ES2660756T3

ES2660756T3 - Síntesis y análisis de nuevos compuestos capaces de inducir la diferenciación de célula madre mesenquimal humana en hepatocito

Info

Publication number: ES2660756T3
Application number: ES12771389.9T
Authority: ES
Inventors: Goshi Shiota; Yoshiko HOSHIKAWA; Noriko Matsumoto; Yoshiaki MATSUMI; Minoru Morimoto; Takayuki TONOI; Hiroyuki Saimoto; Kazuo Ohashi; Teruo Okano
Original assignee: Tottori University NUC; Tokyo Womens Medical University; KanonCure Inc
Current assignee: Tottori University NUC; Tokyo Womens Medical University; KanonCure Inc
Priority date: 2011-04-15
Filing date: 2012-04-02
Publication date: 2018-03-26
Anticipated expiration: 2032-04-02
Also published as: JP2018008948A; US9555061B2; EP2698365B1; WO2012141038A1; US20140112892A1; EP2698365A1; JP6008297B2; EP2698365B8; JPWO2012141038A1; EP2698365A4; JP6391067B2; JP2016222678A; JP6201008B2; JP2017205526A

Abstract

Un compuesto, una sal del mismo, o un solvato de ellos, el compuesto estando representado por la fórmula (1): **(Ver fórmula)** en donde R1, R2, y R4 son lo mismo o diferentes entre sí y cada uno representa H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo; R3 representa H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido; m es un número entero de cualquiera de 1 a 4; n es un número entero de cualquiera de 1 a 3; p es un número entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde el término "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4, o 5 sustituyentes seleccionados de H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halógeno alquilo C1-6, hidroxi alquilo C1-6, alquil C1-6 amino, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, halógeno alquenilo C2-6, hidroxi alquenilo C2-6, alquenilamino C2-6, cicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, halógeno alquinilo C2-6, hidroxi alquinilo C2-6, alquinil C2-6 amino, alcoxi C1-6, halógeno alcoxi C1-6, hidroxi alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 amino, arilo, y heteroarilo.

Description

imagen1

Síntesis y análisis de nuevos compuestos capaces de inducir la diferenciación de célula madre mesenquimal humana en hepatocito

Descripción

5

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo compuesto, un inductor de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos, y un inhibidor de la vía de señalización de Wnt/β-catenina, y también se refiere a un método para producir hepatocitos usando estos compuestos y hepatocitos como se producen por el método de producción, etc.

Antecedentes de la técnica

15 Se dice que la enfermedad del hígado es una enfermedad tan prevalente como para dañar la nación en su totalidad en nuestro país. Muchos pacientes sufren de enfermedad del hígado. Adicionalmente, aproximadamente

34.000 personas murieron de hepatocarcinoma en un año. Recientemente, debido a que ha avanzado la intervención terapéutica, se ha mejorado un resultado clínico para el tratamiento del hepatocarcinoma. A medida que aumenta el número de pacientes con cáncer avanzado, el número de gente que muere de lo que se denomina insuficiencia hepática provocada por una disminución en las funciones del hígado debido a cirrosis hepática combinada aumenta. El trasplante de hígado es ideal para el tratamiento de insuficiencia hepática. En nuestro país sin embargo, es difícil obtener el número suficiente de donantes. Por consiguiente, deberían usarse células madre para el desarrollo de terapia regenerativa del hígado.

25 Las células madre de tejido como células de médula ósea y células sanguíneas del cordón umbilical son prometedoras como células madre que pueden diferenciarse en hepatocitos. Por consiguiente, muchos institutos de investigación han estado realizando I+D para desarrollar medicina regenerativa usando terapia de trasplante de hepatocitos para pacientes con insuficiencia hepática crónica y para desarrollar una tecnología inductora de la diferenciación eficiente, clínicamente aplicable que pueda diferenciar células madre de tejido humano en hepatocitos funcionales.

Por ejemplo, el laboratorio del Prof. Shiota de la Tottori University Faculty of Medicine ha informado de la diferenciación en hepatocitos inhibiendo la vía de señalización de Wnt/β-catenina usando interferencia de ARN durante la inducción de la diferenciación de células madre mesenquimales humanas en hepatocitos (Bibliografía No

35 de Patentes 1 y 3 a 5). Adicionalmente, otros institutos de investigación también han estado investigando la inducción de la diferenciación en hepatocitos (Bibliografía No de Patentes 2 y Bibliografía de Patentes 1 y 2).

Mientras tanto, se ha cribado recientemente una biblioteca de compuestos grande que contiene 4.000 compuestos o más. Luego, se han identificado cinco compuestos de bajo peso molecular capaces de inhibir la vía de señalización de Wnt/β-catenina (Bibliografía No de Patentes 6 a 9).

Lista de Citas

Bibliografía de Patentes

45 Bibliografía de Patentes 1: JP2009-535035A Bibliografía de Patentes 2: JP2010-75631A

Bibliografía No de Patentes

Bibliografía No de Patentes 1: Atsushi Yanagitani et al., "Retinoic Acid Receptor Dominant Negative Form Causes Steatohepatitis and Liver Tumors in Transgenic Mice", HEPATOLOGY, Vol. 40, No. 2, 2004, p. 366375 Bibliografía No de Patentes 2: Seoyoung Park et al., "Hexachlorophene Inhibits Wnt/β-Catenin Pathway by

55 Promoting Siah-Mediated β-Catenin Degradation", Mol Pharmacol Vol. 70, No. 3, 960-966, 2006 Bibliografía No de Patentes 3: Yoko Yoshida et al., "A role of Wnt/β-catenin signals in hepatic fate specification of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells", Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 293: G1089-G1098, 2007 Bibliografía No de Patentes 4: Shimomura T et al., "Hepatic differentiation of human bone marrow-derived UE7T-13 cells: Effects of cytokines and CCN family gene expression", Hepatol Res., 37, 1068-79, 2007 Bibliografía No de Patentes 5: Ishii K et al., "Hepatic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells by tetracycline-regulated hepatocyte nuclear factor 3 beta" Hepatology, 48, 597-606, 2008 Bibliografía No de Patentes 6: Maina Lepourcelet et al., "Small-molecule antagonists of the oncogenic Tcf/β

65 catenin protein complex", CANCER CELL, ENERO 2004, VOL. 5, 91-102 Bibliografía No de Patentes 7: Emami KH et al., "A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription", Proc Natl Acad Sci USA. 24 de Agosto de 2004; 101(34): 12682-7. Bibliografía No de Patentes 8: Jufang Shan et al., "Identification of a Specific Inhibitor of the Dishevelled PDZ Domain", Biochemistry. 29 de Noviembre de 2005; 44 (47): 15495-503

imagen2

5 Bibliografía No de Patentes 9: Trosset JY et al., "Inhibition of protein-protein interactions: the discovery of druglike betacatenin inhibitors by combining virtual and biophysical screening", Proteins. 2006 1 de Julio; 64 (1): 60-7

Sumario de la Invención

Problema Técnico

Desafortunadamente, las tecnologías convencionales como se describen en las bibliografías anteriores tienen cabida para mejorar en referencia a los siguientes puntos.15

Las Bibliografías de Patente 1 y 2 describen proteínas que inducen hepatocitos a partir de células madre no del hígado. Como se ha usado una preparación de proteínas como un inductor de la diferenciación, hay cabida para mejora adicional con referencia a aspectos de estabilidad y seguridad.

Las Bibliografías No de Patente 1 y 3 a 5 informan de la inducción de la diferenciación a partir de células madre mesenquimales humanas en hepatocitos. Como se ha usado ARNip como un inductor de la diferenciación, hay cabida para mejora adicional referente a aspectos de estabilidad y seguridad. Las Bibliografías No de Patente 2 y 6 a 9 no dicen nada sobre un método para inducir la diferenciación en hepatocitos.

25 La presente invención se ha completado a la luz de las situaciones anteriores. Es un objeto de la presente invención proporcionar un compuesto de bajo peso molecular efectivo en la inducción de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos. También, es otro objeto de la presente invención proporcionar un método seguro para inducir la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos con excelente eficiencia de diferenciación, el método usando el compuesto de bajo peso molecular anterior.

Solución al Problema

La presente invención está dirigida a la materia como se define en las reivindicaciones.

35 Un aspecto de la presente invención proporciona un compuesto, un sal del mismo, o un solvato de ellos, el compuesto estando representado por la fórmula (1):

imagen3

en donde R1, R2, y R4 son lo mismo o diferentes entre sí y cada uno representa H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo;

55 R3 representa H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido;

m es un número entero de cualquiera de 1 a 4;

n es un número entero de cualquiera de 1 a 3;

p es un número entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde

el término "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4, o 5 65 sustituyentes seleccionados de H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halógeno alquilo C1-6, hidroxi alquilo C1-6, alquil C1-6 amino, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, halógeno alquenilo C2-6, hidroxi alquenilo C2-6, alquenilamino C2-6, cicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, halógeno alquinilo C2-6, hidroxi alquinilo C2-6, alquinil C2-6 amino, alcoxi C1-6, halógeno alcoxi C1-6, hidroxi alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 amino, arilo, y heteroarilo.

imagen4

5 Cuando se usa este compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos, la diferenciación de las células madre mesenquimales en hepatocitos puede inducirse como se demuestra en los siguientes Ejemplos. Adicionalmente, este compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos es un compuesto orgánico de bajo peso molecular, y por consiguiente tiene mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos. Esto permite un método de inducción de la diferenciación seguro con excelente eficiencia de diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos.

Adicionalmente, se divulga un inductor de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos, que comprende un compuesto representado por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos.

15 Cuando se usa este inductor de la diferenciación, la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos puede inducirse como se demuestra en los Ejemplos siguientes. Adicionalmente, se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular para este inductor de la diferenciación, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o preparación de ácidos nucleicos. Esto permite un método de inducción de la diferenciación seguro con excelente eficiencia de diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos.

Adicionalmente, se divulga un inhibidor de la vía de señalización de Wnt/β-catenina que comprende un compuesto representado por la fórmula (1), una sal del mismo, o solvato de ellos.

25 Estos inhibidores de la vía de señalización de Wnt/β-catenina pueden inhibir la vía de señalización de Wnt/β-catenina. También se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular para los inhibidores, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos.

Adicionalmente, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir hepatocitos a partir de células madre mesenquimales, que comprende un paso de tratar las células madre mesenquimales in vitro con un compuesto representado por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos. También, otro aspecto de la presente invención proporciona un método de producción que comprende un paso de tratar células madre mesenquimales in vitro con el inductor de la diferenciación anterior.

35 Para este método de producción se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o preparación de ácidos nucleicos. Esto hace posible inducir eficientemente la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos.

Adicionalmente, otro aspecto de la presente divulgación proporciona hepatocitos diferenciados a partir de células madre mesenquimales, que comprende hepatocitos producidos tratando las células madre mesenquimales con un compuesto representado por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos. También, otro aspecto de la presente divulgación proporciona hepatocitos producidos tratando las células madre mesenquimales con el inductor de la diferenciación anterior.

45 Estos hepatocitos se diferencian a partir de células madre mesenquimales usando un compuesto orgánico de bajo peso molecular, de tal manera que este caso tiene mejor estabilidad y seguridad durante la producción que el caso de la inducción de la diferenciación usando una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos.

Adicionalmente, se divulga un tejido hepático o hígado para medicina regenerativa, que comprende los hepatocitos anteriores. El tejido hepático o hígado usa hepatocitos diferenciados a partir de células madre mesenquimales usando un compuesto orgánico de bajo peso molecular, de tal manera que este caso tiene mejor estabilidad y seguridad durante la producción que el caso de usar células madre para la inducción de la diferenciación usando una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos. Por tanto, los

55 hepatocitos pueden usarse adecuadamente para un tejido hepático o hígado para la medicina regenerativa.

Adicionalmente, se divulga una lámina de células que comprende los hepatocitos anteriores. El uso de esta lámina de células puede suprimir la disfunción hepática como se demuestra en los Ejemplos siguientes. También, este caso tiene mejor estabilidad y seguridad durante la producción que el caso de usar células madre para la inducción de la diferenciación usando una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos.

Adicionalmente, se divulga un material de trasplante que comprende la lámina de células anterior y un soporte para recoger la lámina de células. El uso de este material de trasplante puede suprimir la disfunción hepática como se demuestra en los Ejemplos siguientes. También, este caso tiene mejor estabilidad y seguridad durante la

65 producción que el caso de usar células madre para la inducción de la diferenciación usando una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos.

imagen5

Adicionalmente, otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir un material de trasplante, que comprende un paso de tratar células madre in vitro con un compuesto representado por la fórmula

5 (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos. Como se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular, estos métodos de producción tienen mejor estabilidad y seguridad que un método que usa una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos.

Adicionalmente, se divulga un método para producir una lámina de células para el trasplante en una superficie del hígado, que comprende un paso de inducción de tratar células madre mesenquimales con hexaclorofeno, un derivado del mismo, una sal de ellos, o un solvato de ellos para inducir las células madre mesenquimales en hepatocitos. Como se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular, este método de producción tiene mejor estabilidad y seguridad que un método que usa una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos. También, la lámina de células preparada usando este método de producción puede

15 ejercer un efecto excelente de suprimir la disfunción hepática cuando se trasplanta en una superficie del hígado como se demuestra en los Ejemplos siguientes. Por lo tanto, este método de producción es un método de producción excelente para producir una lámina de células para el trasplante a una superficie del hígado.

Adicionalmente, se divulga un método para producir una lámina de células para el trasplante a una superficie del hígado, que comprende un paso de inducción de tratar células madre mesenquimales con un inhibidor de la vía de señalización de Wnt/β-catenina para inducir las células madre mesenquimales en hepatocitos. La lámina de células preparada usando este método de producción puede ejercer un efecto excelente en la supresión de la disfunción hepática cuando se trasplanta en una superficie del hígado como se demuestra en los Ejemplos siguientes. Por lo tanto, este método de producción es un método de producción excelente para producir una lámina

25 de células para el trasplante a una superficie del hígado.

Efectos Ventajosos de la Invención

De acuerdo con la presente invención, se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular particular, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos. Esto hace posible inducir eficientemente la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos. También puede inhibirse una vía de señalización de Wnt/β-catenina.

Breve Descripción de los Dibujos

35 [FIG. 1] La FIG. 1 muestra datos del espectro de ICG-001 descrito en los Ejemplos. [FIG. 2] La FIG. 2 muestra datos del espectro de IC-2 descrito en los Ejemplos. [FIG. 3] La FIG. 3 es un diagrama esquemático que ilustra cómo establecer una célula madre mesenquimal humana que expresa establemente un gen indicador de β-catenina/TCF4/luciferasa. [FIG. 4] La FIG. 4 es un gráfico que ilustra los resultados de examinar el potencial de proliferación de células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) cuando se tratan con IC-2. [FIG. 5] La FIG. 5 es un gráfico que ilustra los resultados de examinar el potencial de proliferación de células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) cuando se tratan con HC-1. [FIG. 6] La FIG. 6 es un gráfico que ilustra los resultados de examinar el potencial de proliferación de células

45 derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) cuando se tratan con PN-3-4. [FIG. 7] La FIG. 7 es un gráfico que ilustra los resultados de examinar el potencial de proliferación de células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) cuando se tratan con PN-3-13. [FIG. 8] La FIG. 8 es un gráfico que ilustra los resultados de examinar el potencial de proliferación de células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) cuando se tratan con PN-1-2. [FIG. 9] La FIG. 9 es un gráfico que ilustra como IC-2, etc., afecta a la actividad de Wnt/β-catenina. [FIG. 10] La FIG. 10 son imágenes de gel de electroforesis que ilustran la diferenciación de hepatocitos usando IC-2, etc. [FIG. 11] La FIG. 11 son imágenes de gel de electroforesis que ilustran la diferenciación de hepatocitos usando IC-2, etc.

55 [FIG. 12] La FIG. 12 son gráficos que ilustran una capacidad de la síntesis de urea (en los días 8 y 16) de muestras diferenciadas usando IC-2, etc. [FIG. 13] La FIG. 13 son fotomicrografías (tinción por PAS) que ilustran una capacidad de inducir la diferenciación en hepatocitos usando IC-2, etc. [FIG. 14] La FIG. 14 son fotomicrografías fluorescentes que ilustran la inducción de diferenciación en hepatocitos (en el día 8) usando IC-2, etc. [FIG. 15] La FIG. 15 son fotomicrografías fluorescentes que ilustran la inducción de diferenciación en hepatocitos (en el día 16) usando IC-2, etc. [FIG. 16] La FIG. 16 son imágenes que ilustran los resultados de examinar la expresión génica de citoquinas. [FIG. 17] La FIG. 17 es un diagrama que ilustra los resultados de examinar el efecto de neovascularización

65 inducido por un dispositivo de liberación sostenida de bFGF.

imagen6

5 [FIG. 20] La FIG. 20 son fotografías e imágenes que ilustran los resultados de tinción inmunohistoquímica cuando se trasplantó una lámina de células a una superficie del hígado. [FIG. 21] La FIG. 21 ilustra cómo realizar un experimento para la supresión de disfunción hepática cuando se trasplantan láminas de células en dos sitios de una superficie del hígado. [FIG. 22] La FIG. 22 son fotografías de un hígado cuando se trasplantan láminas de células en dos sitios de una superficie del hígado. [FIG. 23] La FIG. 23 son gráficos que ilustran los resultados de como cambiaron las funciones hepáticas cuando se trasplantaros láminas de células a dos sitios de una superficie del hígado. [FIG. 24] La FIG. 24 son gráficos que ilustran los resultados de como cambiaron las funciones hepáticas cuando se trasplantaros láminas de células a dos sitios de una superficie del hígado.

15 [FIG. 25] La FIG. 25 es un gráfico que ilustra los resultados de examinar tasas de supervivencia de ratones cuando se trasplantaron láminas de células a dos sitios de una superficie del hígado. [FIG. 26] La FIG. 26 son imágenes que ilustran los resultados de examinar la expresión génica de proteínas y citoquinas secretoras específicas del hígado. [FIG. 27] La FIG. 27 son imágenes que ilustran los resultados de examinar niveles de expresión de α1antitripsina humana cuando se trasplantaron láminas de células en dos sitios de una superficie del hígado. [FIG. 28] La FIG. 28 proporciona una visión general de un método para clasificar una células madre mesenquimal (JP2009-060840A). [FIG. 29] La FIG. 29 es un gráfico que ilustra los resultados de medir la actividad de luciferasa. [FIG. 30] La FIG. 30 son imágenes que ilustran los resultados de examinar la expresión génica de un

25 marcador de la diferenciación de hepatocitos. [FIG. 31] La FIG. 31 es una tabla que enumera información de especímenes clínicos. [FIG. 32] La FIG. 32 son imágenes que ilustran los resultados de examinar la expresión génica de un marcador de la diferenciación de hepatocitos. [FIG. 33] La FIG. 33 son fotomicrografías (tinción por inmunofluorescencia) que ilustran una capacidad de inducir la diferenciación en hepatocitos usando PN-3-13 o IC-2. [FIG. 34] La FIG. 34 es un gráfico que ilustra una capacidad (síntesis de urea) de inducir la diferenciación en hepatocitos usando hexaclorofeno, PN-3-13, o IC-2. [FIG. 35] La FIG. 35 son fotomicrografías (tinción por PAS) que ilustran una capacidad de inducir la diferenciación en hepatocitos usando PN-3-13 o IC-2.

35 [FIG. 36] La FIG. 36 son gráficos que ilustran como cambiaron las funciones hepáticas cuando se trasplantó una lámina de células "sana" o derivada de "paciente" a una superficie del hígado. [FIG. 37] La FIG. 37 ilustra cómo realizar un experimento para la supresión de la disfunción hepática cuando se trasplantaron seis láminas de células a una superficie del hígado o cuando se trasplantaron células mediante una vena porta por inyección en un bazo. [FIG. 38] La FIG. 38 es un gráfico que ilustra los resultados de examinar tasas de supervivencia de ratones. [FIG. 39] La FIG. 39 son gráficos que ilustran los resultados de como cambiaron las funciones hepáticas.

DESCRIPCION DE LAS REALIZACIONES

45 En lo sucesivo, se describirán con detalles realizaciones de la presente invención.

Un compuesto de acuerdo con una realización de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos. Este compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos es un compuesto orgánico de bajo peso molecular, y por tanto tiene mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o preparación de ácidos nucleicos. Esto permite un método de inducción de la diferenciación seguro con excelente eficiencia de diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos.

55 En la fórmula (1), R1, R2 y R4 son lo mismo o diferentes entre sí y cada uno representa H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo. Adicionalmente, R3 representa H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido. Adicionalmente, m es un número entero de cualquiera de 1 a 4. Adicionalmente, n es un número entero de cualquiera de 1 a 3. Adicionalmente, p es un número entero de cualquiera de 1 a 5. A este respecto, sin embargo, el término "opcionalmente sustituido significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4, o 5 sustituyentes seleccionados de H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halógeno alquilo C1-6, hidroxi alquilo C1-6, alquil C1-6 amino, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, halógeno alquenilo C2-6, hidroxi alquenilo C2-6, alquenilamino C2-6, cicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, halógeno alquinilo C2-6, hidroxi alquinilo C2-6, alquinil C2-6 amino, alcoxi C1-6, halógeno alcoxi C1-6, hidroxi alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 amino, arilo, y heteroarilo.

65

imagen7

Los R1, R2 y R4 anteriores son lo mismo o diferentes entre sí y cada uno puede representar H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halógeno alquilo C1-6, hidroxi alquilo C1-6, alquil C1-6 amino, alcoxi C1-6, halógeno alcoxi C1-6, hidroxi alcoxi C1-6, o alcoxi C1-6 amino. El R3 anterior puede representar H.

5 Como se usa en la presente, el término "halógeno" significa F, Cl, Br, o I.

Como se usa en la presente, a menos que se indique lo contrario, los términos "alquilo" y "alquenilo" significan una cadena de hidrocarburos lineal o ramificada.

Como se usa en la presente, el término "C1-6" se refiere a un hidrocarburo que contiene 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 átomos de carbono. Es decir, el término "alquilo C1-6" se refiere a un alquilo que contiene 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 átomos de carbono. Ejemplos de alquilo C1-6 incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo y n-hexilo.

15 Como se usa en la presente, ejemplos de "alquenilo" incluyen etenilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 2-metil-1propenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 3-metil-2-butenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-pentenilo, 4-pentenilo, 4metil-3-pentenilo, 1-hexenilo, 3-hexenilo y 5-hexenilo.

Como se usa en la presente, ejemplos de "alcoxi" incluyen metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, pentoxi, isopentoxi y hexoxi.

Como se usa en la presente, el término "opcionalmente sustituido" significa que un compuesto no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4, ó 5 sustituyentes en posiciones que pueden sustituirse. Tener en cuenta que cuando se incluyen una pluralidad de sustituyentes, estos sustituyentes pueden ser el mismo o diferentes entre sí.

25 Adicionalmente, la posición de cada sustitución puede ser la posición 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ó 9. Aquí, ejemplos de sustituyentes incluyen, H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halógeno alquilo C1-6, hidroxi alquilo C1-6, alquil C1-6 amino, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, halógeno alquenilo C2-6, hidroxi alquenilo C2-6, alquenilamino C2-6, cicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, halógeno alquinilo C2-6, hidroxi alquinilo C2-6, alquinil C2-6 amino, alcoxi C1-6, halógeno alcoxi C1-6, hidroxi alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 amino, arilo, y heteroarilo.

Como se usa en la presente, el "halógeno alquilo C1-6" se refiere a un alquilo C1-6 que está sustituido por uno o más halógenos. El número de halógenos puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 13. También, el número puede estar dentro de un intervalo entre cualquiera de los dos números indicados anteriormente. Adicionalmente, cuando se incluyen dos o más halógenos, el tipo de cada halógeno puede ser el mismo o diferentes entre sí.

35 Ejemplos de halógeno alquilo C1-6 incluyen, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, fluorometilo, difluorometilo, trifluorometilo, bromometilo, dibromometilo, tribromometilo, cloroetilo, dicloroetilo, tricloroetilo, fluoroetilo, difluoroetilo y trifluoroetilo.

Como se usa en la presente, el "hidroxi alquilo C1-6" se refiere a un alquilo C1-6 que está sustituido por uno o más grupos hidroxi. El número de grupos hidroxi puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 13. También, el número puede estar dentro de un intervalo entre cualquiera de los dos números indicados anteriormente. Ejemplos de hidroxi alquilo C1-6 incluyen hidroximetilo, 1-hidroxietilo, 2-hidroxietilo, 2-hidroxi-n-propilo y 2,3-dihidroxi-n-propilo.

Como se usa en la presente, el "alquil C1-6 amino" se refiere a alquilo C1-6 que está sustituido por uno o más

45 grupos amino. El número de grupos amino puede ser, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ó 13. También, el número puede estar dentro de un intervalo entre cualquiera de los dos números indicados anteriormente. Ejemplos de alquil C1-6 amino incluyen metil amino y etil amino.

Como se usa en la presente, el "halógeno alcoxi C1-6" es equivalente a halógeno alquilo C1-6 cuyo alquilo está reemplazado por alcoxi. Ejemplos de halógeno alcoxi C1-6 incluyen fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, 1-fluoroetoxi, 2-fluoroetoxi 2-cloroetoxi, 2-bromoetoxi, (1,1-difluoro)etoxi, (1,2-difluoro)etoxi, (2,2,2-trifluoro)etoxi, (1, 1,2,2-tetrafluoro)etoxi, (1, 1,2,2,2-pentafluoro)etoxi, 1-fluoro-n-propoxi, 1,1-difluoro-n-propoxi, 2,2-difluoro-n-propoxi, 3-fluoro-n-propoxi, (3,3,3-trifluoro) -n-propoxi, (2,2,3,3,3-pentafluoro) -n-propoxi, 4-fluoro-n-butoxi, (4,4,4-trifluoro) -nbutoxi, 5-fluoro-n-pentiloxi, (5,5,5-trifluoro)-n-pentiloxi, 6-fluoro-n-hexiloxi, (6,6,6-trifluoro)-n-hexiloxi, 2

55 fluorciclopropoxi y 2-fluorociclobutoxi.

Como se usa en la presente, el "hidroxi alcoxi C1-6" es equivalente a hidroxi alquilo C1-6 cuyo alquilo está reemplazado por alcoxi. Ejemplos de hidroxi alcoxi C1-6 incluyen 2-hidroxietoxi, 2-hidroxi-n-propoxi, 3-hidroxi-npropoxi, 2,3-dihidroxi-n-propoxi y 2-hidroxiciclopropilo.

Como se usa en la presente, el término "arilo" se refiere a un anillo de hidrocarburos monocíclico, dicíclico,

o tricíclico aromático C6-14. Ejemplos de arilo incluyen fenilo, naftilo (por ejemplo, 1-naftilo, 2-naftilo), tetrahidronaftalenilo, indenilo y fenilo que está sustituido con cinco halógenos. También, el arilo incluye un grupo de anillo que está condensado con cicloalqueno C5-8 en su posición de enlace doble.

65

15

25

35

45

55

65

Como se usa en la presente, el "heteroarilo" incluye grupos que tienen de 5 a 14 átomos del anillo y nelectrones compartidos dentro de sus anillo, y que tiene de 1 a 4 heteroátomos seleccionados del grupo que consiste de N, S, y O. Ejemplos de heteroarilo incluyen tienilo, benzotienilo, furilo, benzofurilo, dibenzofurilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, tetrazolilo, oxazolilo, tiazolilo e isooxazolilo.

Como se usa en la presente, ejemplos de la "sal" incluyen, pero no están particularmente limitados a, sales aniónicas que se forman usando cualquier grupo ácido (por ejemplo, carboxilo) y sales catiónicas que se forman usando cualquier grupo básico (por ejemplo, amino). Ejemplos de las sales incluyen sales inorgánicas, sales orgánicas, y sales divulgadas en un artículo (Berge, Bighley, and Monkhouse, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19). Los ejemplos incluyen además sales metálicas, sales de amonio, sales con una base orgánica, sales con un ácido inorgánico, sales con un ácido orgánico y sales con un aminoácido básico o ácido. Ejemplos de sales metálicas incluyen sales de metales alcalinos (por ejemplo, sales de sodio, sales de potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sales de calcio, sales de magnesio, sales de bario), y sales de aluminio. Ejemplos de las sales con una base orgánica incluyen sales con trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, 2,6-lutidina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, ciclohexilamina, diciclohexilamina o N,N'-dibenciletilendiamina. Ejemplos de las sales con un ácido inorgánico incluyen sales con ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico o ácido fosfórico. ejemplos de sales con un ácido orgánico incluyen sales con ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido ftálico, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico o ácido p-toluenosulfónico. Ejemplos de las sales con un aminoácido básico incluyen sales con arginina, lisina u ornitina. Ejemplos de las sales con aminoácidos ácidos incluyen sales con ácido aspártico o ácido glutámico.

Como se usa en la presente, el término "solvato" se refiere a un compuesto formado por un soluto y un solvente. Puede consultarse un diccionario en relación al solvato (J. Honig et al., The Van Nostrand Chemist’s Dictionary P650 (1953)). Si el solvente es agua, el solvato formado es un hidrato. Preferiblemente, el solvente no interfiere con una actividad biológica del soluto. Ejemplos de solventes preferibles incluyen, pero no están limitados a, agua, etanol y ácido acético. El solvente más preferido es agua. Un compuesto o una sal del mismo de acuerdo con una realización de la presente invención absorbe humedad cuando contacta con aire o recristaliza. Algunas veces posee humedad higroscópica o se vuele un hidrato. Como se usa en la presente, el término "isómero" incluye moléculas cuya fórmula molecular es idéntica pero cuya estructura es diferente. Ejemplos de isómero incluyen enantiómeros, isómeros geométricos (cis/trans), e isómeros (diastereómeros) que tienen uno o más centros quirales pero no son imágenes espejo entre sí. Como se usa en la presente, el término "profármaco" incluye un compuesto precursor en el que cuando se administra el compuesto anterior a un sujeto, tiene lugar un cambio químico debido a los procesos metabólico de varias reacciones químicas para dar un compuesto, una sal del mismo, o un solvato de ellos de acuerdo con la presente invención. Con respecto al profármaco, se puede hacer referencia a un artículo (T. Higuchi and V. Stella, "Pro-Drugs as Novel Delivery Systems", A.C.S. Symposium Series, Volumen 14).

Un compuesto de acuerdo con una realización de la presente invención es por lo menos un compuesto, una sal del mismo, o un solvato de ellos, el compuesto estando representado por la fórmula (3):

imagen8

Un inductor de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos como se divulga en la presente es un inductor de la diferenciación que comprende un compuesto representado por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos. Se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular para estos inductores de la diferenciación, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o una preparación de ácido nucleicos. Esto permite un método de inducción de la diferenciación seguro con excelente eficiencia de diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos. Adicionalmente, a la vista de la eficiencia de la diferenciación, es preferible que la estructura del compuesto contenido en un inductor de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos de acuerdo con esta realización tenga una estructura similar a la de la fórmula (3).

Como se usa en la presente, el término "células madre mesenquimales" incluye células madre somáticas derivadas de la mesénquima. Estas células madre mesenquimales pueden diferenciarse en células mesenquimales. Estas células madre mesenquimales deberían ser aplicables a medicina regenerativa como reestructuración de huesos, vasos sanguíneos, y músculos cardiacos en un futuro cercano.

imagen9

Ejemplos de las "células madre mesenquimales" incluyen células madre mesenquimales de médula ósea y células madre derivadas de sangre del cordón umbilical. Las células madre mesenquimales parecen estar presentes 5 en todos los tejidos que contienen tejido mesenquimal. Entre los tejidos mesenquimales, las células madre mesenquimales de médula ósea, sin embargo, pueden ser fácilmente recogidas por aspiración de la médula ósea, y se ha establecido su técnica de cultivo. Las células estromales de médula ósea contienen células madre mesenquimales de médula ósea, y son un tipo de células que soportan las células hematopoyéticas contenidas en la médula ósea. Mientras tanto, la sangre del cordón umbilical incluye sangre contenida en un cordón umbilical que constituye un tejido fetal que conecta un feto con su madre. Se sabe que esta sangre del cordón umbilical contiene una gran cantidad de células madre derivadas de sangre del cordón umbilical (células madre hematopoyéticas). Recientemente, las células madre mesenquimales (es decir, las células madre mesenquimales derivadas de sangre del cordón umbilical), que son células madre somáticas distintas de las células madre hematopoyéticas, se han encontrado en sangre del cordón umbilical. Hasta la fecha, se ha informado que las células madre mesenquimales

15 están presentes en la médula ósea. Sin embargo, se ha indicado que no sólo la médula ósea sino que también la sangre del cordón umbilical puede proporcionar una fuente para células madre mesenquimales, y pueden ser aplicables a reparación de hueso y/o cartílago usando diseño de tejido o aplicación clínica para medicina regenerativa.

Aquí, las células madre mesenquimales, en general, tienen un periodo de vida corto y no son necesariamente fáciles de cultivar in vitro durante un periodo largo. Sin embargo, ya se han establecido líneas de células madre mesenquimales derivada de médula ósea humana y derivada de sangre del cordón umbilical que tienen el gen hTERT introducido y pueden proliferar establemente. Aunque estas células proliferan establemente, no tienen anormalidades cromosómicas, pero tienen inhibición de contacto funcional. Además, no forman tumores

25 cuando se trasplantan a un animal inmunosuprimido. También, como no afectan a la diferenciación celular, estas células son útiles para investigar la diferenciación de células madre mesenquimales.

Adicionalmente, como se usa en la presente, el término "hepatocitos" incluye células con un tamaño de aproximadamente 20 µm que constituyen del 70 al 80% de un hígado. Ejemplos de funciones generales de hepatocitos incluyen: síntesis y almacenamiento de proteínas; conversión de carbohidratos; síntesis de colesterol, ácido biliar y fosfolípidos; y desintoxicación, desnaturalización y excreción de sustancias endógenas y exógenas. También , los ejemplos incluyen además la promoción de generación y secreción de bilis.

Como se usa en la presente, el término "diferenciación" incluye un cambio estructural y funcional de células

35 individuales en un organismo multicelular. Hablando de manera general, la diferenciación de una células madre en una células funcional en un organismos multicelular es a menudo irreversible en muchos casos. Descubrimientos anteriores han enseñado que una células madre mesenquimal tiene multipotencia, es decir, tiene una capacidad de diferenciarse en una amplia variedad de tipos de células mientras que los linajes celulares que pueden diferenciarse son limitados. Por lo tanto, la célula madre mesenquimal, en general, no puede diferenciarse en células derivadas de una capa germinal diferente. Aquí, un inductor de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos de acuerdo con esta realización puede inducir la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos que se derivan de una capa germinal diferente. Puede decirse que este punto es una gran característica técnica.

Hablando de manera general, es bastante natural usar células madre del hígado como una fuente de

45 células para medicina regenerativa del hígado. Sin embargo, como las células madre del hígado solo aparecen durante daño hepático severo como hepatitis fulminante, la recogida de las células madre de un paciente real no es práctica. Entonces, células madre de tejido distintas de células madre del hígado o células iPS podrían ser una fuente de células para la medicina regenerativa del hígado. Informes recientes han mostrado que las células madre mesenquimales pueden diferenciarse en células con un cierto grado de función hepática bajo condiciones in vitro. Es decir, la adición de varias citoquinas a células madre mesenquimales, seguido por cultivo durante aproximadamente 4 semanas, ha promovido según se ha informado la diferenciación en células similares a hepatocitos. Las células madre mesenquimales están presentes en la médula ósea y la sangre del cordón umbilical, y son relativamente fáciles de recoger. El uso de médula ósea tiene una ventaja de evitar el rechazo inmune debido al uso de células autólogas. Alternativamente, la sangre del cordón umbilical se desecha habitualmente, por lo que hay una ventaja de

55 tener menos problemas éticos. A la vista de lo anterior, las células madre mesenquimales son una fuente de células prometedora para la medicina regenerativa del hígado.

Como se usa en la presente, la " vía de señalización de Wnt/β-catenina" incluye una de las vías que regulan una decisión del destino celular durante el desarrollo de vertebrados e invertebrados. Un ligando Wnt es una glicoproteína típica que enlaza con un receptor Frizzled secretor. Su enlace activa una cascada de señalización, lo que resulta en la disociación de una quinasa multifuncional GSK-3β de un complejo APC/Axin/GSK-3β. Sin la señal Wnt (es decir, estado apagado), la β-catenina, que es un coactivador transcripcional y una proteína adaptadora esencial para la adhesión célula a célula, se vuelve un objetivo para la degradación por el complejo APC/Axin/GSK3β. CK1 y GSK-3β actúan de manera coordinada para fosforilar apropiadamente la β-catenina. Luego, la β-catenina

65 se ubiquitina y se degrada por un complejo β-TrCP/SKP en proteasomas.

15

25

35

45

55

65

Cuando Wnt enlaza con el receptos (Es decir, estado activado) Dishevelled (Dsh) parece estar por lo menos parcialmente fosforilado para ser activado. Luego, GSK-3β se disocia de un complejo de inducción de la degradación. Esto facilita la estabilización del nivel de expresión de β-catenina, la translocación nuclear, y el reclutamiento de LEF/TCF a un factor de enlace de ADN. Entonces, la β-catenina reemplaza un correpresor Griucho-HDAC y sirve como un activador transcripcional.

Adicionalmente, similar al complejo represor transcripcional, se muestra que un complejo con Prop 1, un factor de homeodominio, tiene β-catenina que ejerce sus funciones por activación condicional. De manera importante, se ha descubierto que varios cánceres humanos contienen mutaciones de punto de β-catenina que llevan a estabilización incontrolable de la β-catenina. Adicionalmente, se ha informado que APC y Axin también contienen mutaciones. Así, se ha enfatizado que la activación aberrante de esta vía se relaciona con tumores humanos. Durante un curso de desarrollo, la vía de señalización de Wnt/β-catenina juega un papel en la integración de señales de varias vías como ácidos retinoico, FGF, TGF-β, y BMP en diferentes tipos de células y/o tejidos. Además, el GSK-3β, que es un componente de la vía de señalización de Wnt/β-catenina, está implicado en el metabolismo del glucógeno y otras vías principales. Así, la inhibición de GSK-3β se considera que es una medida razonable para tratar diabetes y/o enfermedad neurodegenerativa.

Como se usa en la presente, el término "compuesto orgánico de bajo peso molecular" incluye un compuesto orgánico con un peso molecular de 2000 o menos. El peso molecular es preferiblemente 1000 o menos, más preferiblemente 900 o menos, y aún más preferiblemente 800 o menos. Como un compuesto de alto peso molecular que incluye una preparación de ácidos nucleicos y una preparación de proteínas es susceptible a degradación in vivo o in vitro, el compuesto es inestable. Cuando el compuesto se usa en medicina regenerativa, sigue habiendo una preocupación por la seguridad. Por el contrario, como el compuesto orgánico de bajo peso molecular es improbable que se degrade in vivo o in vitro, el compuesto es estable. Así, cuando se usa en medicina regenerativa, el compuesto tienen una ventaja de seguridad. Adicionalmente, a medida que el peso molecular disminuye, su síntesis orgánica se vuelve más fácil. Además, el compuesto tiene viabilidad excelente como estabilidad y seguridad. Tener en cuenta que los péptidos y los nucleótidos son susceptibles a degradación in vivo e in vitro, siendo de este modo inestables. Además, cuando se usan en medicina regenerativa, sigue habiendo una preocupación por la seguridad.

Bajo estas circunstancias, los presentes inventores han sintetizado varios compuestos orgánicos de bajo peso molecular, y han evaluado los compuestos de acuerdo con los siguientes puntos. Como resultado, los presentes inventores han descubierto que cinco compuestos orgánicos de bajo peso molecular (en lo sucesivo, referidos algunas veces como "IC-2, etc.") incluyendo IC-2, HC-1, PN-3-4, PN-3-13, y PN-1-2 pueden inducir la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos como se demuestra en los Ejemplos descritos a continuación.

1.: Expresión de Factores de Transcripción específicos del Hígado;

2.: Expresión de Proteínas específicas del Hígado;

3.: Síntesis de Glucógeno;

4.: Síntesis de Urea; y

5.: Evaluación de Fuerza de Señal de la Vía de Señalización de Wnt/β-catenina Que tiene Actividad TCF Usando Medición de Actividad de Luciferasa.

Ejemplos del inductor anteriormente mencionada de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos de acuerdo con una realización de la presente invención incluyen compuestos orgánicos de bajo peso molecular (por ejemplo IC-2) que inhiben la vía de señalización de Wnt/β-catenina. Estos compuestos de bajo peso molecular tienen mejor viabilidad como estabilidad y seguridad que las preparaciones de proteínas y/o preparaciones de ácidos nucleicos, por lo que los compuestos deberían proporcionar un método prometedor para desarrollar medicina regenerativa.

Tener en cuenta que en esta realización, se determina si un compuesto orgánico de bajo peso molecular, que es una sustancia candidata para el inductor de diferenciación, tiene características de inducción de la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos. Para determinar lo anterior, si se induce o no la expresión de por lo menos una proteína seleccionada del grupo consistente de albúmina, C/EBPα, CYP1A1, y CYP3A4 es un indicador crítico. Esto se debe a que los hepatocitos, en general, tienen niveles aumentados de expresión de por lo menos una proteína (en lo sucesivo, algunas referida como "albúmina, etc.") seleccionada del grupo que consiste de la albúmina, C/EBPα, CYP1A1, y CYP3A4 anteriores, pero las células madre mesenquimales tienen niveles bajos de expresión de la albúmina, etc.

Tener en cuenta que en este momento, si el nivel de expresión de albúmina, etc., excede un umbral predeterminado en el post-tratamiento de células madre mesenquimales, se determina que la sustancia candidata puede inducir la diferenciación de las células madre mesenquimales en hepatocitos. Por el contrario, si al expresión es inferior al umbral predeterminado, se determina que la sustancia candidata no se caracteriza por inducir la diferenciación de las células madre mesenquimales en hepatocitos. Este umbral, por ejemplo, puede establecerse a 1,5 o más, 2 o más, 5 o más, o 10 o más veces más grande que la media de cada nivel de expresión de albúmina C/EBPα, CYP1A1, y CYP3A4 en células madre mesenquimales antes del tratamiento. También, este umbral, por ejemplo, puede establecerse a 2 o más, 5 o más, o 10 o más veces más grande que la media ± la desviación estándar de cada nivel de expresión de albúmina C/EBPα, CYP1A1, y CYP3A4 en células madre mesenquimales

imagen10

5 antes del tratamiento.

Alternativamente, puede determinarse si el nivel de expresión de cualquiera de albúmina C/EBPα, CYP1A1, y CYP3A4 en células madre mesenquimales tratadas con la sustancia candidata tiene o no, por ejemplo, un nivel de expresión significativamente mayor que en células madre mesenquimales antes del tratamiento. Con respecto a una prueba para la diferencia significativa, es preferible tener una diferencia significativa en, por ejemplo, la prueba t de Student, que es una prueba paramétrica, cuando se asume que una población tiene una distribución Gaussiana. Específicamente, en la prueba t de Student, una prueba unilateral dará preferiblemente p<0,05, más preferiblemente p<0,03, y todavía más preferiblemente p<0,01. Tener en cuenta que la prueba t de Student no se limita a la prueba unilateral, sino que puede ser una prueba bilateral. Además, si se asume que la población no tienen una distribución

15 Gaussiana, puede determinarse si hay o no una diferencia significativa usando una prueba U de Mann-Whitney como una prueba no paramétrica.

Adicionalmente, para determinar si un compuesto orgánico de bajo peso molecular, que es una sustancia candidata para el inductor de diferenciación, se caracteriza o no por inducir la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos en una realización de la presente invención, si el compuesto aumenta o no la capacidad de producción de glucógeno o la síntesis de urea en las células madre mesenquimales proporciona otro indicador crítico. Esto se debe a que mientras los hepatocitos, en general, tienen aumentada la capacidad de producción de glucógeno o síntesis de urea, las células madre mesenquimales no tienen aumentada la capacidad de producción de glucógeno o síntesis de urea. Tener en cuenta en este momento, se usa un umbral o diferencia

25 significativa para la determinación de una manera similar a las de cuando se determina el nivel de expresión de albúmina, etc. anterior.

Se divulga un inhibidor de la vía de señalización de Wnt/β-catenina que comprende por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de compuestos representados por la fórmula (1), una sal del mismo,

o un solvato de ellos. El uso de estos inhibidores de la vía de señalización de Wnt/β-catenina puede inhibir la vía de señalización de Wnt/β-catenina. También se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular para los inhibidores, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o una

35 preparación de ácidos nucleicos.

Adicionalmente, como un compuesto contenido en un inhibidor de la vía de señalización de Wnt/β-catenina de acuerdo con esta realización tiene una estructura más similar a la de los compuestos representados por la fórmula (3), la estructura es más preferible en vista de la eficiencia de la inhibición de la vía de señalización de Wnt/β-catenina.

<Método para Producir Hepatocitos a partir de Células Madre Mesenquimales>

Un método para producir hepatocitos de acuerdo con una realización de la presente invención es un

45 método de producción que comprende un paso de tratar células madre mesenquimales in vitro con por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de los compuestos representados por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos. También, el método de producción comprende el paso de tratar células madre mesenquimales in vitro con el inductor de la diferenciación anterior. Se usa un compuesto orgánico de bajo peso molecular para estos métodos de producción, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos. Esto hace posible inducir eficientemente la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos.

Tener en cuenta que en este momento, es preferible incluir un paso de tratar las células madre mesenquimales con el inductor de la diferenciación durante 8 días o más como se demuestra en los Ejemplos

55 descritos a continuación. La progresión de los cambios en varios eventos intracelulares biológicos moleculares lleva tanto tiempo ya que la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos contiene procesos biológicos. En este caso, como el inductor de la diferenciación de acuerdo con esta realización es un compuesto orgánico de bajo peso molecular, tiene estabilidad superior. Por consiguiente, el tratamiento durante un periodo largo de 8 días o más es improbable que haga que el compuesto se degrade. Sin embargo, es preferible cambiar apropiadamente un medio para suministrar los nutrientes necesarios para la supervivencia, proliferación, y cambios de las células madre mesenquimales. En dicha ocasión, también es preferible añadir el compuesto orgánico de bajo peso molecular en un medio recién reemplazado, la cantidad de compuesto orgánico de bajo peso molecular siendo sustancialmente la misma que la del medio antes del cambio.

65 Adicionalmente, como el inductor de la diferenciación de acuerdo con esta realización es un compuesto

15

25

35

45

55

65

orgánico de bajo peso molecular, tiene estabilidad superior. Por consiguiente, si la temperatura de tratamiento es alta o baja es improbable que afecte a su descomposición. Es preferible establecer una temperatura de un medio a una temperatura adecuada para la supervivencia de células mamíferas para mantener un ambiente necesario para la supervivencia, proliferación, y cambios de las células madre mesenquimales. Específicamente, la temperatura se establece para ser preferiblemente de 20 a 45º C, más preferiblemente de 30 a 40º C, y aún más preferiblemente de aproximadamente 36 º a aproximadamente 38º C.

En este caso, un método para cultivar células madre mesenquimales permite preferiblemente que contacten con un compuesto orgánico de bajo peso molecular en un medio adecuado para la supervivencia de las células madre mesenquimales en, por ejemplo, una placa de cultivo sensible a la temperatura. Ejemplos de un medio preferido que puede usarse incluyen Medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y Medio Basal de células Madre Mesenquimales (MSCBM).

En este momento, ejemplos de fuentes de cultivo sensibles a la temperatura preferidas incluyen fuentes de cultivo cuya superficie se ha polimerizado con un polímero sensible a la temperatura (por ejemplo, PIPAAm) y/o metilcelulosa. Esto se debe a que disminuir meramente la temperatura permitiría que las células se recogiesen sin daño mientras se mantiene la adhesión intercelular.

<Aplicación en Medicina Regenerativa>

Los hepatocitos así diferenciados pueden usarse adecuadamente para terapias de trasplanta, como trasplante de hepatocitos, y la aplicación para desarrollo de fármacos en evaluación de la eficacia y efectos adversos de un fármaco. Adicionalmente, estos hepatocitos se diferencian a partir de células madre mesenquimales usando un compuesto orgánico de bajo peso molecular, por lo que este caso tiene mejor estabilidad y seguridad durante la producción que el acaso de la inducción de la diferenciación usando una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos.

Además, los hepatocitos así diferenciados pueden hacerse crecer para adaptarse a una forma deseada usando una fuente de cultivo sensible a la temperatura y/o un sustrato como un andamiaje de polímero sintético usando un polímero sintético biodegradable como ácido poliláctico (PLA) y ácido polietilenglicólico (PGA). Luego, los hepatocitos resultantes pueden usarse como tejido del hígado, hígado, o una lámina de células para medicina regenerativa. El tejido del hígado estructurado en 3-D, hígado, o lámina de células resultante para la medicina regenerativa puede usarse adecuadamente para terapias de trasplante, como trasplante de hepatocitos, y la aplicación para desarrollo de fármacos en evaluación de la eficacia y efectos adversos de un fármaco. Adicionalmente, el tejido del hígado, hígado, o lámina de células se diferencia a partir de células madre mesenquimales usando un compuesto orgánico de bajo peso molecular, por lo que este caso tiene mejor estabilidad y seguridad durante la producción que el caso de la inducción de la diferenciación usando una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos.

Además, los hepatocitos, tejido de hígado, hígado, o lámina de células anteriores pueden tener componentes que comprenden, por ejemplo, por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de los compuestos representados por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos.

Adicionalmente, los niveles de expresión de los genes en los hepatocitos anteriores no están particularmente limitados, pero los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de cualquiera de transtirretina, apolipoproteína B, haptoglobina, fibrinógeno α y fibrinógeno β, por ejemplo, pueden ser inferiores a los de los genes anteriores en hepatocitos comercialmente disponibles. También, los niveles de expresión de cualquiera de los genes anteriores puede ser inferior que el de los hepatocitos en el hígado de un paciente trasplantado con los hepatocitos anteriores. Tener en cuenta que el término "comercialmente disponible" incluye aquellos comercialmente disponibles para medicina regenerativa o propósitos de investigación. Adicionalmente, la frase "es inferior" incluye un estado en el que el nivel de expresión génica está significativa o sustancialmente disminuido. También el nivel puede estar disminuido por el 40, 50, 60, 70, 80, 90, ó 100%. Esta tasa puede ser cualquiera de los valores anteriores o más alto, o puede estar entre dos cualquiera de los valores anteriores.

Adicionalmente, los niveles de expresión de los genes en el tejido de hígado, hígado, o lámina de células anteriores no están particularmente limitados, pero los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de cualquiera de transtirretina, apolipoproteína B, C4, RBP4, RBP1, haptoglobina, fibrinógeno α, y fibrinógeno β, por ejemplo, pueden ser inferiores a los de los genes anteriores en hepatocitos, tejidos de hígado, o hígados comercialmente disponibles. También, los niveles de expresión de cualquiera de los genes anteriores pueden ser inferiores a los de los hepatocitos en el hígado, un tejido del hígado, o el hígado de un paciente trasplantado con los hepatocitos anteriores.

Además, se divulga un agente terapéutico o un material para su uso en el tratamiento de disfunción hepática o una enfermedad acompañada por la disfunción hepática que comprende hepatocitos, un tejido del hígado, un hígado, o una lámina de células divulgada en la presente.

15

25

35

45

55

65

<Lámina de Células>

Se divulga una lámina de células que comprende hepatocitos diferenciados de la manera descrita anteriormente. El uso de estas láminas de células puede suprimir la disfunción hepática como se demuestra en los Ejemplos siguientes. Por lo tanto, la lámina de células puede usarse adecuadamente para el tratamiento de disfunción hepática.

Adicionalmente, está lámina de células puede usarse para el trasplanta a una superficie del hígado. Cuando esta lámina de células se trasplanta a una superficie del hígado, los siguientes Ejemplos demuestran un efecto remarcable de supresión de la disfunción hepática.

También, para el trasplanta, pueden trasplantarse una o más capas de esta lámina de células. Adicionalmente, con respecto al sitio del trasplante, pueden seleccionarse uno o más sitios. El número de sitios puede ser, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, ó 6. El número puede ser el número anterior o más, o puede estar entre dos cualquiera de los números anteriores.

También se divulga un material de trasplante que comprende la lámina de células anterior y un soporte para recoger la lámina de células. El uso de este material de trasplante puede suprimir la disfunción hepática como se demuestra en los Ejemplos siguientes. Por ejemplo, cuando se usa, este material de trasplante es coloca en un sitio de interés. Luego, se hace que la lámina de células contacte el sitio. Luego, se puede retirar el soporte para recoger la lámina de células. Este procedimiento permite que la lámina de células se una establemente al sitio de interés.

Otra realización de la presente invención proporciona un método para producir un material de trasplante, que comprende los pasos de tratar células madre in vitro con por lo menos un compuesto seleccionado del grupo consistente de los compuestos representados por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos. Para este método de producción se usa un compuesto de bajo peso molecular, impartiendo de este modo mejor estabilidad y seguridad que una preparación de proteínas y/o una preparación de ácidos nucleicos. Esto hace posible producir eficientemente el material de trasplante.

El método para producir un material de trasplante puede incluir el paso de: cultivar células madre mesenquimales en un medio que comprende por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de los compuestos representados por la fórmula (1), una sal del mismo, o un solvato de ellos para diferenciar las células madre mesenquimales en hepatocitos. Tener en cuenta que como se usa en la presente, el término "material de trasplante" puede incluir, por ejemplo, una lámina de células. Adicionalmente, el material de trasplante puede venir con cualquier soporte.

También se divulga un método para producir una lámina de células para el trasplante a una superficie del hígado, que comprende un paso de inducción de tratar células madre mesenquimales con hexaclorofeno, un derivado del mismo, una sal de ellos, o un solvato de ellos para inducir las células madre mesenquimales en hepatocitos. La lámina de células como se prepara usando este método de producción puede ejercer un efecto remarcable de supresión de disfunción del hígado cuando se trasplanta en una superficie del hígado como se demuestra en los Ejemplos siguientes. Por lo tanto, este método de producción es un método de producción excelente para producir una lámina de células para el trasplante a una superficie del hígado. Tener en cuenta que cuando se toma un cierto compuesto orgánico como un material de partida, un derivado significa un compuesto modificado en tal grado sin grandes modificaciones estructurales y de características en el material de partida por la introducción de un grupo funcional mediante la introducción de un grupo funcional, oxidación, reducción, o reemplazo o adición de un átomo, etc. Por ejemplo, puede hacerse referencia a "Burger’s Medicinal Chemistry And Drug Discovery, 5ª Edición, Vol 1: Principles and Practice".

Adicionalmente, se divulga un método para producir una lámina de células para el trasplante a una superficie del hígado, que comprende un paso de inducción para tratar células madre mesenquimales con un inhibidor de la vía de señalización de Wnt/β-catenina para inducir las células madre mesenquimales en hepatocitos. La lámina de células como se prepara usando este método de producción puede ejercer un efecto remarcable de supresión de la disfunción hepática cuando se trasplanta a una superficie del hígado como se demuestra en los Ejemplos siguientes. Por lo tanto, este método de producción es un método de producción excelente para producir una lámina de células para el trasplante a una superficie del hígado.

Como se ha descrito anteriormente, se han ilustrado las realizaciones de la presente invención. Estas realizaciones son ejemplos de la presente invención. Adicionalmente, también pueden emplearse combinaciones entre las realizaciones anteriormente descritas.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se ilustra adicionalmente con referencia a los Ejemplos <Ejemplo 1> Síntesis de IC-2

imagen11

(1) Síntesis de ICG-001

El ICG-001 es un oligopéptido que tienen una estructura mimética de giro β bicíclica en se esqueleto, y funciona según se ha informado como un potente antagonista para la activación transcripcional por un complejo βcatenina/Tcf (Drug Discov. Today 2005, 10, 1467-1474). El ICG-001 se sintetizó y examinó de acuerdo con un artículo de investigación (Tetrahedron 2007, 63, 12912-12916).

imagen12

(1-1) Síntesis del Compuesto 1

Se mezclaron y se agitaron a 100º C durante 20 minutos 1-naftaldehído (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)(1,56 g, 10 mmol) y 2,2-dietoxietanamina (TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.)(1,33 g, 10 mmol). Después de que la mezcla se hubo enfriado a temperatura ambiente, se uso EtOH (20 ml) para la dilución. Se añadió NaBH4 (0,38 g, 10 mmol) gota a gota y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Tras la finalización de la reacción, se destiló el EtOH bajo presión reducida. Luego, se extrajo un producto con AcOEt. El producto resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (hexano/AcOEt = 5/1) para producir el compuesto 1 (2,29 g, 8,5 mmol, 85%).

imagen13

(1-2) Síntesis del Compuesto 3

Se añadieron un agente de condensación HATU (0,76 g, 2,0 mmol) y diisopropiletilamina (DIEA)(0,35 ml, 65 2,0 mmol) a una solución de DMF (7 ml) que contenía Fmoc-L-Tyr(t-Bu)-OH (0,87 g, 1.9 mmol). Después, la mezcla se agitó durante 20 minutos. Luego, se añadió el compuesto 1 (0,54 g, 2,0 mmol) , y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Tras la reacción se destiló el DMF bajo presión reducida. El producto resultante se purificó por cromatografía en columna (hexano/AcOEt = 10/1) para producir el compuesto 2 (1,33 g, 1,9 mmol, 93%). El compuesto resultante 2 (1,33 g, 1,9 mmol) se disolvió en CH2Cl2 (20 ml). Posteriormente, se añadió dietilamina (DEA) (10 ml, exceso), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después de que se verificase la finalización de la reacción por TLC, el CH2Cl2 se destiló bajo presión reducida. El producto resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt) para producir el compuesto 3 (0,982 g, 1,8 mmol, 92%).

imagen14

imagen15

(1-3) Síntesis del Compuesto 5

Se añadieron un agente de condensación HATU (0,70 g, 1,8 mmol) y diisopropiletilamina (DIEA)(0,32 ml, 1,8 mmol) a una solución de DMF (8 ml) que contenía Fmoc-β-Ala-OH (0,53 g, 1,7 mmol). Después, la mezcla se

25 agitó durante 20 minutos. Luego, se añadió el compuesto 3 (0,92 g, 1,8 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. Tras la reacción se destiló el DMF bajo presión reducida. El producto resultante se purificó por cromatografía en columna (hexano/AcOEt = 1/1) para producir el compuesto 4 (1,2 g, 1,5 mmol, 82%). El compuesto resultante 4 (1,2 g, 1,5 mmol) se disolvió en CH2Cl2 (20 ml). Posteriormente, se añadió dietilamina (DEA) (9 ml, exceso), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Después de que se verificase la finalización de la reacción por TLC, el CH2Cl2 se destiló bajo presión reducida. El producto resultante se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (AcOEt/EtOH = 1/1) para producir el compuesto 5 (0,66 g, 1,2 mmol, 80%).

imagen16

45 (1-4) Síntesis del Compuesto 7

Se añadió una solución de CH2Cl2 (8 ml) que contenía bencilisocianato (0,16 g, 1,2 mmol) a una solución de CH2Cl2 (8 ml) que contenía que contenía el compuesto 5 (0,66 g, 1,2 mmol), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 12 horas. Después de que se verificase la finalización de la reacción por TLC, el CH2Cl2 se destiló bajo presión reducida. El producto resultante se purificó por cromatografía en columna (AcOEt/EtOH = 1/1) para producir el compuesto 6 (0,59 g, 0,85 mmol, 73%). El compuesto resultante 6 (0,59 g, 0,85 mmol) se disolvió en ácido fórmico (9 ml), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. Luego, se destiló el ácido fórmico bajo presión reducida. El producto resultante se purificó por cromatografía en columna (AcOEt) para producir

55 el compuesto 7a (ICG-001) como un sólido blanco (0,26 g, 0,48 mmol, 57%).

El producto resultante se identificó usando espectro MS y espectro 1H NMR (teniendo valores idénticos en la bibliografía) (FIG. 1).

imagen17

(2) Síntesis de IC-2

Cuando se sintetizó el compuesto 3 descrito en la sección anterior (1-2), la síntesis se llevó a cabo usando "Fmoc-L-Phe(t-Bu)-OH" en lugar de "Fmoc-L-Tyr(t-Bu)-OH" durante el proceso de síntesis en la sección anterior (1). Haciendo esto, el sintetizado era un derivado IC-2 (benzilamida de ácido IC-2 (6S,9aS)-6-fenil-8-naftalen-1-ilmetil4,7-dioxo-hexahidro-pirazino[1,2-a] pirimidina-1-carbocílico) (rendimiento total 29%) en el que se modificaron cadenas laterales de ICG-001. La FIG. 2 muestra los datos espectrales.

25

35

imagen18

<Ejemplo 2> Síntesis de HC-1

El hexaclorofeno es un compuesto fenólico altamente clorado usado para un repelente de insectos, microbicida, desinfectante, etc. Aquí, el sintetizado era un derivado, en el que un grupo hidroxilo fenólico de

45 hexaclorofeno se tapó con un grupo metilo. Se añadieron MeI (1,0 ml, 16 mmol) y K2CO3 (5,3 g, 36 mmol) a una solución de acetona (10 ml) que contenía hexaclorofeno (TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.) (417 mg, 1,0 mmol), y la mezcla se agitó durante 14 horas. Después se eliminó el exceso de K2CO3, y la mezcla se secó sobre Na2SO4. Luego, se destiló el solvente para producir un producto bruto. El producto bruto resultante se purificó por cromatografía en columna (hexano/AcOEt =7/1) para producir un derivado de hexaclorofeno de interés (un compuesto de metil éter) (bis(2,3,5-tricloro-6-metoxifenil)metano)(355 mg, 0,85 mmol, 85%). Este compuesto de metil éter se analizó por 1H NMR.

imagen19

<Ejemplo 3> Síntesis de PN-3-4

Se disolvió fenoxi benzohidrazida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)(0,46 g, 2,0 mmol, 1,0 eq) en EtOH. 65 Después, se añadió 1-naftaldehido (0,32 g, 2,0 mmol, 1,0 eq), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante

22 horas. Después de que pasasen 22 horas, la solución de la reacción se filtró y se sometió a recristalización con EtOH para producir un compuesto de interés (403 mg, 58%).

imagen20

El PN-3-4 (N’-[(E)-1-naftilmetilideno]-2-fenoxibenzohidrazida) así obtenido se analizó como sigue:

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 6.83-8.78 (m, 16H, Ar-H) 8.82 (s, 1H, -CONHN=CHC), 10.79 (s, 1H, CONHN=CH) IR(KBr) 758, 1249, 1358, 1371, 1449, 1481, 1662, 2969, 3082 cm-1; MS (EI) Encontrado: m/z 366. Calculado para C24H18N2O2: M+, Peso Molar: 366.41

25 Anal. Encontrado: C, 78.37; H, 5.02; N, 7.68; O, 8.98%. Calculado para C24H18N2O2: C, 78.67; H, 4.95; N, 7.65; O, 8.73

<Ejemplo 4> Síntesis de PN-3-13

La síntesis se llevó a cabo usando pentafluorobenzaldehído (TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.) en lugar de 1-naftaldehido en el Ejemplo anterior 3. Se disolvió fenoxi benzohidrazida (0,24 g, 1,0 mmol, 1,0 eq) en EtOH. Después se añadió pentafluorobenzaldehído (196 g, 1,0 mmol, 1,0 eq), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. Después de que pasasen 14 horas, la solución de la reacción se filtró y se sometió luego a recristalización con EtOH para producir un compuesto de interés (287 mg, 71%).

35

imagen21

El PN-3-13 (N’-[(E)-pentafluorofenilmetilideno]-2-fenoxibenzohidrazida) así obtenido se analizó como sigue:

1H-NMR (400 MHz, CDCl3) 6.79-8.37(m, 9H, Ar-H) 8.53 (s, 1H, -CONHN=CH-C), 10.92 (s, 1H, CONHN=CH) IR(KBr) 750, 980, 1231,

55 1493, 1518, 1659, 3285 cm-1; MS (EI) Encontrado: m/z 406. Calculado para: C20H11F5N2O2 M Peso Molar: 406.31

<Ejemplo 5> Síntesis de PN-1-2

La síntesis se llevó a cabo usando 3-fenoxi benzohidrazida (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) en lugar de 1-naftaldehído en el Ejemplo 3 anterior. La 3-fenoxi benzohidrazida (0,78 g, 3,4 mmol, 1,0 eq) se disolvió en EtOH. Después, se añadió 5-metil-furfural (0,43 g, 3,4 mmol, 1,0 eq), y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. Después de que pasasen 14 horas, la solución de la reacción se filtró y se sometió luego a

65 recristalización con EtOH para producir un compuesto de interés (318 mg, 29%).

15

25

35

45

55

65

imagen22

El PN-1-2 (N’-[(E)-(5-metil-2-fulil)metilideno]-3-fenoxibenzohidrazida) así obtenido se analizó como sigue:

1H-NMR (400 MHz, CDCl3)

2.35 {s, 3H, -CH=C(CH3)} 6.11{s, 1H, -CHC(CH3)} 6.69{s, 1H, -CHCHC(CH3)} 7.03-7.52 (m, 9H, Ar-H) 8.48 (s, 1H, -CONHN=CH-), 8.92 (s, 1H, CONHN=CH) IR(KBr) 746, 1018, 1233, 1287, 1300, 1489, 1580, 1651, 3048, 3194 cm-1; MS (EI) Encontrado: m/z 320. Calculado para C19H16N2O3: M, Peso Molar: 320.34 Anal. Encontrado: C, 71.25; H, 5.04; N, 8.79; O, 14.92%. Calculado para: C19H16N2O3 C, 71.24; H, 5.03; N, 8.74; O, 14.98

<Ejemplo 6> Establecimiento de Línea Celular (UE7T-13) Que Tiene Vector que Expresa Establemente Luciferasa

La FIG. 3 es un diagrama esquemático que ilustra cómo establecer una células madre mesenquimal humana que exprese establemente un gen indicador de β-catenina/TCF4/luciferasa. La FIG. 3 ilustra cómo construir un plásmido pTCF4-CMVpro-GL4.20 usando un vector de expresión de luciferasa. El plásmido pTCF4-CMVproGL4.20 contiene tres secuencias de TCF4 CCTTTGATC secuencia arriba de un promotor de CMV para expresar luciferasa. Adicionalmente el plásmido pCMVpro-GL4.20 se construyó como un control. Los plásmidos resultantes estaban cada uno linealizado introducidos en UE7T-13 por electroporación, y seleccionados usando puromicina (0,25 µg/ml) suplementada en un medio. Las células resistentes a puromicina se clonaron y usaron para un ensayo de luciferasa.

<Ejemplo 7> Ejemplos de Prueba para IC-2, etc.

Se trataron células derivadas de médula ósea (células UE7T-13) con IC-2, etc. Después, se examinaron los siguientes puntos: (1) Potencial de Proliferación (Toxicidad); (2) Capacidad de Inhibir la Vía de Wnt/β-Catenina; y (3) Capacidad de Diferenciarse en Hepatocitos.

(1) Examen de Potencial de Proliferación (Toxicidad) (Ensayo MTT (UE7T-13))

Se sembró una línea de células madre mesenquimales humanas, UE7T-13, en una placa de 96 pocillos (con un área inferior de 0,3 cm2) a una densidad de células de 9,0 x 103 células/cm2, y se cultivó en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS; JRH Biosciences, INC.), 100 U/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque). Este punto temporal se estableció como día 0. Al día siguiente (día 1), el medio se cambió a DMEM que contenía IC-2, etc. Después de eso, en los días 2, 4, 8, se uso Tetra Color One (SEIKAGAKU CORPORATION) para la medición, y se investigó si el compuesto afectó o no a la proliferación de células UE7T-13. El DMSO contenido en el medio de cultivo tenía una concentración final del 0,1%.

Las FIGS. 4 a 8 muestran los resultados de tratar células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) con IC-2, etc. El tratamiento con IC-2, etc., inhibió algo la proliferación de células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) en algunos casos. Sin embargo, el potencial de proliferación en sí mismo se mantuvo (excepto en los días 2, 4 y 8 con 50 µM de IC-2 y el día 8 con 10 µM de PN-1-2). Es decir, IC-2, etc., tenían toxicidad celular suficientemente baja hacia las células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13), para que los compuestos puedan ser usados definitivamente como un inductor de la diferenciación. Los resultados, en particular, demostraron toxicidad celular muy baja hacia las células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) cuando se usó IC-2 de 20 µM o menos, HC-1 de 8 µM o menos, PN-3-4 de 30 µM o menos, PN-3-13 de 10 µM o menos, o PN-1-2 de 40 µM o menos.

imagen23

(2) Examen de Capacidad de Inhibir la vía de Wnt/β-Catenina (Ensayo de Luciferasa (UE7T-13))

Se sembró la línea celular que tiene un vector que expresa luciferasa establemente en una placa de 24 pocillos, y se cultivó a 37º C. Al día siguiente, el medio se cambió a un medio que contenía IC-2, etc., y la línea

5 celular se cultivó adicionalmente a 37º C. Después de eso, en los días 1, 4 y 8, se usó un sistema de ensayo de luciferasa (Prmega) y se leyó la actividad de luciferasa con un lector de placas de fluorescencia (ARVO) a una longitud de onda de 556 nm.

De acuerdo con un ensayo de indicador usando el plásmido pTCF4-CMV-luciferasa, los resultados demostraron que el tratamiento de las células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) con IC-2 de 15 µM o más inhibiendo significativamente la vía de señalización de Wnt/β-catenina a los 8 días después del tratamiento (FIG. 9). Adicionalmente, los resultados demostraron que el tratamiento de las células derivadas de la médula ósea (Células UE7T-13) con HC1 de 2 µM o más inhibieron significativamente la vía de señalización de Wnt/β-catenina a los 8 días después del tratamiento. Además, los resultados demostraron que el tratamiento de las células derivadas

15 de la médula ósea (células UE7T-13) con PN-3-4 de 20 µM o más inhibieron significativamente la Wnt/β-catenina a los 8 días después del tratamiento. Además, los resultados demostraron que el tratamiento de las células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) con PN-3-13 de 9 µM o más inhibió significativamente la vía de señalización de Wnt/β-catenina a los 8 días después del tratamiento. Además, los resultados demostraron que el tratamiento de las células derivadas de la médula ósea (células UE7T-13) con PN-1-2 de 3 µM o más inhibió significativamente la vía de señalización de Wnt/β-catenina a los 8 días después del tratamiento.

(3) examen de Capacidad de Diferenciación en Hepatocitos

(3-1) Inducción de la Diferenciación (UE7T-13)

25 Las células se colocaron en placas en una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 9,0 x 103 células/cm2, y se cultivaron a 37º C durante 24 horas. Después de 24 horas, el medio se cambió a medio que contenía IC-2, etc. Después de eso, el medio se cambio dos veces a la semana, y las células se subcultivaron una vez a la semana para ajustar un número de células a 9,0 x 103 células/cm2. Se recogió el ARN total en los días 8, 16 y 24 después del inicio de la inducción.

(3-2) Reacción en Cadena de Polimerasa con Transcriptasa Inversa (UE7T-13)

Se extrajo el ARN total con un reactivo de TRIzol. Después de la extracción, para eliminar completamente

35 el ADN, se añadió desoxirribonucleasa y la mezcla se incubó a 37º C durante 1 hora. Se usó un Sistema de Síntesis SuperScript First-Stand para RT-PCR (Invitrogen) para transcripción inversa, y se usó un cebador oligo dT para convertir 1 µg de ARN en ADNc. Para realizar un PCR, el ADNc se diluyó 5 veces y se usó 1 µl de ADNc. Se usó una polimerasa de ADN Taq recombinante (Invitrogen) para el PCR. Respecto a los cebadores para albúmina humana, se usaron 5’-TTGGAAAAATCCCACTGCAT-3’ (SEQ ID NO: 1) y 5’-CTCCAAGCTGCTCAAAAAGC-3’ (SEQ ID NO: 2). El PCR implicó 1 ciclo de 95º C durante 2 minutos y 35 ciclos de 95º C durante 30 segundos, 58º C durante 30 segundos, y 72º C durante 30 segundos. Se usó gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humana como un control interno. Con respecto a los cebadores de GAPDH, se usaron 5’-GTCTTCTCCACCATGGAGAAGGCT-3’ (SEQ ID NO: 3) y 5’-CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3’ (SEQ ID NO: 4). El PCR implicó 1 ciclo de 95º C durante 2 minutos y 20 ciclos de 95º C durante 30 segundos, 60º C durante 30

45 segundos, y 72º C durante 30 segundos. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis durante 30 minutos en 2% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio, y se tomaron sus imágenes de gel con un transiluminador.

Las FIGS. 10 y 11 son imágenes de gel de electroforesis que ilustran la inducción de la diferenciación en hepatocitos usando IC-2, etc. El tratamiento con cualquiera de IC-2, etc., aumentó aparentemente los niveles de expresión de albúmina, que es un marcador representativo para la diferenciación en hepatocitos, en comparación con los de un control. Los niveles de la expresión de albúmina fueron particularmente altos cuando las células se trataron con 15 µM de IC-2. Tener en cuenta que la GAPDH era un control interno y la cantidad de ARN usado era la misma que la usada para la sustancia de prueba. La Huh-7 es una línea celular de hepatoma humana. El PNU74654 (N-[(5-metil-2-furil)metilideneamino]-2-fenoxi-benzamida) es un compuesto de bajo peso molecular que se ha

55 informado inhibe la vía de Wnt/β-catenina bloqueando la interacción entre la β-catenina y TCF.

(3-3) Ensayo de Urea (UE7T-13)

Las células se colocaron en placas en una placa de 24 pocillos, y se cultivaron en un medio que contenía IC-2, etc. Se añadió cloruro de amonio (a una concentración final de 5 mM) al medio, y las células se cultivaron durante 48, 72, y 96 horas. Luego, se determinó una cantidad de urea en el medio usando el Kit de Ensayo de Urea QuantiChrom (BioAssay Systems) y un lector de placa de fluorescencia (TECAN) a una longitud de onda de 520 nm.

La FIG. 12 son gráficos que ilustran la capacidad de síntesis de urea (en los días 8 y 16) de las muestras 65 diferenciadas usando IC-2, etc. La capacidad de inducir la diferenciación en hepatocitos (medición de la capacidad de síntesis de urea) por IC-2, etc., se determinó en el día 8. Como resultado, cualquiera de los compuestos aumentó aparentemente la síntesis de urea en comparación con la del control negativo (0,1% de DMSO). Los niveles aumentaron en la misma cantidad o más en comparación con los de un control positivo (Huh-7).

imagen24

5 Adicionalmente, se determinó la capacidad de inducir la diferenciación en hepatocitos (medición de la capacidad de síntesis de urea) por IC-2, etc., en el día 16. Como resultado, cualquiera de los compuestos aumentó aparentemente la síntesis de urea en comparación con la del control negativo (0,1% de DMSO). Además, los niveles aumentaron en la misma cantidad o más en comparación con los de un control positivo (Huh-7). Los resultados anteriores indican que las células tratadas con IC-2, etc., no sólo expresan marcadores de hepatocitos sino que también ejercen potenciales como hepatocitos funcionales.

(3-4) Tinción por Ácido Peryódico de Schiff (PAS) (UE7T-13)

Se esterilizó un vidrio de cobertura (22 x 22 mm, MATSUNAMI) con 70% de EtOH y se colocó en una placa

15 de 6 pocillos. Después, las células se sembraron en el vidrio de cobertura y se cultivaron en un medio que contenía IC-2, etc. 8, 16, y 24 días después del inicio del cultivo, las células se lavaron dos veces con PBS. Luego, las células se trataron con 4% de paraformaldehido/PBS durante 20 minutos y se fijaron sobre el vidrio de cobertura. Como un control negativo, se añadieron 10 mg/ml de α-amilasa (10 mg/ml; en 0,1 M de solución tampón de fosfato a pH 6,8), y las células se incubaron con ello a 37º C durante 1 hora para digerir su glucógeno. Posteriormente, se usó un 1% de ácido peryódico acuoso para tratamiento de oxidación durante 10 minutos. Después de eso, las células se trataron con un reactivo de Schiff durante 15 minutos para teñir el glucógeno. Después, las células se lavaron tres veces con ácido sulfuroso acuoso y se lavaron tres veces con agua destilada. Después de que sus núcleos se tiñeron con hematoxilina de Mayer, se usó 50% de glicerol diluido con PBS para montar el vidrio de cobertura. Finalmente, las células se observaron bajo un microscopio de luz. Las células que se habían cultivado con 0,1% de

25 DMSO se usaron como un control.

La FIG. 13 son micrografías (tinción PAS) que ilustran una capacidad de inducir la diferenciación en hepatocitos usando IC-2, etc. Se examinó una capacidad de inducir la diferenciación en hepatocitos usando IC-2 (tinción por PAS). Como resultado, aparentemente aumentó la acumulación de glucógeno intracelular en comparación con un control negativo (0,1% de DMSO), y fue sustancialmente el mismo nivel que el del control positivo (Huh-7, una célula de hepatoma).

Adicionalmente a IC-2, etc., también se sintetizó otro compuesto para inhibir la vía de señalización de Wnt/β-catenina. Con respecto a este compuesto, ICG-001, y PNU-74654, se evaluó la capacidad de inducir la

35 diferenciación en hepatocitos usando tinción por PAS de una manera similar a la anterior. Como resultado, en todos los casos de usar cualquiera de los compuestos, la acumulación de glucógeno intracelular no aumentó en comparación con el control negativo. En vista de los anterior, la razón por la que la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos en este Ejemplo tuvo éxito fue porque IC-2, etc., tiene una estructura particular.

(3-5) Inmunocitoquímica (UE7T-13)

Se esterilizó un vidrio de cobertura (22 x 22 mm, MATSUNAMI) con 70% de EtOH y se colocó en una placa de 6 pocillos. Después, las células se sembraron en el vidrio de cobertura y se cultivaron en un medio que contenía IC-2, etc. 8, 16, y 24 días después del inicio del cultivo, las células se lavaron dos veces con PBS. Luego, las células

45 se trataron con 4% de paraformaldehido/PBS durante 20 minutos y se fijaron sobre el vidrio de cobertura. Después de eso, las células se permearon con 0,2% de Triton X-100 durante 10 minutos. Posteriormente, las células se bloquearon con 3% de BSA/PBS durante 30 minutos. Se usó un anticuerpo anti-albúmina, anticuerpo anti-C/EBP, anticuerpo anti-AFP, o anticuerpo anti-CYPIAI como un anticuerpo principal, y las células se incubaron con él a 4º C durante la noche. Después, se usó un anticuerpo anti-ratón de cabra Alexa Fluoro 488 o anticuerpo anti-ratón de cabra Alexa Fluoro 594 como un anticuerpo secundario, y las células se incubaron con él a temperatura ambiente durante 1 hora. Se usó DAPI para tinción nuclear. Posteriormente, se usó 50% de glicerol diluido con PBS para montar el vidrio de cobertura. Finalmente, se observaron las células bajo un microscopio láser confocal. Las células que se habían cultivado con 0,1% de DMSO se usaron como un control.

55 La FIG. 14 son fotomicrografías fluorescentes que ilustran la inducción de la diferenciación en hepatocitos (en el día 8) usando IC-2, etc. La diferenciación en hepatocitos de indujo por IC-2, etc. Como resultado, en el día 8 tras el tratamiento con IC-2, etc., los niveles de expresión de marcadores como albúmina, C/EBPa, CYP1A1, y CYP3A4, que son marcadores representativos para la diferenciación en hepatocitos, aparentemente aumentaron en comparación con los de un control negativo (0,1% de DMSO). Los niveles son equivalentes a los de un control positivo (Huh-7). La FIG. 15 son fotomicrografías fluorescentes que ilustran la inducción de la diferenciación en hepatocitos (en el día 16) usando IC-2, etc. En el día 16 se obtuvieron resultados similares tras el tratamiento con IC2, etc. El tratamiento con IC-2, en particular, aumentó remarcablemente los niveles de expresión de los marcadores. Tener en cuenta que se usó DAPI como un control para cada tinción, y se muestran sus fotomicrografías fluorescentes.

65

15

25

35

45

55

65

<Discusión de los Resultados>

A la vista de los resultados experimentales anteriores, los presente inventores han revelado que IC-2, etc., pueden usarse para diferenciar células madre mesenquimales en hepatocitos funcionales. Al mismo tiempo, han dilucidado que las células madre mesenquimales son útiles como una fuente de células para medicina regenerativa del hígado para desarrollar medicina regenerativa del hígado. También, fue efectiva para inducir la diferenciación, la inhibición de la vía de señalización de Wnt/β-catenina por IC-2, etc. Estos descubrimientos son importantes para desarrollar medicina regenerativa del hígado genuinamente aplicable clínicamente.

<Ejemplo 8> Evaluación de Niveles de Expresión de Genes que Codifican Proteínas y Citoquinas Secretoras específicas del Hígado.

Se trataron células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (células UE7T-13) con un compuesto, hexaclorofeno (H4625-25G; Sigma-Aldrich, Inc.) o IC-2. En ese tiempo, se evaluó la expresión génica de cada proteína y citoquina secretora específica del hígado. Primero, se sembraron células madre mesenquimales derivadas de médula ósea (células UE7T-13) en una placa de 6 pocillos (con un área inferior de 9,6 cm2) a una densidad celular de 9,0 x 103 células/cm2, y se cultivaron bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS; JRH Biosciences, INC.), 100 U/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque). Este punto temporal se estableció como día 0.

Al día siguiente correspondiente al día 1, el medio se cambió a DMEM que contenía hexaclorofeno a una concentración final de 0,8 µM o IC-2 a una concentración final de 15 µM. En el día 4, se cambió el medio, y en el día 8, las células se resembraron y subcultivaron a una densidad celular de 9,0 x 103 células/cm2. Después de eso, el medio se reemplazó dos veces durante 8 días, y las células se subcultivaron cada 8 días. Después, se llevó a cabo una operación similar hasta el día 24. En los días 8, 16 y 24 después del inicio de la inducción, se usó TRIzol (Invitrogen) para extraer el ARN total de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Tras la extracción, se añadió desoxirribonucleasa (Nippon Gene), y la mezcla se incubó a 37º C durante 30 minutos para eliminar el ADN. En una reacción de transcripción inversa, se añadieron Transcriptasa Inversa SuperScriptII (Invitrogen) y cebador Oligo(dT)15 a 1 µg de ARN para convertirlo en ADNc. En un método de RT-PCR, el ADNc se diluyó 5 veces. Después, se usó 1 µl de ADNc como una plantilla. Luego, se usó ADN polimerasa rTaq (TOYOBO) para amplificar el ADNc. Se usó agua MQ como un control negativo. Se usó el ADNc de células Huh-7 o UE7T-13 como un control positivo.

Las secuencias de cebadores usados en un PCR para detectar la expresión de genes que codifican proteínas secretoras específicas del hígado humanas se describen cada una como sigue: los cebadores para albúmina eran 5’-TTGGAAAAATCCCACTGCAT-3’ (SEQ ID NO: 1) y 5’-CTCCAAGCTGCTCAAAAAGC-3’ (SEQ ID NO: 2); los cebadores para α1-antitripsina eran 5’-CAAGGAGCTTGACAGAGACACAGTTTTT-3’ (SEQ ID NO: 5) y 5’-GTGTCCTTGACTTCAAAGGGTCTCT-3’ (SEQ ID NO: 6); los cebadores para ceruloplasmina eran 5’-CGACTTGGGATTATGCCTCTGACC-3’ (SEQ ID NO: 7) y5’-CCCAATTCTATCTGGGCCATTTTGA-3’ (SEQ ID NO: 8); los cebadores para transtirretina eran 5’-AAGGCACTTGGCATCTCCCCA-3’ (SEQ ID NO: 9) y 5’-CAGGGCGGCAATGGTGTAGC-3’ (SEQ ID NO: 10); los cebadores para apolipoproteína E eran 5’-GTCCTTCCCCAGGAGCCGAC-3’ (SEQ ID NO: 11) y 5’-GTCTCCACCGCTTGCTCCAC-3’ (SEQ ID NO: 12); los cebadores para apolipoproteína B eran 5’-GCTTCAAGCCCATCCGCACA-3’ (SEQ ID NO: 13) y 5’-TGACAGGACTGGCTGCTGCT-3’ (SEQ ID NO: 14); los cebadores para el complemento C3 eran 5’-CAGCACCATGGGACCCACCTCAG-3’ (SEQ ID NO: 15) y 5’-CTCTCCAGCCGCAAGATGTTGGG-3’ (SEQ ID NO: 16); los cebadores para el complemento C4 eran 5’-ACTTTGAGACCGAGGGGCCC-3’ (SEQ ID NO: 17) y 5’-GGCACTTCCTGCACAGCCTC-3’ (SEQ ID NO: 18); los cebadores para la proteína 4 de enlace a retinol eran 5’-CCCAGAAGCGCAGAAGATT-3’ (SEQ ID NO: 19) y 5’-AAGGTTTCTTTCTGATCTGCCAT-3’ (SEQ ID NO: 20); los cebadores para la proteína 5 de enlace a retinol eran 5’-CTTGTGGCCAACTGGCTC-3’ (SEQ ID NO: 21) y 5’-GCTTCAGCAAGTTGGCGA-3’ (SEQ ID NO: 22); los cebadores para haptoglobina eran 5’-TTCCAGAGGCAAGACCAACC-3’ (SEQ ID NO: 23) y 5’-TGCCTGAGTCCACTGCAAA-3’ (SEQ ID NO: 24); los cebadores para α-fibrinógeno eran 5’-AGGATTCTCATTCGTTGACCAC-3’ (SEQ ID NO: 25) y 5’-TCTGACACTCGGTTGTAGGT-3’ (SEQ ID NO: 26); los cebadores para β-fibrinógeno eran 5’-AAAGTTAGAATCTGATGTCTCAGCTCAA-3’ (SEQ ID NO: 27) y5’-CTTTCCTGATAATTTCCTCACATTCTTT-3’ (SEQ ID NO: 28); y los cebadores para GAPDH, un control interno, eran 5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’ (SEQ ID NO: 29) y 5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’ (SEQ ID NO: 30).

El PCR implicó 1 ciclo de 94º C durante 2 minutos, seguido por 35 ciclos de 94º C durante 30 segundos, una temperatura correspondiente para cada cebador durante 30 segundos, y 72º C durante 30 segundos, y 1 ciclo de 72º C durante 5 minutos. La temperatura correspondiente a cada cebador era de 58º C para la albúmina, 68º C para el complemento C3, 60º C para la proteína 4 de enlace a retinol, 56º C para la proteína 1 de enlace a retinol y haptoglobina, o 64º C para el resto.

Las secuencias de cebadores usados en un PCR para detectar la expresión de genes que codifican

imagen25

citoquinas humanas se describen cada uno como sigue: los cebadores para interleuquina 6 (IL6) eran 5’-CCAGAGCTGTGCAGATGAG-3’ (SEQ ID NO: 31) y 5’-GTCAGCAGGCTGGCATTT-3’ (SEQ ID NO: 32); los cebadores para el antagonista del receptor de IL-1 (IL1ra) eran 5’-CAGCTGGAGGCAGTTAACAT-3’ (SEQ ID NO: 33)y 5’-CGCCTTCGTCAGGCATATTG-3’ (SEQ ID NO: 34); los cebadores para el factor de crecimiento de 5 hepatocitos (HGF) eran 5’-CCCTTCAATAGCATGTCAAGTGG-3’ (SEQ ID NO: 35) y 5’-GTTCCCTTGTAGCTGCGT3’ (SEQ ID NO: 36); los cebadores para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) eran 5’-TTGCCTTGCTGCTCTACCT 3’ (SEQ ID NO: 37) y 5’-TCCATGAACTTCACCACTTCGT-3’ (SEQ ID NO: 38); los cebadores para el factor de crecimiento transformante α (TGFα) eran 5’-CTGAAGGGAAGAACCGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 39) y 5’-AGCCTTTCTTTATTGATCTGCCACA-3’ (SEQ ID NO: 40); los cebadores para el factor de crecimiento transformante β (TGFβ) eran 5’-CTGCGTCTGCTGAGGC-3’ (SEQ ID NO: 41) y 5’-TCCACGGCTCAACCACTG-3’ (SEQ ID NO: 42); los cebadores para el factor de crecimiento epidérmico (EGF) eran 5’-TGGGTCAAGGCAAGAGAGAGTA-3’ (SEQ ID NO: 43) y 5’-GATTCCTTCCTGTTGATTTGACCA-3’ (SEQ ID NO: 44); los cebadores para factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) eran 5’-GGGTCCGGGAGAAGAGC-3’ (SEQ ID NO: 45) y 5’-GCCAGGTAACGGTTAGCAC-3’ (SEQ ID NO: 46); los cebadores para el factor de crecimiento 15 similar a EGF de enlace a heparina (HB-EGF) eran 5’-GGACCGGAAAGTCCGT-3’ (SEQ ID NO: 47) y 5’-GCTCCTCCTTGTTTGGTGT-3’ (SEQ ID NO: 48); los cebadores para anfirregulina (AREG) eran 5’-AACGAAAGAAACTTCGACAAGAGA-3’ (SEQ ID NO: 49) y 5’-ATGATCCACTGGAAAGAGGACC-3’ (SEQ ID NO: 50); los cebadores para factor de células madre (SCF) eran 5’-AGGGACAGTGGAGAGGG-3’ (SEQ ID NO: 51) y 5’-GCAAGTGAGAATCCAAGTTTGTGT-3’ (SEQ ID NO: 52); los cebadores para angiogenina eran 5’-TTCCATTGTCCTGCCCG-3’ (SEQ ID NO: 53) y 5’-AAGTGTGTGTACCTGGAGTTATC-3’ (SEQ ID NO: 54); los cebadores para angiopoyetina eran 5’-ATGTGCAAATGTGCCCTCA-3’ (SEQ ID NO: 55) y 5’-TCGCTTCTGACATTGCGCT-3’ (SEQ ID NO: 56); los cebadores para el factor de necrosis tumoral (TNFα) eran 5’-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3’ (SEQ ID NO: 57) y 5’-GGCCAGGAGGGCATTG-3’ (SEQ ID NO: 58); los cebadores para antígeno fas (Fas) eran 5’-GTTGGTGGACCCGCTCAGTA-3’ (SEQ ID NO: 59) y 5’

25 AACAGACGTAAGAACCAGAGGTAG-3’ (SEQ ID NO: 60); los cebadores para el inhibidor tisular de metaloproteinasa 3 (TIMP3) eran 5’-GGCAGCAGCGGCAATG-3’ (SEQ ID NO: 61) y 5’-CCACCTTGGCCCGGATCA3’ (SEQ ID NO: 62); y los cebadores para GAPDH, un control interno, eran 5’-AGCCACATCGCTCAGACAC-3’ (SEQ ID NO: 63) y 5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’ (SEQ ID NO: 64).

El PCR implicó 1 ciclo de 94º C durante 2 minutos, seguido por 35 ciclos de 94º C durante 30 segundos, una temperatura correspondiente para cada cebador durante 30 segundos, y 72º C durante 30 segundos, y 1 ciclo de 72º C durante 5 minutos. La temperatura correspondiente a cada cebador era de 60ºC para el factor de crecimiento similar a EGD de enlace a heparina (HB-EGF), anfiregulina (AREG), factor de células madre (SCF), factor de necrosis tumoral (TNFα) y antígeno fas (Fas), o 56° C para el resto. Los productos del PCR se sometieron

35 a electroforesis durante 30 minutos en un 2% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio, y sus imágenes de gel de electroforesis se tomaron con un transiluminador.

La FIG. 16 ilustra los resultados de examinar la expresión génica de proteínas y citoquinas secretoras específicas del hígado. Como resultado, los hepatocitos como se obtuvieron usando tratamiento con hexaclorofeno o IC-2 tenían niveles aumentados de expresión de una pluralidad de proteínas y citoquinas secretoras específicas del hígado. Adicionalmente, incluso si se indujo la diferenciación, se descubrió que se mantuvieron los niveles de expresión de las proteínas y citoquinas secretoras específicas del hígado que eran efectivas en la regeneración del hígado.

45 <Ejemplo 9> Preparación de Dispositivo de liberación sostenida de bFGF

Se preparó un dispositivo de liberación sostenida de bFGF de acuerdo con el American Journal of Transplantation 2006, 6, 50-59 y Nature Medicine 2007, 13(7), 880-885. El dispositivo de liberación sostenida de bFGF se implantó bajo la piel en la región dorsal de un ratón inmunodeficiente, un ratón NOD-SCID, para inducir la neovascularización. Primero, se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia. Tras la introducción de la anestesia, se afeitó la piel dorsal izquierda del ratón. Después, se usaron unas tijeras de operación o instrumento quirúrgico similar para cortar, en una dirección perpendicular a una dirección del eje del cuerpo, aproximadamente de 1,5 a 2,0 cm de la piel con sólo tejido subcutáneo que estaba posicionado

55 aproximadamente 1 cm caudal a la posición donde se implantaría el dispositivo bFGF. Las tijeras de operación o el instrumento quirúrgico se insertaron bajo la piel desde esta incisión y se movieron hacia la dirección rostral para ir más allá de la posición donde se implantaría el dispositivo. Después, se abrieron las tijeras de operación, lo que creó un espacio donde podría implantarse el dispositivo bajo la piel del ratón. El dispositivo de bFGF se insertó en este espacio, y la incisión se cerró con un clip quirúrgico o sutura.

Los ratones se alimentaron bajo condiciones normales durante de 10 a 12 días. Después de 10 a 12 días, se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia de una manera similar a cuando se implanto el dispositivo bFGF. La parte que rodeaba el sitio donde se había implantado el dispositivo bFGF se cortó

65 con tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar, y se extirpó la piel con tejido subcutáneo. Como un control, se cortó igualmente en el mismo ratón NOD-SCID, y se extirpó la piel dorsal derecha con tejido subcutáneo que no tenía implantado el dispositivo de bFGF. La piel extirpada con el tejido subcutáneo se fijo con 4% de paraformaldehido (Nacalai Tesque). El tejido post-fijado se insertó en parafina, se uso para preparar secciones de tejido usando un micrótomo, y se tiñó con hematoxilina y eosina. Haciendo esto, se examinó si la implantación del

imagen26

5 dispositivo de bFGF bajo la piel ejerció o no un efecto de neovascularización (FIG. 17).

<Ejemplo 10> Preparación de Lámina de Células y Trasplante Subcutáneo

Se dividieron ratones de 7 semanas de edad NOD-SCID en cuatro grupos (FIG. 18). El grupo 1 era un grupo de operación simulada en el que no se trasplantó lámina de células. El grupo 2 era un grupo en el que se trasplanto una lámina de células bajo la piel tras la neovascularización. El grupo 3 era un grupo en el que se trasplantaron dos láminas de células bajo la piel tras la neovascularización. El grupo 4 era un grupo en que se trasplantaron tres láminas de células bajo la piel tras la neovascularización. A los 12 días antes del trasplante de la lámina de células, el dispositivo de bFGF se implantó bajo la piel dorsal de los cuatro grupos para inducir la

15 neovascularización.

Primero, se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia. Tras la introducción de la anestesia, se afeitó la piel dorsal izquierda del ratón. Después, se usaron unas tijeras de operación o instrumento quirúrgico similar para cortar, en una dirección perpendicular a una dirección del eje del cuerpo, aproximadamente de 1,5 a 2,0 cm de la piel con sólo tejido subcutáneo que estaba posicionado aproximadamente 1 cm caudal a la posición donde se implantaría el dispositivo bFGF. Las tijeras de operación o el instrumento quirúrgico se insertaron bajo la piel desde esta incisión y se movieron hacia la dirección rostral para ir más allá de la posición donde se implantaría el dispositivo. Después, se abrieron las tijeras de operación, lo que creó

25 un espacio donde podría implantarse el dispositivo bajo la piel del ratón. El dispositivo de bFGF se insertó en este espacio, y la incisión se cerró con un clip quirúrgico o una sutura.

Después de que los ratones se alimentasen bajo condiciones normales durante 12 días, se trasplanto la lámina de células. Las láminas de células se prepararon de acuerdo con el procedimiento siguiente. A los 8 días antes del trasplante, se sembró una línea de células madre mesenquimales derivada de médula ósea humana (células UE7T-13) en una fuente de 6 cm (CellSeed Inc.), que es un artículo de cultivo de células sensible a la temperatura UpCell para recoger una lámina de células, a una densidad celular de 9,0X103 células/cm2, y se cultivó bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS; JRH Biosciences, INC.), 100 U/ml de

35 penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque). Este punto temporal se estableció como día 0.

Al día siguiente correspondiente al día 1, el medio se cambió a DMEM que contenía hexaclorofeno a una concentración final de 0,8 µM. Similar al día 1, el medio se cambió en el día 4. En el día 8 correspondiente a un día antes del trasplante de la lámina de células, las células unidas a la periferia del fondo de la fuente se rasparon con la punta de una punta desechable, etc., y el medio se cambió con un medio a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2 durante 20 minutos o más para producir una lámina de células. Hasta su trasplante, la lámina de células se mantuvo bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2.

Al de 12 días después del implante del dispositivo bFGF, la lámina de células se trasplantó en ratones de

45 los Grupos 2 a 4. Primero, se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia. Después, la incisión abierta durante el implante del dispositivo de bFGF se cortó de nuevo. Luego, se usaron unas tijeras de operación o instrumento quirúrgico similar para cortar sólo el tejido subcutáneo en una dirección desde el borde dorsal de la incisión directamente hacia la dirección rostral para abrir el tejido subcutáneo y retirar el dispositivo de bFGF. Después de eso, se colocó un Cell Shifter (CellSeed Inc.), que es un soporte para recoger una lámina de células, en una lámina de células cuyo medio se había cambiado con DMEM libre de suero y se retiró luego completamente. La lámina de células, junto con el soporte, se recogió usando fórceps, etc. El soporte que tenía en el mismo la lámina de células se colocó en el sitio donde el dispositivo de bFGF había inducido la neovascularización. El operario esperó aproximadamente de 3 a 5 minutos para la adhesión de la lámina de células, y conformó que la

55 lámina de células estaba unida bajo la piel del ratón. Posteriormente, se usaron fórceps, etc., para retirar el soporte solamente.

En referencia al Grupo 2, se trasplantó una lámina de células, y la incisión se cerró luego con un clip quirúrgico o una sutura. En referencia a los Grupos 3 y 4, después de que se hubieron usado fórceps, etc., para retirar el soporte, se trasplantó igualmente la segunda lámina de células sobre la primera lámina de células que ya se había trasplantado. En referencia al Grupo 3, después de que se hubieron trasplantado dos láminas de células, la incisión se cerró luego con un clip quirúrgico o una sutura. En referencia al Grupo 4, la tercera lámina de células se trasplanto de nuevo en las dos láminas de células que ya se habían trasplantado, y la incisión se cerró luego con un clip quirúrgico o una sutura. En referencia al Grupo 1 como un control, el dispositivo de bFGF se retiró usando el

65 mismo proceso que para los Grupos 2 a 4, y la incisión se cerró luego con un clip quirúrgico o una sutura.

imagen27

Luego, los ratones se alimentaron de nuevo bajo condiciones normales. Al día siguiente de la operación, se diluyeron 0,2 µl de tetracloruro de carbono por 1g de peso corporal del ratón 10 veces con aceite de oliva, y se dieron a todos los ratones incluyendo los Grupos 1 a 4 a través de una sonda oral desechable, concretamente un tubo estomacal. Se comprobó diariamente si los ratones habían sobrevivido o no desde el día del trasplante hasta 8

5 días después. El peso corporal se midió una vez cada dos días. En los días 2 y 4 después del trasplante de la lámina de células, los ratones se pusieron bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Abbott Japón), y se extrajeron de 100 a 200 µl de sangre venosa usando un capilar de recogida de sangre (HIRSCHMANN LABORGERATE) del plexo orbital de los ratones para recoger la sangre en un tubo de 1,5 ml. La sangre venosa recogida estuvo en reposo durante la noche en hielo, y luego se centrifugó en una centrífuga fría a 2.000 g y 4º C durante 20 minutos para separar el suero. Después de eso, se recogió sólo el suero en un nuevo tubo de 1,5 ml. Cada cantidad necesaria del suero recogido se dispensó en un tubo de 1,5 ml, y los tubos se almacenaron en un ultracongelador a 80º C hasta su uso.

En el día 8 después del trasplante de la lámina de células, todos los ratones se pusieron bajo anestesia por

15 inhalación usando isoflurano (Abbott Japón). Luego se utilizaron tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar, y fórceps para realizar laparotomía. Después de eso, se usaron una aguja de 27-G y una jeringuilla de 1 ml para extraer toda la sangre de la vena cava inferior. Después del muestreo de sangre, se extirparon un tejido subcutáneo que contenía una pieza de la lámina de células trasplantada y el hígado completo. Se midió el peso húmedo del hígado completo extirpado, y se fotografió su imagen con una cámara digital. De los tejidos extirpados, se cortaron en piezas pequeñas aquellos para la extracción de ARN a un peso húmedo de 0,1 g por medio de tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar. Después, se añadió a los mismos 1 ml de TRIzol (Invitrogen). Luego, se usó un POLYTRON (KINEMATICA AG) para homogeneización, y las muestras se almacenaron en un congelador a -30º C hasta que se usaron para los experimentos. Las piezas de tejido para la extracción de proteínas se cortaron igualmente en piezas pequeñas a un peso húmedo de 0,1 g por medio de tijeras de operación o un

25 instrumento quirúrgico similar. Las muestras se pusieron en un tubo de 15 ml, posteriormente se sumergieron en nitrógeno líquido, se congelaron al instante, y se almacenaron en un ultracongelador a -80º C hasta que se usaron en los experimentos. Las piezas de tejido para tinción histoquímica se fijaron con 4% de paraformaldehido (Nacalai Tesque). Los tejidos post-fijados se insertaron en parafina, y sus secciones de tejido se prepararon con un micrótomo y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones de tejido distintas a estas se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica. El suero de la sangre venosa recogida de la vena cava inferior se separó usando el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente, y se almacenó en un ultracongelador a -80º C.

Se determinaron los niveles de transaminasas séricas de los ratones en los días 2, 4 y 8 después del

35 trasplante de las láminas de células usando un kit Transaminase CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). El procedimiento se realizó de acuerdo con el protocolo adjunto excepto que se redujo la escala de reacción a un cuarto de la escala descrita en el prospecto. La absorbancia se leyó a 555 nm usando un lector de microplacas (Sunrise Absorbance Reader; Tecan Group Ltd.). De acuerdo con una curva estándar, se usó la absorbancia resultante para calcular un valor de la actividad (unidad Karmen) y una unidad internacional de cada una de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT).

Se determinaron los niveles de bilirrubina sérica de los ratones en los días 2, 4 y 8 después del trasplante de las láminas de células usando un kit QuantiChrom Bilirubin Assay (BioAssaySystems). De acuerdo con el protocolo adjunto, se leyó la absorbancia a 530 nm usando un lector de microplacas (Sunrise Absorbance Reader;

45 Tecan Group Ltd.). De acuerdo con una curva estándar, se calcularon los niveles de bilirrubina total.

La FIG. 19 muestra los resultados anteriores. El trasplante subcutáneo de dos o tres capas de láminas de células dio como resultado niveles disminuidos de transaminasas séricas. Adicionalmente, el trasplante de una o más capas de la lámina de células dio como resultado nivel disminuido del valor de bilirrubina.

<Ejemplo 11> Preparación de Lámina de Células y Trasplante en la Superficie del Hígado

Se dividieron ratones NOD-SCID macho de 7 semanas de edad en cuatro grupos. El grupo 1 era un grupo de operación simulada al que no se le trasplantaron láminas de células. El Grupo 2 era un grupo en el que se

55 trasplantó una lámina de células en la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado. El Grupo 3 era un grupo en el que se trasplantaron dos láminas de células en la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado. El Grupo 4 era un grupo en el que se trasplantaron tres láminas de células en la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado.

Las láminas de células se prepararon de acuerdo con el siguiente procedimiento. A los 8 días antes del trasplante de las láminas de células, se sembró una línea de células madre mesenquimales derivada de médula ósea humana (células UE7T-13) en una fuente de 6 cm (CellSeed Inc.), que es un artículo de cultivo de células sensible a la temperatura UpCell para recoger una lámina de células, a una densidad celular de 9,0X103 células/cm2, y se cultivó bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS; JRH Biosciences, INC.), 100 U/ml de

65 penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque). Este punto temporal se estableció como día 0.

imagen28

Al día siguiente correspondiente al día 1, el medio se cambió a DMEM que contenía hexaclorofeno a una concentración final de 0,8 µM. Similar al día 1, el medio se cambió en el día 4. En el día 8 correspondiente a un día antes del trasplante de la lámina de células, las células unidas a la periferia del fondo de la fuente se rasparon con la punta de una punta desechable, etc., y el medio se cambió con un medio a temperatura ambiente. Luego, las células

5 se incubaron bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2 durante 20 minutos o más para producir una lámina de células. Hasta su trasplante, la lámina de células se mantuvo bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2.

Primero, en el día del trasplante se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia. Tras la introducción de la anestesia, se afeitó el abdomen del ratón, y se usaron tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar para cortar la piel abdominal a lo largo de la línea media. Después, se diseccionó el peritoneo a lo largo de la línea media usando tijeras de operación o un instrumento similar. Luego, se usaron fórceps, etc., para sostener la piel y el peritoneo para mantener abierto el campo quirúrgico en el peritoneo. Se hizo una sutura para que pasase a través del proceso de xifoides dos veces, y se apretó y fijó. Esto permitió

15 adicionalmente que el campo quirúrgico que rodeaba el hígado se mantuviese abierto. Con respecto a la lámina de células, después de que el medio se cambió a DMEM libre de suero en el artículo de cultivo, el medio se eliminó completamente. Luego se colocó un Cell Shifter (CellSeed Inc.), que es un soporte para recoger una lámina de células, en la lámina de células. Esta lámina de células junto con el soporte, se recogieron usando fórceps, etc. Luego, la lámina de células que tenía unida a la misma el soporte se colocó en la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado. El operario esperó aproximadamente de 3 a 5 minutos para la adhesión de la lámina de células, y se confirmó que la lámina de células se hubo unido a la superficie del hígado del ratón. Posteriormente, se usaron fórceps, etc., para retirar solamente el soporte.

Con respecto al Grupo 2, después de que se hubo trasplantado la primera lámina de células, se retiró la

25 sutura se había pasados a través del proceso de xifoides; se extrajeron el fórceps, etc. , que fijaban el peritoneo y la piel; y el peritoneo se cerró con una sutura. Después de eso, la piel se cerró con un clip quirúrgico o una sutura. En referencia a los Grupos 3 y 4, después de que se usasen los fórceps, etc., para retirar el soporte, se trasplantó de igual manera la segunda lámina de células y se superpuso sobre la primera lámina de células que ya se había trasplantado. Con respecto al Grupo 3, después de que se trasplanten dos láminas de células, se retiró la sutura que se había pasado a través del proceso de xifoides; se extrajeron el fórceps, etc. , que fijaban el peritoneo y la piel; y el peritoneo se cerró con una sutura. Posteriormente, se cerró la piel con un clip quirúrgico o una sutura. Respecto al Grupo 4, la tercera lámina de células se trasplantó en las dos láminas de células que ya se habían trasplantado, y se cerraron el peritoneo y la piel de una manera similar. Respecto al Grupo 1 como un control, después de que se hubo aplicado la misma operación que la de los grupos de trasplante para mantener abierto el campo quirúrgico, se

35 cerraron el peritoneo y la piel.

Luego, los ratones se alimentaron bajo condiciones normales hasta el día del sacrificio. En el día 7 después del trasplante de las láminas de células, los ratones se pusieron bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Abbott Japón), y se sometieron a laparotomía de una manera similar a cuando se realizó el trasplante. Posteriormente, se extirpó el hígado completo. El hígado extirpado se fotografió con una cámara digital. De las piezas de tejido que contenían la lámina de células trasplantada, se cortaron en piezas pequeñas aquellas para la extracción de ARN a un peso húmedo de 0,1 g por medio de tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar. Después, se añadió a los mismos 1 ml de TRIzol (Invitrogen). Luego, se usó un POLYTRON (KINEMATICA AG) para homogeneización, y las muestras se almacenaron en un congelador a -30º C hasta que se usaron para los

45 experimentos. Las piezas de tejido para la tinción histoquímica se fijaron con 4% de formaldehido (Nacalai Tesque). Los tejidos post-fijados se insertaron en parafina, y sus secciones de tejido se prepararon luego con un micrótomo y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones de tejido distintas a estas se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica.

La FIG. 20 muestra los resultados anteriores. El trasplante de la lámina de células en la superficie del hígado dio como resultado la supresión de la disfunción hepática.

<Ejemplo 12> Preparación de Lámina de Células y Trasplante en Dos Sitios de la Superficie del Hígado

55 Se dividieron ratones NOD-SCID macho de 9 semanas de edad en cuatro grupos (FIG. 21). El grupo de operación simulada en el que no se trasplantaron láminas de células. El grupo 2 era un grupo en el que se trasplanto una lámina de células en cada uno de los dos sitios de la superficie del lóbulo lateral del hígado. El grupo 3 era un grupo en el que se trasplantaron dos láminas de células en cada uno de los dos sitios de la superficie del lóbulo lateral del hígado. El grupo 4 era un grupo en el que se trasplantaron tres láminas de células en cada uno de los dos sitios de la superficie del lóbulo lateral del hígado.

Las láminas de células se prepararon de acuerdo con el siguiente procedimiento. A los 8 días antes del trasplante de las láminas de células, se sembró una línea de células madre mesenquimales derivada de médula ósea humana (células UE7T-13) en una fuente de 6 cm (CellSeed Inc.), que es un artículo de cultivo de células

65 sensible a la temperatura UpCell para recoger una lámina de células, a una densidad celular de 9,0X103 células/cm2, y se cultivó bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS; JRH Biosciences, INC.), 100 U/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque). Este punto temporal se estableció como día 0.

imagen29

5 Al día siguiente correspondiente al día 1, el medio se cambió a DMEM que contenía hexaclorofeno a una concentración final de 0,8 µM. Similar al día 1, el medio se cambió en el día 4. En el día 8 correspondiente a un día antes del trasplante de la lámina de células, las células unidas a la periferia del fondo de la fuente se rasparon con la punta de una punta desechable, etc., y el medio se cambió con un medio a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2 durante 20 minutos o más para producir una lámina de células. Hasta su trasplante, la lámina de células se mantuvo bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2.

Primero, en el día del trasplante, se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia. Tras la introducción de la anestesia, se afeitó el abdomen del ratón, y se usaron tijeras de operación o un

15 instrumento quirúrgico similar para cortar la piel abdominal a lo largo de la línea media. Después, se diseccionó el peritoneo a lo largo de la línea media usando tijeras de operación o un instrumento similar. Luego, se usaron fórceps, etc., para sostener la piel y el peritoneo para mantener abierto el campo quirúrgico en el peritoneo. Se hizo una sutura para que pasase a través del proceso de xifoides dos veces, y se apretó y fijó. Esto permitió adicionalmente que el campo quirúrgico que rodeaba el hígado se mantuviese abierto. Con respecto a la lámina de células, después de que el medio se cambió a DMEM libre de suero en el artículo de cultivo, el medio se eliminó completamente. Luego se colocó un Cell Shifter (CellSeed Inc.), que es un soporte para recoger una lámina de células, en la lámina de células. Esta lámina de células junto con el soporte, se recogieron usando fórceps, etc. Luego, la lámina de células que tenía unida a la misma el soporte se colocó en cada uno de los dos sitios de la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado. El operario esperó aproximadamente de 3 a 5 minutos para la

25 adhesión de la lámina de células, y se confirmó que la lámina de células se hubo unido a la superficie del hígado del ratón. Posteriormente, se usaron fórceps, etc., para retirar solamente el soporte.

Con respecto al Grupo 2, después de que se hubo trasplantado la primera lámina de células, se retiró la sutura se había pasados a través del proceso de xifoides; se extrajeron el fórceps, etc. , que fijaban el peritoneo y la piel; y el peritoneo se cerró con una sutura. Después de eso, la piel se cerró con un clip quirúrgico o una sutura. Respecto a los Grupos 3 y 4, después de que se usasen los fórceps, etc., para retirar el soporte, se trasplantó de igual manera la segunda lámina de células y se superpuso sobre cada una de las primeras láminas de células que ya se habían trasplantado. Con respecto al Grupo 3, después de que se hubiesen trasplantado dos láminas de células en cada uno de los dos sitios, se retiró la sutura que se había pasado a través del proceso de xifoides; se

35 extrajeron el fórceps, etc. , que fijaban el peritoneo y la piel; y el peritoneo se cerró con una sutura. Luego, se cerró la piel con un clip quirúrgico o una sutura. Respecto al Grupo 4, la tercera lámina de células se trasplantó en cada uno de los dos sitios que tenían las láminas de células que ya se habían trasplantado, y se cerraron el peritoneo y la piel de una manera similar. Respecto al Grupo 1 como un control, después de que se hubo aplicado la misma operación que la de los grupos de trasplante para mantener abierto el campo quirúrgico, se cerraron el peritoneo y la piel.

Al día siguiente después de la operación, se diluyeron 0,2 µl de de tetracloruro de carbono por 1g de peso corporal del ratón 10 veces en aceite de oliva y se dieron a todos los ratones incluyendo los Grupos 1 a 4 a través de una sonda oral desechable, concretamente un tubo estomacal. Se comprobó diariamente si los ratones habían

45 sobrevivido o no desde el día del trasplante hasta 8 días después. El peso corporal se midió una vez cada dos días. En los días 2 y 4 después del trasplante de la lámina de células, los ratones se pusieron bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Abbott Japón), y se extrajeron de 100 a 200 µl de sangre venosa usando un capilar de recogida de sangre (HIRSCHMANN LABORGERATE) del plexo orbital de los ratones para recoger la sangre en un tubo de 1,5 ml. La sangre venosa recogida estuvo en reposo durante la noche en hielo, y luego se centrifugó en una centrífuga fría a 2.000 g y 4º C durante 20 minutos para separar el suero. Después de eso, se recogió sólo el suero en un nuevo tubo de 1,5 ml. Cada cantidad necesaria del suero recogido se dispensó en un tubo de 1,5 ml, y los tubos se almacenaron en un ultracongelador a -80º C hasta su uso.

55 inhalación usando isoflurano (Abbott Japón). Luego se utilizaron tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar, y fórceps para realizar laparotomía. Después de eso, se usaron una aguja de 27-G y una jeringuilla de 1 ml para extraer toda la sangre de la vena cava inferior. Después del muestreo de sangre, se extirpó el hígado completo. Se midió el peso húmedo del hígado completo extirpado, y se fotografió su imagen con una cámara digital. De las piezas de tejido que contenían la lámina de células trasplantadas, se cortaron en piezas pequeñas aquellas para la extracción de ARN a un peso húmedo de 0,1 g por medio de tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar. Después, se añadió a las mismos 1 ml de TRIzol (Invitrogen). Luego, se usó un POLYTRON (KINEMATICA AG) para homogeneización, y las muestras se almacenaron en un congelador a -30º C hasta que se usaron para los experimentos. Las piezas de tejido para la extracción de proteínas se cortaron igualmente en piezas pequeñas a un peso húmedo de 0,1 g por medio de tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar. Las muestras se

65 pusieron en un tubo de 15 ml, posteriormente se sumergieron en nitrógeno líquido, se congelaron al instante, y se almacenaron en un ultracongelador a -80º C hasta que se usaron en los experimentos. Las piezas de tejido para tinción histoquímica se fijaron con 4% de paraformaldehido (Nacalai Tesque). Los tejidos post-fijados se insertaron en parafina, y sus secciones de tejido se prepararon con un micrótomo y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones de tejido distintas a estas se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se llevó a cabo la tinción

imagen30

5 inmunohistoquímica. El suero de la sangre venosa recogida de la vena cava inferior se separó usando el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente, y se almacenó en un ultracongelador a -80º C.

La FIG. 22 muestra los resultados anteriores. El trasplanta de la lámina de células en dos sitios de la superficie del hígado dio como resultado la supresión de la disfunción hepática. Esta supresión fue remarcable cuando se trasplantaron dos o tres capas de la lámina de células.

Los niveles de transaminasas séricas de los ratones en los días 2, 4 y 8 después del trasplante de láminas de células se determinaron usando un CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). El procedimiento se realizó de acuerdo con el protocolo adjunto excepto que se redujo la escala de reacción a un cuarto de la escala

15 descrita en el prospecto. La absorbancia se leyó a 555 nm usando un lector de microplacas (Sunrise Absorbance Reader; Tecan Group Ltd.). De acuerdo con una curva estándar, se usó la absorbancia resultante para calcular un valor de la actividad (unidad Karmen) y una unidad internacional de cada una de aspartato aminotransferasa y alanina aminotransferasa.

La FIG. 23 muestra los resultados. El trasplante de la lámina de células en dos sitios de la superficie del hígado dio como resultado una gran disminución de los niveles de transaminasas séricas. Esta disminución fue remarcable cuando se trasplantaron dos o tres capas de la lámina de células.

Los niveles de bilirrubina sérica de los ratones se determinaron en los días 2, 4 y 8 después del trasplante

25 de las láminas de células usando un kit QuantiChrom Bilirubin Assay (BioAssaySystems). De acuerdo con el protocolo adjunto, se leyó la absorbancia a 530 nm usando un lector de microplacas (Sunrise Absorbance Reader; Tecan Group Ltd.). De acuerdo con una curva estándar, se calcularon los niveles de bilirrubina total.

La FIG. 24 muestra los resultados. El trasplante de la lámina de células en dos sitios de la superficie del hígado dio como resultado una gran disminución en los niveles de bilirrubina.

El número de ratones supervivientes se contó cada día después del trasplante de acuerdo con el procedimiento en la FIG. 21. En base al número, se dibujo una curva de supervivencia usando software estadístico PASW de acuerdo con un método Kaplan-Meier. La tasa de supervivencia se probó por una prueba de rango

35 logarítmico.

La FIG. 25 muestra los resultados. El trasplante de la lámina de células en dos sitios de la superficie del hígado dio como resultado un gran aumento en la tasa de supervivencia.

Las muestras se almacenaron para extracción de ARN de acuerdo con el procedimiento de la FIG. 21. Luego se extrajo su ARN total de acuerdo con las instrucciones adjuntas respecto a TRIzol (Invitrogen). Tras la extracción, se añadió desoxirribonucleasa (Nippon Gene) y la mezcla se incubó a 37º C durante 30 minutos para eliminar el ADN. En una reacción de transcripción inversa, se añadieron Transcriptasa Inversa SuperScriptII (Invitrogen) y cebador Oligo(dT)15 a 1 µg de ARN para convertirlo en ADNc. En un método de RT-PCR, el ADNc se

45 diluyó 5 veces. Después, se usó 1 µl de ADNc como una plantilla. Luego, se usó ADN polimerasa rTaq (TOYOBO) para amplificar el ADNc. Después de eso, se realizó un PCR de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 8 anterior. Los productos del PCR se sometieron a electroforesis durante 30 minutos en un 2% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio, y sus imágenes de gel de electroforesis se tomaron con un transiluminador.

La FIG. 26 ilustra los resultados de examinar la expresión génica de proteínas y citoquinas secretoras específicas del hígado. Entre las mostradas en la FIG. 26, los marcadores de proteínas séricas o citoquinas que tenían expresión aumentada (por ejemplo, α1-AT) parecían ser efectivas en la regeneración del hígado. Tener en cuenta que los marcadores que no tenían expresión reconocible (por ejemplo, Apolipoproteína B) pueden no estar implicados directamente en el presente mecanismo de regeneración del hígado. Adicionalmente, cuando la lámina

55 de células se trasplantó en dos o más sitios de la superficie del hígado, en particular, los marcadores de proteínas séricas y citoquinas tenían expresión génica aumentada en comparación con los de cuando no se trasplantó lámina de células.

Se usaron secciones de tejido preparadas de acuerdo con el procedimiento de la FIG. 21 para realizar la tinción por inmunofluorescencia. Se tiño α1-antitripsina humana de acuerdo con el procedimiento siguiente. Las secciones de tejido se sometieron a desparafinado usando xileno y tratamiento de hidratación usando 100% de etanol, se lavaron con agua corriente seguido por lavado con 1 x PBS(-), y se bloquearon luego en una solución de bloqueo que contenía suero de cabra a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se añadieron una o dos gotas de un anticuerpo anti-al-antitripsina policlonal de conejo (Abcam) a las secciones de tejido. Las secciones se

65 mantuvieron en una cámara húmeda a 4º C durante la noche para llevar a cabo la reacción de anticuerpos primaria.

imagen31

Después de lavar con 1 x PBS(-) , se añadieron 100 µl de anticuerpo IgG (H+L) anti-conejo de cabra Alexa Fluor 488 (Invitrogen) que se había diluido 200 veces en las secciones de tejido. Luego, las secciones se mantuvieron en un sitio oscuro a temperatura ambiente durante 1 hora para llevar a cabo una reacción de anticuerpos secundaria. Tras lavar con 1 x PBS(-), se cubrió cada sección. Las imágenes de la tinción se observaron bajo un microscopio de

5 fluorescencia (IX71, Olympus Corporation), y se obtuvieron las imágenes.

La FIG. 27 muestra los resultados anteriores. Se descubrió que la lámina de hepatocitos trasplantada y la parénquima hepática del ratón tenían expresión de α1-antitripsina humana.

<Ejemplo 13> Clasificación de Células Madre Mesenquimales e Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos

(1) Método para Clasificar Células Madre Mesenquimales

El Profesor Okano y el Profesor Asociado Matsuzaki de la Keio University han desarrollado un método para 15 clasificar una células madre mesenquimal CD90+CD271+ (JP2009-060840A). La FIG. 28 muestra una visión general del método. Las células madre mesenquimales se clasificaron en base al método.

(2) Método de Separación, Preparación y Cultivo de Células Madre Mesenquimales derivadas de Médula Ósea

Se suspendieron células mononucleares de médula ósea humana que se habían adquirido de Lonza Inc. en 1 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Gibco, Life Technologies Corp.) suplementada con un anticuerpo anti-CD90 APC-etiquetado diluido 100 veces, un anticuerpo anti-CD271 PE-etiquetado diluido 407 veces, y 2% de suero bovino fetal (FBS, Definifido, Thermo Fisher Scientific Inc.),, y se tiñeron en hielo durante 30 minutos. Se usó un citómetro de flujo (MoFlo XDP, Beckman Coulter Inc.) para separar selectivamente células madre

25 mesenquimales. Las células resultantes se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (Glucosa Baja, Gibco, Life Technologies Corp.) que contenía 20% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 ng/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque), y 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (TRANS GENIC INC., Ltd.) en una fuente de 35 mm bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2. El medio se cambió cada 4 días. Después de que se formasen colonias, las células se separaron usando una solución de 0,025% de tripsina/ 1 mM de EDTA (Nacalai Tesque), se dividieron en una fuente de 100 mm, y se cultivaron bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2. Luego, las células que se mantuvieron del 70 al 80% confluentes se separaron usando tratamiento con tripsina. Estas células en una fuente se dividieron en cuatro fuentes para el pase.

(3) Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos y Ensayo de Luciferasa 35

Las células se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad celular de 5,0X103 células/cm2. Después de 24 horas, el medio se cambió a un medio que contenía 0,1% de DMSO o IC-2 (a una concentración final de 40 ó 45 µM). Luego, las células se cultivaron bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2. A los 4 días después de que se sembraran las células, el medio se cambió a un medio que contenía el compuesto anterior. A los 3 días antes de la medición, las células se infectaron a MOI = 10 con un lentivirus (SABiosciences, QIAGEN N.V.) que expresaba luciferasa de luciérnaga bajo control de promotor de CMV. Como un control interno, las células se infectaron simultáneamente con un lentivirus (SABiosciences, QIAGEN N.V.) que expresaba luciferasa Renilla. A los 8 días después del tratamiento químico con el compuesto anterior, se usó un Sistema de Ensayo de Indicadores de Luciferasa Dual (Promega Corp.) para medir la actividad de luciferasa usando un luminómetro.

45

La FIG. 29 muestra los resultados del ensayo de luciferasa. Los resultados demostraron que el tratamiento de las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea con IC-2 inhibió significativamente la vía de señalización de Wnt/β-catenina a los 8 días después del tratamiento.

(4) Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos y Evaluación de Expresión Génica de Marcadores de Diferenciación de Hepatocitos

Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Este día se designó como día 0. En el día 1 correspondiente al día siguiente, el medio se cambió a un medio que contenía55 IC-2 (a una concentración final de 25, 35, o 45 µM) o 0,1% de DMSO. En el día 4, el medio se cambió de una manera similar a la del día 1, y en el día 8, las células se resembraron y subcultivaron a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Después de eso, el medio se reemplazo dos veces durante 8 días, y las células se subcultivaron cada 8 días. Luego, se llevó a cabo una operación similar hasta el día 24. En los días 8, 16 y 24 después del inicio de la inducción, se usó TRIzol (Invitrogen) para extraer el ARN total de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Tras la extracción, se añadió desoxirribonucleasa (Nippon Gene), y la mezcla se incubó a 37º C durante 30 minutos para eliminar el ADN. En una reacción de transcripción inversa, se añadieron Transcriptasa Inversa SuperScriptII (Invitrogen) y cebador Oligo(dT)15 a 1 µg de ARN para convertirlo en ADNc. En un método de RT-PCR, el ADNc se diluyó 5 veces. Después, se usó 1 µl de ADNc como una plantilla. Luego, se usó ADN polimerasa rTaq (TOYOBO) para amplificar el ADNc. Se usó agua MQ como un control negativo. Se usó el ADNc de células Huh-7 o UE7T-13

65 como un control positivo.

imagen32

Para determinar los marcadores de diferenciación de hepatocitos, se midieron los niveles de expresión de albúmina. Los cebadores usados tenían las siguientes secuencias: 5’-TTGGAAAAATCCCACTGCAT-3’ (SEQ ID NO: 1) y 5’-CTCCAAGCTGCTCAAAAAGC-3’ (SEQ ID NO: 2).

5 El PCR implicó 1 ciclo de 94º C durante 2 minutos, seguido por 35 ciclos de 94º C durante 30 segundos, 58º C durante 30 segundos, y 72º C durante 30 segundos, y un ciclo de 72º C durante 5 minutos. Los productos del PCR se sometieron a electroforesis durante 30 minutos en un 2% de gel de agarosa que contenía bromuro de etidio, y se tomaron sus imágenes de gel de electroforesis con un transiluminador.

La FIG. 30 muestra los resultados de examinar la expresión génica de la albúmina. Estos resultados demostraron que el tratamiento con 45 µM de IC-2, que había mostrado un efecto de inhibición de la vía de señalización de la Wnt/β catenina en la FIG. 24 anterior, indujo un aumento remarcable en la expresión de albúmina cuando se compara con 0,1% de DMSO.

15 <Ejemplo 14> Clasificación de Células Madre Mesenquimales derivadas de Especímenes Clínicos e Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos

(1) Método de Separación, Preparación, y Cultivo de Células Madre Mesenquimales derivadas de Especímenes Clínicos

Se recogió un aspirado de médula ósea reciente bajo consentimiento informado de un paciente (una señora mayor de 60 años) con osteoartritis que se sometió a una artroplastia de reemplazo en el Departamento de Cirugía Ortopédica, Tottori University Hospital. Este aspirado se sometió a centrifugación en gradiente de densidad usando ficoll (Amersham Biosciences) para separar las células mononucleares de médula ósea (FIG. 31.). Estas células

25 mononucleares de médula ósea se suspendieron en 1 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Gibco, Life Technologies Corp.) suplementada con un anticuerpo anti-CD90 APC-etiquetado diluido 100 veces, un anticuerpo anti-CD271 PE-etiquetado diluido 407 veces, y 2% de suero bovino fetal (FBS, Definifido, Thermo Fisher Scientific Inc.),, y se tiñeron en hielo durante 30 minutos. Se usó un citómetro de flujo (MoFlo XDP, Beckman Coulter Inc.) para separar selectivamente células madre mesenquimales. Las células resultantes se cultivaron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (Glucosa Baja, Gibco, Life Technologies Corp.) que contenía 20% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 ng/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque), y 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (TRANS GENIC INC., Ltd.) en una fuente de 35 mm bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2. El medio se cambió cada 4 días. Después de que se formasen colonias, las células se separaron usando una solución de 0,025% de tripsina/ 1 mM de EDTA (Nacalai Tesque), se dividieron en una fuente de 100 mm, y se cultivaron bajo condiciones a

35 37º C y 5% de CO2. Luego, las células que se mantuvieron del 70 al 80% confluentes se separaron usando tratamiento con tripsina. Estas células en una fuente se dividieron en cuatro fuentes para el pase.

(2) Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos y Evaluación de Expresión Génica de Marcadores de Diferenciación de Hepatocitos.

Las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Este día se designó como día 0. En el día 1 correspondiente al día siguiente, el medio se cambió a un medio que contenía cualquiera de hexaclorofeno (a una concentración final de 4 µM). HC-2 (a una concentración final de 20µM), PN-3-13 (a una concentración final de 20µM), IC-2 (a una concentración final de 40µM), y 0,1% de DMSO. En el día 4, el

45 medio se cambió de una manera similar a la del día 1, y en el día 8, las células se resembraron y subcultivaron a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Después de eso, el medio se reemplazo dos veces durante 8 días, y las células se subcultivaron cada 8 días. Luego, se llevó a cabo una operación final hasta el día 24. En los días 8, 16, y 24 tras el inicio de la inducción, se usó TRIzol (Invitrogen) para extraer el ARN total de acuerdo con las instrucciones adjuntas. El siguiente procedimiento se llevó de igual manera de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 13(4) anterior.

(3) Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos y Tinción por Inmunofluorescencia

Se colocó un vidrio de cobertura que había sido esterilizado con 100% de etanol en una placa de 12

55 pocillos. Las células se sembraron en el vidrio de cobertura a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Este día se designó como día 0. En el día 1 correspondiente al día siguiente, el medio se cambió a un medio que contenía HC-2 (a una concentración final de 20 µM), PN-3-13 (a una concentración final de 20 µM), IC-2 (a una concentración final de 40 µM), o 0,1% de DMSO. En el día 4, el medio se cambió de una manera similar a la del día 1. En el día 8, se retiró el medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS. Luego, para realizar la inmunotinción de albúmina, las células se fijaron durante 20 minutos con 4% de paraformaldehido (Nacalai Tesque) que contenía 8% de sacarosa (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Para inmunotinción de C/EBPα o CYP1A1, las células se fijaron durante 20 minutos con 4% de paraformaldehido. Después de eso, las células se permearon con 0,2% de Triton X100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) durante 10 minutos y se bloquearon en 3% de BSA (Nacalai Tesque) a temperatura ambiente durante 30 minutos sin agitación.

65

imagen33

Las células se cubrieron cada una de un anticuerpo de albúmina de suero anti-humano monoclonal diluido

1.000 veces (Sigma-Aldrich Corp.), un anticuerpo de proteína A de enlace al potenciado de CCAAT anti-humano policlonal diluido 125 veces (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), y un anticuerpo anti-CYPIAI policlonal diluido 250 veces (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) como un anticuerpo primario, y se mantuvieron a 4º C durante la noche para 5 llevar a cabo la reacción del anticuerpo primario. Después de la reacción del anticuerpo primaria, las células se lavaron con 0,1% de BSA/PBS. Para la tinción de albúmina, se usó un anticuerpo de inmunoglobulina G anti-ratón de cabra Alexa Fluor 488 diluido 1.000 veces (Molecular Probes). Para otra tinción, se usó un anticuerpo de inmunoglobulina G anti-conejo de cabra Alexa Fluor 594 (Molecular Probes). Las células se incubaron con cada anticuerpo, y se mantuvieron a oscuras a temperatura ambiente durante 1 hora para llevar a cabo una reacción de anticuerpo secundaria. Sus núcleos se tiñeron con DAPI (Cell Signaling Technology Inc.). Tras la reacción, las células se lavaron con 0,2% de Tween-20 (Nacalai Tesque). Además, las células se lavaron con agua MQ. Luego, se recogió el cristal de cobertura, se colocó en un portaobjetos, se selló, y se observó bajo un microscopio FV1000D 1X81 (Olympus Corporation). Se usó una la línea celular de hepatoma Huh-7 como un control positivo para la tinción por inmunofluorescencia. Como un control negativo, se usaron células madre mesenquimales derivadas de médula

15 ósea CD90+CD271+ que se sembraron un día antes del día de la inmunotinción y no se sometieron a inducción de la diferenciación.

La FIG. 33 muestra los resultados de la tinción por inmunofluorescencia. En el día 8, el tratamiento con PN3-13 o IC-2 aumento aparentemente los niveles de expresión de cualquiera de albúmina, C/EBPa, y CYP1A1, que son marcadores representativos para la diferenciación en hepatocitos, en comparación con los de un control negativo (0,1% de DMSO). Adicionalmente, los niveles eran cercanos a los de un control positivo (Huh-7).

(4) Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos y Ensayo de Urea

25 Se realizó un ensayo de urea de acuerdo con el protocolo siguiente. Se sembraron células madre mesenquimales derivadas de médula ósea CD90+CD271+ que se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Este día se designó como día 0. En el día 1 correspondiente al día siguiente, cada medio se cambió a un medio que contenía hexaclorofeno (a una concentración final de 4 µM), HC-2 (a una concentración final de 20 µM), PN-3-13 (a una concentración final de 20 µM), IC-2 (a una concentración final de 40 µM), o 0,1% de DMSO. En el día 4, el medio se cambió de una manera similar a la del día 1, y las células se cultivaron hasta el día 8. En el día 8, se retiró el medio, y se reemplazo con un medio que contenía cloruro de amonio (Nacalai Tesque) a una concentración final de 5 mM. Las células se cultivaron adicionalmente durante 96 horas. Al de 96 horas tras la adición del cloruro de amonio, los niveles de urea en el medio se determinaron usando un Kit de Ensayo de Urea QuantiChrom (BioAssay Systems) de acuerdo con el protocolo adjunto leyendo la

35 absorbancia a una longitud de onda de 520 nm con un lector de microplacas. Los niveles de urea se calcularon en base a una muestra estándar de acuerdo con el método de cálculo adjunto. Como un control negativo para el ensayo de urea, se usaron células madre mesenquimales derivadas de médula ósea CD90+CD271+ que se habían sembrado un día antes del día de la inmunotinción y no se sometieron a la inducción de la diferenciación.

La FIG. 34 muestra los resultados del ensayo de urea. El uso de cualquiera de hexaclorofeno, PN-3-13, y IC-2 dio como resultado un aumento aparente en la síntesis de urea celular cuando se comparó con un control negativo (0,1% de DMSO). Los resultados anteriores indican que las células tratadas con hexaclorofeno, PN-3-13, o IC-2 no sólo expresaban marcadores de hepatocitos sino también que ejercían potenciales como hepatocitos funcionales.

45

(5) Inducción de la Diferenciación en Hepatocitos y tinción por PAS

La tinción por PAS se realizó de acuerdo con el procedimiento siguiente. Se colocó un vidrio de cobertura que había sido esterilizado con 100% de etanol en una placa de 12 pocillos. Las células se sembraron en el vidrio de cobertura a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Este día se designó como día 0. En el día 1 correspondiente al día siguiente, el medio se cambió a un medio que contenía HC-2 (a una concentración final de 20 µM), PN-3-13 (a una concentración final de 20 µM), IC-2 (a una concentración final de 40 µM), o 0,1% de DMSO. En el día 4, el medio se cambió de una manera similar a la del día 1, y las células se cultivaron hasta el día 8. En el día 8, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con 4% de paraformaldehido durante 30 minutos. Como un

55 control negativo, se añadió, α-amilasa (Nacalai Tesque) a una concentración final de 10 mg/ml, y las células se cultivaron con él a 37º C durante 1 hora para diferir sus glucógenos. Posteriormente, las células se trataron con 1% de ácido peryódico acuoso durante 5 minutos. Luego, las células se trataron con reactivo de Schiff (Nacalai Tesque) durante 15 minutos para teñir glucógeno. Después de eso, las células se lavaron tres veces con ácido sulfuroso acuoso y se lavaron luego tres veces con agua destilada. Los núcleos se tiñeron con Hematoxilina de Mayer (MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD.) durante 1 minuto. Posteriormente, se recogió el vidrio de cobertura, se colocó en un portaobjetos, se selló y se observó bajo un microscopio de luz (IX71, Olympus Corporation). Una la línea celular de hepatoma Huh-7 se usó como un control positivo para la tinción por PAS. Como un control negativo se usaron células madre mesenquimales derivadas de médula ósea CD90+CD271+ que se habían sembrado un día antes del día de la inmunotinción y no se sometieron a la inducción de la diferenciación.

65

imagen34

La FIG. 35 muestra los resultados de la tinción por PAS. El uso de cualquiera de PN-3-13 e IC-2 dio como resultado un aumento aparente en la acumulación de glucógeno celular cuando se comparó con un control negativo (0,1% de DMSO).

5 <Ejemplo 15> Preparación de Lámina de Células y Trasplante a la Superficie del Hígado

Se dividieron ratones NOD-SCID macho de 7 semanas de edad en tres grupos. El grupo 1 era un grupo de operación simulada en el que no se trasplantó lámina de células. El grupo 2 era un grupo trasplantado con una lámina de células preparada induciendo la diferenciación de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea CD90+CD271+ (en lo sucesivo, referidas como "células sanas") separadas y preparadas a partir de células mononucleares de médula ósea que se habían adquirido de Lonza Inc. El grupo 3 era un grupo trasplantado con una lámina de células preparada induciendo la diferenciación de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea CD90+CD271+ (en lo sucesivo, referidas como "células sanas") separadas y preparadas a partir de médula ósea de un paciente que se había sometido a artroplastia de reemplazo en el Departamento de Cirugía Ortopédica,

15 Tottori University Hospital.

Las láminas de células se prepararon de acuerdo con el procedimiento siguiente. A los 8 días antes del trasplante de la lámina de células, cada una de las células sanas y células madre mesenquimales derivadas de médula ósea CD90+CD271+ de pacientes se sembró en una fuente de 6 cm (CellSeed Inc.), un artículo de cultivo de células sensible a la temperatura UpCell para recoger una lámina de células, a una densidad celular de 1,8 x 104 células/cm2. Las células respectivas se cultivaron en DMEM (Glucosa Baja, Gibco, Life Technologies Corp.) que contenía 20% de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 ng/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque), y 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (TRANS GENIC INC., Ltd.) bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2. Este punto temporal se estableció como día 0.

25 Al día siguiente correspondiente al día 1, el medio de células sanas se cambió a un medio que contenía IC2 a un concentración final de 45 µl, y el médico de las células de pacientes a un medio que contenía IC2 a una concentración final de 45 µl. De manera similar al día 1, el medio se cambió en el día 4. En el día 8 correspondiente a un día antes del trasplante de las láminas de células, las células unidas a la periferia del fondo de la fuente se rasparon con la punta de una punta desechable, etc., y el medio se cambió con un medio a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2 durante 30 minutos o más para producir una lámina de células. Hasta su trasplante, la lámina de células se mantuvo bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2.

Primero, en el día del trasplante, se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku

35 Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia. Tras la introducción de la anestesia, se afeitó el abdomen del ratón, y se usaron tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar para cortar la piel abdominal a lo largo de la línea media. Después, se diseccionó el peritoneo a lo largo de la línea media usando tijeras de operación o un instrumento similar. Luego, se usaron fórceps, etc., para sostener la piel y el peritoneo para mantener abierto el campo quirúrgico en el peritoneo. Se hizo una sutura para que pasase a través del proceso de xifoides dos veces, y se apretó y fijó. Esto permitió adicionalmente que el campo quirúrgico que rodeaba el hígado se mantuviese abierto.

La lámina de células se trasplantó en los Grupos 2 y 3. Con respecto a la lámina de células, después de que el medio se cambió a DMEM libre de suero en el artículo de cultivo, el medio se eliminó completamente. Luego

45 se colocó un Cell Shifter (CellSeed Inc.), que es un soporte para recoger una lámina de células, en la lámina de células. Esta lámina de células junto con el soporte, se recogieron usando fórceps, etc. Luego, la lámina de células que tenía unida a la misma el soporte se colocó en la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado. El operario esperó aproximadamente de 3 a 5 minutos para la adhesión de la lámina de células, y confirmó que la lámina de células se hubo unido a la superficie del hígado del ratón. Posteriormente, se usaron fórceps, etc., para retirar solamente el soporte.

Posteriormente, la segunda lámina de células se trasplanto sobre la primera lámina de células, que ya había sido trasplantada, de una manera similar a la de la primera lámina de células. Luego, la tercera lámina de células se trasplanto sobre la segunda lámina de células, que ya había sido trasplantada, de una manera similar a la

55 de la primera lámina de células. Mientras tanto, la cuarta lámina de células se trasplanto a la superficie del lóbulo medio derecho del hígado de una manera similar a la de la primera lámina de células. Luego, se trasplantó igualmente la quinta lámina de células sobre la cuarta lámina de células, que ya se había trasplantado sobre la superficie del lóbulo medio derecho. Además, la sexta lámina de células se trasplantó igualmente sobre la quinta lámina de células que ya se había trasplantado.

Se retiró la sutura que se había pasado a través del proceso de xifoides; se extrajeron el fórceps que fijaban el peritoneo y la piel; y el peritoneo se cerró con una sutura. Después de eso, la piel se cerró con un clip quirúrgico o una sutura. Respecto al Grupo 1 como un control, después de que se hubo aplicado la misma operación que la de los grupos de trasplante para mantener el campo quirúrgico abierto, se cerraron el peritoneo y la piel.

65

imagen35

Al día siguiente de la operación, se diluyeron 0,2 µl de tetracloruro de carbono por 1g de peso corporal del ratón 10 veces con aceite de oliva, y se dieron a todos los ratones incluyendo los Grupos 1 a 3 a través de una sonda oral desechable, concretamente un tubo estomacal. Posteriormente, se comprobó diariamente si los ratones habían sobrevivido o no desde el día del trasplante hasta 8 días después. El peso corporal se midió una vez cada

5 dos días. En los días 2 y 4 después del trasplante de la lámina de células, los ratones se pusieron bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Abbott Japón), y se extrajeron de 100 a 200 µl de sangre venosa usando un capilar de recogida de sangre (HIRSCHMANN LABORGERATE) del plexo orbital de los ratones para recoger la sangre en un tubo de 1,5 ml. La sangre venosa recogida estuvo en reposo durante la noche en hielo, y luego se centrifugó en una centrífuga fría a 2.000 g y 4º C durante 20 minutos para separar el suero. Después de eso, se recogió sólo el suero en un nuevo tubo de 1,5 ml. Cada cantidad necesaria del suero recogido se dispensó en un tubo de 1,5 ml, y los tubos se almacenaron en un ultracongelador a -80º C hasta su uso.

En el día 8 después del trasplante de las láminas de células, todos los ratones se pusieron bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Abbott Japón). Luego se utilizaron tijeras de operación o un instrumento quirúrgico

15 similar, y fórceps para realizar laparotomía. Después de eso, se usaron una aguja de 27-G y una jeringuilla de 1 ml para extraer toda la sangre de la vena cava inferior. Después del muestreo de sangre, se extirpó el hígado completo. Se midió el peso húmedo del hígado completo extirpado, y se fotografió su imagen con una cámara digital.

De las piezas de tejido que contenían las láminas de células trasplantadas, se cortaron en piezas pequeñas aquellas para la extracción de ARN a un peso húmedo de 0,1 g por medio de tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar. Después, se añadió a las mismas 1 ml de TRIzol (Invitrogen). Luego, se usó un POLYTRON (KINEMATICA AG) para homogeneización, y las muestras se almacenaron en un congelador a -30º C hasta que se usaron para los experimentos. Las piezas de tejido para la extracción de proteínas se cortaron igualmente en piezas pequeñas a un peso húmedo de 0,1 g por medio de tijeras de operación o un instrumento

25 quirúrgico similar. Las muestras se pusieron en un tubo de 15 ml, posteriormente se sumergieron en nitrógeno líquido, se congelaron al instante, y se almacenaron en un ultracongelador a -80º C hasta que se usaron en los experimentos.

Las piezas de tejido para tinción histoquímica se fijaron con 4% de paraformaldehido (Nacalai Tesque). Los tejidos post-fijados se insertaron en parafina, y sus secciones de tejido se prepararon luego con un micrótomo y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones de tejido distintas a estas se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se llevó a cabo la tinción inmunohistoquímica. El suero de la sangre venosa recogida de la vena cava inferior se separó usando el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente, y se almacenó en un ultracongelador a -80º C.

35 Se determinaron los niveles de transaminasas séricas de los ratones en los días 2, 4 y 8 después del trasplante de las láminas de células usando un kit Transaminase CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). El procedimiento se realizó de acuerdo con el protocolo adjunto excepto que se redujo la escala de reacción a un cuarto de la escala descrita en el prospecto. La absorbancia se leyó a 555 nm usando un lector de microplacas (Sunrise Absorbance Reader; Tecan Group Ltd.). De acuerdo con una curva estándar, se usó la absorbancia resultante para calcular un valor de la actividad (unidad Karmen) y una unidad internacional de cada una de aspartato aminotransferasa (AST) y alanina aminotransferasa (ALT).

La FIG. 36 muestra los resultados anteriores. El trasplante de láminas de células preparadas a partir de

45 células sanas diferenciadas dio como resultado niveles disminuidos de valores de ALT y AST. Adicionalmente, el trasplante de la lámina de células preparada a partir de células de pacientes diferenciadas dio como resultados niveles disminuidos del valor de AST.

<Ejemplo 16> Preparación de Lámina de Células y Trasplante a la Superficie del Hígado

Se dividieron ratones NOD-SCID macho de 9 semanas de edad en cinco grupos (FIG. 37). El grupo 1 era un grupo de operación simulada en el que no se trasplantó lámina de células. El grupo 2 era un grupo en el que se trasplantaron seis láminas de células en la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado. El grupo 3 era un grupo en el que se administró solución salina tamponada con fosfato (PBS) a través de la vena porta por inyección en el

55 bazo. El grupo 4 era un grupo en el que se trasplantaron 1 x 106 células a través de la vena porta por inyección en el bazo. El grupo era un grupo en el que se trasplantaron 4 x 107 células a través de la vena porta por inyección en el bazo.

imagen36

Al día siguiente correspondiente al día 1, el medio se cambió a DMEM que contenía hexaclorofeno a una concentración final de 0,8 µM. Similar al día 1, el medio se cambió en el día 4. En el día del trasplante de la lámina de células, las células unidas a la periferia del fondo de la fuente se rasparon con la punta de una punta desechable, etc., y el medio se cambió con un medio a temperatura ambiente. Luego, las células se incubaron bajo condiciones a

5 20º C y 5% de CO2 durante 20 minutos o más para producir una lámina de células. Hasta su trasplante, la lámina de células se mantuvo bajo condiciones a 20º C y 5% de CO2.

Las células para el trasplantes a través de una vena porta por inyección en el bazo se prepararon de acuerdo con el procedimiento siguiente. Se sembró una línea de células madre mesenquimales derivada de médula ósea humana (células UE7T-13) en una fuente de cultivo de 10 cm (TPP Techno Plastic Products AG) a una densidad celular de 9,0X103 células/cm2, y se cultivó bajo condiciones a 37º C y 5% de CO2 en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; NISSUI PHARMACEUTICAL CO., LTD.) que contenía 10% de suero bovino fetal (FBS; JRH Biosciences, INC.), 100 U/ml de penicilina, y 100 µg/ml de estreptomicina (Nacalai Tesque). Este punto temporal se estableció como día 0.

15 Al día siguiente correspondiente al día 1, el medio se cambió a DMEM que contenía hexaclorofeno a una concentración final de 0,8 µM. Similar al día 1, el medio se cambió en el día 4. Las células se separaron usando tratamiento con tripsina inmediatamente antes del trasplante de células. El número de células del Grupo 4 se ajustó con 100 µl de PBS a 1 x 106 células, y el número del células del Grupo 5 era de 4 x 107 células.

Primero, en el día del trasplante, se administró intraperitonealmente 1 µl de somnopentilo (Kyoritsuseiyaku Corporation), un anestésico sistémico, por 1 g de peso corporal del ratón NOD-SCID para poner el ratón bajo anestesia. Tras la introducción de la anestesia, se afeitó el abdomen del ratón del Grupo 2, y se usaron tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar para cortar la piel abdominal a lo largo de la línea media. Después, se

25 diseccionó el peritoneo a lo largo de la línea media usando tijeras de operación o un instrumento similar. Luego, se usaron fórceps, etc., para sostener la piel y el peritoneo para mantener abierto el campo quirúrgico en el peritoneo. Se hizo una sutura para que pasase a través del proceso de xifoides dos veces, y se apretó y fijó. Esto permitió adicionalmente que el campo quirúrgico que rodeaba el hígado se mantuviese abierto.

Con respecto a la lámina de células, después de que el medio se cambiase a DMEM libre de suero en el artículo de cultivo, el medio se eliminó completamente. Luego se colocó un Cell Shifter (CellSeed Inc.), que es un soporte para recoger una lámina de células, en la lámina de células. Esta lámina de células junto con el soporte, se recogieron usando fórceps, etc. Luego, la lámina de células que tenía unida a la misma el soporte se colocó en la superficie del lóbulo lateral izquierdo del hígado. El operario esperó aproximadamente de 3 a 5 minutos para la

35 adhesión de la lámina de células, y confirmó que la lámina de células se hubo unido a la superficie del hígado del ratón. Posteriormente, se usaron fórceps, etc., para retirar solamente el soporte. Posteriormente, se trasplantó igualmente la segunda lámina de células y se superpuso sobre la primera lámina de células que ya se había trasplantado. Tras su adhesión, se trasplanto la tercera lámina de células sobre las dos láminas de células que ya se habían trasplantado. Se retiró la sutura que se había pasado a través del proceso de xifoides; se extrajeron el fórceps, etc. , que fijaban el peritoneo y la piel; y el peritoneo se cerró con una sutura. Finalmente, la piel se cerró con un clip quirúrgico o una sutura.

Respecto al Grupo 1 como un control para una operación de trasplante de láminas de células. después de que se hubo aplicado la misma operación que para los grupos de trasplante para mantener, el campo quirúrgico 45 abierto, se cerraron el peritoneo y la piel. Después de la anestesia, se afeitó el abdomen izquierdo de los Grupos 4 y

5. Luego, se usaron tijeras de operación o un instrumento quirúrgico similar para cortar aproximadamente 1 cm de la piel del abdomen izquierdo en una posición media entre el esternón y el fémur en una dirección perpendicular a la línea media. Luego, se corto igualmente el peritoneo. Después de eso, se usaron fórceps para extraer directamente la grasa de debajo del bazo. Finalmente, se expusieron aproximadamente dos tercios del bazo fuera del cuerpo. Con respecto al Grupo 4, se llenó una jeringuilla de 24-G con 1 x 106 células suspendidas en 100 µl de PBS, y las células se inyectaron en el bazo. Después de que se hubo extraído la aguja del bazo, el bazo se ligó rápidamente con una sutura. Luego se detuvo el sangrado y el bazo se devolvió a su posición original. Después de eso, se cerraron el peritoneo y la piel con suturas. Con respecto al Grupo 5, se inyectaron igualmente 4 x 107 células en el bazo. Respecto al Grupo 3, que era un control para las operaciones de trasplante de los Grupos 4 y 5, se expuso el bazo

55 en sustancialmente la misma manera que los Grupos 4 y 5. Luego, una jeringuilla de 1 ml con una aguja de 24-G se llenó con 100 µl de PBS y el PBS se inyectó en el bazo. Después de eso, se cerraron el peritoneo y la piel de la misma manera que en los Grupos 4 y 5. Posteriormente, los ratones se alimentaron bajo condiciones normales hasta el día del sacrificio.

Al día siguiente después de la operación, se diluyeron 0,2 µl de tetracloruro de carbono por 1 g de peso corporal del ratón 10 veces con aceite de oliva, y se dieron a todos los ratones incluyendo los Grupos 1 a 5 a través de una sonda oral desechable, concretamente un tubo estomacal. Posteriormente, se comprobó diariamente si los ratones habían sobrevivido o no desde el día del trasplante hasta 8 días después. En los días 2 y 4 después del trasplante de las láminas de células, los ratones se pusieron bajo anestesia por inhalación usando isoflurano (Abbott

65 Japón), y se extrajeron de 100 a 200 µl de sangre venosa usando un capilar de recogida de sangre (HIRSCHMANN

Claims

imagen1

Reivindicaciones

1. Un compuesto, una sal del mismo, o un solvato de ellos, el compuesto estando representado por la fórmula (1):

imagen2

25 en donde R1, R2, y R4 son lo mismo o diferentes entre sí y cada uno representa H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, alcoxi C1-6 opcionalmente sustituido, arilo o heteroarilo; R3 representa H, alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, o alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido; m es un número entero de cualquiera de 1 a 4; n es un número entero de cualquiera de 1 a 3; p es un número entero de cualquiera de 1 a 5; y en donde

el término "opcionalmente sustituido" significa que el grupo respectivo no está sustituido o tiene 1, 2, 3, 4, o 5 sustituyentes seleccionados de H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halógeno alquilo C1-6, hidroxi alquilo C1-6,

35 alquil C1-6 amino, cicloalquilo C3-6, alquenilo C2-6, halógeno alquenilo C2-6, hidroxi alquenilo C2-6, alquenilamino C2-6, cicloalquenilo C3-6, alquinilo C2-6, halógeno alquinilo C2-6, hidroxi alquinilo C2-6, alquinil C2-6 amino, alcoxi C1-6, halógeno alcoxi C1-6, hidroxi alcoxi C1-6, alcoxi C1-6 amino, arilo, y heteroarilo.
2. El compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos de acuerdo con la Reivindicación 1, en donde R1, R2, y R4 son lo mismo o diferentes entre sí y cada uno representa H, halógeno, nitro, ciano, OH, alquilo C1-6, halógeno alquilo C1-6, hidroxi alquilo C1-6, alquil C1-6 amino, alcoxi C1-6, halógeno alcoxi C1-6, hidroxi alcoxi C1-6, o alcoxi C1-6 amino; y R3 representa H.
3. El compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos de acuerdo con la Reivindicación 2, en donde el compuesto, 45 la sal del mismo, o el solvato de ellos está representado por la fórmula (3):

imagen3
4. Un método para producir hepatocitos a partir de células madre mesenquimales, que comprende un paso de tratar

células madre mesenquimales un vitro con el compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos de acuerdo con 65 cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

46

imagen4
5.

El método para la producción de hepatocitos a partir de células madre mesenquimales de acuerdo con la Reivindicación 4, que comprende un paso de tratar células madre mesenquimales in vitro con por lo menos un compuesto, una sal del mismo, o un solvato de ellos, el compuesto estando representado por la fórmula (3):
6.

El método para producir hepatocitos a partir de células madre mesenquimales de acuerdo con la Reivindicación 4 ó 5, en donde la células madre mesenquimal es célula derivada de la médula ósea.

imagen5

25 7. Un método para inhibir una vía de señalización de Wnt/β-catenina, que comprende un paso de tratar células madre mesenquimales in vitro con el compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.
8. El método para inhibir una vía de señalización de Wnt/β-catenina de acuerdo con la Reivindicación 7, que

30 comprende un paso de tratar células madre mesenquimales con por lo menos un compuesto, una sal del mismo, o un solvato de ellos, el compuesto estando representado por la fórmula (3):

imagen6

50 9. Un método para producir un material de trasplante, que comprende un paso de:

a) tratar células madre in vitro con el compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3.

55 10. El método de producción de acuerdo con la Reivindicación 9, en donde el paso a) comprende un paso de cultivar células madre mesenquimales en un medio que comprende el compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 3 para diferenciar las células madre mesenquimales en hepatocitos.

60 11. Un método para inducir la diferenciación de células madre mesenquimales en hepatocitos, que comprende un paso de tratar células madre mesenquimales in vitro con:

a) el compuesto, la sal del mismo, o el solvato de ellos de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a
3.

47