (0.70 g, 1.8 mmol)とdiisopropylethylamine (DIEA) (0.32 mL, 1.8 mmol)を加え、20 min撹拌後、化合物3 (0.92 g, 1.8 mmol)を加え、室温下、14 h撹拌した。反応後、減圧濃縮によりDMFを留去し、得られた生成物をカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt = 1/1)で精製し、化合物4を得た(1.2 g, 1.5 mmol, 82 %)。得られた化合物4 (1.2 g, 1.5 mmol)をCH2Cl2 (20 mL)に溶解し、diethylamine (DEA) (9 mL, excess)を加え、室温下、1 h撹拌した。TLCで反応終了を確認後、減圧濃縮によりCH2Cl2を留去し、得られた生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(AcOEt/EtOH = 1/1)で精製し、化合物5を得た(0.66 g, 1.2 mmol, 80 %)。
化合物5(0.66 g, 1.2 mmol)のCH2Cl2溶液(8 mL)にbenzylisocyanate (0.16 g, 1.2 mmol)のCH2Cl2溶液(8 mL)を加え、室温下、12 h撹拌した。TLCで反応終了を確認後、減圧濃縮によりCH2Cl2を留去し、得られた生成物をカラムクロマトグラフィー(AcOEt/EtOH = 1/1)で精製し、化合物6を得た(0.59 g, 0.85 mmol, 73 %)。得られた化合物6(0.59 g, 0.85 mmol)を蟻酸(9 ml)中で室温下、20 h撹拌した。減圧濃縮により蟻酸を留去し、得られた生成物をカラムクロマトグラフィー(AcOEt)で精製し、化合物7a (ICG−001)を白色個体として得た(0.26 g, 0.48 mmol, 57 %)。
得られた生成物は、MSスペクトルおよび、1H NMRスペクトル(文献値と一致)から同定した(図1)。
上記(1)の合成法において、上記(1−2)の化合物3の合成の際に、「Fmoc−L−Tyr(t−Bu)−OH」を「Fmoc−L−Phe(t−Bu)−OH」に代えて合成を行った。これによりICG−001の側鎖を変換した、誘導体IC−2 ((6S,9aS)−6−phenyl−8−naphthalen−1−ylmethyl−4,7−dioxo−hexahydro−pyrazino[1,2−a]pyrimidine−1−carbocylic acid benzylamide)(全収率29%)を合成した。スペクトルデータを図2に示す。
Hexachloropheneは防虫剤、殺菌剤、消毒剤などに用いられている高度に塩素化されたフェノール性化合物である。ここでは、Hexachloropheneのフェノール性水酸基をメチル基でキャップした誘導体を合成した。hexachlorophene(東京化成工業)(417 mg, 1.0 mmol)のacetone溶液(10 mL)にMeI (1.0 mL, 16 mmol)、K2CO3 (5.3 g, 36 mmol)を加え、14 h撹拌した。過剰のK2CO3を除去し、Na2SO4で乾燥後、溶媒を留去することで粗生成物を得た。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー(hexane/AcOEt =7/1)で精製し目的のhexachlorophene誘導体(メチルエーテル体)(bis(2,3,5−trichloro−6−methoxyphenyl)methane)を得た(355 mg, 0.85 mmol, 85 %)。このメチルエーテル体を1H NMRで分析した。
Phenoxy benzhydrazide (和光純薬)(0.46 g, 2.0 mmol, 1.0 eq)をEtOHに溶解させ、1−naphtaldehyde ( 0.32g, 2.0 mmol, 1.0 eq )を加えて室温で22時間攪拌。22時間後反応溶液を濾過し、EtOHで再結晶して目的物を得た(403 mg, 58 %)。
1H−NMR (400 MHz, CDCl3)
6.83−8.78 ( m , 16H , Ar−H) 8.82 (s , 1H, −CONHN=CHC), 10.79 (s , 1H , CONHN=CH)
IR(KBr) 758, 1249, 1358, 1371, 1449, 1481, 1662, 2969, 3082 cm−1;
MS (EI) Found: m/z 366. Calcd for C24H18N2O2: M+, Mol. Wt.: 366.41
Anal. Found: C, 78.37; H, 5.02; N, 7.68; O, 8.98 %. Calcd for C24H18N2O2: C, 78.67; H, 4.95; N, 7.65; O, 8.73
上記実施例3において、1−naphtaldehydeをpentafluorobenzaldehyde(東京化成工業)に変えて合成を行った。Phenoxy benzhydrazide ( 0.24 g, 1.0 mmol, 1.0 eq)をEtOHに溶解させ、 pentafluorobenzaldehyde( 196 g, 1.0 mmol, 1.0 eq )を加えて室温で14時間攪拌。14時間後反応溶液を濾過し、EtOHで再結晶して目的物を得た(287 mg,, 71 %)。
1H−NMR (400 MHz, CDCl3)
6.79−8.37( m , 9H , Ar−H) 8.53 (s , 1H, −CONHN=CH−C), 10.92 (s , 1H , CONHN=CH)
IR(KBr) 750, 980, 1231, 1493, 1518, 1659, 3285 cm−1;
MS (EI) Found: m/z 406. Calcd for : C20H11F5N2O2 M Mol. Wt.: 406.31
上記実施例3において、1−naphtaldehydeを3−phenoxy benzhydrazide(和光純薬)に変えて合成を行った。3−Phenoxy benzhydrazide ( 0.78 g, 3.4 mmol, 1.0 eq)をEtOHに溶解させ、5−methyl−furfural ( 0.43 g, 3.4 mmol, 1.0 eq )を加えて室温で14時間攪拌。14時間後反応溶液を濾過し、EtOHで再結晶して目的物を得た(318 mg, 29 %)。
1H−NMR (400 MHz, CDCl3)
2.35 { s , 3H , −CH=C(CH3)} 6.11{ s , 1H , −CHC(CH3)}6.69{ s , 1H , −CHCHC(CH3)} 7.03−7.52 ( m , 9H , Ar−H) 8.48 (s , 1H, −CONHN=CH−), 8.92 (s , 1H , CONHN=CH)
IR(KBr) 746, 1018, 1233, 1287, 1300, 1489, 1580, 1651, 3048, 3194 cm−1;
MS (EI) Found: m/z 320. Calcd for C19H16N2O3: M, Mol. Wt.: 320.34
Anal. Found: C, 71.25; H, 5.04; N, 8.79; O, 14.92 %. Calcd for : C19H16N2O3 C, 71.24; H, 5.03; N, 8.74; O, 14.98
図3は、β−catenin/TCF4/ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定発現するヒト間葉系幹細胞の樹立方法について説明するための概念図である。図1に示すように、Luciferase発現ベクターを用いてpTCF4−CMVpro−GL4.20プラスミドを構築した。TCF4−CMVpro−GL4.20プラスミドは、3回繰り返しのTCF4配列CCTTTGATCをCMVプロモーターの上流に含み、luciferaseを発現する。また、pCMVpro−GL4.20プラスミドをコントロールとして構築した。得られたプラスミドをそれぞれ線状化し、UE7T−13にエレクトロポレーションによって導入し、培地中に加えたPuromycin(0.25μg/ml)によって選別した。Puromycin耐性の細胞はクローン化し、luciferaseアッセイに用いることにした。
骨髄由来細胞(UE7T−13細胞)をIC−2等で処理した場合について、(1)増殖能(毒性)の検討、(2)Wnt/β−catenin経路抑制能の検討、(3)肝細胞分化能の検討を行った。
ヒト間葉系幹細胞株UE7T−13を細胞密度が9.0x103cells/cm2になるように96well plate(底面積:0.3cm2)に播種し、10%ウシ胎児血清(FBS,JRH Biosciences,INC)、100U/ml penicillin、100ug/ml streptomycin(Nacalai Tesque)を含むDulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM,ニッスイ)にて培養した。この時点をday0とする。翌日(day1)、IC−2等を含むDMEMにメディウムチェンジした。以降、day2、day4、day8にTetraColor one(生化学工業)を用いて測定を行い、UE7T−13の細胞増殖への影響を検討した。培養液に含まれるDMSOは、終濃度が0.1%となるようにした。
24well plateにLuciferase発現ベクター安定導入株を播種し、37℃で培養した。翌日、IC−2等を含むメディウムに交換し、37℃で培養した。その後、1,4,8日後にluciferase活性をLuciferase Assay System(Promega)を使用し、556nmの波長を蛍光プレートリーダー(ARVIO)で測定した。
(3−1) 分化誘導(UE7T−13)
6well plateに細胞密度が9.0x103cells/cm2になるように播種し、37℃で24時間培養した。24時間後に、IC−2等を含むメディウムに交換した。以降、週に2回培地交換し、週に1回継代して細胞数を9.0x103cells/cm2に調整した。誘導開始から8、16、24日目にTotal RNAを回収した。
Total RNAは、TRIzol試薬で抽出した。抽出後、DNAを完全に除くため、Deoxyribonucleaseを加えて37℃で1時間インキュベートした。逆転写反応には、SuperScript First−Stand Synthesis System for RT−PCR(Invitrogen)を使用し、1μgのRNAをOligo dT PrimerにてcDNAへ変換した。PCRには、cDNAを5倍希釈し、そのうち1μlを使用した。PCR反応には、Taq DNA polymerase,recombinat(Invitrogen)を使用した。ヒトアルブミンのプライマーは、5'−TTGGAAAAATCCCACTGCAT−3'(配列番号:1)と5'−CTCCAAGCTGCTCAAAAAGC−3'(配列番号:2)を用いた。PCR反応は、95℃2分で1サイクル、95℃30秒、58℃30秒、72℃30秒で35サイクル施行した。内部対照としてヒトglyceradehyde 3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)を用いた。GAPDHプライマーは、5'−GTCTTCTCCACCATGGAGAAGGCT−3'(配列番号:3)と5'−CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA−3'(配列番号:4)を用いた。PCR反応は、95℃2分で1サイクル、95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒で20サイクル施行した。PCR産物は、エチジウムブロマイドの入った2%アガロースゲルで30分間電気泳動し、トランスイルミネ―ターを用いて写真を撮った。
細胞を24well plateに播種し、IC−2等を含む培地で培養した。メディウムに塩化アンモニウム(終濃度5mM)を加え、48,72,96時間培養後にメディウム中の尿素量をQuantiChrom Urea Assay Kit(BioAssay Systems)を使用し、520nmの波長を蛍光プレートリーダー(TECAN)を用いて測定した。
6well plateに70% EtOHで滅菌したカバーガラス(22x22mm,MATSUNAMI)を入れ、その上に細胞を播種し、IC−2等を含む培地で培養した。培養開始から8,16,24日後にPBSで2回洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド/PBSで細胞を20分間処理してカバーガラスに固定した。陰性対照として、10mg/mlのα−アミラーゼ(10mg/ml,0.1M リン酸緩衝液,pH6.8)で1時間、37℃でインキュベートしてグリコーゲンを消化した。1%過ヨウ素酸水溶液で10分間酸化処理した後、Schiff試薬で15分間処理してグリコーゲンを染色し、亜硫酸水溶液で3回、蒸留水で3回洗浄した。Mayer's hematoxylinで核染色した後、カバーガラスをPBSで希釈した50% glycerolで封入し、光学顕微鏡下で観察した。0.1% DMSOで培養した細胞をコントロールとした。
6well plateに70% EtOHで滅菌したカバーガラス(22x22mm,MATSUNAMI)を入れ、その上に細胞を播種し、IC−2等を含む培地で培養した。培養開始から8,16,24日後にPBSで2回洗浄した後、4%パラホルムアルデヒド/PBSで細胞を20分間処理してカバーガラスに固定した。その後、0.2% Triton X−100で10分間透過処理した。3% BSA/PBSで30分間処理してブロッキングした。一次抗体としてanti−albumin antibody, anti−C/EBP antibody, anti−AFP antibody, anti−CYP1A1 antibodyを用い、4℃で一晩インキュベートした。次に、二次抗体としてAlexa Fluoro 488 goat anti−mouse antibody、Alexa Fluoro 594 goat anti−rabbit antibodyを用い、室温で1時間インキュベートした。核染色にDAPIを用いた。カバーガラスをPBSで希釈した50% glycerolで封入し、共焦点レーザー顕微鏡下で観察した。0.1% DMSOで培養した細胞をコントロールとした。
以上の実験結果から、本発明者らは、IC−2等を用いて間葉系幹細胞を機能性肝細胞へ分化誘導可能であることを明らかにした。同時に、肝再生医療の実現化に向けて、間葉系幹細胞は肝再生医療の細胞ソースとして有用であることを明らかにした。また分化誘導には、IC−2等によるWnt/β−カテニンシグナル経路の抑制が有効であった。これらは、真に臨床応用可能な肝再生医療の開発をしていく上で重要な知見である。
骨髄由来間葉系幹細胞(UE7T-13細胞)を化合物hexachlorophene(Sigma-Aldrich社、H4625-25G)、IC-2で処理した場合の肝特異的分泌蛋白質とサイトカインの遺伝子発現を検討した。まず、骨髄由来間葉系幹細胞(UE7T-13細胞)を細胞密度が9.0×103 cells/cm2となるように6-well plate (底面積:9.6cm2)に播種し、10%ウシ胎児血清(FBS, JRH Biosciences, INC)、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン (Nacalai Tesque)を含むDulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, ニッスイ)中、37℃、5%CO2条件下で培養した。この時点をday 0とする。
bFGF徐放デバイスの作製法は、American Journal of Transplantation 2006; 6: 50-59ならびにNature Medicine 2007; 13(7): 880-885に準ずる。bFGF徐放デバイスは免疫不全マウスNOD-SCIDマウスの背部皮下に埋め込み血管新生を誘導した。まず、NOD-SCIDマウス体重1gあたり1 μlの全身麻酔薬ソムノペンチル (共立製薬)を腹腔内投与し、麻酔を導入した。麻酔導入後マウスの左背部の剃毛を行い、術用ハサミもしくはそれに準ずる術用器具によりbFGFデバイスを埋め込む位置の1cm弱尾側の箇所を皮下組織のみ体軸方向に対して垂直に約1.5cm〜2.0cm、切開した。切開口より術用ハサミもしくはそれに準ずる術用器具を皮下に沿って頭側に向かって、デバイスを埋め込む位置より奥に進めた。その後、術用ハサミを皮下で開くことで、マウス皮下にデバイスを埋め込み可能な空間を作った。この空間にbFGFデバイスを入れ、縫合クリップもしくは縫合糸により切開口を縫合した。
7週齢の雄のNOD-SCIDマウスを4群に分けた(図18)。第1群は、細胞シートの移植を行わない偽移植群とし、第2群は細胞シートを血管新生後の皮下へ1枚移植を実施する群、第3群は細胞シートを血管新生後の皮下へ2枚移植を実施する群、第4群は細胞シートを血管新生後の皮下へ3枚移植を実施する群とした。4群共に細胞シート移植実施日の12日前にbFGFデバイスをマウスの背部皮下に埋め込み血管新生を誘導した。
7週齢雄のNOD-SCIDマウスを4群に分けた。第1群は、細胞シートの移植を行わない偽移植群とし、第2群は肝外側左葉に細胞シート1枚移植を実施する群、第3群は肝外側左葉に細胞シート2枚移植を実施する群、第4群は肝外側左葉に細胞シート3枚移植を実施する群とした。
9週齢の雄のNOD-SCIDマウスを4群に分けた(図21)。第1群は、細胞シートの移植を行わない偽移植群とし、第2群は2か所の肝外側左葉表面に細胞シートを1枚ずつ移植する群、第3群は2か所の肝外側左葉表面に細胞シートを2枚ずつ移植する群、第4群は2か所の肝外側左葉表面に細胞シートを3枚ずつ移植する群とした。
(1)間葉系幹細胞の分取方法
慶応大学岡野教授、松崎准教授らにより開発されたCD90+CD271+間葉系幹細胞の分取方法(特開2009-060840)の概要図を図28に示す。この方法に基づいて、間葉系幹細胞を分取した。
Lonza社より購入したヒト骨髄単核球細胞を100倍希釈したAPC標識抗CD90抗体、407倍希釈したPE標識抗CD271抗体、2% ウシ胎児血清 (FBS, Defined, Thermo Fisher Scientific Inc.)を加えた1 mlのHanks-balanced salution supplemented (HBSS, gibco, Life Technologies Corp.) に懸濁し、氷上で30分間染色した。フローサイトメーター (Moflo XDP, Beckman Coulter Inc.) を用いて間葉系幹細胞を選択的に分離した。得られた細胞は、20% FBS、100 U/ml penicillin、100 ng/ml streptomycin (Nacalai Tesque)、20 ng/ml basic fibroblast growth factor (株式会社トランスジェニック) を含むDulbecco's Modified Eagle's Medium (Low Glucose , gibco, Life Technologies Corp) 中で35 mm dish を用い37℃、5% CO2条件下で培養した。4日毎に培地交換を行い、コロニー形成後、0.025% trypsin/1mM EDTA solution (Nacalai Tesque) にて細胞を剥離し、100 mm dish に継代を行い37℃、5% CO2条件下で培養した。その後、70〜80% コンフルエントの状態でトリプシン処理により細胞を剥離し、1dish分を4dishに分けて継代した。
96wellプレートに5.0×103 cells/cm2の細胞密度で細胞を播種し、24時間後0.1%DMSO、又はIC-2 (終濃度40、45 μM)を含む培地にて培地交換を行い、37℃、5% CO2条件下で培養した。細胞を播種してから4日後に、上記化合物を含む培地にて培地交換を行った。測定の3日前にTCFモチーフ及びmCMVプロモーターの制御によりホタルルシフェラーゼ発現するレンチウイルス (SABiosciences, Qiagen N.V.) をMOI=10で感染させた。内部コントロールとしてウミシイタケルシフェラーゼを発現するレンチウイルス (SABiosciences, Qiagen N.V.) を同時に感染させた。上記化合物による薬剤処理から8日目に、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Corp.) を使用し、ルミノメーターによりルシフェラーゼ活性を測定した。
6wellプレートに1.8×104 cells/cm2の細胞密度で細胞を播種し、この日をday 0とした。翌日に相当するday 1にIC-2 (終濃度25、35、45 μM)、又は0.1% DMSOを含む培地にて培地交換を行った。day 4でday 1同様の操作で培地交換を行い、day 8で継代して細胞数を1.8×104 cells/cm2に調整し直し再播種した。以降、8日間に2回の培地交換、8日毎の継代を同様の操作でday 24まで実施した。誘導開始から8、16、24日目にTRIzol (Invitrogen)を用いて添付文書の方法に従い、Total RNAを抽出した。抽出後、Deoxyribonuclease (NipponGene)を加え37℃、30分間incubation し、DNAの除去を行った。逆転写反応には、1 μgのRNA にSuperScriptII Reverse Transcriptase (Invitrogen)、Oligo(dt)15 primerを加えcDNAへ変換した。RT-PCR法には、cDNAを5倍希釈後、そのうちの1 μlを鋳型として使用し、rTaq DNA polymerase (TOYOBO)により増幅した。陰性対照はMQ水を、陽性対照はHuh-7もしくはUE7T-13細胞のcDNAを使用した。
(1)臨床検体由来の骨髄由来間葉系幹細胞の分離・調整・培養方法
インフォームドコンセントの下、鳥取大学附属病院整形外科にて人工関節置換術が施行された変形性関節症患者(60歳女性)より採取した新鮮骨髄液をficol (Amersham Biosciences) による密度勾配遠心にて骨髄単核球を分離した(図31)。この骨髄単核球を100倍希釈したAPC標識抗CD90抗体、407倍希釈したPE標識抗CD271抗体、2% ウシ胎児血清 (FBS, Defined, Thermo Fisher Scientific Inc.)を加えた1 mlのHanks-balanced salution supplemented (HBSS, gibco, Life Technologies Corp.) に懸濁し、氷上で30分間染色した。フローサイトメーター (Moflo XDP, Beckman Coulter Inc.) を用いて間葉系幹細胞を選択的に分離した。得られた細胞は、20% FBS、100 U/ml penicillin、100 ng/ml streptomycin (Nacalai Tesque)、20 ng/ml basic fibroblast growth factor (株式会社トランスジェニック) を含むDulbecco's Modified Eagle's Medium (Low Glucose , gibco, Life Technologies Corp) 中で35 mm dish を用い37℃、5% CO2条件下で培養した。4日毎に培地交換を行い、コロニー形成後、0.025% trypsin/1mM EDTA solution (Nacalai Tesque) にて細胞を剥離し、100 mm dish に継代を行い37℃、5% CO2条件下で培養した。その後、70〜80% コンフルエントの状態でトリプシン処理により細胞を剥離し、1dish分を4dishに分けて継代した。
6wellプレートに1.8×104 cells/cm2の細胞密度で細胞を播種し、この日をday 0とした。翌日に相当するday 1にhexachlorophene (終濃度4 μM)、HC-2 (終濃度20 μM) 、PN-3-13 (終濃度20 μM) 、IC-2 (終濃度40 μM)又は0.1% DMSOをそれぞれ含む培地にて培地交換を行った。day 4でday 1同様の操作で培地交換を行い、day 8で継代して細胞数を1.8×104 cells/cm2に調整し直し再播種した。以降、8日間に2回の培地交換、8日毎の継代を同様の操作でday 24まで実施した。誘導開始から8、16、24日目にTRIzol (Invitrogen)を用いて添付文書の方法に従い、Total RNAを抽出した。以下の操作は上記実施例13(4)と同様の方法に従った。
12wellプレートに100%エタノールで滅菌したカバーガラスを入れ、その上に細胞を1.8×104 cells/cm2の細胞密度で播種し、この日をday 0とした。翌日に相当するday 1にHC-2 (終濃度20 μM) 、PN-3-13 (終濃度20 μM)、IC-2 (終濃度40 μM)、又は0.1% DMSOを含む培地にて培地交換を行った。day 4でday 1同様の操作で培地交換を行い、day 8で、培養液を除き、PBSで2回洗浄した後、albumin免疫染色には8% sucrose (和光純薬工業株式会社) を含む4% パラホルムアルデヒド (Nacalai Tesque)で20分間固定した。C/EBPαおよび、CYP1A1の免疫染色には4% パラホルムアルデヒドで20分間固定した。次に0.2% Triton X-100 (和光純薬工業株式会社) で10分間透過処理をし、3% BSA (Nacalai Tesque)で、室温、30分間静置してブロッキングを行った。
ウレアアッセイを次の操作方法に従い実施した。24wellプレートにCD90+CD271+骨髄由来間葉系幹細胞を1.8×104 cells/cm2の細胞密度で播種し、この日をday 0とした。翌日に相当するday 1にhexachlorophene (終濃度4 μM)、HC-2 (終濃度20 μM)、PN-3-13 (終濃度20 μM)、IC-2 (終濃度40 μM)、又は0.1% DMSOを含む培地にてそれぞれ培地交換を行った。day 4でday 1同様の操作で培地交換を行い、day 8まで培養した。day 8で培地を除き、最終濃度5 mMの塩化アンモニウム (Nacalai Tesque) を含む培地にて培地交換を行いさらに96時間培養した。塩化アンモニウムの添加96時間後、培地中の尿素量をQuantiChrom Urea Assay Kit (BioAssay Systems) を添付の操作方法に従い使用し、マイクロプレートリーダーにより520 nmの波長の吸光度を測定した。尿素量は添付の計算方法に従い、標準サンプルを元に算出した。ウレアアッセイの陰性対照には、免疫染色実施日の前日に播種した分化誘導未実施の同じCD90+CD271+骨髄由来間葉系幹細胞を用いた。
以下の方法でPAS染色を実施した。12wellプレートに100% エタノールで滅菌したカバーガラスを入れ、その上に細胞を1.8×104 cells/cm2の細胞密度で播種し、この日をday 0とした。翌日に相当するday 1にHC-2 (終濃度20 μM)、PN-3-13 (終濃度20 μM)、IC-2 (終濃度40 μM)、又は0.1% DMSOを含む培地にてそれぞれ培地交換を行った。day 4でday 1同様の操作で培地交換を行い、day 8まで培養した。8日目にPBSで2回洗浄した後、4% パラホルムアルデヒドで30分間固定した。陰性対照として、終濃度10 mg/mlのα-アミラーゼ(Nacalai Tesque) で1時間、37℃でインキュベートしてグリコーゲンを消化した。1% 過ヨウ素酸水溶液 (Nacalai Tesque) で5分間処理した後、シッフ試薬 (Nacalai Tesque) で15分間処理してグリコーゲンを染色し、亜硫酸水で3回、脱イオン水で3回洗浄した。Mayer's Hematoxylin (武藤化学株式会社) で1分間核染色した後、カバーガラスを取り出してスライドガラスに載せて封入し、光学顕微鏡 (オリンパス、IX71)で観察した。PAS染色の陽性対照には、肝癌細胞株Huh-7を用いた。陰性対照には、免疫染色実施日の前日に播種した分化誘導未実施の同じCD90+CD271+骨髄由来間葉系幹細胞を用いた。
7週齢の雄のNOD-SCIDマウスを3群に分けた。第1群は、細胞シートの移植を行わない偽移植群とし、第2群はLonza社より購入した骨髄単核球細胞より分離、調整したCD90+CD271+骨髄由来間葉系幹細胞(以下、healthyとする)を分化誘導し作製した細胞シートを移植する群、第3群は鳥取大学附属病院整形外科、人工関節置換術を施行された患者の骨髄より分離調整したCD90+CD271+骨髄由来間葉系幹細胞(以下、patientとする)を分化誘導し作製した細胞シートを移植する群とした。
9週齢雄のNOD-SCIDマウスを5群に分けた(図37)。第1群は、細胞シートの移植を行わない偽移植群とし、第2群は肝外側左葉表面に細胞シート6枚移植を実施する群、第3群は脾内注入による経門脈phosphate-buffered saline (PBS)投与を実施する群、第4群は脾内注入により経門脈的に1×106細胞移植を実施する群、第5群は脾内注入により経門脈的に4×107細胞移植を実施する群とした。
以上の実験結果から、本発明者らは、IC−2等によって、Wnt/β−カテニンシグナル経路を抑制できることを明らかにした。さらに、IC−2等を用いて間葉系幹細胞を機能性肝細胞へ分化誘導可能であることを明らかにした。
Claims (23)
- 式(1)及び式(2)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物。
(式中、
R1、R2、R4、R5、及びR6は、同一又は互いに異なって、H、ハロゲン、ニトロ、シアノ、OH、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、置換されていてもよいC1〜C6アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール;
R3、及びR7は、H、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、置換されていてもよいC2〜C6アルケニル;
環Aは、置換されていてもよいアリール、又は置換されていてもよいヘテロアリール;
m、及びqは、1〜4いずれかの整数;
nは、1〜3いずれかの整数;
p及びrは、1〜5いずれかの整数である。
但し、N−[(5−メチル−2−フリル)メチリデンアミノ]−2−フェノキシ-ベンザミドを除く。) - 前記R1、R2、R4、R5、及びR6が、同一又は互いに異なって、H、ハロゲン、ニトロ、シアノ、OH、C1〜C6アルキル、ハロゲノC1〜C6アルキル、ヒドロキシC1〜C6アルキル、C1〜C6アルキルアミノ、C1〜C6アルコキシ、ハロゲノC1〜C6アルコキシ、ヒドロキシC1〜C6アルコキシ、又はC1〜C6アルコキシアミノであり、
前記R3、及びR7はHであり、
前記環Aは、置換されていてもよいナフチル、5つのハロゲンで置換されているフェニル、又は1つのメチルで置換されているフリルである、
請求項1に記載の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物。 - 式(3)〜式(5)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項2に記載の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物。
(式中、
R7は、置換されていてもよいナフチル、または5つのハロゲンで置換されていているフェニルである。) - 式(3)、式(5)、式(6)、及び式(7)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物である、請求項3に記載の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物。
- 間葉系幹細胞の肝細胞への分化誘導剤であって、
a)請求項1〜4いずれかに記載の化合物、その塩もしくはそれらの溶媒和物、または、
b)式(8)に示す化合物、その塩もしくはそれらの溶媒和物、
を含む分化誘導剤。
(式中、
R8、及びR9は、同一又は互いに異なって、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、又は置換されていてもよいC2〜C6アルケニルである。) - 式(3)、式(5)、式(6)、式(7)、及び式(9)に示す化合物群から選ばれる1種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含む分化誘導剤である、請求項5に記載の分化誘導剤。
- Wnt/β−カテニンシグナル経路を抑制する、請求項5または6に記載の分化誘導剤。
- 前記間葉系幹細胞が、骨髄由来細胞である、請求項5〜7いずれかに記載の分化誘導剤。
- 前記間葉系幹細胞におけるアルブミン、C/EBPα、CYP1A1、及びCYP3A4からなる群から選ばれる1種以上の蛋白質の発現を誘導する、請求項5〜8いずれかに記載の分化誘導剤。
- 前記間葉系幹細胞におけるグリコーゲン生産能または尿素合成能を増強する、請求項5〜9いずれかに記載の分化誘導剤。
- Wnt/β−カテニンシグナル経路抑制剤であって、
c)請求項1〜4いずれかに記載の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物、または、
d)式(8)に示す化合物、その塩またはそれらの溶媒和物、
を含むWnt/β−カテニンシグナル経路抑制剤。
(式中、
R8、及びR9は、同一又は互いに異なって、置換されていてもよいC1〜C6アルキル、又は置換されていてもよいC2〜C6アルケニルである。) - 間葉系幹細胞から肝細胞を生産する方法であって、間葉系幹細胞を、
e)請求項1〜4いずれかに記載の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物、または
f)請求項5〜10いずれかに記載の分化誘導剤、
で処理する工程を含む、生産方法。 - 間葉系幹細胞から分化誘導された肝細胞であって、請求項12に記載の生産方法で得られる、肝細胞。
- 請求項13に記載の肝細胞を含む、再生医療用の肝組織。
- 請求項13に記載の肝細胞を含む、再生医療用の肝臓。
- 請求項13に記載の肝細胞を含む、細胞シート。
- 肝表面移植用である、請求項16に記載の細胞シート。
- 請求項16または17に記載の細胞シートと、細胞シート回収用支持体とを含む、移植材料。
- 移植材料を生産する方法であって、幹細胞を、
g)請求項1〜4いずれかに記載の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物で処理する工程、または、
h)式(8)に示す化合物、その塩またはそれらの溶媒和物で処理する工程、
を含む、生産方法。 - 前記g)の工程は、間葉系幹細胞を請求項1〜4いずれかに記載の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含む培地で培養し、間葉系幹細胞を肝細胞に分化させる工程を含み、
前記h)の工程は、間葉系幹細胞を式(8)に示す化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含む培地で培養し、間葉系幹細胞を肝細胞に分化させる工程を含む、
請求項19に記載の生産方法。 - 前記移植材料が細胞シートである、請求項20に記載の生産方法。
- 間葉系幹細胞をヘキサクロロフェン、その誘導体、それらの塩、またはそれらの溶媒和物で処理し、間葉系幹細胞を肝細胞に誘導する誘導工程を含む、
肝表面移植用の細胞シートの生産方法。 - 間葉系幹細胞をWnt/β-カテニンシグナル経路阻害剤で処理し、間葉系幹細胞を肝細胞に誘導する誘導工程を含む、
肝表面移植用の細胞シートの生産方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011091599 | 2011-04-15 | ||
JP2011091599 | 2011-04-15 | ||
PCT/JP2012/059021 WO2012141038A1 (ja) | 2011-04-15 | 2012-04-02 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016123647A Division JP6201008B2 (ja) | 2011-04-15 | 2016-06-22 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2012141038A1 true JPWO2012141038A1 (ja) | 2014-07-28 |
JP6008297B2 JP6008297B2 (ja) | 2016-10-19 |
Family
ID=47009217
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013509857A Active JP6008297B2 (ja) | 2011-04-15 | 2012-04-02 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
JP2016123647A Active JP6201008B2 (ja) | 2011-04-15 | 2016-06-22 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
JP2017117768A Pending JP2017205526A (ja) | 2011-04-15 | 2017-06-15 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
JP2017128831A Active JP6391067B2 (ja) | 2011-04-15 | 2017-06-30 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016123647A Active JP6201008B2 (ja) | 2011-04-15 | 2016-06-22 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
JP2017117768A Pending JP2017205526A (ja) | 2011-04-15 | 2017-06-15 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
JP2017128831A Active JP6391067B2 (ja) | 2011-04-15 | 2017-06-30 | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9555061B2 (ja) |
EP (1) | EP2698365B8 (ja) |
JP (4) | JP6008297B2 (ja) |
ES (1) | ES2660756T3 (ja) |
WO (1) | WO2012141038A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11213527B2 (en) * | 2014-03-28 | 2022-01-04 | National University Corporation Tottori University | Inhibitory effect of low molecular weight compound on cancer and fibrosis |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2970178B1 (en) * | 2013-03-15 | 2017-06-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Compounds for improved stem cell differentiation into hepatocytes |
US10597398B2 (en) * | 2015-09-18 | 2020-03-24 | National University Corporation Tottori University | Suppression and regeneration promoting effect of low molecular weight compound on cancer and fibrosis |
JP2017200473A (ja) * | 2016-04-27 | 2017-11-09 | 株式会社Cells Power | 活性化幹細胞 |
TWI774829B (zh) | 2017-09-01 | 2022-08-21 | 國立大學法人鳥取大學 | 具有纖維化抑制作用之細胞層片 |
WO2019235362A1 (ja) | 2018-06-08 | 2019-12-12 | カノンキュア株式会社 | 線維化抑制組成物、これを生産する細胞、およびこの細胞からなる細胞シート |
CA3114565A1 (en) * | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Nissan Chemical Corporation | Additive for medium for promoting production of paracrine factor |
JPWO2020122022A1 (ja) * | 2018-12-10 | 2021-10-28 | 東京都 | 肝機能改善剤 |
JP7452799B2 (ja) | 2018-12-26 | 2024-03-19 | 国立大学法人京都大学 | 肝細胞の製造方法 |
JPWO2021149830A1 (ja) | 2020-01-24 | 2021-07-29 | ||
MX2022011245A (es) | 2020-03-11 | 2023-01-11 | Bit Bio Ltd | Método de generación de células hepáticas. |
CN116925081A (zh) * | 2022-04-11 | 2023-10-24 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种环肽类化合物及其应用 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU4923093A (en) * | 1992-09-11 | 1994-04-12 | Regents Of The University Of California, The | Inhibitors of metazoan parasite proteases |
US20040204477A1 (en) * | 2001-07-09 | 2004-10-14 | Juergen Moll | Interaction inhibitors of tcf-4 with beta-catenin |
EP1660502A2 (en) | 2003-08-28 | 2006-05-31 | Choongwae Pharma Corporation | MODULATION OF ß-CATENIN/TCF ACTIVATED TRANSCRIPTION |
DK1980613T3 (en) * | 2006-01-12 | 2016-02-08 | Univ Tokyo Womens Medical | PROCEDURE FOR KEEPING THE FUNCTION OF Liver Tissue Cells Over a Long Time |
CA2650594A1 (en) | 2006-04-25 | 2007-11-08 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Adipose derived adult stem cells in hepatic regeneration |
KR20090026302A (ko) | 2006-05-30 | 2009-03-12 | 주식회사 중외제약 | 줄기세포 분화의 유도 또는 억제를 위한 조성물 |
KR20100016073A (ko) * | 2007-04-02 | 2010-02-12 | 인스티튜트 포 원월드 헬스 | Cftr 억제제 화합물 및 이의 용도 |
JP2009060840A (ja) | 2007-09-06 | 2009-03-26 | Keio Gijuku | ヒト間葉系幹細胞濃縮方法 |
JP2010075631A (ja) | 2008-09-29 | 2010-04-08 | Japan Science & Technology Agency | 未分化細胞から肝臓を分化誘導する方法 |
WO2010075286A1 (en) * | 2008-12-24 | 2010-07-01 | University Of Washington | MOLECULAR ACTIVATORS OF THE Wnt/β-CATENIN PATHWAY |
WO2010144696A1 (en) * | 2009-06-11 | 2010-12-16 | Burnham Institute For Medical Research | Directed differentiation of stem cells |
JP5704554B2 (ja) * | 2010-04-14 | 2015-04-22 | 国立大学法人鳥取大学 | ヒト幹細胞を肝細胞へと分化誘導する化合物 |
-
2012
- 2012-04-02 EP EP12771389.9A patent/EP2698365B8/en active Active
- 2012-04-02 US US14/111,757 patent/US9555061B2/en active Active
- 2012-04-02 WO PCT/JP2012/059021 patent/WO2012141038A1/ja active Application Filing
- 2012-04-02 JP JP2013509857A patent/JP6008297B2/ja active Active
- 2012-04-02 ES ES12771389.9T patent/ES2660756T3/es active Active
-
2016
- 2016-06-22 JP JP2016123647A patent/JP6201008B2/ja active Active
-
2017
- 2017-06-15 JP JP2017117768A patent/JP2017205526A/ja active Pending
- 2017-06-30 JP JP2017128831A patent/JP6391067B2/ja active Active
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11213527B2 (en) * | 2014-03-28 | 2022-01-04 | National University Corporation Tottori University | Inhibitory effect of low molecular weight compound on cancer and fibrosis |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2698365B8 (en) | 2018-02-14 |
EP2698365B1 (en) | 2017-12-13 |
US20140112892A1 (en) | 2014-04-24 |
JP2017205526A (ja) | 2017-11-24 |
JP2016222678A (ja) | 2016-12-28 |
US9555061B2 (en) | 2017-01-31 |
EP2698365A1 (en) | 2014-02-19 |
JP6391067B2 (ja) | 2018-09-19 |
WO2012141038A1 (ja) | 2012-10-18 |
JP6008297B2 (ja) | 2016-10-19 |
JP2018008948A (ja) | 2018-01-18 |
JP6201008B2 (ja) | 2017-09-20 |
ES2660756T3 (es) | 2018-03-26 |
EP2698365A4 (en) | 2015-04-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6391067B2 (ja) | ヒト間葉系幹細胞を肝細胞へ分化誘導する新規化合物の合成と解析 | |
JP6456425B2 (ja) | 組織及び臓器の作製方法 | |
Stock et al. | The generation of hepatocytes from mesenchymal stem cells and engraftment into murine liver | |
KR102184473B1 (ko) | 생물학적 조직에 혈관계를 부여하는 방법 | |
Lin et al. | Presence of stem/progenitor cells in the rat penis | |
Zhang et al. | Patch grafting, strategies for transplantation of organoids into solid organs such as liver | |
Wabitsch et al. | Human stem cells promote liver regeneration after partial hepatectomy in BALB/C nude mice | |
JP6552005B2 (ja) | 低分子化合物による癌と線維化の抑制効果 | |
JPWO2005123904A1 (ja) | 霊長類動物胚性幹細胞からの血管内皮細胞の製造方法 | |
JP5704554B2 (ja) | ヒト幹細胞を肝細胞へと分化誘導する化合物 | |
WO2019087988A1 (ja) | 構造体と細胞塊を連結した構築物 | |
JP6968347B2 (ja) | 肝細胞の製造方法 | |
US20200147143A1 (en) | Human adult hepatocyte reprogramming medium composition | |
JPWO2002088332A1 (ja) | 小型肝細胞高含有コロニー、その調製方法、その肝組織への成熟化方法、成熟化した小型肝細胞高含有コロニーを用いた薬物機能の推定方法 | |
US20220144775A1 (en) | Hydrazide compound and kinase inhibitor | |
Christ et al. | Hepatic transplantation of mesenchymal stem cells in rodent animal models | |
WO2019230756A1 (ja) | ヒト血管の形成、構造または機能に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法、およびヒト血管の製造方法 | |
JP7228269B2 (ja) | 細胞塊融合法 | |
WO2018070346A1 (ja) | 腎臓様組織の製造方法 | |
WO2016103529A1 (ja) | 唾液腺細胞の培養方法 | |
Lin | Identification of resident and circulating endothelial stem cells | |
JP2016140336A (ja) | ヒト肝細胞 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20150310 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20150313 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20151106 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20151106 |
|
A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20151217 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160105 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160224 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160322 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160622 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20160725 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160809 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20160902 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6008297 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |