TW202028456A

TW202028456A - 旁泌素因子產生促進用培養基添加劑

Info

Publication number: TW202028456A
Application number: TW108135205A
Authority: TW
Inventors: 阿武志保; 深澤菜月; 西野泰斗
Original assignee: 日商日產化學股份有限公司
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2020-08-01
Also published as: US20210353683A1; WO2020067477A1; CN112805268A; CA3114565A1; JPWO2020067477A1; EP3851519A4; EP3851519A1

Abstract

本發明係提供一種細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其含有由下述式(I)所示之化合物或其鹽：

(式中各記號之定義如說明書中所示)。

Description

旁泌素因子產生促進用培養基添加劑

本發明係關於一種旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，和經添加該培養基添加劑之培養基以及使用該培養基之旁泌素因子產生經促進之細胞的生產方法。又，本發明係關於包含藉由該細胞的生產方法所生產的細胞之炎症性疾病(inflammatory disease)或缺血性疾病(ischemic disease)之治療劑以及移植用組成物，且該治療劑以及移植用組成物包含藉由該細胞的生產方法所產生之細胞。再者，本發明係關於包含在經添加該培養基添加劑的培養基中培養細胞之旁泌素因子的生產方法。

近年來，利用生體的細胞或組織之醫藥品的開發或再生醫療的研究有所進展而受到注目。尤其，使用ES細胞、iPS細胞等多能性幹細胞之臟器再生技術的研究正加速進行。另一方面，利用間葉系幹細胞(以下有稱為「MSC」)或骨髓幹細胞等體性幹細胞之細胞療法，係利用體性幹細胞本來的機能修復由於疾病而受到障害的組織，因此在再生醫療中也作為實現性更高者而受到注目並進行著研究。

關於MSC移植治療的機制，推測有複數的作用機序，如同於非專利文獻1或非專利文獻2中所示，由於移植的MSC所具有的旁泌素效果而生體內的修復機能亢進之機序已為所知。顯示出治療效果的MSC旁泌素效果可舉例如，由於細胞介素(cytokine)或增殖因子等旁泌素因子的分泌之血管新生作用或抗炎症作用等。

又近年來，在單層培養系的細胞和生體內組織的細胞之間，各種的性質、刺激應答性、細胞機能等差異變得明確，因此比起形成單層構造的單層培養，形成與生體內的組織構造相近的三維構造之三維培養，尤其是球狀(spheroid)培養的需要正在擴大。

關於MSC亦有所謂藉由球狀(spheroid)培養因而增強旁泌素效果之報告。於非專利文獻3中記載，球狀培養之MSC，增加為抗炎症性蛋白質之TNF alpha induced protein 6(以下有稱為「TSG-6」)或斯鈣素(Stanniocalcin)-1(以下有稱為「STC-1」)的分泌。又於非專利文獻4中述，球狀培養MSC中為血管新生促進蛋白質之VEGF(血管內皮生長因子血管內皮生長因子Vascular endothelial growth factor)或FGF-2(纖維母細胞生長因子Fibroblast growth factors-2)的產生量增加，並且將球狀MSC移植至小鼠的缺血肢後，促進血管新生並改善壞死。

針對球狀MSC的移植療法，用以具有更高治療效果的球狀製作的各式各樣培養法正在進行開發。於專利文獻1中記載，藉由使用生物相容性(biocompatibility)高分子塊(macromolecular blocks)將MSC球狀化，抗炎症性蛋白質等的分泌量增加並且改善了炎症疾患。

[先前技術文獻]

[專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2017/221879號

[非專利文獻]

[非專利文獻1] Gnecchi M et al, Circ Res. 2008 Nov 21; 103(11): 1204-19.

[非專利文獻2] Madrigal M et al, J Transl Med. 2014 Oct 11;12：260.

[非專利文獻3] Bartosh TJ et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 3; 107(31):13724-9.

[非專利文獻4] Bhang SH et al, Tissue Eng Part A. 2012 Oct;18(19-20):2138-47.

以上述的MSC為代表例，利用細胞的旁泌素效果作為疾患的治療方法能夠非常地有效。然而，於專利文獻1中所教示的方法，有將生物相容性高分子塊和MSC球狀化的必要，需要煩雜的操作。又，依非專利文獻1或2中所教示的方法，旁泌素因子的產生量難謂充分等，有許多以往技術中應解決的課題。在此，本發明之目的係提供簡便且有效促進細胞旁泌素因子生產量的手段。又，目的係提供將使用該手段生產的旁泌素因子的產生經促進的細胞予以利用之新穎治療手段。

本發明者們針對上述課題積極研究的結果，發現特定的化合物能夠促進細胞的旁泌素因子產生，基於這些已知發現因而進行深入研究以至完成本發明。亦即，本發明為如以下所述。

[1]一種細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，係含有由下述式(I)所示之化合物或其鹽：

{式中，X為-NHCO-，R₁為-Y-NH-Z-Ar(式中，Y以及Z為單鍵，或可以具有取代基之碳數1至6的伸烷基，Ar為可以具有取代基之芳香基或雜芳基。)，R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基，R₃為羥基，n為0、1或2的整數。}

[2]如[1]所述之劑，其中，

R₂為甲基、乙基、或異丁基，

n為0，

Ar為可以被羥基或甲基取代之苯基，

Y為可以被甲基或乙基取代之亞甲基。

[3]如[1]或[2]所述之劑，其中，化合物為自下列者所組成之群組選擇之化合物或其鹽。

H

以及

[4]如[1]所述之劑，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽。

[5]如[1]所述之劑，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽。

或，

[6]如[1]至[5]中任一項所述之劑，其中，旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[7]如[6]所述之劑，其中，抗炎症性蛋白質為自腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白(TSG-6)以及斯鈣素-1(STC-1)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[8]如[6]所述之劑，其中，血管新生促進蛋白質為自血管生成素(ANG)、表皮生長因子(EGF)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、上皮衍生嗜中性球活化肽78(ENA-78)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、介白素(Interleukin)-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、基質金屬蛋白酶之組織抑制因子(TIMP)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[9]如[1]至[8]中任一項所述之劑，其中，細胞為間葉系幹細胞。

[10]一種細胞培養的培養基，係含有[1]至[9]中任一項所述之劑。

[11]一種旁泌素因子的產生經促進的細胞之生產方法，係包含在含有由下述式(I)所示之化合物或其鹽之培養基中培養細胞：

[12]如[11]所述之方法，其中，

R₂為甲基、乙基、或異丁基，

n為0，

Ar為可以被羥基或甲基取代之苯基，

Y為可以被甲基或乙基取代之亞甲基。

[13]如[11]或[12]所述之方法，其中，化合物為自下列者所組成之群組選擇之化合物或其鹽。

以及

[14]如[11]所述之方法，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽。

[15]如[11]所述之方法，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽。

或，

[16]如[11]至[15]中任一項所述之方法，其中，旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[17]如[16]所述之方法，其中，抗炎症性蛋白質為自腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白(TSG-6)以及斯鈣素-1(STC-1)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[18]如[16]所述之方法，其中，血管新生促進蛋白質為自血管生成素(ANG)、表皮生長因子(EGF)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、上皮衍生嗜中性球活化肽78(ENA-78)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、基質金屬蛋白酶之組織抑制因子(TIMP)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)所組成之群組之至少一種的蛋白質。

[19]如[11]至[18]中任一項所述之方法，其中，細胞為間葉系幹細胞。

[20]如[11]至[19]中任一項所述之方法，其中，培養以三維培養進行。

[21]一種生體移植用組成物，係包含藉由如[11]至[20]中任一項所述之方法所產生之細胞。

[22]一種炎症性疾病(inflammatory disease)或缺血性疾病(ischemic disease)的治療用組成物，係包含藉由如[19]或[20]所述之方法所產生之細胞。

[23]如[22]所述之治療用組成物，其中，炎症性疾病為自炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、克隆氏病(Crohn’s disease)、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、IgA腎病、糖尿病性腎病、膜性腎病、水腎、造影劑腎病、腎盂腎炎、腎衰竭、間質性腎炎(interstitial nephritis)、腎損傷、腎病症候群、高血壓性腎硬化症、糖尿病性腎絲球硬化症、腎結石、類澱粉(amyloid)腎、腎靜脈血栓症、Alport症候群、肝炎、肝硬化、胰臟炎、肺炎、鼻竇炎、鼻炎、關節炎、變形性膝關節病、變形性手關節病、變形性足關節病、變形性股關節病、風濕性關節炎、周期性發熱、口瘡口炎(aphthous stomatitis)、咽炎、淋巴結炎症候群、成年發病型Still氏病、貝西氏病(Behcet’s Disease)、痛風、假性痛風(pseudogout)、Schnitzler氏症候群、慢性復發性多發性骨髓炎、Cryopyrin相關周期熱症候群、家族性寒冷蕁麻疹、Muckle-Wells症候群、慢性嬰幼兒神經皮膚關節炎症候群、新生兒發症多臟器炎症疾患、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關周期性症候群、高IgD症候群、Blau症候群、幼發性類肉瘤病、家族性地中海熱、化膿性關節炎、壞疽性膿皮症、座瘡、中條-西村症候群、Majeed症候群、NLRP12相關周期熱症候群、介白素1受體拮抗因子缺損症、介白素36受體拮抗因子缺損症、磷脂酶(phospholipase)Cγ2相關抗體缺損/免疫異常症、HOIL-1缺損症、SLC29A3缺損症、CARD14異常症、腺核苷去胺酶(adenosine deaminase)2缺損症、嬰兒期發症的STING-相關血管病(STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy(SAVI))以及NLRC4異常症所組成之群組選擇者。

[24]如[20]所述之治療用組成物，其中，缺血性疾病為自狹心症、心肌梗塞、章魚壺心肌症(Takotsubo Cardiomyopathy)、中樞性肺水腫、腦梗塞、缺血性腦中風、閉塞性動脈硬化症以及危急性肢體缺血所組成之群組選擇者。

[25]一種旁泌素因子的生產方法，係包含下列步驟：

(1)在如[10]所述之培養基中培養細胞的步驟，以及

(2)將在(1)中所使用的培養基之上清回收的步驟。

[26]如[25]所述之方法，其中，細胞為間葉系幹細胞。

[27]如[25]或[26]所述之方法，其中，旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

又，在另一態樣中，本發明為如以下所述：

[1’]細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，係含有由下述式(I)所示之化合物或其鹽：

{式中，X為-NHCO-，R₁為-Y-NH-Z-Ar(式中，Y以及Z為單鍵，或可以具有取代基之碳數1至6的伸烷基，Ar為可以具有取代基之芳香基。)，R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基，R₃為羥基，n為0、1或2的整數。}

[2’]如[1’]所述之劑，其中，

R₂為甲基、乙基、或異丁基，

n為0，

Ar為可以被羥基或甲基取代之苯基，

Y為可以被甲基或乙基取代之亞甲基。

[3’]如[1’]或[2’]所述之劑，其中，化合物為自下列者所組成之群組選擇之化合物或其鹽。

以及

[4’]如[1’]所述之劑，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽。

[5’]如[1’]至[4’]中任一項所述之劑，其中，旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[6’]如[5’]所述之劑，其中，抗炎症性蛋白質為自腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白(TSG-6)以及斯鈣素-1(STC-1)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[7’]如[5’]所述之劑，其中，血管新生促進蛋白質為自血管生成素(ANG)、表皮生長因子(EGF)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、上皮衍生嗜中性球活化肽78(ENA-78)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、基質金屬蛋白酶之組織抑制因子(TIMP)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[8’]如[1’]至[7’]中任一項所述之劑，其中，細胞為間葉系幹細胞。

[9’]一種細胞培養的培養基，係含有[1’]至[8’]中任一項所述之劑。

[10’]一種旁泌素因子的產生經促進的細胞之生產方法，係包含在含有由下述式(I)所示之化合物或其鹽之培養基中培養細胞：

{式中，X為-NHCO-，R₁為-Y-NH-Z-Ar(式中，Y以及Z為單鍵，或可以具有取代基之碳數1至6的伸烷基，Ar為可以具有取代基之芳香基。)，R₂R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基，R₃為羥基，n為0、1或2的整數。}

[11’]如[10’]所述之方法，其中，

R₂為甲基、乙基、或異丁基，

n為0，

Ar為可以被羥基或甲基取代之苯基，

Y為可以被甲基或乙基取代之亞甲基。

[12’]如[10’]或[11’]所述之方法，其中，化合物為自下列者所組成之群組選擇之化合物或其鹽。

以及

[13’]如[10’]所述之方法，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽。

[14’]如[10’]至[13’]中任一項所述之方法，其中，旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[15’]如[14’]所述之方法，其中，抗炎症性蛋白質為自腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白(TSG-6)以及斯鈣素-1(STC-1)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[16’]如[14’]所述之方法，其中，血管新生促進蛋白質為自血管生成素(ANG)、表皮生長因子(EGF)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、上皮衍生嗜中性球活化肽78(ENA-78)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、介白素- 6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、基質金屬蛋白酶之組織抑制因子(TIMP)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

[17’]如[10’]至[16’]中任一項所述之方法，其中，細胞為間葉系幹細胞。

[18’]如[10’]至[17’]中任一項所述之方法，其中，培養以三維培養進行。

[19’]一種生體移植用組成物，係包含藉由如[10’]至[18’]中任一項所述之方法所產生之細胞。

[20’]一種炎症性疾病或缺血性疾病的治療用組成物，係包含藉由如[17’]或[18’]所述之方法所產生之細胞。

[21’]如[20’]所述之治療用組成物，其中，炎症性疾病為自炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、克隆氏病、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、腎絲球腎炎、IgA腎病、糖尿病性腎病、膜性腎病、水腎、造影劑腎病、腎盂腎炎、腎衰竭、間質性腎炎、腎損傷、腎病症候群、高血壓性腎硬化症、糖尿病性腎絲球硬化症、腎結石、類澱粉腎、腎靜脈血栓症、Alport症候群、肝炎、肝硬化、胰臟炎、肺炎、鼻竇炎、鼻炎、關節炎、變形性膝關節病、變形性手關節病、變形性足關節病、變形性股關節病、風濕性關節炎、周期性發熱、口瘡口炎、咽炎、淋巴結炎症候群、成年發病型Still氏病、貝西氏病、痛風、假性痛風、Schnitzler氏症候群、慢性復發性多發性骨髓炎、Cryopyrin相關周期熱症候群、家族性寒冷蕁麻疹、Muckle-Wells症候群、慢性嬰幼兒神經皮膚關節炎症候群、新生兒發症多臟器炎症疾患、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關周期性症候群、高IgD症候群、Blau症候群、幼發性類肉瘤病、家族性地中海熱、化膿性關節炎、壞疽性膿皮症、座瘡、中條-西村症候群、Majeed症候群、NLRP12相關周期熱症候群、介白素1受體拮抗因子缺乏症、介白素36受體拮抗因子缺損症、磷脂酶Cγ2相關抗體缺乏/免疫異常症、HOIL-1缺損症、SLC29A3缺損症、CARD14異常症、腺核苷去胺酶2缺損症、嬰兒期發症的STING-相關血管病以及NLRC4異常症所組成之群組選擇者。

[22’]如[20’]所述之治療用組成物，其中，缺血性疾病為自狹心症、心肌梗塞、章魚壺心肌症、中樞性肺水腫、腦梗塞、缺血性腦中風、閉塞性動脈硬化症以及危急性肢體缺血所組成之群組選擇者。

[23’]一種旁泌素因子的生產方法，係包含下列步驟：

(1)在如[9’]所述之培養基中培養細胞的步驟，以及

(2)將在(1)中所使用的培養基之上清回收的步驟。

[24’]如[23’]所述之方法，其中，細胞為間葉系幹細胞。

[25’]如[23’]或[24’]所述之方法，其中，旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。

藉由本發明能夠非常地簡便且效率良好地促進細胞的旁泌素因子(例如，抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質)的產生。又，使用本發明所產生的細胞，由於旁泌素因子產生以及分泌受到促進，可認為非常地適當作為移植用細胞。又，使用本發明所產生的細胞(例如，間葉系幹細胞)，旁泌素因子之中複數的抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質的產生以及分泌顯著地受到促進。因此，使用本發明所產生的細胞(例如，間葉系幹細胞)係適合使用於抗炎症性疾病以及缺血性疾病的治療。再者，藉由本發明能夠非常地簡便且效率良好地產生/回收醫藥上有用的細胞來源的旁泌素因子。

本說明書中所使用的用語定義如下。

本說明書中之用語各自意指：n-為「正(normal)」、i-為「異(iso)」、sec-為「二級(secondary)」，以及tert-為「三級(tertiary)」。又，本說明書中之用語各自意指：o-為「鄰位(ortho)」、m-為「間位(meta)」，以及p-為「對位(para)」。

「鹵原子」為氟原子、氯原子、溴原子、碘素原子。「鹵基」為氟(fluoro)、氯(chloro)、溴(bromo)、碘(iodo)。

「烷基」以及「碳數1至6的烷基」意指直鏈或分支狀的烷基，具體而言，可舉例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、tert-戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、n-己基、2-己基等基。作為此種的烷基較佳為碳數1至4的低級烷基，尤其為甲基以及乙基。

「芳香基」係至少1個的環為芳香族，可舉例如各環為具有5至8個環原子之單環式、二環式、三環式以及四環式碳環式基，具體而言，可舉例如苯基、茚基、萘、茀等。尤其，芳香基得以為C_6-10的芳香族的苯基、茚基、萘。又，「雜芳基」係在一個或複數個環內具有碳以外的原子之環狀芳香族基，具體而言，可舉例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡

基、萘啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、咔唑基等。

「伸烷基」以及「碳數1至6的伸烷基」係意指直鏈的碳鏈，具體而言，可舉例如亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基等基。

「烷基」、「芳香基」以及「伸烷基」可以各別具有取代基，該取代基可舉例如下。而且，針對「烷基」之取代基可舉例如下述(1)至(40)，針對「芳香基」以及「伸烷基」之取代基可舉例如下述(1)至(41)：

(1)鹵基；

(2)羥基；

(3)氰基；

(4)硝基；

(5)羧基；

(6)烯基(C_2-10烯基；例如，乙烯基、烯丙基(allyl)、丙烯基(propenyl)、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、丁二烯基、己三烯，以及其各異構物)；

(7)炔基(C_2-10炔基；例如，乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基，以及其各異構物)；

(8)鹵烷基(例如，單氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、單氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、氯甲基、氯乙基、二氯乙基、以及其各異構物)；

(9)環狀烷基(環中可以含有雜原子)(例如，環丙基、環丁基、環戊基、環己基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、疊氮基、吖呾基、吡咯啶基、哌啶基，

啉基)；

(10)芳香基(例如，苯基、萘基)；

(11)雜芳基(例如，吡啶基、嗒

基、嘧啶基、吡

基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、三唑基(例如，1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基)、四唑基、

唑基、異

唑基、噻唑基、異噻唑基、二

唑基(例如，1,2,3-

二唑基、1,2,4-

二唑基、1,3,4-

二唑基)、噻二唑基(例如：1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基)、苯并呋喃、苯并噻吩基、吲哚基、異吲哚基、苯并

唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并異

唑基、苯并異噻唑、苯并

二唑基、苯并噻二唑基、嘌呤基、喹啉基、異喹啉基、

啉基、呔

基、喹唑啉基、喹

啉基、喋啶基、咪唑并

唑基、咪唑并噻唑基、咪唑并咪唑基)；

(12)烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、異丙氧基、n-丁氧基、異丁氧基、sec-丁氧基、tert-丁氧基、n-戊氧基、異戊氧基、tert-戊氧基、新戊氧基、2-戊氧基、3-戊氧基、n-己氧基、2-己氧基)；

(13)烷硫基(例如，甲硫基、乙硫基、n-丙硫基、異丙硫基、sec-丁硫基、異丁硫基、sec-丁硫基、tert-丁硫基、n-戊硫基，異戊硫基、tert-戊硫基、新戊硫基、2-戊硫基、3-戊硫基、n-己硫基、2-己硫基)；

(14)以芳香基(與上述(10)同義)取代之烷氧基(與上述(12)同義)；

(15)以芳香基(與上述(10)同義)取代之烷硫基(與上述(13)同義)；

(16)以雜芳基(與上述(11)同義)取代之烷氧基(與上述(12)同義)；

(17)以雜芳基(與上述(11)同義)取代之烷硫基(與上述(13)同義)；

(18)環狀烷(在環中可以含有雜原子)氧基(例如，環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基、四氫呋喃氧基、四氫吡喃氧基、疊氮氧基、吖呾氧基、吡咯啶氧基、哌啶氧基、

啉氧基)；

(19)芳氧基(例如，芳香基(與上述(10)同義)與氧原子結合的基)；

(20)雜芳基氧基(例如，雜芳基(與上述(11)同義)與氧原子結合的基)；

(21)鹵烷氧基(例如，鹵烷基(與上述(8)同義)與氧原子結合的基)；

(22)鹵烷硫基(例如，鹵烷基(與上述(8)同義)與硫原子結合的基)；

(23)以羥基取代之烷氧基(與上述(12)同義)；

(24)以烷氧基(與上述(12)同義)取代之烷氧基(與上述(12)同義)；

(25)胺基；

(26)以烷基單或二取代之胺基

在此所謂「烷基」可舉例如C_1-6烷基，具體而言，可舉例如甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、tert-戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、n-己基、2-己基等；

(27)胺甲醯基；

(28)以烷基(與上述(26)之「烷基」同義)單或雙取代之胺甲醯基(例如，甲基胺甲醯基、乙基胺甲醯基、二甲基胺甲醯基、二乙基胺甲醯基、乙基甲基胺甲醯基)；

(29)胺磺醯基；

(30)以烷基(與上述(26)之「烷基」同義)單或二取代之胺磺醯基(例如，甲基胺磺醯基、乙基胺磺醯基、二甲基胺磺醯基、二乙基胺磺醯基、乙基甲基胺磺醯基)；

(31)烷醯基(例如，氫原子或烷基(與上述(26)之「烷基」同義)與碳原子結合之羰基)；

(32)芳醯基(例如，芳香基(與上述(10)同義)與碳原子結合之羰基)；

(33)以烷基磺醯胺基(例如，烷基(與上述(26)之「烷基」同義)取代之磺醯胺基)；

(34)芳香基磺醯胺基(例如，芳香基(與上述(10)同義)取代之磺醯胺基)；

(35)以雜芳基磺醯胺基(例如，雜芳基(與上述(11)同義)取代之磺醯胺基)；

(36)醯胺基(例如，以醯基取代之胺基)；

在此，所謂「醯基」係具有C_1-6烷基、或C_6-10芳香基之醯基。在此，所謂「C_1-6烷基」係上述「烷基」之中，碳數為1至6者，所謂「C_6-10芳香基」係上述「芳香基」之中，碳數為6至10者。醯基具體而言可舉例如，乙醯基、丙醯基、丁醯基、異丁醯基、戊醯基、異戊醯基、三甲基乙醯基、己醯基、丙烯醯基、甲基丙烯醯基、巴豆醯(crotonoyl)基、異巴豆醯基、苯甲醯基、萘甲醯基(naphthoyl)等；

(37)烷氧羰基胺基(例如，以烷氧基(與上述(12)同義)取代之羰基胺基)，

(38)烷基磺醯基(例如，以烷基(與上述(26)之「烷基」同義)取代之磺醯基)；

(39)烷基亞磺醯基(例如，以烷基(與上述(26)之「烷基」同義)取代之亞磺醯基基)；

(40)烷氧羰基(例如，甲氧羰基、乙氧羰基)；

(41)烷基(C_1-6烷基；可舉例如，甲基、乙基、n-丙基、異丙基、n-丁基、異丁基、sec-丁基、tert-丁基、n-戊基、異戊基、tert-戊基、新戊基、2-戊基、3-戊基、n-己基、2-己基等)等。

取代基有2個以上存在之情形，該等取代基可以相同亦可以相異。

由式(I)所示之化合物可以為鹽的形態。前述式(I)中所表示之化合物的鹽可舉例如，與鹽酸以及氫溴酸等無機酸的鹽，以及與乙酸、丙酸、酒石酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、蘋果酸、草酸、琥珀酸、檸檬酸以及安息香酸等有機酸的鹽。此等的鹽藉由本身公知的方法製造。

由式(I)所示之化合物，依照取代基的種類存在有具有E的立體配置之E體以及具有Z的立體配置之Z體的幾何異構物的情形。本發明係包含此等的E體、Z體或以任意的比例含有E體以及Z體之混合物者。

又，由式(I)所示之化合物存在有起因於1個或2個以上不對稱的碳原子存在之光學活性物質，惟由式(I)所示之化合物包含全部的光學活性物質或外消旋物。

[由式(I)所示之化合物的合成]

由式(I)所示之化合物如表示於下述式，將酮化合物和H₂NX-R₁(式中，X以及R₁為前述表示之意義，例如，醯肼化合物、胺甲醯肼化合物等)各個分別使用1當量，在甲苯、1,4-二

烷、N,N-二甲基甲醯胺、二甲基亞碸等溶劑中，以100℃以上的溫度範圍進行1小時至3日間的反應較佳。

[反應式1]

反應終了後的反應混合物係添加蒸餾水使其析出，或者，在不進行析出時係進行所謂有機溶劑抽出後濃縮的通常後處理，而能夠得到目的之特定化合物。又，在有精製的必要發生時，能夠藉由再結晶、管柱層析法、薄層層析法、液體層析法分取等任意的精製方法分離、精製。

[光學活性物質的取得]

藉由上述的方法所合成的化合物之中，關於具有光學異構物者可以存在有光學活性物質(eutomer)。光學活性物質的取得，可以藉由結晶化的方法，使用酵素反應的方法，或使用HPLC的方法(例如，手性色譜法)等使用本身公知的方法進行。又，也可以使用不對稱的合成法等調製光學活性物質。

1．細胞旁泌素因子產生促進用培養基添加劑

本發明係提供包含以下特定化合物或其鹽之細胞的旁泌素因子產生促進用培養基添加劑(以下有時稱作為「本發明之培養基添加劑」)。

本發明之培養基添加劑中所含有的化合物，係由式(I)所示之化合物或其鹽：

{式中，X為-NHCO-，

R₁為-Y-NH-Z-Ar(式中，Y以及Z為單鍵，或可以具有取代基之碳數1至6的伸烷基，Ar為可以具有取代基之芳香基或雜芳基。)，R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基，R3為羥基，n為0、1或2的整數。}(以下將「由式(I)所示之化合物或其鹽」簡單地通稱為「本發明中所使用之特定化合物」等)。

在一態樣中，Y為單鍵時，Z為可以具有取代基之伸烷基(再佳為不具有取代基之伸烷基，特佳為亞甲基)，Ar為可以具有取代基(再佳為鹵原子、甲基、羥基、或甲氧基)之芳香基(再佳為具有羥基之芳香基或不具有取代基之芳香基，特佳為具有苯基或羥基之苯基)，或可以具有取代基(再佳為鹵原子、甲基、羥基、或甲氧基)之雜芳基(再佳為可以具有取代基之吡啶基，特佳為不具有取代基之吡啶基或具有氟基之吡啶基)，R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基(再佳為不具有取代基之碳數1至6的烷基，特佳為乙基)，n為0、1或2的整數，較佳係n為0。

又，Y為可以具有取代基之碳數1至6的伸烷基時(再佳為不具有取代基之碳數1至6的伸烷基，特佳為亞甲基、亞乙基或亞丙基)，Z為單鍵，Ar為可以具有取代基之芳香基(再佳為具有取代基之芳香基，特佳為具有鹵基、甲基、羥基或乙氧基之苯基，或萘基)，或可以具有取代基之雜芳基(再佳為可以具有鹵基之雜芳基，特佳為不具有取代基之吡啶基或具有氟基之吡啶基)，R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基(再佳為不具有取代基之碳數1至6的烷基，特佳為甲基、乙基、或異丙基)，n為0、1或2的整數，較佳係n為0。

配合於本發明之培養基添加劑而在本發明中所使用之特定化合物的量，只要能夠得到所期望的效果即沒有特別限定，通常可以為0.01至100重量%，較佳為0.1至100重量%，再佳為1至100重量%，更佳為5至100重量%，特佳為10至100重量%。

本發明之培養基添加劑在提供時或保存時可以為任意的形狀。本發明之培養基添加劑可以為固形狀、液體狀、以及凝膠狀等形狀。

又，本發明之培養基添加劑可以視需要施行滅菌處理。滅菌方法並沒有特別限制，只要配合本發明之培養基添加劑的形狀進行適宜選擇即可。滅菌方法可舉例如，放射線滅菌、環氧乙烷氣體滅菌、熱壓鍋滅菌、過濾器滅菌等。進行過濾器滅菌(以下有時稱作為「過濾滅菌」)時過濾器部分的材質並沒有特別限制，可舉例如，玻璃纖維、尼龍、PES(聚醚碸)、親水性PVDF(聚偏二氟乙烯)、纖維素混合酯、纖維素乙酸酯、聚四氟乙烯等。過濾器之細孔的大小並沒有特別限制，較佳為0.1μm至10μm，再佳為0.1μm至1μm，最佳為0.1μm至0.5μm。

本發明之培養基添加劑中所謂「促進細胞之旁泌素因子的產生」，係意指提高細胞之旁泌素因子的產生能力，使該因子之往細胞外的分泌量增加。並且，在本說明書中，因本發明之培養基添加劑而增加的旁泌素因子的量，係意指與為對照組之指定的旁泌素因子的分泌量進行比較，蛋白質的產生/分泌量增大至少120%以上、至少130%以上、至少140%以上、至少150%以上、至少160%以上、至少170%以上、至少180%以上、至少190%以上、至少200%以上、至少300%以上、之至少400%以上、至少500%以上、至少600%以上、至少700%以上、至少800%以上、至少900%以上、至少1000%以上。分泌的蛋白質量的測定如以下的實施例中所說明，能夠使用ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)法或流式細胞儀(flow cytometer)法等本身公知的方法。

因本發明之培養基添加劑所促進產生之旁泌素因子，可舉例如，TSG-6(TNF-stimulated gene 6 protein)，以及STC-1(斯鈣素-1)等的抗炎症性蛋白質，以及ANG(血管生成素)、EGF(表皮生長因子)、MCP-1(單核細胞趨化蛋白-1)、ENA-78(上皮衍生嗜中性球活化肽(epithelial-derived neutrophil-activating peptide)78)、bFGF(鹼性纖維母細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor))、IL-6(介白素-6)、IL-8(介白素-8)、VEGF(血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor0)、VEGF-D(血管內皮生長因子-D-D)、TIMP(基質金屬蛋白酶組織抑制劑)、PDGF(血小板衍生生長因子)、TGF-β(乙型轉化生長因子r-β)等血管新生促進蛋白質，但不限定於此等。尤其，細胞為間葉系幹細胞時，能夠使TSG-6、STC-1ANG，以及MCP-1的產生/分泌量顯著地增加。

添加本發明之培養基添加物的培養基培養而得的細胞，只要能得到期望的效果即沒有特別限定，可以為源自哺乳動物的細胞。此種細胞可舉例如，構成生體的體細胞、正常細胞株、癌細胞株、前驅細胞、幹細胞、由生體分離且基因經人為地改變而成的細胞、由生體分離且核經人為地交換的細胞等細胞，但不限定於此等。並且，此等的細胞的來源也沒有特別限定，可舉例如，源自大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、倉鼠、鼷鼠、鴨嘴獸、海豚、鯨魚、犬、貓、山羊、牛、馬、羊、豬、象、狨(Common Marmoset)、松鼠猴(Saimiri)、恆河猴(Rhesus monkey)、黑猩猩(Chimpanzee)、人類等哺乳動物的細胞。又，此種細胞來源的組織或臟器也沒有特別限定，組織可舉例如，皮膚、腎臟、脾臟、副腎、肝臟、肺、卵巣、胰臟、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前列腺、精巢、胸腺、肌肉、結締組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臟、眼、腦或神經組織等組織，又，臟器可舉例如，肝臟、肺、腎臟、心臟、胰臟、胃、脾臟、小腸、大腸、生殖器等臟器。此外，本說明書中所謂「幹細胞」，係意指兼具複製自體本身的能力和分化為其他複數系統細胞的能力之細胞，作為該細胞的例子，並不限定於以下者，可舉例如，胚性幹細胞(ES細胞)、胚性腫瘤細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、神經幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、胰幹細胞、肌肉幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛囊幹細胞等。前述幹細胞之中，作為多能性幹細胞可舉例如，ES細胞、胚性生殖幹細胞、iPS細胞。前驅細胞係位於由前述幹細胞分化為特定的體細胞或生殖細胞之途中的階段的細胞。在較佳一態樣中，細胞係人類間葉系幹細胞(hMSC)。

本發明之培養基添加劑添加至培養基的較佳添加量，只要能得到本發明所期望的效果即沒有特別限制，例如，能夠以本發明中所使用的特定化合物在培養基中的濃度通常成為0.001至100μM(較佳為0.01M至50μM，再佳為0.1至30μM，更佳為1至20μM，特佳為5至10μM)的方式將本發明之培養基添加劑添加至培養基中。

得以適用本發明之培養基添加劑的培養基並沒有特別限定，藉由添加至市售的培養基也能夠得到本發明之培養基添加劑之所期望的效果。作為適宜的市售培養基可舉例如：杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、哈姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培養基，麥考伊5A培養基(McCoy’s 5A medium)、伊格爾MEM(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM(alpha Modified Eagle’s Minimum Essential Medium；αMEM)、MEM(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培養基、伊斯科夫改良杜爾貝科培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、MCDB131培養基、威廉培養基E、IPL41培養基、費歇爾培養基(Fischer’s Medium)、StemPro34(Thermo Fisher scientific公司製)、X-VIVO 10(Cambrex公司製)、X-VIVO 15(Cambrex公司製)、HPGM(Cambrex公司製)、StemSpan H3000(STEMCELL Technologies公司製)、StemSpanSFEM(STEMCELL Technologies公司製)、StemlineII(Sigma-Aldrich公司製)、QBSF-60(Quality Biological公司製)、StemProhESCSFM(Thermo Fisher scientific 公司製)、Essential8(註冊商標)培養基(Gibco公司製)、mTeSR1或mTeSR2培養基(STEMCELL Technologies公司製)、TeSR-E8培養基(STEMCELL Technologies公司製)、ReproFF或ReproFF2(REPROCELL公司製)、Primate ES Cell Medium(REPROCELL公司製)、PSGro hESC/iPSC培養基(System Biosciences公司製)、NutriStem(註冊商標)培養基(Biological Industries公司製)、StemFit(註冊商標)培養基(Ajinomoto公司製)、CSTI-7培養基(細胞科學研究所公司製)、MesenPRO RS培養基(Gibco公司製)、MF-Medium(註冊商標)間葉系幹細胞增殖培養基(東洋紡股份有限公司製)、間葉系幹細胞用培養基(PromoCell公司製)、間葉系幹細胞用培養基2(PromoCell公司製)、MSCGM(Lonza公司製)、MesenCult XF(STEMCELL Technologies公司製)、StemPro MSC XF(Thermo Fisher scientific公司製)、Sf-900II(Thermo Fisher scientific公司製)、Opti-Pro(Thermo Fisher scientific公司製)等培養基，但不限定於此等。

又，能夠適宜在上述的培養基中更添加鈉、鉀、鈣、鎂、磷、氯、各種胺基酸、各種維他命、抗生素、血清、脂肪酸、糖、細胞增殖因子、分化誘導因子、細胞接著因子、抗體、酵素、細胞介素(cytokine)、荷爾蒙、凝集素、細胞外基質、生理活性物質等物質。作為具體的例子可舉例如，TNF(Tumor Necrosis Factor)α、LPS(脂多醣(lipopolysaccharide))、BMP2(Bone Morphogenetic Protein 2)等。

細胞培養條件(例如，溫度、二氧化碳濃度、培養期間等)使用本身公知的條件即可，或者也可以視目的需要做適宜的改變。例如，培養細胞時的溫度通常為25至39℃，較佳為33至39℃(例如，37℃)。培養的氣體環境中二氧化碳濃度通常為4至10體積%，較佳為4至6體積%。培養期間通常為1至35日間，但亦可配合培養的目的進行適宜設定。

將本發明之培養基添加劑添加至三維細胞培養培養基後，能夠得到更顯著的旁泌素產生促進效果。本說明書中所謂三維細胞培養(3D細胞培養)，係意指使用例如，包埋培養法、微載體(Microcarrier)培養法、球狀細胞塊(sphere)培養法、懸滴(Hanging drop)培養法等將細胞在三維的環境中培養。包埋培養係使細胞埋入Matrigel(註冊商標)、Geltrex(註冊商標)、瓊脂、甲基纖維素、膠原蛋白、明膠、纖維蛋白(fibrin)、瓊脂糖(agarose)、海藻酸鹽(alginate)等固形或半固體的凝膠基材中使其固定的培養方法。微載體(Microcarrier)培養法係使細胞在較水稍微重的微粒子(以下也稱為「微載體(Microcarrier)」)的表面上單層地增殖，將該微粒子在燒瓶等培養容器內攪拌，在浮遊狀態下進行的培養者。球狀細胞塊(sphere)培養法係使目的的細胞由數十至數百個所形成的凝集塊(以下也稱為「球狀細胞塊(sphere)或球狀體(spheroid)」)形成後，將該凝集塊在培養基中靜置或進行振盪而培養的方法。懸滴(Hanging drop)培養法可舉例如，將細胞懸濁液的液滴(容量為10至50μL左右)點著在培養容器的蓋等頂面，使承載的液滴如懸吊地在顛倒的狀態下培養的方法。由於如此的培養，細胞受到因與平面接觸所得的影響為最小，因而在液滴的下部形成球狀細胞塊(sphere)。如此的液滴也可以使用GravityPLUS Plate(PerkinElmer公司製)狀的特殊培養容器調製。又，作為能夠適用本發明之培養基添加劑的三維細胞培養(三維細胞培養)，也能夠使用藉由使玻尿酸，去醯化結蘭膠，黃原膠等多糖類或此等的衍生物在培養基中分散，使不定形狀的三維網絡形成，將其作為支架而藉由將接著性細胞在培養基中維持在浮遊的狀態，以更接近於生體內的三維的狀態中培養細胞的手法。此時，三維細胞培養中的細胞，由於在該三維網絡中被束縛而不沈殿，因此不需要振盪、旋轉操作等而能夠進行培養。三維細胞培養能夠藉由本身公知的方法實施(例如參照：WO2014/017513)。

細胞的培養能夠使用細胞培養中一般所使用的培養皿(schale)、燒瓶、塑膠袋(plastic bag)、鐵氟龍(teflon)(註冊商標)袋、培養碟(dish)、培養皿(petri dish)、組織培養用培養皿，多孔盤(multidish)、微盤(microplate)、微孔盤(microwell plate)、多盤(multiplate)、多孔盤(multiwell plate)、細胞培養玻片(chamber slide)、試管(tube)、吊盤(tray)、培養袋、滾筒瓶(roller bottle)等的培養容器而實施。在一態樣中，也可以使用該培養容器的表面係用以提升與細胞的接著性之目的而經人工地處理(例如，用細胞外基質等的塗佈處理)者作為培養容器。作為此種容器可舉例如，經塗佈Matrigel(註冊商標)、Geltrex(註冊商標)、膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、板素(Laminin)、纖網蛋白(fibronectin)、玻連蛋白(Vitronectin)、肌腱蛋白(Tenascin)、選滯蛋白(Selectin)、玻尿酸、纖維蛋白(Fibrin)等的容器，但不僅限定於此等。又，亦可以使用針對細胞的培養器材而用以阻礙接著的塗佈材料。作為如此的塗佈材料可舉例如，水凝膠(Hydrogel)、prevelex(註冊商標)、矽、聚(2-羥基甲基甲基丙烯酸)、聚(2-甲基丙烯醯氧基乙基磷酸膽鹼)等，但並不限定於此等。

細胞的培養可以在機械的控制下進行，也可以在閉鎖環境下自動地實行細胞播種、培養基交換、細胞影像取得、培養細胞回收，並一邊控制pH、溫度、氧濃度等的同時，藉由能夠高密度培養的生物反應器(bioreactor)或自動培養裝置進行。使用此等裝置在培養的途中補給新的培養基且需求物質在沒有過與不足地供給予細胞以及/或組織的手法中，包含饋料批式培養(fed-batch culture)、連續培養、灌流培養，但不限定於此等。

2．細胞培養用培養基

另外，本發明提供含有本發明培養基添加劑之細胞培養培養基(以下有時稱作為「本發明之培養基」)。

本發明之培養基係藉由在細胞培養用培養基中添加本發明之培養基添加劑而調製。能夠使用於調製本發明培養基之細胞培養用培養基包含在「1．細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑」中所例示的市售培養基，但不限定於此等。本發明之培養基添加劑中所含有使用於本發明之特定化合物的濃度也能夠與在「1．細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑」中所說明者同樣處理。

在較佳的一態樣中，本發明之培養基可以是能夠三維細胞培養之細胞培養培養基。

3．旁泌素因子的產生經促進之細胞的生產方法

此外，本發明提供旁泌素因子的產生經促進的細胞的生產方法(以下有時稱作為「本發明之生產方法」)，其包含在含有本發明中所使用之特定化合物之培養基中培養細胞。

本發明之生產方法中，使用於本發明之特定化合物、該培養基中的濃度、能夠使用的培養基、能夠培養的細胞種類、培養條件等，能夠與在「1．細胞的旁泌素因子產生促進用培養基添加劑」中所說明者同樣處理。又，使用於本發明之生產方法之培養基，可以使用上述之本發明之培養基。

在本發明之生產方法的一態樣中，細胞的培養可以使用三維細胞培養法進行。藉由在三維細胞培養法中培養，能夠更顯著地促進旁泌素因子的生產。關於三維細胞培養法係如上所述。

4．生體移植用組成物

此外，本發明提供生體移植用組成物(以下有時稱作為「本發明之組成物」)，其包含藉由本發明之生產方法所生產的細胞。

本發明之組成物所移植之組織，視所含有的細胞種類決定即可。例如，主要含有間葉系幹細胞的情形，能夠適合使用於由間葉系細胞所構成的組織之骨組織、軟骨組織、脂肪組織，以及血管組織等的修復乃至再生，但不限定於此等。

本發明之組成物中所含有細胞的含有量沒有特別限定，視適用的部位，適用目的，途徑等為適宜決定即可。

本發明之組成物除了以本發明之方法所生產的細胞之外，也可以含有藥學上能夠許容的醫藥品添加物。醫藥品添加物可舉例如，等張化劑、緩衝劑、pH調整劑、安定化劑、螫合劑、防腐劑等，但不限定於此等。

等張化劑能夠例示如，氯化鈉、氯化鉀、糖類、甘油等。緩衝劑能夠例示如，硼酸、磷酸、乙酸、檸檬酸，以及該等所對應的鹽(例如該等的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽等鹼金屬鹽或鹼土類金屬鹽)等。pH調整劑能夠例示如，鹽酸、硫酸、磷酸、多磷酸(polyphosphoric acid)、硼酸、或硼砂等無機酸類；乙酸、丙酸、草酸、葡萄糖酸、反丁烯二酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、蘋果酸等有機酸類；氫氧化鉀，或氫氧化鈉等無機鹼；單乙醇胺、三乙醇胺、二異丙醇胺，或三異丙醇胺等有機鹼；乙酸銨、乳酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫銨、磷酸二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、乳酸鈣等。安定化劑能夠例示如，人類血清白蛋白或通常的L-胺基酸、糖類、纖維素衍生物等，此等能夠單獨使用或與界面活性劑等組合使用。上述L-胺基酸可以為甘胺酸、半胱胺酸、穀胺酸等的任一個，但不限定於此等。糖類可以為葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等單糖類，甘露醇、肌醇、木醣醇等糖醇，蔗糖、麥芽糖、乳糖等二糖類，聚葡萄糖、羥丙基澱粉、硫酸軟骨素、玻尿酸等多糖類等，以及該等的衍生物等的任一個，但並非限定於該等者。纖維素衍生物可以為甲基纖維素、乙基纖維素、羥基乙基纖維素、羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧基甲基纖維素鈉等的任一個，但不限定於此等。螫合劑能夠例示如，依地酸鈉(edetate sodium)、檸檬酸等。

本發明之組成物的形狀只要為能夠移植至生體的形狀即沒有特別限定，可例示如，細胞與適當的分散媒所形成的液體狀，或使細胞固著於適切的生體適合性材料上的板狀等形狀。

本發明之組成物中所含有藉由本發明之方法所生產的細胞，如上所述，旁泌素因子的生產/分泌受到促進。例如，藉由本發明之方法所生產的間葉系幹細胞與未經由本發明中所使用之特定化合物進行處理之間葉系幹細胞比較，具有較高的抗炎症效果以及血管新生促進效果。因此，藉由含有如此的間葉系幹細胞作為成分之本發明之組成物移植至生體，可認為期待適用部位具有更高的再生效果。

5．炎症性疾病(inflammatory disease)或缺血性疾病(ischemic disease)治療用組成物

又，本發明提供炎症性疾病或缺血性疾病的治療用組成物(以下有時稱作為「本發明之治療用組成物」)，其包含藉由本發明之生產方法所生產的間葉系幹細胞。能夠藉由將本發明之治療用組成物投與於罹患炎症性疾病或缺血性疾病的對象而治療疾患。

將本發明之治療組成物投與於對象的方法只要能夠得到所期望的效果即沒有特別限定，由非常簡便的觀點而言，血中內投與較佳。又，尤其認為是位在治療對象的重症部位的情形等，也能夠直接將本發明之治療用組成物移植至該部位。

本發明之治療用組成物中所含有之間葉系幹細胞，只要為藉由本發明之方法所生產之間葉系幹細胞即可。

本發明之治療用組成物中所含有之間葉系幹細胞的含有量，只要為治療有效量即沒有特別限定，考量組成物的形狀等為適宜決定即可。

作為本發明之治療用組成物的形狀，只要為能夠非經口投與於對象的形狀即沒有特別限定，例如，能夠為細胞與適當的分散媒所形成的液體狀。又，在將本發明之治療用組成物直接移植至重症部位的情形等，也能夠將本發明之治療用組成物的形狀處理成在生體適合性材料上使間葉系幹細胞固著的板狀。

將本發明之治療用組成物投與至對象的量沒有特別限定，只要為治療有效量任何的量均可以。治療有效量能夠在考慮到疾患的程度、對象的年齢或體重、投與方法、投與次數、本發明之治療組成物的形狀等之上為適宜決定。

本發明之治療用組成物除了以本發明之方法所生產之間葉系幹細胞之外，也可以含有藥學上能夠許容的醫藥品添加物。醫藥品添加物可舉如，等張化劑、緩衝劑、pH調整劑、安定化劑、螫合劑、防腐劑等，但不限定於此等。醫藥品添加物的具體例與在「4．生體移植用組成物」中所述者相同。

作為適合使用本發明之治療用組成物之疾患可舉例如，炎症性疾病以及缺血性疾病。

作為本發明之治療用組成物所能夠適用之炎症性疾病可舉例如，炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、克隆氏病(Crohn’s disease)、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、腎絲球腎炎、IgA腎病、糖尿病性腎病、膜性腎病、水腎(hydronephrosis)、造影劑腎病、腎盂腎炎、腎衰竭、間質性腎炎、腎損傷、腎病症候群、高血壓性腎硬化症、糖尿病性腎絲球硬化症、腎結石、類澱粉腎、腎靜脈血栓症、Alport症候群、肝炎、肝硬化、胰臟炎、肺炎、鼻竇炎(sinusitis)、鼻炎、關節炎、變形性膝關節病、變形性手關節病、變形性足關節病、變形性股關節病、風濕性關節炎、[周期性發熱(Periodic fever)、口瘡口炎、咽炎、淋巴結炎症候群(PFAPA syndrome)][PFAPA]、成年發病型Still氏病(adult-onset Still’s disease)、貝西氏病(Behcet`s Disease)、痛風、假性痛風(pseudogout)、Schnitzler氏症候群、慢性婦發性多發性骨髓炎(CRMO)、Cryopyrin相關周期熱症候群(CAPS)、家族性寒冷蕁麻疹、Muckle-Wells症候群、慢性嬰幼兒神經皮膚關節炎症候群(chronic infantile neurologic cutaneous,and articular syndrome：CINCA症候群)(CINCA症候群)/新生兒發症多臟器炎症疾患(NOMID)、TNF(腫瘤壞死因子)受體相關周期性症候群(TRAPS)、高IgD症候群(甲羥戊酸激酶缺損症)、Blau症候群/幼發性類肉瘤病、家族性地中海熱、PAPA(化膿性關節炎/壞疽性膿皮症(pyoderma gangrenosum)/座瘡)症候群、中條-西村症候群、Majeed症候群、NLRP12相關周期熱症候群(NAPS12)、介白素1受體拮抗因子缺損症(DIRA)、介白素36受體拮抗因子缺損症(DITRA)、磷脂酶(phospholipase)Cγ2相關抗體缺乏/免疫異常症(PLAID)、HOIL-1缺損症、SLC29A3缺損症、CARD14異常症、ADA2(腺核苷去胺酶(adenosine deaminase)2)缺損症、嬰兒期發症的STING-相關血管病(STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy(SAVI))以及NLRC4異常症等，但不限定於此等。

又，作為本發明之治療用組成物所能夠適用之缺血性疾病可舉例如，狹心症、心肌梗塞、章魚壺心肌症(Takotsubo Cardiomyopathy)、中樞性肺水腫、腦梗塞、缺血性腦中風、閉塞性動脈硬化症、危急性肢體缺血(critical limb ischemia：CLI)等，但不限定於此等。

6．炎症性疾病或缺血性疾病治療用組成物

又，本發明之旁泌素因子的生產方法包含下列步驟，(以下有時稱作為「本發明之旁泌素因子的生產方法」)：

(1)本發明之培養基中培養細胞的步驟，以及

(2)將在(1)中所使用的培養基之上清回收的步驟。

本發明之旁泌素因子的生產方法之步驟(1)中所使用之細胞為可以產生/分泌旁泌素因子的任何細胞，可舉例如，在「1．細胞的旁泌素因子產生促進用培養基添加劑」中所說明者。在較佳一態樣中，細胞為間葉系幹細胞。

細胞培養的條件沒有特別限定，只要為維持/增殖培養的細胞之任何條件均可。適合的細胞培養條件，只要為本領域中之通常知識者即能夠使用公知的方法而容易地決定。在較佳一態樣中，細胞係藉由三維培養而培養。

細胞的培養可以在機械的控制下進行，也可以在閉鎖環境下自動地實行細胞播種、培養基交換、細胞影像取得、培養細胞回收，並一邊控制pH、溫度、氧濃度等的同時，藉由能夠高密度培養的生物反應器(bioreactor)或自動培養裝置進行。使用此等裝置在培養的途中補給新的培養基且需求物質在沒有過與不足地供給予細胞的手法中，包含饋料批式培養(fed-batch culture)、連續培養、灌流培養，但不限定於此等。

藉由使用本發明之培養基培養細胞而該細胞有效率地產生旁泌素因子，其結果，產生的旁泌素因子大量地分泌於培養基中。接著，藉由回收該培養基之上清，能夠將大量地產生/分泌的旁泌素因子回收。

本發明之旁泌素因子的生產方法之步驟(2)中上清的回收方法也沒有特別限制，使用公知的上清回收方法即可。例如，能夠將含有培養後細胞的培養基進行離心分離，使細胞沈殿後，使用吸量管等將上清回收，但不限定於此。

將經沈殿的細胞再度進行步驟(1)的培養，藉由重複進行本發明之旁泌素因子的生產方法，能夠進一步將大量的旁泌素因子回收。

在以下的實施例中更加具體地說明本發明，但本發明並不受該等例之任何限定。

[實施例]

[化合物之合成例]

關於本說明書之2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮(有時稱作為「k-1」)的「酮」能夠藉由本身公知的方法合成(Sum TH et al.,Tetrahedron.2015 Jul 1；71(26-27)：4557-4564.)。又，2-(苯基胺基)乙醯肼(有時稱作為「H-1」)的「肼(hydrazine)」也能夠藉由本身公知的方法合成(Samal RP et al.,Chem Biol Drug Des.2013 Jun；81(6)：715-29.)。

[合成例1]k-1：B-1的合成法

使2-溴丙酸甲酯(109)(500mg、3.0mmol)溶解於DMSO(6mL)，添加苯胺(0.36mL、3.9mmol)、碳酸鉀(0.54g、3.9mmol)並在室溫攪拌21小時。接著添加乙酸乙酯(30mL)、水(50mL)而分液，再將有機層用飽和食鹽水(30mL)洗淨並用無水硫酸鈉乾燥。將過濾、減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g、乙酸乙酯/己烷=2/98至15/85)精製，得到為淡黃色液體之N-苯丙胺酸甲酯(110)(343mg、1.91mmol、回收率64%)。

使如上述進行所得到之110(340mg、1.9mmol)溶解於甲醇(3.8mL)，添加肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)並在60℃攪拌24小時。追加肼一水合物(0.36mL、7.4mmol)並在60℃進一步攪拌17小時。將反應溶液在減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(胺矽膠10g、乙酸乙酯/二氯甲烷=0/100至20/80)精製，得到為無色固體之2-(苯基胺基)丙烷醯肼(111)(321mg、1.79mmol、回收率94%)。

使如上述進行所得到之111(168mg、0.937mmol)、2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮(k-1)(130mg、0.72mmol)溶解於DMSO(1.4mL)並在100℃攪拌19小時。放冷後，添加蒸餾水(15mL)，濾取析出的固體，將乾燥所得到的黃色固體用二氯甲烷懸濁洗淨後在減壓下乾燥，得到為淡黃色固體之k-1：B-1(173mg、0.507mmol、回收率70%)。

[合成例2]k-1：D-1的合成法

使3-苯甲氧基苯胺(129)(2.44g、12.2mmol)溶解於DMF(24mL)，添加乙酸鈉(1.10g、13.5mmol)、溴乙酸乙酯(128)(1.49mL、13.5mmol)並在室溫攪拌4小時。接著添加水(300mL)、乙酸乙酯(150mL)而分液，再將有機層用飽和食鹽水(100mL)洗淨。將用無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(矽膠50g、乙酸乙酯/己烷=2/98至10/90)精製，得到為淡黃色固體之N-(3-苯甲氧基苯基)甘胺酸乙酯(130)(2.82g、9.88mmol、回收率81%)。

使如上述進行所得到之130(1.0g、3.5mmol)懸濁於甲醇(18mL)，添加10% Pd/C(0.1g)並在氫氣體環境下在室溫攪拌5小時。將反應溶液用矽藻土過濾，再將濾液在減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g，乙酸乙酯/己烷=3/97至35/65)精製，得到為淡黃色液體之N-(3-羥基苯基)甘胺酸乙酯(131)(295mg、1.51mmol、回收率43%)。

使如上述進行所得到之131(0.29g、1.5mmol)溶解於乙醇(3.5mL)，添加肼一水合物(0.32mL、6.5mmol)並在60℃攪拌18小時。將反應溶液在減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(胺矽膠10g、甲醇/二氯甲烷=1/99至10/90)精製。將所得到之固體用IPE懸濁洗淨後在減壓下乾燥，得到為淡黃色固體之2-[(3-羥基苯基)胺基]乙醯肼(132)(239mg、1.32mmol、回收率88%)。

使如上述進行所得到之132(130mg、0.72mmol)、2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮(k-1)(100mg、0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)並在100℃攪拌21小時。放冷後，將反應溶液直接用中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g、乙酸乙酯/二氯甲烷=5/95至50/50)精製。將所得到之固體用水以及IPE懸濁洗淨後在減壓下乾燥，得到為無色固體之k-1：D-1(95.9mg、0.279mmol、回收率51%)。

[合成例3]k-1：J-1的合成法

在冰冷的THF(10mL)中依順次添加氫化鋁(1.0g、26mmol)、3-氰基苯酚(148)(0.63g、5.3mmol)，且分別在室溫攪拌1.5小時和在60℃攪拌3.5小時。放冷後，追加氫化鋁(1.0g、26mmol)、THF(10mL)並在60℃進一步攪拌16小時。將反應溶液冰凍冷卻，依順次添加水(1.5mL)、15%氫氧化鈉水溶液(1.5mL)、水(4.5mL)並在室溫攪拌3小時。將懸濁溶液用矽藻土過濾，再將濾液在減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(胺矽膠10g、甲醇/二氯甲烷=0/100至8/92)精製。將所得到之固體用IPE懸濁洗淨後在減壓下乾燥，得到為無色固體之3-(胺基甲基)苯酚(149)(477mg、3.87mmol、回收率73%)。

使如上述進行所得到之149(200mg、1.6mmol)溶解於二氯甲烷(2mL)、水(2mL)，添加碳酸氫鈉(0.27g、3.2mmol)並在冰冷的狀態下緩慢滴入氯甲酸苯基酯(136)(0.22mL、1.7mmol)。在室溫攪拌20小時後，接著添加乙酸乙酯(20mL)、水(20mL)而分液。將有機層用飽和食鹽水(20mL)洗淨，再將用無水硫酸鎂乾燥、過濾、減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g、乙酸乙酯/己烷=5/95至35/65)精製，得到為無色液體之(3-羥基苯)胺甲酸苯甲基酯(carbamate)(150)(369mg、1.52mmol、回收率95%)。

使如上述進行所得到之150(365mg、1.50mmol)懸濁於乙腈(3.8mL)，添加肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)並在室溫攪拌2.5小時，追加肼一水合物(0.18mL、3.8mmol)並在55℃進一步攪拌20小時。將反應溶液在減壓下濃縮所得到之固體用IPE/二氯甲烷(3/1)懸濁洗淨後在減壓下乾燥，得到為無色固體之N-(3-羥基苯甲基)肼羧基醯胺(151)(233mg、1.29mmol、回收率86%)。

使如上述進行所得到之151(130mg、0.72mmol)、2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮(k-1)(100mg、0.55mmol)溶解於DMSO(1.1mL)並在100℃攪拌15小時。放冷後，將反應溶液直接用中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g、乙酸乙酯/二氯甲烷=10/90至55/45)精製。添加水至所得到之精製物而將析出之固體濾取後在減壓下乾燥，得到為無色固體之k-1：J-1(102mg、0.297mmol、回收率54%)。

[合成例4]k-1：H-1的合成法

使k-1(100mg、0.555mmol)、H-1(110mg、0.666mmol)溶解於DMSO(1.1mL)並在100℃攪拌14小時。放冷後，添加蒸餾水(11mL)，再度在100 ℃攪拌後，進行熱時過濾而得到為淡黃色固體之k-1：H-1(70.1mg、0.214mmol、回收率39%)。

[合成例5]GA-002A的合成法

將在前述的合成例1中所合成之k-1：B-1(外消旋物)依照下述分餾條件用Waters公司製超臨界流體層析法(SFC)進行光學分割，取得以下2個之鏡相異構物。兩鏡相異構物之比旋光度，係使用旋光度計P-1020(日本分光公司製)而進行測定。又，鏡相異構物之立體配置(R體、S體)，係藉由X射線結晶構造解析而決定。

化合物GA-002A(k-1：B-1之左旋性鏡相異構物)；保持時間11.95分、分取量475.1mg、光學純度99.9ee%、純度99.0%、比旋光度[α]2二維-10.5(c=0.1019、乙醇)、立體配置R體

<分取條件>

管柱：CHIRALPAK IA<Daicel公司製、20＊250mm、5μm>、弱溶劑：CO₂(70%)，強溶劑：MeOH(30%)、管柱溫度：40℃、總進料量：1g、流速：15mL/分

[合成例6]GA-005A的合成法

(式中，Bn係表示苯甲基)

使D-丙胺酸甲基鹽酸鹽(157)(1.40g、10.0mmol)、3-苯甲氧基苯基硼酸(158)(3.43g、15.1mmol)、乙酸銅(II)一水合物(3.00g、15.1mmol)、分子篩(molecular sieve)4A(MS4A；20g)溶解於二氯甲烷(200mL)，添加三乙胺(4.17mL、30.1mmol)並在氧氣體環境下在室溫攪拌23小時。將反應溶液用矽藻土過濾，再將濾液在減壓下濃縮至半量為止，接著添加飽和碳酸氫鈉水溶液(50mL)而分液。將有機層用飽和食鹽水(20mL)洗淨，再將用無水硫酸鈉乾燥、過濾、減壓下濃縮。所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g、乙酸乙酯/己烷=1/99至10/90)精製，得到為黃色液體之159(595mg、2.09mmol、回收率21%)。

(式中，Bn係表示苯甲基)

使如上述進行所得到之159(595mg、2.09mmol)溶解於甲醇(21mL)，添加鈀碳乙二胺複合體(241mg)並在氫氣體環境下在室溫攪拌3.5小時。濾別鈀碳，將濾液在減壓下濃縮所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(矽膠30g、乙酸乙酯/己烷=10/90至30/70)精製，得到為黃色液體之160(413mg、2.12mmol，quant.)。

使如上述進行所得到之160(413mg、2.12mmol)溶解於甲醇(4.2mL)，添加水合肼(1.0mL、21mmol)並在60℃攪拌3.5小時。將反應溶液在減壓下濃縮，將甲苯共沸所得到之殘渣用中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g、甲醇/二氯甲烷=1/99至10/90)精製，得到為褐色非晶形之161(391mg、2.00mmol、回收率95%)。

使如上述進行所得到之161(72mg、0.37mmol)、2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮(100)(60mg、0.33mmol)溶解於DMSO(0.67mL)並在100℃攪拌3日。放冷後，將反應溶液直接用中壓矽膠管柱層析法(矽膠10g、乙酸乙酯/二氯甲烷=5/95至50/50)精製，將所得到之精製物用蒸餾水、異丙醇(IPA)/己烷、蒸餾水依序懸濁洗淨，得到為淡茶色固體之GA-005A(ZX-01-R(40.5mg、0.113mmol、回收率34%))。比旋光度係使用旋光度計P-1020(日本分光公司製)而進行測定。

1H-NMR(270MHz)；；δ13.65(s,1H),10.75(s,1H),9.70(s,1H),8.97(s,1H),7.25(d,J=8.1Hz,1H),6.83(t,J=8.1Hz,1H),6.39(d,J=8.1Hz,1H),6.15-5.95(m,3H),5.81(d,J=8.1Hz,1H),4.18(m,1H), 2.78(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.37(d,J=8.1Hz,3H),1.03(t,J=8.1Hz,3H).

化合物GA-005A；光學純度99.9ee%、純度99.2%、比旋光度[α]2二維-11.4(c=0.0264、乙醇)、立體配置R體

[合成例7]A-004的合成法

藉由依照合成例1的方法由2-(吡啶-3-胺基)丙烷醯肼135mg以及2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮135mg合成A-004 81.6mg。

[合成例8]A-004A的合成法

使用Waters公司製超臨界流體層析法(SFC)進行光學分割A-004，得到6.6mg之A-004A。

〔光學分割條件〕

管柱：CHIRALPAK IA-3(20×250mm,5μm；Daicel公司製)

移動相：CO2：MeOH=60：40(體積比)

管柱溫度：40℃

流速：15mL/分

在上述條件中A-004A(光學純度99.9ee%)的保持時間為8.14分。

[合成例9]A-007的合成法

藉由依照合成例1的方法由2-(吡啶-3-胺基-5-氟)丙烷醯肼143mg以及2’,4’-二羥基-3’-甲基苯丙酮100mg合成A-007 94.4mg。

由式(I)所示之化合物，能夠依照前述的合成例1至9合成。藉由前述的合成例所合成之由式(I)所示之化合物的例子表示於表1至表3中，但本發明中所使用之特定化合物並非僅只限定於此等者。

表中，「Me」之記載係表示甲基，以下各自同樣地，「Et」之記載係表示乙基，「n-Pr」以及「Pr-n」之記載係表示正丙基，「i-Bu」之記載係表示異丁基。又，R₅為芳香基之取代基，與前述者相同。此外，在(R₃)_n以及(R₅)_m中「-」之記載係表示無取代。構造式中所記載之編號係表示(R₃)_n或(R₅)_m的取代位置。n為0、1或2的整數，m為0、1、2、3、4或5的整數。R₅為複數存在時，R₅各別可以相同也可以相異。

[表1]

[表1]

[表2]

[表2]

[表3]

[表3]

由式(I)所示之化合物之中，將表1至表3所述之化合物的¹H-NMR數據表示如下(GA-005A的NMR數據由於已於上述因此以下省略)。

將重二甲基亞碸的值設定為2.49ppm，用270MHz或400MHz，測定在重二甲基亞碸中之質子核磁共振化學位移(chemical shift)值。並且，表中之記號係表示下述之意思。s：單峰(singlet)，brs：寬單峰(broad singlet)，d：雙峰(doublet)，dd：雙雙峰(double doublet)，t：三峰(triplet)，q：四峰(quartet)，m：多峰(multiplet)。

k-1：B-1；400MHz δ10.82(s,1H),9.71(s,1H),7.25(d,J=8.0Hz,1H),7.07(t,J=8.0Hz,2H),6.63(d,J=8.0Hz,2H),6.56(t,J=8.0Hz,1H),6.39(d,J=8.0Hz,1H),5.93(d,J=12Hz,1H),4.28(m,1H),2.80(q,J=8.0Hz,2H),1.95(s,3H),1.40(d,J=8.0Hz,3H)1.03(t,J=8.0Hz,3H).(未觀測到NH的一個訊號。)

k-1：D-1；270MHz δ 13.66(s,1H),10.76(s,1H),9.70(s,1H),8.98(s,1H),7.25(d,J=10.8Hz,1H),6.86(t,J=10.8Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.20-5.95(m,3H),5.87(t,J=5.4Hz,NH),3.88(d,J=5.4Hz,2H),2.78(q,J=8.0Hz,2H),1.97(s,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).

k-1：J-1；270MHz δ13.45(br,1H),9.57(s,1H),9.53(s,1H),9.36(s,1H),7.17(d,J=8.1Hz,1H),7.11(d,J=8.1Hz,1H),6.80-6.70(m,3H),6.64(br,NH),6.37(d,J=8.1Hz,1H),4.25(d,J=5.4Hz,2H),2.65(q,J=8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.08(t,J=8.1Hz,3H).

k-1：H-1；270MHz δ13.98(s,1H),11.13(s,1H),10.01(s,1H),7.58(d,J=8.1Hz,1H),7.41(t,J=8.1Hz,2H),6.95(d,J=8.1Hz,2H),6.89(t,J=8.1Hz,1H),6.72(d, J=8.1Hz,1H),6.29(t,J=8.1Hz,NH),4.27(d,J=8.1Hz,2H),3.11(q,J=8.1Hz,2H),2.29(s,3H),1.37(t,J=8.1Hz,3H).

A-004；270MHz δ13.63(s,1H),10.91(s,1H),9.71(s,1H),8.02(d,J=2.7Hz,1H),,7.79(d,J=5.4Hz,1H),7.26(d,J=8.1Hz,1H),7.08(t,J=8.1Hz,1H),6.94(d,J=8.1Hz,1H),6.40(d,J=8.1Hz,1H),6.23(d,J=8.1Hz,1H),4.33(m,J=8.1Hz,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.42(d,J=8.1Hz,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).

A-007；270MHz δ13.61(s,1H),10.97(s,1H),9.73(s,1H),7.89(brs,1H),7.71(brs,1H),7.26(d,J=8.1Hz,1H),6.98(d,J=8.1Hz,1H),6.79(d,J=13.5Hz,1H),6.69(d,J=8.1Hz,1H),6.38(d,J=8.1Hz,1H),4.34(m,1H),2.82(q,J=8.1Hz,2H),1.93(s,3H),1.40(d,J=8.1Hz,3H),1.05(t,J=8.1Hz,3H).

[實施例1]旁泌素因子放出量試驗1

(培養上清的回收)

將源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC，Promocell公司製)，藉由使用間葉系幹細胞增殖培養基2(Promocell公司製)單層培養法(2D)進行前培養。將hMSC懸濁於相同培養基後，在三維培養法(3D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在底面具有凹陷部的細胞非接著性6孔EZSPHERE盤(AGC Techno Glass公司製，# 4810-900)中。在二維培養法(2D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在6孔平底盤(Corning公司製，# 3516)中。接著，使終濃度成為5μM的方式添加2μL/孔溶解於DMSO之化合物k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養48小時。添加DMSO使終濃度成為0.05%的方式作為對照組。48小時後，交換為不含有化合物之培養基，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養，48小時後回收培養上清。又，培養上清回收時的細胞數係使用Detach Kit(Promocell公司製)將上清中的細胞分散為單一細胞，並將其一部分用台酚藍(trypan blue)(和光純藥工業公司製)懸濁，再藉由TC-20(BIO-RAD公司製)計算活細胞數而計測。

(使用ELISA定量)

將培養上清中所含有的旁泌素因子的一種，亦即為細胞介素(cytokine)之血管生成素(ANG)使用微量盤檢測儀進行定量。關於定量，使用Human Angiogenin ELISA Kit(Abcam公司製，# ab99970)。

將ANG的培養上清中的濃度以細胞數補正，以相對於二維培養之對照組之方式將相對值表示於表4。其結果，由於添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1，以及化合物k-1：J-1，二維培養以及三維培養之分泌量均增加。根據此結果，得知由於在間葉系幹細胞中添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1，以及化合物k-1：J-1，促進旁泌素因子的分泌。

[表4]

[實施例2]旁泌素因子放出量試驗2

(培養上清的回收)

源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC，Promocell公司製)，藉由使用間葉系幹細胞增殖培養基2(Promocell公司製)單層培養法(2D)進行前培養。將hMSC懸濁於相同培養基後，在三維培養法(3D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在底面具有凹陷部的細胞非接著性6孔EZSPHERE盤(AGC Techno Glass公司製，# 4810-900)中。在二維培養法(2D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在6孔平底盤(Corning公司製，# 3516)中。接著，使終濃度成為5μM的方式添加2μL/孔溶解於DMSO之化合物k-1：B-1，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養48小時。添加DMSO使終濃度成為0.05%的方式作為對照組。48小時後，交換為不含有化合物之培養基，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養，48小時後回收培養上清。又，培養上清回收時的細胞數係使用Detach Kit(Promocell公司製)將上清中的細胞分散為單一細胞，並將其一部分用台酚藍(和光純藥工業公司製)懸濁，再藉由TC-20(BIO-RAD公司製)計算活細胞數而計測。

(使用ELISA定量)

將培養上清液中所含有的旁泌素因子的一種，亦即為細胞介素之斯鈣素-1(STC-1)使用微量盤檢測儀進行定量。關於定量，使用Human Stanniocalcin ELISA Kit(Abcam公司製，# ab213829)。

將STC-1的培養上清中的濃度以細胞數補正，以相對於二維培養之對照組之方式將相對值表示於表5。其結果，與二維培養相比較在三維培養中此等的分泌量增加。又，由於添加化合物k-1：B-1，二維培養以及三維培養之分泌量均增加，與二維培養之對照組相比較而三維培養之化合物添加組中，STC-1之分泌量增加為8.95倍。根據此結果，得知由於在三維培養之間葉系幹細胞中添加化合物k-1：B-1，最為促進旁泌素因子的分泌。

[表5]

[實施例3]在炎症刺激下之旁泌素因子放出量試驗

(培養上清的回收)

將源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC，Promocell公司製)，藉由使用間葉系幹細胞增殖培養基2(Promocell公司製)單層培養法(2D)進行前培養。將hMSC懸濁於相同培養基後，在三維培養法(3D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在底面具有凹陷部的細胞非接著性6孔EZSPHERE盤(AGC Techno Glass公司製，# 4810-900)中。在二維培養法(2D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在6孔平底盤(Corning公司製，# 3516)中。接著，使終濃度成為5μM的方式添加2μL/孔溶解於DMSO之化合物k-1：J-1，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養48小時。添加DMSO使終濃度成為0.05%的方式作為對照組。48小時後，交換為僅只添加10ng/ml之TNFα(R & Dsystemes，# 210-TA-020)的培養基，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養，48小時後回收培養上清。又，培養上清回收時的細胞數係使用Detach Kit(Promocell公司製)將上清中的細胞分散為單一細胞，並將其一部分用台酚藍(和光純藥工業公司製)懸濁，再藉由TC-20(BIO-RAD公司製)計算活細胞數而計測。

(使用ELISA定量)

將培養上清液中所含有的旁泌素因子的一種，亦即為細胞介素之腫瘤壞死因子可誘發基因6蛋白質(TSG-6)使用微量盤檢測儀進行定量。關於定量，將TSG-6抗體(SantaCruz公司製，#sc-65886)固相化於NuncMaxisorp(Thermo Fisher Scientific公司製，# 44-2404-21)plate，使其與培養上清樣品反應，再使用生物素(biotin)修飾TSG-6抗體(R & Dsystems公司製，#BAF-2104)、鏈黴素-HRP(Abcam公司製，# ab7403)、基質溶液(KPL公司製，# 52-00-03)、反應停止液(KPL公司製，# 50-85-06)檢測出。檢量線的作成係使用重組(recombinant)人類TSG-6蛋白質(R & Dsystems公司製，#2104-TS)。

(使用流式細胞儀(flow cytometer)定量)

將培養上清中所含有的旁泌素因子的一種，亦即為細胞介素之單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)使用流式細胞儀(flow cytometer)定量。定量解析係使用BD^TM CBA Flex Set(BD公司製558287)，依照BD公司製之步驟準則實施。

將TSG-6、MCP-1的培養上清中濃度以細胞數補正，以相對於二維培養之對照組之方式將相對值表示於表6。其結果，關於TSG-6，與二維培養相比較在三維培養中此等的分泌量增加。又，由於添加化合物k-1：J-1，TSG-6的分泌量在二維培養以及三維培養均增加，與二維培養之對照組相比較而在三維培養之化合物添加組中，TSG-6之分泌量增加為3.21倍。MCP-1之分泌量僅只在三維培養之化合物添加組中增加。在TNFα刺激下促進TSG-6或MCP-1的產生為既知的事實，但由此結果得知由於在三維培養之間葉系幹細胞中添加化合物k-1：J-1對於TNFα刺激的應答性提升，因此促進旁泌素因子的分泌。此即是，化合物k-1：J-1提高對炎症刺激的應答性，呈現釋出較多的抗炎症細胞介素(cytokine)的狀態，故表示化合物k-1：J-1作為抗炎症治療劑係非常有用。

[表6]

[實施例4]旁泌素因子放出量試驗3

(培養上清的回收)

將源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC，Promocell公司製)，藉由使用間葉系幹細胞增殖培養基2(Promocell公司製)單層培養法(2D)進行前培養。將hMSC懸濁於相同培養基後，在三維培養法(3D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在底面具有凹陷部的細胞非接著性6孔EZSPHERE盤(AGC Techno Glass公司製，# 4810-900)中。在二維培養法(2D)中，以成為5×10⁵細胞/2mL/孔的方式播種在6孔平底盤(Corning公司製，# 3516)中。接著，使終濃度成為5μM的方式添加2μL/孔溶解於DMSO之化合物k-1：B-1，k-1：D-1，k-1：J-1，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養48小時。添加DMSO使終濃度成為0.05%的方式作為對照組。48小時後，交換為不含有化合物之培養基，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養，48小時後回收培養上清。又，培養上清回收時的細胞數係使用Detach Kit(Promocell公司製)將上清中的細胞分散為單一細胞，並將其一部分用台酚藍(和光純藥工業公司製)懸濁，再藉由TC-20(BIO-RAD公司製)計算活細胞數而計測。

(使用ELISA定量)

將培養上清液中所含有的旁泌素因子的一種，亦即為細胞介素之血管內皮生長因子(VEGF)使用微量盤檢測儀進行定量。關於定量，使用Human VEGF ELISA Kit(Abcam公司製，# ab100662)。

VEGF的培養上清中的濃度以細胞數補正，以相對於二維培養之對照組之方式將相對值表示於表7。其結果，由於添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1，以及化合物k-1：J-1，二維培養以及三維培養之分泌量均增加。根據此結果，得知由於在三維培養之間葉系幹細胞中添加化合物k-1：B-1、k-1：D-1，以及化合物k-1：J-1，促進旁泌素因子的分泌。

[表7]

[實施例5]在三維培養條件下之旁泌素因子放出量試驗

(培養上清的回收)

將源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC，Promocell公司製)，藉由使用間葉系幹細胞增殖培養基2(Promocell公司製)單層培養法(2D)進行前培養。將hMSC懸濁於相同培養基後，以成為20000細胞/250μL/孔的方式播種在底面具有凹陷部的細胞非接著性24孔EZSPHERE盤(AGC Techno Glass公司製，# 4820-900SP)中。接著，使終濃度成為10μM的方式添加250μL/孔溶解於DMSO之本發明中所使用之特定化合物，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養72小時。添加DMSO使終濃度成為0.1%的方式作為對照組。72小時後，交換為不含有化合物之培養基，並在37℃、5% CO₂恆溫箱中培養，24小時後回收培養上清。培養上清回收時的細胞數的補正，係使用藉由Protein Assay BCA Kit(Fuji film和光純藥公司製，#297-73101)所測定之總蛋白量進行。

(使用ELISA定量)

將培養上清液中所含有的旁泌素因子的一種，亦即為細胞介素之血管內皮生長因子(VEGF)以及血管生成素(ANG)使用微量盤檢測儀進行定量。關於定量，分別使用Human VEGF ELISA Kit(Abcam公司製，# ab100662)，和Human Angiogenin ELISA Kit(Abcam公司製，# ab99970)。

將VEGF以及ANG的培養上清中的濃度以總蛋白量補正，算出相對於對照組之相對值。細胞介素之相對的分泌量為增加之化合物編號記載於下述中。本試驗之結果得知，本發明中所使用之特定化合物促進旁泌素因子的分泌。

VEGF之相對的分泌量增加為1.2倍以上之化合物編號：

k-1：B-1、k-1：J-1、A-004、GA-002A、A-004A

VEGF之相對的分泌量增加為2倍以上之化合物編號：

k-1：B-1、A-004A

ANG之相對的分泌量增加為2倍以上之化合物編號：

k-1：H-1、k-1：B-1、k-1：D-1、k-1：J-1、A-004、GA-002A、A-004A、A-007、GA-005A

ANG之相對的分泌量增加為4倍以上之化合物編號：

k-1：H-1、k-1：B-1、k-1：D-1、A-004A

[產業上的利用可能性]

藉由本發明能夠非常地簡便且效率良好地促進細胞的旁泌素因子的產生。又，使用本發明所生產的細胞作為移植用細胞，用以促進旁泌素因子產生以及分泌可認為非常地適當。又，使用本發明所生產的細胞(例如，間葉系幹細胞)，顯著地促進旁泌素因子之中複數的抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質的產生以及分泌。因此，使用本發明所產生的細胞(例如，間葉系幹細胞)係適合使用於抗炎症性疾病以及缺血性疾病的治療。由以上得知，本發明在細胞培養領域或醫療領域中極為有益。

本申請案係以在日本申請之特願2018-185799(申請日：2018年9月28日)為基礎，並將其內容全部引入本說明書中。

Claims

一種細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，係含有由下述式(I)所示之化合物或其鹽：

式中，X為-NHCO-，R₁為-Y-NH-Z-Ar；式中之Y以及Z為單鍵，或可以具有取代基之碳數1至6的伸烷基，Ar為可以具有取代基之芳香基或雜芳基；R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基，R₃為羥基，n為0、1或2的整數。
如申請專利範圍第1項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，

R₂為甲基、乙基、或異丁基，

n為0，

Ar為可以被羥基或甲基取代之苯基，

Y為可以被甲基或乙基取代之亞甲基。
如申請專利範圍第1或2項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，該化合物為自下列者所組成之群組選擇之化合物或其鹽

以及
如申請專利範圍第1項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽
如申請專利範圍第1項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽

或，
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，該旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。
如申請專利範圍第6項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，該抗炎症性蛋白質為自腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白(TSG-6)以及斯鈣素-1(STC-1)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。
如申請專利範圍第6項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，該血管新生促進蛋白質為自血管生成素(ANG)、表皮生長因子(EGF)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、上皮衍生嗜中性球活化肽78(ENA-78)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、基質金屬蛋白酶之組織抑制因子(TIMP)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。
如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑，其中，該細胞為間葉系幹細胞。
一種細胞培養的培養基，係含有申請專利範圍第1至9項中任一項所述之細胞之旁泌素因子產生促進用培養基添加劑。
一種旁泌素因子的產生經促進的細胞之生產方法，係包含在含有由下述式(I)所示之化合物或其鹽之培養基中培養細胞：

式中，X為-NHCO-，R₁為-Y-NH-Z-Ar；式中之Y以及Z為單鍵，或可以具有取代基之碳數1至6的伸烷基，Ar為可以具有取代基之芳香基或雜芳基；R₂為可以具有取代基之碳數1至6的烷基，R₃為羥基，n為0、1或2的整數。
如申請專利範圍第11項所述之生產方法，其中，

R₂為甲基、乙基、或異丁基，

n為0，

Ar為可以被羥基或甲基取代之苯基，

Y為可以被甲基或乙基取代之亞甲基。
如申請專利範圍第11或12項所述之生產方法，其中，該化合物為自下列者所組成之群組選擇之化合物或其鹽

以及
如申請專利範圍第11項所述之生產方法，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽
如申請專利範圍第11項所述之生產方法，其中，前述化合物為下列者所示之化合物或其鹽

或，
如申請專利範圍第11至15項中任一項所述之生產方法，其中，該旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。
如申請專利範圍第16項所述之生產方法，其中，該抗炎症性蛋白質為自腫瘤壞死因子刺激基因6蛋白(TSG-6)以及斯鈣素-1(STC-1)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。
如申請專利範圍第16項所述之生產方法，其中，該血管新生促進蛋白質為自血管生成素(ANG)、表皮生長因子(EGF)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，上皮衍生嗜中性球活化肽78(ENA-78)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、介白素-6(IL-6)、介白素-8(IL-8)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子-D(VEGF-D)、基質金屬蛋白酶之組織抑制因子(TIMP)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。
如申請專利範圍第11至18項中任一項所述之生產方法，其中，該細胞為間葉系幹細胞。
如申請專利範圍第11至19項中任一項所述之生產方法，其中，該培養以三維培養進行。
一種生體移植用組成物，係包含藉由如申請專利範圍第11至20項中任一項所述之生產方法所生產之細胞。
一種炎症性疾病或缺血性疾病的治療用組成物，係包含藉由如申請專利範圍第19或20項所述之生產方法所生產之細胞。
如申請專利範圍第22項所述之治療用組成物，其中，該炎症性疾病為自炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、克隆氏病(Crohn’s disease)、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、腎絲球腎炎、IgA腎病、糖尿病性腎病、膜性腎病、水腎、造影劑腎病、腎盂腎炎、腎衰竭、間質性腎炎(interstitial nephritis)、腎損傷、腎病症候群、高血壓性腎硬化症、糖尿病性腎絲球硬化症、腎結石、類澱粉腎、腎靜脈血栓症、Alport症候群、肝炎、肝硬化、胰臟炎、肺炎、鼻竇炎、鼻炎、關節炎、變形性膝關節病、變形性手關節病、變形性足關節病、變形性股關節病、風濕性關節炎、周期性發熱、口瘡口炎、咽炎、淋巴結炎症候群、成年發病型Still氏病、貝西氏病(Behcet`s Disease)、痛風、假性痛風、Schnitzler氏症候群、慢性復發性多發性骨髓炎、Cryopyrin相關周期熱症候群、家族性寒冷蕁麻疹、Muckle-Wells症候群、慢性嬰幼兒神經皮膚關節炎症候群、新生兒發症多臟器炎症疾患、腫瘤壞死因子(TNF)受體相關周期性症候群、高IgD症候群、Blau症候群、幼發性類肉瘤病、家族性地中海熱、化膿性關節炎、壞疽性膿皮症(pyoderma gangrenosum)、座瘡、中條-西村症候群、Majeed症候群、NLRP12相關周期熱症候群、介白素1受體拮抗因子缺損症、介白素36受體拮抗因子缺損症、磷脂酶(phospholipase)Cγ2相關抗體缺乏/免疫異常症、HOIL-1缺損症、SLC29A3缺損症、CARD14異常症、腺核苷去胺酶2缺損症、嬰兒期發症的STING-相關血管病(STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy(SAVI))以及NLRC4異常症所組成之群組選擇者。
如申請專利範圍第20項所述之治療用組成物，其中，該缺血性疾病為自狹心症、心肌梗塞、章魚壺心肌症(Takotsubo Cardiomyopathy)、中樞性肺水腫、腦梗塞、缺血性腦中風、閉塞性動脈硬化症以及危急性肢體缺血所組成之群組選擇者。
一種旁泌素因子的生產方法，係包含下列步驟：

(1)在如申請專利範圍第10項所述之培養基中培養細胞的步驟，以及

(2)將在(1)中所使用的培養基之上清回收的步驟。
如申請專利範圍第25項所述之生產方法，其中，該細胞為間葉系幹細胞。
如申請專利範圍第25或26項所述之生產方法，其中，該旁泌素因子為自抗炎症性蛋白質以及血管新生促進蛋白質所組成之群組選擇之至少一種的蛋白質。