CN113348017A - 酰肼化合物及激酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供在细胞培养(尤其是三维细胞培养)中能够促进细胞增殖的新颖化合物。式(I)表示的酰肼化合物或其盐、及包含其的组合物能够显著地促进细胞的增殖、球状体形成、胞囊形成及/或类器官形成，此外，能够显著地抑制LATS1、LATS2等激酶的活性。式中，各符号如说明书中所定义。

Description

酰肼化合物及激酶抑制剂
技术领域
本发明涉及新颖的酰肼化合物、含有该酰肼化合物的培养基添加用组合物、特征在于使用该培养基添加用组合物的细胞或组织的培养方法、以及含有该酰肼化合物的激酶抑制剂等。
背景技术
近年来，为了阐明生命现象的作用机理、确立疾病的治疗方法等，在以生命科学领域为代表的许多领域中极其频繁地进行使用了细胞的实验。例如，作为创新药物领域中的一例，有使候选化合物作用于作为治疗靶标的癌细胞、筛选能抑制癌细胞增殖的化合物的方法。该筛选中，有时对数万种候选化合物进行筛选，在这样的方式中需要准备大量均质的细胞。但是，就人等高等生物的细胞而言，即使是分裂较快的细胞也需要1天左右的时间，并且，癌细胞、干细胞中还存在1次细胞分裂所需要的时间达数月以上的细胞，这成为妨碍迅速供应细胞的主要原因。基于上述背景，谋求构建能促进分裂慢的细胞的增殖的手段，例如，报道了具有特定结构的硫醇化合物促进造血前体细胞的增殖；聚戊二烯(Polyprenyl)类化合物促进肝细胞的增殖；等等(专利文献1、2)。
另一方面，在创新药物筛选领域中，近年来，细胞的三维培养受到瞩目。三维培养是介于体外与体内的中间的细胞培养技术。三维培养中，细胞能形成球状体(也称为球体)等立体结构，因此，与通常的二维培养相比，能够进行更接近于生物体的分析。因此，三维培养可能能够鉴定出使用了二维培养的创新药物筛选所无法鉴定的疾病治疗用化合物(非专利文献1)。
激酶(蛋白质磷酸化酶、蛋白激酶)是将蛋白质的丝氨酸、苏氨酸、或酪氨酸的羟基进行磷酸化的酶，是担负细胞的增殖、分化等的信号传导的酶群。迄今为止，克隆了500种以上的编码激酶的基因。此外，蛋白质激酶存在于细胞内的各个位置，与细胞的增殖、分化或功能表达等的调节和控制密切相关(非专利文献2)。
大肿瘤抑制因子(Large tumor suppressor，以下简称为LATS)1及LATS2为构成Hippo信号传导通路的主要因子的蛋白质激酶(专利文献3、非专利文献3、4)。已知当细胞密度上升而导致接触抑制时,或者当细胞因活性氧、DNA损伤等而受到损伤时，该传导通路会激活(非专利文献5、6、7)。该传导通路被激活时，LATS将作为转录共激活因子的Yes相关蛋白(Yes-associated protein，以下简称为YAP)或PDZ结合基序转录共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，以下简称为TAZ)磷酸化。经磷酸化的YAP或TAZ从细胞核向细胞质转移，发生蛋白质分解，因此，YAP或TAZ的靶基因的表达被抑制。作为受到YAP表达调节的基因的例子，已知有CCND1、CTGF、BIRC2、CYR61、AMOTL2、TGFB2等(非专利文献8、9、10、11)。Hippo信号传导通路的激活与这些基因的表达抑制有关，引起细胞增殖抑制、细胞死亡诱导。近年来，有报道称，通过使LATS1及LATS2发生遗传性缺损，从而在体外的三维培养中促进细胞的增殖(非专利文献12)。
已知Hippo信号传导通路调控干细胞的自我复制·分化(非专利文献13)。另外，Hippo信号传导通路对于皮肤、肠管、神经的维持而言是必需的，若YAP不正常发挥作用，则会阻碍组织损伤时的修复(非专利文献14)。此外，还报道了Hippo信号传导通路的缺失会使心肌梗塞后的收缩期心力衰竭恢复(非专利文献15)。如此，Hippo信号传导通路调控细胞、组织、器官的增殖、维持、恢复，因此，Hippo信号传导通路的抑制剂或者YAP及TAZ的激活剂可期待作为由细胞增殖不完全引起的疾病的治疗药。作为这样的疾病的例子，可举出烧伤、外伤、肌肉萎缩、缺血性疾病、神经变性病(例如阿尔兹海默症、帕金森症、亨廷顿舞蹈病)等。作为Hippo信号传导通路的抑制剂的例子，报道了XMU-MP-1作为MST1的抑制剂(非专利文献16)。显示XMU-MP-1通过抑制Hippo信号传导通路来促进从肝功能障碍的恢复。另外，报道了IBS008738作为TAZ的激活剂，显示出由该激活剂带来的促进肌肉损伤恢复的效果(非专利文献17)。此外，还报道了由抑制LATS1及LATS2的化合物带来的促进眼球、皮肤、肝脏修复的效果(专利文献4)。如上所述，期待Hippo信号传导通路的控制剂作为各种疾病的治疗药。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平11-504000号公报
专利文献2：国际公开第2008/155920号
专利文献3：美国专利第5994503号
专利文献4：国际公开第2018/198077号
非专利文献
非专利文献1：Susan Breslin,Drug Discovery Today 2013,18(5):240-249
非专利文献2：Robert Roskoski Jr.,Pharmacological Research 2016,100:1-23
非专利文献3：Justice RW等人,Genes&Development 1995,9(5):534-546
非专利文献4：Hergovich A,Cell&Bioscience 2013,3(1):32
非专利文献5：Pefani DE等人,The FEBS Journal 2016,283(8):1392-1403
非专利文献6：Meng Z等人,Genes&Development 2016,30(1):1-17
非专利文献7：Zhao B等人,Current Opinion in Cell Biology 2008,20(6):638-646
非专利文献8：Imajo M等人,The EMBO Journal 2012,31:1109-1122
非专利文献9：Hong W et al,Seminars in Cell&Developmental Biology 2012,23(7):785-793
非专利文献10：Gujral TS等人,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 2017,114(18):E3729-E3738
非专利文献11：Lee DH等人,Nature Communication 2016,7:11961
非专利文献12：Moroishi T等人,Cell 2016,167:1525-1539
非专利文献13：Aylon Y等人,Cell Death&Differentiation 2014,21(4):624-633
非专利文献14：Johnson R等人,Nature Reviews Drug Discovery 2014,13(1):63-79
非专利文献15：Leach JP等人,Nature 2017,550(7675):260-264
非专利文献16：Fan F等人,Science Translational Medicine 2016,8(352):352ra108
非专利文献17：Yang Z等人,Molecular and Cellular Biology 2014,34(9):1607-1621
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供在细胞培养(尤其是三维细胞培养)中可促进细胞增殖的新颖化合物。
用于解决课题的手段
本申请的发明人等针对上述课题进行了深入研究，结果发现，此次新合成的酰肼化合物能够极其良好地促进培养(尤其是三维培养)下的各种细胞的增殖。此外，本申请的发明人等还发现该化合物抑制LATS1及LATS2。基于该发现而进一步进行研究，从而完成了本发明。即，本发明如下所述。
[1]式(I)表示的酰肼化合物或其盐，
[化学式1]
Figure BDA0003182630120000051
[式中，X为-N(R5)C(R2)(R3)-、-C(R2)(R3)N(R5)-或-C(R2)(R3)O-，
W表示以下的D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11或D-12中的任一者所示的环，
[化学式2]
Figure BDA0003182630120000052
[化学式3]
Figure BDA0003182630120000053
R1为C1～C6烷基或卤代(C1～C6)烷基，
R2及R3各自独立地为氢原子或C1～C6烷基，
R4及R5各自独立地为氢原子或C1～C6烷基，
Ra为羟基、硝基、卤素原子、C1～C6烷基、卤代(C1～C6)烷基、C2～C6链烯基、C2～C6炔基、C1～C6烷氧基、卤代(C1～C6)烷氧基、C1～C6烷基硫基、卤代(C1～C6)烷基硫基、C1～C6烷基亚磺酰基或C1～C6烷基磺酰基，
m为0、1、2、3或4，
p为0、1、2或3，
r为0或1。]。
[2]如[1]所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-C(R2)(R3)N(R5)-，
W为D-1、D-2或D-3中任一者所示的环，
R4及R5为氢原子，
Ra为C1～C6烷基或卤素原子，
m为0或1，
r为0。
[3]如[1]所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-N(R5)C(R2)(R3)-，
W为D-2、D-4、D-5、D-6或D-7中任一者所示的环，
R2、R3、R4及R5为氢原子，
p、m及r为0。
[4]如[1]所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-C(R2)(R3)O-，
W为D-2所示的环，
m及r为0。
[5]如[1]所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-C(R2)(R3)N(R5)-，
W为D-8、D-9、D-10、D-11或D-12中的任一者所示的环，
R4及R5为氢原子，
p为0。
[6]培养基添加用组合物，其包含[1]至[5]中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
[7]如[6]所述的培养基添加用组合物，其用于促进细胞增殖。
[8]如[7]所述的培养基添加用组合物，其中，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。
[9]如[6]所述的培养基添加用组合物，其用于促进球状体形成、胞囊形成或类器官形成。
[10]如[6]所述的培养基添加用组合物，其用于移植用细胞或移植用类器官的制造。
[11]如[6]所述的培养基添加用组合物，其用于促进细胞粘附。
[12]细胞培养培养基，其包含[1]至[5]中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
[13]促进细胞增殖的方法，其包括将[1]至[5]中任一项所述的酰肼化合物或其盐添加至细胞培养培养基的步骤。
[14]如[13]所述的方法，其中，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。
[15]促进细胞粘附的方法，其包括将[1]至[5]中任一项所述的酰肼化合物或其盐添加至细胞培养培养基的步骤。
[16]激酶抑制剂，其包含[1]至[5]中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
[17]如[16]所述的激酶抑制剂，其中，激酶为LATS。
[18]Hippo信号传导通路抑制剂，其包含[1]至[5]中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
[19]药物组合物，其包含[1]至[5]中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
[20]如[19]所述的药物组合物，其用于治疗眼、肝脏、皮肤或肠的疾病。
发明的效果
根据本发明，能够显著地促进细胞的增殖、球状体形成、胞囊形成及/或类器官形成。此外，根据本发明，能够显著地抑制LATS1、LATS2等激酶的活性。此外，根据本发明，能够治疗伴随细胞增殖不完全的疾病，并且能够促进损伤组织的再生。
附图说明
[图1]为试验例4的共聚焦荧光显微镜照片。
[图2]为显示本发明化合物对试验例18中的经切除的肝脏的恢复效果的图。
[图3]为显示本发明化合物对试验例19中的大肠炎的恢复效果的图。
具体实施方式
本发明中使用的新颖化合物为下式(I)表示的化合物(以下，有时称为“本发明化合物”)。
[化学式4]
Figure BDA0003182630120000081
[式中，X为-N(R5)C(R2)(R3)-、-C(R2)(R3)N(R5)-或-C(R2)(R3)O-，
W表示以下的D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11或D-12中的任一者所示的环，
[化学式5]
Figure BDA0003182630120000091
[化学式6]
Figure BDA0003182630120000092
R1为C1～C6烷基或卤代(C1～C6)烷基，
R2及R3各自独立地为氢原子或C1～C6烷基，
R4及R5各自独立地为氢原子或C1～C6烷基，
Ra为羟基、硝基、卤素原子、C1～C6烷基、卤代(C1～C6)烷基、C2～C6链烯基、C2～C6炔基、C1～C6烷氧基、卤代(C1～C6)烷氧基、C1～C6烷基硫基、卤代(C1～C6)烷基硫基、C1～C6烷基亚磺酰基或C1～C6烷基磺酰基，
m为0、1、2、3或4，
p为0、1、2或3，
r为0或1。]
一个方式中，式(I)表示的化合物中，可以是：
X为-C(R2)(R3)N(R5)-，
W为D-1、D-2或D-3中任一者所示的环，
R4及R5为氢原子，Ra为C1～C6烷基或卤素原子，
m为0或1，
r为0。
一个方式中，式(I)表示的化合物中，可以是：
X为-C(R2)(R3)N(R5)-，
W为D-2所示的环，
R2为C1～C6烷基，
R3、R4及R5为氢原子，
Ra为C1～C6烷基，
m为0，
r为0。
一个方式中，式(I)表示的化合物中，可以是：
X为-C(R2)(R3)N(R5)-，
W为D-2所示的环，
R2为C1～C6烷基，
R3、R4及R5为氢原子，
Ra为卤素原子，
m为1，
r为0。
另一个方式中，式(I)表示的化合物中，可以是：
X为-N(R5)C(R2)(R3)-，
W为D-2、D-4、D-5、D-6或D-7中任一者所示的环，
R2、R3、R4及R5为氢原子，
p、m及r为0。
又一个方式中，式(I)表示的化合物中，可以是：
X为-C(R2)(R3)O-，
W为D-2所示的环，
m及r为0。
又一个方式中，式(I)表示的化合物中，可以是：
W为D-8、D-9、D-10、D-11或D-12中的任一者所示的环，
R4及R5为氢原子，
p为0。
关于式(I)表示的化合物，认为根据取代基的种类、条件，根据情况，例如以下式表示的酮-烯醇结构互变异构体等的形式存在，本发明化合物也包括可存在的所有异构体。
[化学式7]
Figure BDA0003182630120000111
本发明化合物所包括的化合物中，根据取代基的种类，有时存在具有E的立体构型的E体及具有Z的立体构型的Z体的几何异构体。本发明化合物包括这些E体、Z体或者以任意比例含有E体及Z体的混合物，本说明书中，有时将它们例如如上所述地表示为波浪线的键。
另外，就本发明化合物所包括的化合物而言，存在因1个或2个以上的手性碳原子的存在而产生的光学活性体，本发明化合物包括所有光学活性体或外消旋体。
在本发明化合物所包括的化合物中，可按照通常方法制成酸加成盐，包括例如：氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸等氢卤酸的盐；硝酸、硫酸、磷酸、氯酸、高氯酸等无机酸的盐；甲磺酸、乙磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等磺酸的盐；甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙酸、富马酸、酒石酸、草酸、马来酸、苹果酸、琥珀酸、苯甲酸、扁桃酸、抗坏血酸、乳酸、葡萄糖酸、柠檬酸等羧酸的盐或谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的盐，但不限于这些。
或者，本发明化合物所包括的化合物中，可按照通常方法制成金属盐，包括例如：锂、钠、钾这样的碱金属的盐；钙、钡、镁这样的碱土金属的盐或铝的盐，但不限于这些。
接着，将本说明书中示出的各取代基的具体例示于下文。此处，分别地，n-是指正、i-是指异、s-是指仲以及t-是指叔，Ph是指苯基。
作为本说明书中的卤素原子，可举出氟原子、氯原子、溴原子及碘原子。需要说明的是，本说明书中，“卤素”这样的表述也表示这些卤素原子。
本说明书中的Ca～Cb烷基的表述是表示碳原子数为a～b个的直链状或支链状的饱和烃基，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、正己基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的卤代(Ca～Cb)烷基的表述是表示与碳原子键合的氢原子任选地被卤素原子取代的、碳原子数为a～b个的直链状或支链状的饱和烃，此时，被2个以上卤素原子取代的情况下，这些卤素原子可以彼此相同、或者彼此不同。例如可举出氟甲基、氯甲基、溴甲基、碘甲基、二氟甲基、二氯甲基、三氟甲基、氯二氟甲基、三氯甲基、溴二氟甲基、1-氟乙基、2-氟乙基、2-氯乙基、2-溴乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、2-氯-2,2-二氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-溴-2,2-二氟乙基、1,1,2,2-四氟乙基、2-氯-1,1,2-三氟乙基、2-氯-1,1,2,2-四氟乙基、五氟乙基、2,2-二氟丙基、3,3,3-三氟丙基、3-溴-3,3-二氟丙基、2,2,3,3-四氟丙基、2,2,3,3,3-五氟丙基、1,1,2,3,3,3-六氟丙基、七氟丙基、2,2,2-三氟-1-(甲基)乙基、2,2,2-三氟-1-(三氟甲基)乙基、1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基、2,2,3,4,4,4-六氟丁基、2,2,3,3,4,4,4-七氟丁基、九氟丁基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的Ca～Cb链烯基的表述是表示碳原子数为a～b个的直链状或支链状、并且分子内具有1个或2个以上的双键的不饱和烃，例如可举出乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基乙烯基、2-丁烯基、2-甲基-2-丙烯基、3-甲基-2-丁烯基、1,1-二甲基-2-丙烯基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的Ca～Cb炔基的表述是表示碳原子数为a～b个的直链状或支链状、并且分子内具有1个或2个以上三键的不饱和烃，例如可举出乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、1-己炔基、4,4,4-三氟-2-丁炔基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的Ca～Cb烷氧基的表述是表示碳原子数为a～b个的、上述含义的烷基-O-基，例如可举出甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的卤代(Ca～Cb)烷氧基的表述是表示碳原子数为a～b个的、上述含义的卤代烷基-O-，例如可举出二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯二氟甲氧基、溴二氟甲氧基、2-氟乙氧基、2-氯乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基、1,1,2,2-四氟乙氧基、2-氯-1,1,2-三氟乙氧基、1,1,2,3,3,3-六氟丙氧基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的Ca～Cb烷基硫基的表述是表示碳原子数为a～b个的、上述含义的烷基-S-，例如可举出甲基硫基、乙基硫基、正丙基硫基、异丙基硫基、正丁基硫基、异丁基硫基、仲丁基硫基、叔丁基硫基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的卤代(Ca～Cb)烷基硫基的表述是表示碳原子数为a～b个的、上述含义的卤代烷基-S-，例如可举出二氟甲基硫基、三氟甲基硫基、氯二氟甲基硫基、溴二氟甲基硫基、2,2,2-三氟乙基硫基、1,1,2,2-四氟乙基硫基、2-氯-1,1,2-三氟乙基硫基、五氟乙基硫基、1,1,2,3,3,3-六氟丙基硫基、七氟丙基硫基、1,2,2,2-四氟-1-(三氟甲基)乙基硫基、九氟丁基硫基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的Ca～Cb烷基亚磺酰基的表述是表示碳原子数为a～b个的、上述含义的烷基-S(O)-，例如可举出甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、正丙基亚磺酰基、异丙基亚磺酰基、正丁基亚磺酰基、异丁基亚磺酰基、仲丁基亚磺酰基、叔丁基亚磺酰基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
本说明书中的Ca～Cb烷基磺酰基的表述是表示碳原子数为a～b个的、上述含义的烷基-SO2-，例如可举出甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、异丙基磺酰基、正丁基磺酰基、异丁基磺酰基、仲丁基磺酰基、叔丁基磺酰基等作为具体例，在各指定的碳原子数的范围内选择。
接着，以下对本发明化合物的制造方法进行说明。
〔制造方法A〕
如下式所示，式(I)表示的化合物可以通过将式(2-1)(式中R1表示与上述相同的含义)表示的化合物、与式(3-1)(式中，W及X表示与上述相同的含义)进行脱水反应而合成。作为一例，下述式中，示出式(I)中R4为氢原子的情况。
〔反应式1〕
[化学式8]
Figure BDA0003182630120000141
本反应中，相对于1当量的式(2-1)表示的化合物而言，式(3-1)表示的化合物可以在0.5～20当量的范围内使用，优选可在1～2当量的范围内使用。
本反应可以在没有溶剂的条件下实施，也可以使用水或有机溶剂，例如，作为有机溶剂，可举出甲苯、邻二甲苯等芳香族烃类、1,4-二氧杂环己烷、四氢呋喃等醚类、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等极性溶剂。这些溶剂可以单独使用，也可以将它们中的两种以上混合而使用。
就反应温度而言，可以在从0℃至反应混合物的回流温度的范围内、优选从100℃至反应混合物的回流温度的范围内设定任意的温度。
反应时间根据反应基质的浓度、反应温度而变化，通常在从5分钟至100小时的范围内、优选从1小时至72小时的范围内任意地设定。
此处使用的某些式(2-1)表示的化合物为已知化合物，一部分可作为市售品获得。另外，可以遵照文献[例如，Synthesis,(13),p.1857(2002)等]记载的方法来制造。
某些式(3-1)表示的化合物为已知化合物，一部分可作为市售品获得。另外，可以遵照文献[例如，Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry,298(1),p.9(2013)等]记载的方法来制造。
就反应结束后的反应混合物而言，可以进行直接浓缩、或溶解于有机溶剂中水洗后浓缩、或投入冰水中用有机溶剂萃取后浓缩这样的常规后处理，从而得到作为目标的本发明化合物。另外，需要纯化时，可以通过重结晶、柱色谱、薄层色谱、液相色谱分取等任意的纯化方法进行分离、纯化。
另外，在本发明所包括的化合物中存在因1个或2个以上的手性碳原子的存在而产生的光学活性体的情况下，例如，可以使用作为光学活性体的原料并利用遵照上述制造方法的方法来制造，或者，通过进行基于使用手性柱的液相色谱、超临界流体色谱等的光学拆分从而由该化合物的外消旋体得到光学活性体。
本说明书中的三维细胞培养(3D细胞培养)是指使用例如包埋培养法、微载体培养法、球状体培养法等在三维环境中培养细胞。包埋培养是在Matrigel(注册商标)、Geltrex(注册商标)、琼脂、甲基纤维素、胶原蛋白、明胶、血纤维蛋白、琼脂糖、海藻酸盐等固态或半固体的凝胶基材中埋入细胞、将其固定来进行培养的方法。微载体培养法是下述这样的方法：在比水稍重的微粒(下文也称为微载体)的表面上使细胞进行单层增殖，在培养瓶等培养容器内搅拌该微粒，进行悬浮状态下的培养。球状体培养是下述这样的培养方法：使目标细胞形成由数十～数百个细胞构成的凝集块(下文中也称为球状体或球体)，之后在培养基中使该凝集块静置或进行振荡来培养的方法。另外，作为本发明中的三维细胞培养(3D细胞培养)，也可使用下述方法：通过使透明质酸、脱酰基结冷胶、黄原胶等多糖类或它们的衍生物在培养基中分散来形成不规则形态的三维网络，将其作为支架而使粘附细胞在培养基中维持悬浮的状态，从而在更接近于生物体内的三维状态下对细胞进行培养。此时，三维细胞培养中的细胞被该三维网络捕获而不会沉淀，因此能够在不需要振荡、旋转操作等的情况下进行培养。三维细胞培养可利用本身已知的方法来实施(例如，参见WO2014/017513)。
〔培养基添加用组合物〕
本发明提供包含本发明化合物的培养基添加用组合物(以下，有时称为本发明组合物)。本发明组合物通过添加至细胞培养基、尤其是三维细胞培养培养基中，从而能够实现细胞增殖的促进、球状体形成的促进、胞囊(以下，有时记载为Cyst)形成的促进及类器官形成的促进中的任一者或它们的任意组合。
即，本发明组合物的用途具体可示例如下：
(1)促进细胞增殖；
(2)促进球状体形成；
(3)促进类器官形成；
(4)促进胞囊形成；
(5)促进细胞增殖及促进球状体形成；
(6)促进细胞增殖及促进类器官形成；
(7)促进细胞增殖及促进胞囊形成；
(8)促进球状体形成及促进类器官形成；
(9)促进球状体形成及促进胞囊形成；
(10)促进类器官形成及促进Cyst形成；
(11)促进细胞增殖、促进球状体形成及促进类器官形成；
(12)促进细胞增殖、促进球状体形成及促进胞囊形成；
(13)促进细胞增殖、促进类器官形成及促进Cyst形成；
(14)促进球状体形成、促进类器官形成及促进Cyst形成；或
(15)促进细胞增殖、促进球状体形成、促进类器官形成及促进Cyst形成。
本说明书中，所谓“促进细胞的增殖”，是指例如与作为对照的规定的细胞数相比，细胞数增加至少5％以上、至少10％以上、至少20％以上、至少30％以上、至少40％以上、至少50％以上、至少60％以上、至少70％以上、至少80％以上、至少90％以上、至少100％以上、至少150％以上、或至少200％以上。
本发明组合物可以含有一种本发明化合物、或组合含有两种以上的本发明化合物作为有效成分。
另外，本发明组合物也可以含有本发明化合物以外的其他成分。只要能够获得本发明的所期望的效果即可，没有特别限定，所述成分例如可包括水、生理盐水、二甲基亚砜(DMSO)、甘油、丙二醇、丁二醇、及甲醇、乙醇、丁醇、丙醇等各种醇等。另外，本发明组合物可根据需要实施灭菌处理。灭菌方法没有特别限制，例如，可举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤器灭菌等。对于进行过滤器灭菌(以下，有时也称为过滤灭菌)时的过滤器部分的材质而言，没有特别限制，例如，可举出玻璃纤维、尼龙、聚醚砜(PES)、亲水性聚偏氟乙烯(PVDF)、纤维素混合酯、纤维素乙酸酯、聚四氟乙烯等。过滤器的细孔的大小没有特别限制，优选为0.1μm～10μm，更优选为0.1μm～1μm，最优选为0.1μm～0.5μm。上述灭菌处理中，该组合物可以为固态也可以为溶液的状态。
对于本发明组合物中的作为有效成分的本发明化合物的配合量而言，只要是在将本发明组合物添加至培养基(尤其是三维细胞培养培养基)时该培养基能够发挥本发明的所期望的效果的浓度即可，没有特别限定。需要说明的是，作为能够发挥本发明的所期望的效果的浓度，例如，本发明化合物在培养基(尤其是三维细胞培养培养基)中的浓度的下限值通常可以为0.001μM以上、优选0.01μM以上、更优选0.1μM以上、进一步优选1μM以上、特别优选10μM以上。另外，该浓度的上限值通常可以为100μM以下、优选50μM以下、特别优选10μM以下。
本发明组合物在提供时或者保存时可以是任意的形状。该组合物可以是片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂这样的已制成制剂的固体、溶解在适当的溶剂及溶解剂中的溶液或悬浮液这样的液体、或者结合于基板、载体上的状态。作为制成制剂时的添加物，可举出：对羟基苯甲酸酯类等防腐剂；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋型剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。这些添加物不限于上述成分，只要本领域技术人员可利用即可，可自由地进行选择。
作为通过将本发明组合物添加至培养基(尤其是三维细胞培养培养基)从而实现促进细胞增殖等的细胞种类，只要能获得所期望的效果即可，没有特别限定，可举出精子、卵子等生殖细胞、构成生物体的体细胞、正常细胞株、癌细胞株、前体细胞、干细胞、从生物体分离并经过人工基因改造(例如，使用了病毒的基因导入或基于基因组编辑的基因改造)的细胞、从生物体分离并经过人工核更换的细胞等细胞种类。需要说明的是，这些细胞的来源也没有特别限定，优选来源于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、狗、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、猕猴、黑猩猩、人等哺乳动物的细胞。另外，就作为细胞来源的组织或器官而言，只要能获得本发明所期望的效果即可，没有特别限定，作为前述组织，可举出皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、脾脏、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼、脑或神经组织等组织，但不限于这些，另外，作为前述器官，可举出肝脏、肺、肾脏、心脏、胰脏、胃、脾脏、小肠、大肠、生殖器、眼等器官，但不限于这些。需要说明的是，以促进类器官形成为目的的情况下，类器官有时优选为来源于小肠或大肠(结肠)的细胞。另外，以促进Cyst形成为目的的情况下，Cyst有时优选为来源于肾脏的细胞。
需要说明的是，作为正常细胞株，可举出C3H10T1/2(小鼠胚胎成纤维细胞)、HEK293(人胎肾细胞)、MDBK(来源于牛肾脏的细胞)、MDCK(狗肾小管上皮细胞)、CHO-K1(来源于中国仓鼠卵巢的细胞)、Vero(来源于非洲绿猴肾上皮的细胞)、NIH3T3(小鼠胚胎成纤维细胞)、HepaRG(肝细胞，注册商标)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)、人原代培养肝细胞、表皮角化细胞、角膜上皮细胞、角膜内皮细胞等。这些之中，尤其优选MDCK、C3H10T1/2、CHO-K1、Vero、HUVEC、表皮角化细胞、角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、NIH3T3。另外，作为癌细胞株的例子，不限于以下，作为人乳腺癌细胞株可举出HBC-4、BSY-1、BSY-2、MCF-7、MCF-7/ADRRES、HS578T、MDA-MB-231、MDA-MB-435、MDA-N、BT-549、T47D，作为人宫颈癌细胞株可举出HeLa，作为人肺癌细胞株可举出A549、EKVX、HOP-62、HOP-92、NCI-H23、NCI-H226、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、DMS273、DMS114，作为人大肠癌细胞株可举出Caco-2、COLO-205、HCC-2998、HCT-15、HCT-116、HT-29、KM-12、SW-620、WiDr，作为人前列腺癌细胞株可举出DU-145、PC-3、LNCaP，作为人中枢神经系统癌细胞株可举出U251、SF-295、SF-539、SF-268、SNB-75、SNB-78、SNB-19，作为人卵巢癌细胞株可举出OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SKOV3、IGROV-1，作为人肾癌细胞株可举出RXF-631L、ACHN、UO-31、SN-12C、A498、CAKI-1、RXF-393L、786-0、TK-10，作为人胃癌细胞株可举出MKN45、MKN28、St-4、MKN-1、MKN-7、MKN-74，作为皮肤癌细胞株可举出LOX-IMVI、LOX、MALME-3M、SK-MEL-2、SK-MEL-5、SK-MEL-28、UACC-62、UACC-257、M14、A431，作为人肝脏细胞株可举出HuH-7、HepG2、PLC-PRF-5、SK-HEP-1，作为白血病细胞株可举出CCRF-CRM、K562、MOLT-4、HL-60TB、RPMI8226、SR、UT7/TPO、Jurkat等。这些之中，特别优选人卵巢癌细胞株SKOV3、人肝脏细胞株HuH-7、来源于人上皮样细胞癌的细胞株A431。此外，干细胞是指兼具自我复制能力和分化成其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例子，不限于以下，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞(MSC)、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等。作为多能干细胞，可举出前述干细胞中的ES细胞、胚胎生殖干细胞、iPS细胞。前体细胞是指处于从前述干细胞分化为特定的体细胞、生殖细胞的中途阶段的细胞。这些之中，特别优选MSC及iPS细胞。
一个方式中，使用添加有本发明组合物的三维细胞培养培养基对MSC等干细胞进行培养的情况下，能够在维持该细胞的特性(例如未分化性)的状态下促进该细胞的增殖。MSC的未分化性的维持可通过基于流式细胞术(FCM)分析细胞表面标志物的表达来进行确认(例如，参见WO2016/136986)，可举出作为MSC的细胞表面标志物的CD29、CD73、CD90及CD105等为阳性的情况。
本说明书中，术语“本发明组合物”也被称为术语“本发明的培养基添加剂”。
〔培养基〕
本发明提供包含本发明化合物或本发明组合物的培养基(以下，有时称为“本发明的培养基”)。通过使用本发明的培养基，从而能够实现细胞增殖的促进、球状体形成的促进、胞囊形成的促进及类器官形成的促进中的任一者或它们的任意组合。需要说明的是，本发明的培养基特别优选为三维细胞培养培养基。
就本发明的培养基中作为有效成分包含的本发明化合物的浓度而言，只要能获得本发明所期望的效果即可，没有特别限定，例如，该浓度的下限值通常可为0.001μM以上，优选为0.01μM以上，更优选为0.1μM以上，进一步优选为1μM以上，特别优选为10μM以上。另外，该浓度的上限值通常可为100μM以下，优选为50μM以下，特别优选为10μM以下。
就本发明的培养基而言，除了配合有本发明化合物或本发明组合物以外，可以与已知的培养基的组成相同。
一个方式中，本发明的培养基可以通过向市售的培养基(尤其是三维细胞培养培养基)中添加本发明化合物或组合物来制备。作为能通过添加本发明化合物或本发明组合物来制成本发明的培养基的市售培养基，只要能够获得所期望的效果即可，没有特别限定，例如，可举出杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium；DMEM)、HamF12培养基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy 5A培养基(McCoy’s5A medium)、Eagle’s MEM(Eagle’s Minimum Essential Medium；EMEM)、αMEM(alphaModified Eagle’s Minimum Essential Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培养基、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E、IPL41培养基、Fischer’s培养基、StemPro34(Invitrogen公司制)、X-VIVO10(Cambrex公司制)、X-VIVO 15(Cambrex公司制)、HPGM(Cambrex公司制)、StemSpan H3000(STEMCELL Technologies公司制)、StemSpan SFEM(STEMCELL Technologies公司制)、StemlineII(Sigma Aldrich公司制)、QBSF-60(Qualitybiological公司制)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司制)、Essential8(注册商标)培养基(Gibco公司制)、mTeSR1培养基(STEMCELL Technologies公司制)、mTeSR2培养基(STEMCELL Technologies公司制)、ReproFF(ReproCELLIncorporated制)、ReproFF2(ReproCELL Incorporated制)、StemFit(注册商标)AK02N(味之素公司制)、StemFit(注册商标)AK03N(味之素公司制)、PSGrohESC/iPSC培养基(System Biosciences公司制)、NutriStem(注册商标)培养基(Biological Industries公司制)、CSTI-7培养基(株式会社细胞科学研究所制)、MesenPRORS培养基(Gibco公司制)、MF-Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(东洋纺株式会社制)、间充质干细胞用培养基(PromoCell GmbH制)、Sf-900II(Invitrogen公司制)、Opti-Pro(Invitrogen公司制)角膜上皮细胞基础培养基(ATCC(注册商标)、PCS-700-030(注册商标))、Prigrow medium(Applied Biological Materials公司制)、Eagle基础培养基(BasalMedium Eagle)、BGJb培养基、CMRL1066培养基、角质细胞基础培养基2(PromoCell公司制)、角质细胞增殖培养基2(PromoCell公司制)、正常人表皮角化细胞增殖用培养基(Kurabo公司制)、正常人表皮角化细胞基础培养基(Kurabo公司制)、人EpiVita增殖培养基(东洋纺株式会社制)、EpiLife(注册商标)培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)、角膜上皮细胞系基础培养基(ATCC制，#PCS-700-030)、IntestiCult Organoid Growth Medium(STEMCELL Technologies公司制)、STEMdiff Cerebral Organoid Kit(STEMCELLTechnologies公司制)、STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit(STEMCELLTechnologies公司制)、HepatiCult Organoid Growth Medium(STEMCELL Technologies公司制)、PancreaCult Organoid Growth Medium(STEMCELL Technologies公司制)、PneumaCult-ALI(STEMCELL Technologies公司制)、STEMdiff APEL2(STEMCELLTechnologies公司制)等培养基。另外，可使用向这些培养基中添加脱酰基结冷胶等多糖类制成三维细胞培养培养基而得到的培养基。作为这样的三维细胞培养培养基，可举出例如FCeM(注册商标)(富士膜和光纯药公司)，但并不限于此。
另外，可以根据目的向上述的培养基中添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生物质、血清、脂肪酸、糖、细胞增殖因子、分化诱导因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、凝集素、细胞外基质、生理活性物质等。作为具体例，可举出碱性成纤维细胞增殖因子、转化增殖因子-α、转化增殖因子-β、上皮生长因子、类胰岛素生长因子、Wnt蛋白质、双调蛋白、干扰素类、白细胞介素类、血管内皮细胞增殖因子、来自血小板的生长因子、肝细胞增殖因子、白蛋白、胰岛素、β-巯基乙醇、KnockOut血清替代物(Knockout SerumReplacement，KSR，Thermo Fisher Scientific公司制)、Glutamax(Thermo FisherScientific公司制)、氢羟肾上腺皮质素、肾上腺素、L-谷氨酰胺、丙酮酸、亚硒酸、Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)抑制剂等，但并不限于这些。
本发明的培养基中的细胞的培养(尤其是三维细胞培养)可使用通常用于细胞培养的培养皿、培养瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、皿、陪替氏培养皿(Petri Dish)、组织培养用皿、多皿、微孔培养板、微孔板、多片板、多孔板、腔室载玻片(chamber slide)、管、盘、培养袋、滚瓶等培养容器实施。这些培养容器可以包被有胶原蛋白、明胶、层粘蛋白、iMatrix-511、iMatrix-411、iMatrix-221、纤连蛋白、玻连蛋白、Matrigel(注册商标)、聚-L-鸟氨酸/层粘蛋白或聚-D-赖氨酸等细胞外基质。形成细胞凝集块(球状体)时，期望这些培养容器为细胞低粘附性，以使得所培养的(粘附性的)细胞不会粘附于培养容器。作为细胞非粘附性的培养容器，可使用培养容器的表面未基于提高与细胞的粘合性的目的进行人工处理(例如，利用细胞外基质等的包被处理)、或者培养容器的表面基于减弱与细胞的粘合性的目的而经过人工处理的培养容器。作为这样的容器的例子，可举出Sumilon细胞紧密板(SUMITOMO BAKELITE株式会社制)、PrimeSurface(注册商标)板(SUMITOMO BAKELITE株式会社制)、超低粘附表面板(Corning公司制)、NunclonSphera板(Thermo FisherScientific公司制)等，但不限于此。
〔细胞增殖促进方法、球状体形成促进方法、胞囊形成促进方法及类器官形成促进方法〕
本发明提供包括向培养基添加本发明化合物或本发明组合物的步骤的、促进细胞增殖的方法、促进球状体形成的方法、促进胞囊形成的方法或促进类器官形成的方法(以下，有时将它们统称为本发明方法)。
本发明方法中使用的培养基只要能获得所期望的效果即可，没有特别限定。优选为三维细胞培养培养基。另外，本发明方法中的细胞培养条件(例如，温度、二氧化碳浓度、培养时间等)使用本身已知的方法即可，或者可根据目的而适当改变。例如，就培养细胞时的温度而言，若为动物细胞，则通常为25℃～39℃，优选为33℃～39℃(例如37℃)。就二氧化碳浓度而言，在培养的气氛中，通常为4体积％～10体积％，优选为4体积％～6体积％。培养时间通常为1～35天，根据培养的目的而适当设定即可。
形成细胞凝集块(球状体)的方法没有特别限定，本领域技术人员可以适当地选择。作为其例子可举出：使用具有细胞非粘附表面的容器的方法、悬滴法、旋转培养法、三维支架法、离心法、采用利用电场、磁场形成的凝集的方法等。例如，对于使用具有细胞非粘附表面的容器的方法，可以在实施了阻碍细胞粘附的表面处理的培养容器中培养目标细胞，使其形成球体。使用该细胞非粘附性培养容器时，首先，在采集目标细胞后配制其细胞悬浮液，接种于该培养容器中进行培养。持续培养约一周时，细胞自发地形成球体。作为此时使用的细胞非粘附性表面，可以使用在通常所用的培养皿等培养容器的表面涂布了阻碍细胞粘附的物质而得到的细胞非粘附性表面等。作为这样的物质，可举出琼脂糖、琼脂、聚-HEMA(聚-(甲基丙烯酸2-羟基乙酯))2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)与其他单体(例如，甲基丙烯酸丁基酯等)形成的共聚物、聚(丙烯酸2-甲氧基甲酯)、聚-N-异丙基丙烯酰胺、MebiolGel(注册商标)等，只要没有细胞毒性即可，不限于这些。
另外，作为形成细胞凝集块(球状体)的方法，也可以使用Nature Biotechnology,2010,Vol.28,No.4,p.361-366、Nature Protocols,2011,Vol.6,No.5,p.689-700、NatureProtocols,2011,Vol.6,No.5,p.572-579、Stem Cell Research,2011,Vol.7,p.97-111、Stem Cell Reviews and Reports,2010,Vol.6,p.248-259等中记载的方法。
另外，在形成球状体的培养时所使用的培养基中，也可含有加速球状体形成、或促进其维持的成分。作为具有上述效果的成分的例子，可举出二甲基亚砜、超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白、过氧化氢酶、过氧化物酶、L-抗坏血酸、L-抗坏血酸磷酸酯、生育酚、类黄酮、尿酸、胆红素、含硒化合物、转铁蛋白、不饱和脂肪酸、白蛋白、茶碱、毛喉素、胰高血糖素、二丁酰cAMP等。作为含硒化合物，可举出亚硒酸钠、硒酸钠、二甲基硒、硒化氢、硒代蛋氨酸、硒-甲基硒代半胱氨酸、丙氨酸丁氨酸硒醚、硒代半胱氨酸、硒高半胱氨酸、腺苷-5’-磷酰硒酸、硒-腺苷硒代蛋氨酸。另外，作为具有上述效果的成分的例子，可举出Y-27632、Fasudil(HA1077)、H-1152、Wf-536等Rho相关蛋白激酶(Rho-associated protein kinase，ROCK)抑制剂。另外，为了得到作为目标的尺寸均匀的细胞凝集块，也可在所使用的细胞非粘附性培养容器上导入与目标细胞凝集块具有相同直径的多个凹部。如果这些凹部彼此接触、或在目标细胞凝集块的直径的范围内，则在接种细胞时，所接种的细胞不在凹部与凹部之间形成细胞凝集块，而是可靠地在凹部中形成与其容积相应的大小的细胞凝集块，能够得到尺寸均匀的细胞凝集块群。作为此时的凹部的形状，优选半球或圆锥状。
或者，也可基于具有细胞粘附性的支承体而形成球状体。作为这样的支承体的例子，可举出胶原蛋白、聚轮烷、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、水凝胶等。
另外，也可通过与饲养细胞共同培养来形成球状体。作为用于促进球状体形成的饲养细胞，可使用任何粘附性细胞，但优选与各种细胞相应的饲养细胞。虽然没有限定，但例如在形成来源于肝脏、软骨的细胞的球状体时，作为其饲养细胞的例子，可举出COS-1细胞、血管内皮细胞作为优选的细胞种类。
另外，作为形成球状体的方法，可选择悬滴法。作为悬滴法，可举出下述方法：例如，将细胞悬浮液的液滴(容量为10～50μL左右)滴加于培养容器的盖等的顶板侧，以所载置的液滴垂下的方式在颠倒状态下进行培养。通过以这样的方式进行培养，细胞因与平面的接触而受到的影响成为最小限度，在液滴的下部形成球状体。上述液滴可使用GravityPLUS Plate(PerkinElmer公司制)这样的特殊培养容器进行制备。具体而言，可使用含有100～100000个、优选200～10000个、更优选500～10000个细胞的液滴来制备球状体。为了形成球状体，优选培养6～48小时。
球状体的大小根据细胞种及培养期间的不同而不同，没有特别限定，为球形状或椭圆球形状时，具有20μm～1000μm、优选40μm～500μm、更优选50μm～300μm、最优选80μm～200μm的直径。
上述球状体即使以原状态继续静置培养，也能在10天以上、优选13天以上、进一步优选30天以上的时间内保持增殖能力，通过进一步在静置培养的期间定期地进行机械分割，或进一步进行单细胞化处理和凝集，由此能够实质上无限地保持增殖能力。
球状体的培养中使用的培养容器只要是通常能够进行动物细胞培养的容器即可，没有特别限定，例如，可举出培养瓶、皿、陪替氏培养皿、组织培养用皿、多皿、微孔培养板、微孔板、多片板、多孔板、腔室载玻片、细胞培养瓶、旋转瓶、培养皿、管、盘、培养袋、滚瓶、EZSPHERE(AGC TECHNO GLASS公司制)、Sumilon细胞紧密板(SUMITOMO BAKELITE公司制)等。
这些培养容器中，在实施许多医药品候选化合物或医药品的评价时，可优选使用微孔培养板、微孔板、多片板、多孔板。这些板的孔底形状没有特别限定，可使用平底、U字型、V字型的底，优选使用U字型的孔底。这些培养器材的材质没有特别限定，例如可举出玻璃、聚氯乙烯、纤维素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯等塑料等。
进行包埋培养时所使用的培养基可以含有细胞粘附因子，作为其例子，可举出Matrigel(注册商标)、Geltrex(注册商标)、胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘蛋白、iMatrix-511、iMatrix-411、iMatrix-221、纤连蛋白、玻连蛋白、腱生蛋白、选择素、透明质酸、血纤维蛋白等。上述细胞粘附因子也可组合添加两种以上。另外，还可针对包埋培养所使用的培养基进一步混合琼脂、瓜尔胶、罗望子胶、海藻酸丙二醇酯、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、塔拉胶、罗望子胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、琼脂糖、罗望子种子胶、普鲁兰多糖等增稠剂。上述增稠剂也可组合添加两种以上。
形成类器官(将干细胞或前体细胞在三维环境下于生物体外进行培养、形成的微器官)或Cyst(由上皮细胞形成的管腔结构)的方法没有特别限制，本领域技术人员可以适当选择。作为其例子，可举出使用了上述的包埋培养的方法。具体而言，在含有上述细胞粘附因子的包埋培养用培养基中，对作为目标的细胞或组织进行培养，能够形成类器官或胞囊(Cyst)。此处，作为类器官来源的细胞优选为从组织采集的干细胞或前体细胞、多能性干细胞等。例如，在采集作为目标的细胞或组织后制备其悬浮液，接种于包埋培养用的培养基中进行培养。持续培养3～45天后，细胞自发地形成类器官或胞囊(Cyst)。
本发明方法中使用的培养基(尤其是三维细胞培养培养基)使用本发明的培养基即可。
本发明方法中的、培养基中的本发明化合物或本发明组合物的浓度及细胞种类等与在上述〔培养基添加用组合物〕中说明的同样。
〔细胞粘附的促进方法〕
本发明提供包括将本发明的组合物添加于培养基的步骤的、用于促进细胞粘附的方法(以下，有时称为“本发明的细胞粘附促进方法”)。本发明的细胞粘附促进方法能够促进细胞(特别是粘附细胞)向培养容器的细胞粘附。
本发明的细胞粘附促进方法中使用的培养基只要能够获得所期望的效果即可，没有特别限定。另外，本发明的细胞粘附促进方法中的细胞培养条件(例如，温度、二氧化碳浓度、培养时间等)使用本身已知的方法即可，或者可根据目的而适当改变。例如，就培养细胞时的温度而言，若为动物细胞，则通常为25℃～39℃，优选为33℃～39℃(例如37℃)。就二氧化碳浓度而言，在培养的气氛中通常为4体积％～10体积％，优选为4体积％～6体积％。培养时间通常为1至45天，根据培养的目的而适当设定即可。
本发明的细胞粘附促进方法中使用的培养基使用本发明的培养基即可。
本发明的细胞粘附促进方法中的、成为上述有效成分的化合物的浓度及优选的细胞种类等与上述〔培养基添加用组合物〕及〔培养基〕中说明的相同。
〔移植用细胞或移植用类器官的制造方法〕
本发明还提供移植用细胞或移植用类器官的制造方法(以下，有时称为“本发明的制造方法”)，其特征在于，使用包含有效量的上述式(I)表示的化合物或其盐的培养基。作为移植用细胞的例子，例如可举出肝脏细胞、皮肤细胞、成骨细胞、软骨细胞、间充质干细胞、胰脏β细胞、神经细胞、视网膜细胞、角膜上皮细胞及角膜内皮细胞，但不限于这些。例如，由本发明的制造方法得到的角膜上皮细胞及角膜内皮细胞能够合适地用作治疗角膜疾病时的移植用细胞。作为移植用类器官的例子，可举出大脑、小脑、内耳、甲状腺、胸腺、睾丸、肝脏、胰脏、小肠、大肠、结肠、上皮、肺、肾脏等的类器官。例如，由本发明的制造方法得到的大肠或结肠的类器官能够合适地用作治疗肠疾病时的移植用类器官。
本发明的制造方法中的式(I)表示的化合物、其添加量、培养基、培养容器、培养的细胞或类器官、细胞或类器官的培养方法等与上述〔培养基添加用组合物〕、〔培养基〕、及〔细胞增殖促进方法、球状体形成方法、胞囊形成促进方法及类器官形成促进方法〕中记载的相同。
本发明的制造方法中的细胞培养条件(例如，温度、二氧化碳浓度、培养时间等)使用本身已知的方法即可，或者可以根据目的进行适当改变。例如，就培养细胞或类器官时的温度而言，若为动物的细胞或类器官，则通常为25℃～39℃，优选为33℃～39℃(例如37℃)。就二氧化碳浓度而言，在培养的气氛中，通常为4体积％～10体积％，优选为4体积％～6体积％。培养时间通常为1至45天，根据培养的目的而适当设定即可。
〔激酶抑制剂〕
本发明提供包含本发明化合物的激酶抑制剂(以下，有时称为“本发明的激酶抑制剂”)。
本发明的激酶抑制剂中配合的本发明化合物的量只要能够获得所期望的效果即可，没有特别限定，通常可以为0.01～100重量％、优选0.1～100重量％、更优选1～100重量％、进一步优选5～100重量％、特别优选10～100重量％。
本发明的激酶抑制剂在提供时或保存时可以为任意的形状。该组合物可以是片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂这样的经制剂化的固体、溶解在适当的溶剂及溶解剂中的溶液或悬浮液这样的液体、或者结合于基板、载体上的状态。作为制剂化时的溶剂，可举出：水、生理盐水、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、甘油、丙二醇、丁二醇等各种醇等水性溶剂。作为制剂化时的添加物，可举出：对羟基苯甲酸酯类等防腐剂；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋型剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。这些添加物不限于上述成分，只要本领域技术人员可利用即可，可自由地进行选择。
另外，本发明的激酶抑制剂可以根据需要实施灭菌处理。灭菌方法没有特别限制，例如，可举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤器灭菌等。进行过滤器灭菌(以下，有时也称为过滤灭菌)时的过滤器部分的材质没有特别限制，例如，可举出玻璃纤维、尼龙、聚醚砜(以下，简称为PES)、亲水性聚偏氟乙烯(以下，简称为PVDF)、纤维素混合酯、纤维素乙酸酯、聚四氟乙烯等。过滤器的细孔的大小没有特别限制，优选为0.1μm～10μm，更优选为0.1μm～1μm，最优选为0.1μm～0.5μm。这些灭菌处理中，特定化合物可以为固态或溶液的状态。
本发明的激酶抑制剂中，所谓“抑制激酶”，是指抑制激酶的磷酸化功能而使其活性消失或减弱。作为可被本发明的激酶抑制剂抑制的激酶的种类，可举出LATS1及LATS2，但不限于这些。需要说明的是，本说明书中，所谓“减弱激酶的活性”，是指：例如与作为对照的规定的激酶的磷酸化活性水平相比，激酶的活性减弱至少5％以上、至少10％以上、至少15％以上、至少20％以上、至少25％以上、至少30％以上、至少35％以上、至少40％以上、至少50％以上、至少55％以上、至少60％以上、至少65％以上、至少70％以上、至少75％以上、至少80％以上、至少85％以上、至少90％以上、至少95％以上、或至少99％以上。激酶活性的测定可以如以下的实施例中说明的那样使用二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate，以下简称为ADP)定量法、迁移率分析(Mobility Shift Assay，以下简称为MSA)法等本身已知的方法。或者，在激酶为位于Hippo信号传导通路上游的LATS2等的情况下，也可以利用本身已知的分子生物学方法对作为其下游效应物的、成为磷酸化的靶标的YAP及/或TAZ在细胞内的局部存在进行确认，由此间接地评价激酶活性的减弱程度。
本发明的一个方式中，激酶为LATS2的情况下，所谓“抑制LATS2”，是指抑制LATS2作为激酶的功能而使其活性消失或减弱。LATS2在从酵母至人的广泛物种中进化保存。因此，其活性被本发明的激酶抑制剂抑制的LATS2可以为所有生物中的LATS2，可以为大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、狗、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、猕猴、黑猩猩、人等哺乳动物的LATS。被本发明的激酶抑制剂抑制的LATS2优选可以为人LATS。需要说明的是，本说明书中，在简记为“LATS”的情况下，为包括“LATS1”及“LATS2”这两者、以及LATS1与LATS2的复合体的概念。
作为本发明的激酶抑制剂的使用方式的例子，包括在分子生物学试验、研究目的中的用途等，但不限于这些。作为分子生物学试验、研究目的中的用途的一个方式，通过将本发明的激酶抑制剂施予至表达LATS2等特定激酶的细胞，从而能够容易地制备抑制特定激酶的活性的细胞。如此得到的细胞能够用于特定激酶的功能分析、筛选能够调节该特定激酶的功能的候选物质等。
一个方式中，表达特定激酶的细胞可以为来自哺乳动物的细胞。作为该细胞的例子，可举出构成生物体的体细胞、正常细胞株、癌细胞株、前体细胞、干细胞、从生物体分离并经过人工基因改造(例如，使用了病毒的基因导入或基于基因组编辑的基因改造)的细胞、从生物体分离并经过人工核更换的细胞等细胞，但不限于这些。需要说明的是，这些细胞的来源也没有特别限定，可举出来源于大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、狗、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、猕猴、黑猩猩、人等哺乳动物的细胞。另外，上述细胞来源的组织或器官也没有特别限定，作为组织的例子，可举出皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼、脑或神经组织等组织，另外，作为器官的例子，可举出肝脏、肺、肾脏、心脏、胰脏、胃、脾脏、小肠、大肠、生殖器、眼等器官。需要说明的是，本说明书中，所谓“干细胞”，是指兼具将自身复制的能力和分化成其他多个系统的细胞的能力的细胞，作为其例子，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎肿瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能性干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、肌肉干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌干细胞、毛囊干细胞等，但不限于这些。作为多能性干细胞，可举出上述干细胞中的ES细胞、胚性生殖干细胞、iPS细胞。前体细胞是指处于从上述干细胞分化成特定的体细胞、生殖细胞的中途阶段的细胞。
本发明的激酶抑制剂向表达特定激酶的细胞的施予通过下述方式实现：向培养该细胞的培养基中添加本发明的激酶抑制剂。本发明的激酶抑制剂的添加量只要为能够获得本发明所期望的效果的量即可，没有特别限定，例如，本发明化合物在培养基中的浓度通常可以为0.001～100μM、优选0.01M～50μM、更优选0.1～30μM、进一步优选1～20μM、特别优选5～10μM。
另外，使用本发明的激酶抑制剂时，用于培养细胞的培养基没有特别限定，也可以使用市售的培养基。作为优选的市售培养基，可举出前述的〔培养基〕中记载的培养基，但不限于这些。
另外，可以根据试验·研究的目的，向上述的培养基中适当添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生物质、血清、脂肪酸、糖、细胞增殖因子、分化诱导因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、凝集素、细胞外基质、生理活性物质等其他物质。
细胞培养条件(例如，温度、二氧化碳浓度、培养时间等)使用本身已知的条件即可，或者可根据目的而适当改变。例如，培养细胞时的温度通常为25～39℃，优选为33～39℃(例如37℃)。就二氧化碳浓度而言，在培养的气氛中，通常为4～10体积％，优选为4～6体积％。培养时间通常为1～35天，根据培养的目的而适当设定即可。
〔Hippo信号传导通路抑制剂〕
本发明还提供包含本发明化合物的Hippo信号传导通路抑制剂(以下，有时称为“本发明的Hippo信号传导通路抑制剂”)。
Hippo信号传导通路为参与细胞增殖、细胞坏死、器官尺寸、自我复制、干细胞及前体细胞的分化、创伤治愈、组织再生的信号传导通路。该通路在多种生物中进化保存，尤其在哺乳动物中高度保存。哺乳动物中的Hippo信号传导通路的主要因子可举出LATS1及LATS2。LATS通过与支架蛋白质Mob1A/B的会合而被激活。LATS也通过基于STE20家族蛋白质激酶Mst1及Mst2的磷酸化而被激活。LATS将作为转录共激活因子的下游效应物YAP及TAZ磷酸化。由LATS引起的YAP及TAZ的磷酸化是Hippo信号传导通路中非常重要的事项。经磷酸化的YAP及TAZ从细胞核向细胞质转移，被泛素蛋白酶体系统所分解。因此，当Hippo信号传导通路处于被激活的状态下时，YAP及/或TAZ被LATS磷酸化，向细胞质中转移，被分解。另一方面，当Hippo信号传导通路处于非活性的状态下时，YAP及/或TAZ未被磷酸化，局部存在于细胞核中。
如上文所述，已知YAP及/或TAZ为转录共激活因子，在局部存在于细胞核中时，诱导各种基因的表达。已知由YAP及/或TAZ诱导表达的基因大多介导细胞的生存、增殖。作为所述基因的例子，例如，可举出CCND1、CTGF、BIRC2、CYR61、AMOTL2、TGFB2、ANKRD1等，但并不限于这些。需要说明的是，CCND1基因(CYCLIN D1，也称为“PRAD1”等)在人中存在于11号染色体。由该基因编码的蛋白质(295个氨基酸，分子量：约36kDa)参与细胞周期的促进。CTGF基因(connective tissue growth factor，也称为“CCN2”等)在人中存在于第6号染色体，编码诱导细胞增殖促进等的多肽(349个氨基酸，分子量：约35kDa)。BIRC2基因(baculoviral IAP repeat kontaining2，也称为“API1”等)在人中存在于第11号染色体，为编码通过胱天蛋白酶分解活性而抑制凋亡的蛋白质(618个氨基酸，分子量：约70kDa)的基因。CYR61基因(cysteine rich angiogenic inducer 61，也称为“CCN1”等)在人中存在于第1号染色体。由该基因编码的蛋白质(381个氨基酸，分子量：约39kDa)在血管形成、VEGF的增强、骨形成中担负重要的作用。AMOTL2基因(angiomotin like 2，也称为“LCCP”)在人中存在于第3号染色体(3q22.2)。由该基因编码的蛋白质(837个氨基酸，分子量：约92kDa)与抑制血管新生的血管抑素结合蛋白有关，属于结合蛋白质(motin protein)家族。ANKRD1基因(Ankyrin repeat domain-containing protein 1，Cardiac adriamycin-responsiveprotein，也称为“CARP”)在人中存在于第10号染色体。由该基因编码的蛋白质(319个氨基酸，分子量：约36kDa)在心肌、骨骼肌中高度表达，作为转录因子发挥功能。
本发明的Hippo信号传导通路抑制剂抑制LATS的激酶活性，抑制由LATS引起的YAP及/或TAZ的磷酸化。由于YAP及/或TAZ未被磷酸化，因此YAP及/或TAZ的核内转移被促进。结果，由YAP及/或TAZ诱导表达的基因的基因表达增强。因此，本发明的Hippo信号传导通路抑制剂也可以另称为“YAP及/或TAZ的核内转移促进剂”、或者“由YAP及/或TAZ诱导的基因的表达促进剂”。
需要说明的是，本说明书中，“促进YAP及/或TAZ的核内转移”是指：通过抑制YAP及/或TAZ的磷酸化和蛋白质分解，从而相比于细胞质，提高YAP及/或TAZ在核中的存在量。需要说明的是，所谓提高YAP及/或TAZ的存在量，是指：例如，与作为对照的YAP及/或TAZ在细胞核内的存在量相比，YAP及/或TAZ在细胞核内的存在量上升至少1.3倍以上、至少1.5倍以上、至少2倍以上、至少3倍以上、至少4倍以上、至少5倍以上、至少6倍以上、至少7倍以上、至少8倍以上、至少9倍以上、至少10倍以上。需要说明的是，YAP及/或TAZ在细胞核中的存在量的测定可以通过后述的实施例所用的、使用了结合有荧光标记的抗YAP(或TAZ)抗体的成像分析等本身已知的方法来实施。另外，YAP及/或TAZ在细胞核中的存在量可以通过使用蛋白质印迹法等观察YAP及/或TAZ的磷酸化状态来间接地测定。
另外，本说明书中，所谓“由YAP及/或TAZ诱导的基因的表达促进”，是指：YAP及/或TAZ向细胞核的转移被促进，结果，由YAP及/或TAZ诱导的基因(例如，CCND1、CTGF、BIRC2、CYR61、AMOTL2、TGFB2、ANKRD1中的至少一者以上)的表达量增强。需要说明的是，所谓基因表达增强，是指：例如，与规定的对照水平的表达量(例如，未添加本发明的Hippo信号传导通路抑制剂的细胞组)相比，上述基因中的至少一种以上的基因的表达量上升至少1.3倍以上、至少1.5倍以上、至少2倍以上、至少3倍以上、至少4倍以上、至少5倍以上、至少6倍以上、至少7倍以上、至少8倍以上、至少9倍以上、至少10倍以上。需要说明的是，基因表达的增强的评价可以利用微阵列法、实时PCR法等按转录水平来评价，或者，也可以利用蛋白质印迹法等按蛋白质翻译水平来评价。
关于本发明的Hippo信号传导通路抑制剂中的、本发明化合物的量、剂型、灭菌处理等，与在1.本发明的激酶抑制剂中说明的相同。
作为本发明的Hippo信号传导通路抑制剂的使用方式的例子，包括在分子生物学试验、研究目的中的用途等，但不限于这些。作为分子生物学试验、研究目的中的用途的具体例，例如，通过将本发明的Hippo信号传导通路抑制剂施予至具有Hippo信号传导通路的细胞，从而能够容易地制备Hippo信号传导通路被抑制的状态的细胞。如上文所述，本发明的Hippo信号传导通路抑制剂促进YAP及/或TAZ向细胞核的转移，因此在该细胞中，YAP及/或TAZ所参与的疾病的表型能够更明确地呈现。因此，通过使用具有该特性的细胞，能够高效地对可调节YAP及/或TAZ的功能的物质进行探索。
一个方式中，具有Hippo信号传导通路的细胞可以为来自哺乳动物的细胞。作为该细胞的例子，可举出构成生物体的体细胞、正常细胞株、癌细胞株、前体细胞、干细胞、从生物体分离并经过人工基因改造的细胞、从生物体分离并经过人工核更换的细胞等细胞，但不限于这些。需要说明的是，这些细胞的来源也没有特别限定，可举出来自大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、狗、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、猕猴、黑猩猩、人等哺乳动物的细胞。另外，这些细胞所来源的组织或器官也没有特别限定，作为组织的例子，可举出皮肤、肾脏、脾脏、肾上腺、肝脏、肺、卵巢、胰脏、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨、软骨、血管组织、血液、心脏、眼、脑或神经组织等组织，另外，作为器官的例子，可举出肝脏、肺、肾脏、心脏、胰脏、胃、脾脏、小肠、大肠、生殖器、眼等器官。
本发明的Hippo信号传导通路抑制剂向具有Hippo信号传导通路的细胞的施予通过向培养该细胞的培养基中添加本发明的Hippo信号传导通路抑制剂来实现。本发明的激酶抑制剂的添加量只要为能获得本发明的所期望的效果的量即可，没有特别限定，例如，本发明化合物在培养基中的浓度通常可以为0.001～100μM、优选0.01～50μM、更优选0.1～30μM、进一步优选1～20μM、特别优选5～10μM。
另外，使用本发明的Hippo信号传导通路抑制剂时，用于培养细胞的培养基没有特别限定，也可以使用市售的培养基。使用本发明的Hippo信号传导通路抑制剂时，可使用的市售培养基与使用本发明的激酶抑制剂时可使用的市售培养基相同。另外，细胞培养条件等也与在本发明的激酶抑制剂中说明的相同。
〔药物组合物〕
本发明还提供包含本发明化合物的药物组合物(以下，有时称为“本发明的药物组合物”)。
Hippo信号传导通路为参与细胞增殖、细胞坏死、器官尺寸、自己复制、干细胞及前体细胞的分化、创伤治愈、组织再生的信号传导通路，尤其是通过抑制LATS等激酶来抑制Hippo信号传导通路，由此细胞增殖、创伤治愈、及组织再生被增强。因此，包含具有激酶抑制活性的本发明化合物的本发明的药物组合物也能够用于与细胞增殖不完全相伴的疾病或损伤组织的再生。
关于本发明的药物组合物中的、本发明化合物的量、灭菌处理等，与前述的〔激酶抑制剂〕中说明的相同。
本发明的药物组合物可以单独使用，或者与其他至少一种治疗药组合使用。此时，本发明的药物组合物可以与该治疗药一同同时施予，或者，也可以在该治疗药的施予之前或之后施予。本发明的药物组合物可以通过与该治疗药相同或不同的施予路径来施予。作为该治疗药，可举出化学疗法药、支持治疗药、或其组合。
本说明书中，所谓“治疗”，包括部分地或实质性地实现下述中的一种以上：部分地或完全地减轻疾病的程度；改善或提高与疾病相关的临床的症状或指标；延迟、抑制或预防疾病的进展；或者部分地或完全地延迟、抑制或预防疾病的发病或进展。
作为本发明的药物组合物的适用对象的动物通常为哺乳动物，优选为人，也可以为宠物(例如，狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、松鼠等)或家畜(牛、氧、猪、马等)。本发明的药物组合物的适用对象优选为人。
另外，本发明的药物组合物在提供时或保存时可以为任意的形状。本发明的药物组合物通常可以以片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂等经口施予剂、滴眼剂、眼软膏剂、经皮吸收剂、眼科用注射剂、直肠施予剂、经皮吸收剂、肌肉注射剂、静脉注射剂或皮下注射剂的形式施予。本剂可以以单个治疗药、或者与其他治疗药的混合物的形式施予。它们可以以单体进行施予，通常以药物组合物的形态施予。这些制剂可加入药理上、制剂学上可容许的添加物，利用常规方法制造。即，经口剂中可以使用通常的赋型剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、湿润剂、增塑剂、包被剂等添加物。经口用液剂可以为水性或油性悬浮液、溶液、乳浊液、糖浆、酏剂等形态，或者，在使用前可以以在水或其他适当溶剂中制备的干糖浆的形式提供。上述的液剂可以包含悬浮剂、香料、稀释剂或乳化剂这样的通常添加剂。进行直肠内施予时，可以以栓剂的形式施予。栓剂可使用可可脂、月桂酸酯、聚乙二醇、甘油明胶、Witepsol、硬脂酸钠或它们的混合物等合适物质作为基质，并且可根据需要添加乳化剂、悬浮剂、保存剂等。为了形成水性剂型或用时溶解型剂型，静脉或皮下注射剂可使用注射用蒸馏水、生理盐水、5％葡萄糖溶液、丙二醇等溶解剂或溶解辅助剂、pH调节剂、等渗剂、稳定剂等制剂成分。为了形成水性剂型或用时溶解型剂型，眼科用注射剂可使用注射用蒸馏水、生理盐水、5％葡萄糖溶液、丙二醇等溶解剂或溶解辅助剂、pH调节剂、等渗剂、稳定剂等制剂成分。就眼软膏剂而言，可以使用白色凡士林、液体石蜡等通用的基材来制备。滴眼剂可根据需要使用下述物质来制备：氯化钠、氯化钾、甘油、丙二醇等等渗剂；磷酸钠、乙酸钠、硼酸钠、碳酸钠等缓冲剂；聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯聚氧丙二醇、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油等表面活性剂；乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠等稳定剂；苯扎氯铵氯化物、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯等防腐剂；甲基纤维素、羟基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等增稠剂；抗坏血酸、生育酚等抗氧化剂等。pH只要在眼科制剂可容许的范围内即可，优选为4～8的范围。调节pH时，可以使用盐酸、磷酸、柠檬酸、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠等。以下，示例本发明的药物组合物的制剂例及其制备方法，但并不限于这些。
〔制剂例1〕
制造含有以下成分的颗粒剂。
成分
Figure BDA0003182630120000371
使式(I)表示的化合物和乳糖从60网孔的筛通过。使玉米淀粉从120网孔的筛通过。利用V型混合机将它们混合。在混合粉末中添加2％(w/v)低粘度羟丙基纤维素(以下，简称为HPC-L)水溶液，混炼、造粒(挤出造粒孔径0.5～1mm)后干燥。利用振动筛(12/60网孔)对得到的干燥颗粒进行过筛，得到颗粒剂。
〔制剂例2〕
制造含有以下成分的胶囊填充用散剂。
成分
Figure BDA0003182630120000381
使式(I)表示的化合物和乳糖从60网孔的筛通过。使玉米淀粉从120网孔的筛通过。利用V型混合机将它们与硬脂酸镁混合。将10倍散100mg填充于5号硬明胶胶囊中。
〔制剂例3〕
制造含有以下成分的胶囊填充用颗粒剂。
成分
Figure BDA0003182630120000382
使式(I)表示的化合物和乳糖从60网孔的筛通过。使玉米淀粉从120网孔的筛通过。利用V型混合机将它们混合。在混合粉末中添加2％(w/v)HPC-L水溶液，混炼、造粒后干燥。用振动筛(12/60网孔)将得到的干燥颗粒过筛，整粒，将其150mg填充于4号硬明胶胶囊中。
〔制剂例4〕
制造含有以下成分的片剂。
成分
Figure BDA0003182630120000391
使式(I)表示的化合物、乳糖和微晶纤维素、羧甲基纤维素钠盐(CMC-Na)从60网孔的筛通过，进行混合。向混合粉末中添加硬脂酸镁，得到制剂用混合粉末。将本混合粉末直接打片，得到片剂。
〔制剂例5〕
成分
式(I)表示的化合物 100mg
饱和脂肪酸甘油酯 1000mL
静脉用制剂通过将式(I)表示的化合物添加于饱和脂肪酸甘油酯来制造。该溶液通常在1分钟内以1mL的速度对患者进行静脉内施予。
〔制剂例6〕
制造含有以下成分的眼软膏剂(100g中)。
成分
式(I)表示的化合物 300mg
液体石蜡 10g
白色凡士林 适量
〔制剂例7〕
制造含有以下成分的滴眼剂(100mL中)。
成分
式(I)表示的化合物 500mg
氢氧化钠 900mg
灭菌纯化水 适量
〔制剂例8〕
制造含有以下成分的滴眼剂(100mL中)。
成分
Figure BDA0003182630120000401
〔制剂例9〕
制造含有以下成分的片剂。
成分
Figure BDA0003182630120000402
向人施予本发明的药物组合物时，根据患者的年龄、性别、作为治疗对象的疾病、组织损伤的状态或程度来适当确定其施予量，通常为成人的情况下，就经口剂或直肠内施予而言，作为本发明化合物的施予量，为0.1～1000mg/人/天左右，就注射剂而言，为0.05mg～500mg/人/天左右。眼局部施予的情况下，每一天施予量为0.00001～100mg，优选为0.001～10mg，更优选为0.01～1mg、最优选为0.1～0.5mg。施予可以为单次施予或数次施予。例如，本发明的治疗剂为滴眼剂的情况下，可以1天施予1～3次(更优选1天1～2次，最优选1天1次)，每次1～5滴(更优选1～2滴，最优选1滴)。此处1滴通常为0.01～0.1mL。这些数值不过是示例，施予量根据患者的症状来确定。
可作为前药使用的本发明化合物为具有化学或代谢可分解的基团的本发明的衍生物，其通过溶剂解或在生理条件下的体内而生成本发明的药理学上活性的化合物。选择适当前药的方法及制造的方法记载于例如Design of Prodrugs(Elsevier,Amsterdam1985)中。本发明中，为具有羟基的化合物的情况下，作为前药，可示例通过使该化合物与适当的酰卤化合物或适当的酸酐反应而得到的酰氧基衍生物。关于作为前药特别优选的酰氧基，可举出-OCOC2H5、-OCO(t-Bu)、-OCOC15H31、-OCO(m-CO2Na-Ph)、-OCOCH2CH2CO2Na、-OCOCH(NH2)CH3、-OCOCH2N(CH3)2等。本发明化合物具有氨基的情况下，作为前药，可示例通过使具有氨基的化合物与适当的酰卤化物或适当的混合酸酐反应而制造的酰胺衍生物。关于作为前药特别优选的酰胺，可举出-NHCO(CH2)20OCH3、-NHCOCH(NH2)CH3等。
作为可应用本发明的药物组合物的疾病，只要是作为由抑制Hippo信号传导通路带来的细胞增殖促进、创伤治愈、组织再生的结果而可治疗的疾病或组织损伤即可，没有特别限定。一个方式中，与细胞增殖不完全相伴的疾病包括与Hippo信号传导通路的异常激活相伴的疾病。另一个方式中，与细胞增殖不完全相伴的疾病包括与YAP及/或TAZ的异常激活相伴的疾病。作为上述与细胞增殖不完全相伴的疾病或组织损伤的例子，例如，可举出炎症性疾病(例如，炎症、皮肤炎、特应性皮炎、肝炎、肾炎、肾小球肾炎、胰炎、干癣、痛风、爱迪生氏病(AddisoN’s disease)、炎症性肠疾病、克隆氏病(CrohN’s disease)、溃疡性大肠炎等)、神经变性病(例如，阿尔兹海默症病、帕金森症病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、克-雅氏病、亨廷顿舞蹈病、脊髓小脑变性症(SCD)、多系统萎缩症(MSA)、脊髓性肌萎缩症(SMA)、球脊髓性肌萎缩症等)、免疫性神经疾病(例如，多发性硬化症、吉兰-巴雷综合症、重症肌无力症、多发性肌炎等)、肌营养不良、肌病、外伤、烧伤、药伤、皮肤损伤、皮肤溃疡、下肢溃疡、压疮、糖尿病性皮肤溃疡、巨大色素性母斑、瘢痕、由纹身引起的障碍、寻常性白癜风、白皮症、脊髓损伤、肌肉损伤、肝不全、药剂性肝障碍、酒精性肝障碍、缺血性肝障碍、病毒性肝障碍、自身免疫性肝障碍、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、心肌梗塞、脑水肿、脑出血、脑梗塞、角膜内皮变性症、水疱性角膜症、与角膜移植相伴的眼障碍、隐形眼镜眼障碍、无虹膜、史提芬强生症候群、角膜炎、角膜上皮障碍、点状表层角膜症、角膜糜烂、角膜溃疡、干眼症、角膜上皮剥离、翼状片、巩膜化角膜、角膜营养不良、角膜炎、角膜缘干细胞缺损、药伤、烫伤、眼类天疱疮、糖尿病角膜病变、角膜内皮炎、Fuchs角膜内皮营养不良、滴状角膜、虹膜角膜内皮综合征、及角膜移植后的移植不全等，但不限于这些。本方式中，本发明的药物组合物也被称为“本发明的与细胞增殖不完全相伴的疾病或组织损伤的治疗剂”。
另外，一个方式中，本发明的药物组合物可有效促进将细胞、组织、器官等移植至哺乳动物时的植活及恢复。作为移植的细胞的例子，可举出干细胞(造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞等)、β细胞等，但不限于这些。作为被移植的组织的例子，可举出血液、红细胞、血小板、淋巴细胞、骨髓、脐带血、血管、角膜、视网膜、眼球、皮肤等，但不限于这些。作为被移植的器官的例子，可举出胰脏、肺、肾脏、肝脏、心脏、小肠、眼等，但不限于这些。需要说明的是，针对这些细胞、组织、器官，可以在移植前实施使用了病毒的基因导入、基于基因组编辑的基因改造。本方式中，本发明的药物组合物也被称为“细胞、组织、及/或器官移植的植活促进剂”。
实施例
以下，作为实施例，对本发明的组合物等中使用的式(I)表示的酰肼化合物的合成例及试验例进行具体陈述，由此更详细地说明本发明。
〔化合物的合成例〕
〔合成例1〕(E)-N’-(1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)亚丙基)-2-(吡啶-2-基氨基)乙酰肼(化合物No.A-001)的合成方法
使2-(吡啶-2-基氨基)乙酰肼120mg及2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮100mg悬浮于1.1mL的二甲基亚砜中，于100℃搅拌21小时。反应结束后，通过放冷，使该反应溶液冷却至室温，直接用中压硅胶柱色谱[硅胶10g，甲醇/二氯甲烷＝1/99～8/92(体积比。以下同样)的梯度]进行纯化。向得到的纯化物中加入水(5mL)，滤取析出的固体。进而用二氯甲烷对固体进行悬浮清洗，以白色固体的形式得到47.9mg的目标物。
〔合成例2〕(E)-N’-(1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)亚丙基)-2-(吡啶-3-基氨基)丙酰肼(化合物No.A-004)的光学活性化合物的合成(化合物No.A-004A及A-004B)的合成方法
利用遵照合成例1的方法，由2-(吡啶-3-氨基)丙酰肼135mg及2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮135mg合成81.6mg的A-004。使用Waters公司制超临界流体色谱(SFC)，将A-004光学拆分，得到6.6mg的A-004A及4.2mg的A-004B。
〔光学拆分条件〕
柱：CHIRALPAK IA-3(20×250mm，5μm；Daicel公司制)
流动相：CO2：MeOH＝60：40(体积比)
柱温：40℃
流速：15mL/分钟
在上述条件下，A-004显示2个峰，各保留时间为8.14分钟及13.40分钟。光学拆分后，将保留时间为8.14分钟的化合物作为A-004A(光学纯度为99.9％ee)，将保留时间为13.40分钟的化合物作为A-004B(光学纯度为99.9％ee)。
〔合成例3〕(E)-2-(1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)亚丙基)-N-(吡啶-3-基甲基)肼-1-甲酰胺(化合物编号B-001)的合成方法
工序1：
使3-氨基甲基吡啶1.0g悬浮于二氯甲烷11mL及水11mL的混合溶剂中。向该悬浮液中加入碳酸氢钠2.3g，然后冷却至0℃。向该溶液中缓缓滴加氯甲酸苯酯1.3mL后，缓缓地升温至室温。搅拌22小时，加入水10mL使反应停止，然后分液。用饱和盐水10mL清洗有机层，用无水硫酸镁进行干燥，过滤。在减压下浓缩滤液而得到残余物，用中压硅胶柱色谱(硅胶30g，乙酸乙酯/己烷＝5/95～50/50的梯度)将残余物纯化，以白色固体的形式得到0.54g的(吡啶-3-基甲基)氨基甲酸苯酯。
工序2：
使工序1的目标物0.54g悬浮于乙醇4.7mL中，加入肼一水合物0.57mL。将该反应液于60℃搅拌17小时。反应结束后，将反应液在减压下浓缩，然后利用甲苯共沸进行脱水。用甲苯对得到的残余物进行清洗，然后过滤，由此以白色固体的形式得到N-(吡啶-3-基甲基)肼甲酰胺0.28g。
工序3：
利用遵照合成例1的方法，由工序2的目标物120mg及2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮100mg，以白色固体的形式得到95.0mg的目标物。
〔合成例4〕(E)-N’-(1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)亚丙基)-2-(吡啶-3-基氧基)丙酰肼(化合物编号C-001)的合成方法
工序1：
将3-羟基吡啶1.26g、乳酸甲酯1.0mL及三苯基膦3.5g加入至甲苯30mL中，然后在冰冷却下，加入偶氮二甲酸二异丙酯的约1.9mol/L甲苯溶液(东京化成工业公司制。以下同样)7.0mL。使该反应液升温至室温，搅拌19小时。向该反应液中追加三苯基膦1.17g及偶氮二甲酸二异丙酯的约1.9mol/L甲苯溶液2.32mL，进而于室温搅拌28小时。将该反应溶液在减压下浓缩而得到残余物，用中压硅胶柱色谱(硅胶100g，乙酸乙酯/己烷＝10/90～40/60)对残余物进行纯化，以黄色液体的形式得到735mg的2-(吡啶-3-基氧基)丙酸甲酯。
工序2：
使工序1的目标物370mg溶解于乙腈5.1mL中，加入肼一水合物0.50mL后，于60℃搅拌6小时。将该反应溶液在减压下浓缩而得到残余物，用甲苯清洗残余物后，进行过滤，由此以白色固体的形式得到285mg的2-(吡啶-3-基氧基)丙酰肼。
工序3：
利用遵照合成例1的方法，从工序2的目标物130mg及2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮100mg，以白色固体的形式得到93.6mg的目标物。
〔合成例5〕(R,E)-2-[(1H-吲唑-6-基)氨基]-N’-[1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)丙酰肼(化合物编号A-016)的合成方法
工序1：
在氮气流下，于20℃向1H-吲唑-6-胺500mg和2,6-二甲基吡啶553mg的1,2-二氯乙烷溶液(10mL)中加入(S)-2-{[(三氟甲基)磺酰基]氧基}丙酸乙酯1.03g，于70℃搅拌16小时。向反应液中加入水，用乙酸乙酯萃取3次。用无水硫酸钠将合并的有机层干燥，过滤，并进行浓缩。用硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯＝4/1)将残余物纯化，以黄色油状物的形式得到(1H-吲唑-6-基)-D-丙氨酸乙酯247mg。
工序2：
利用遵照合成例3的工序2及3的方法，使用工序1的目标物247mg，以白色固体的形式得到目标物17mg。
〔合成例6〕(R，E)-N’-[1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)亚丙基]-2-(嘧啶-5-基氨基)丙酰肼(化合物编号A-017)的合成方法
工序1：
向六甲基磷酰三胺5.1g的四氢呋喃溶液(5mL)中，于0～5℃加入氢化钠338mg。接着，加入嘧啶-5-基氨基甲酸叔丁酯550mg，于20℃搅拌0.5小时，加入(S)-2{[(三氟甲基)磺酰基]氧基}丙酸乙酯2.11g的四氢呋喃溶液(2mL)。将反应液于50℃搅拌16小时后，向反应混合物中加入水，用乙酸乙酯萃取5次。用无水硫酸钠将合并的有机层干燥，过滤，进行浓缩干固。用硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯0→10％)将残余物纯化，以黄色油状物的形式得到N-(叔丁氧基羰基)-N-(嘧啶-5-基)-D-丙氨酸乙酯325mg。
工序2：
向N-(叔丁氧基羰基)-N-(嘧啶-5-基)-D-丙氨酸乙酯325mg的乙酸乙酯溶液(3mL)中，于0～5℃加入4M氯化氢-乙酸乙酯5.5mL，于20℃搅拌19小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯萃取3次。用无水硫酸钠将合并的有机层干燥，过滤，进行浓缩干固，以黄色油状物的形式得到嘧啶-5-基-D-丙氨酸乙酯160mg。
工序3：
利用遵照合成例3的工序2的方法，使用工序2的目标物和肼一水合物，以黄色油状物的形式得到(R)-2-(嘧啶-5-基氨基)丙酰肼147mg。
工序4：
向工序3的目标物100mg和2’,4’-二羟基-3’-甲基苯丙酮101mg的乙醇溶液中加入乙酸63μL，于65℃搅拌5天。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1)及反相色谱进行纯化，以黄色固体的形式得到目标物11mg。
〔合成例7〕(E)-2-[(1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基]-N’-[1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)丙酰肼(化合物编号A-018)的合成方法
工序1：
向1H-苯并[d]咪唑-6-胺2g的1,2-二氯乙烷溶液(35mL)中，加入2-氧代丙酸乙酯2.09g及乙酸859μL，于50℃搅拌30分钟。接着，向反应混合物中加入三乙酰氧基硼氢化钠4.14g，于50℃搅拌15小时。向反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液，用二氯甲烷萃取4次。用饱和盐水对合并的有机层进行清洗，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，并进行浓缩，以黄色固体的形式得到(1H-苯并[d]咪唑-6-基)氨基丙酸乙酯1.2g。
工序2：
利用遵照合成例3的工序2及合成例6的工序4的方法，使用工序1的目标物300mg，以黄色固体的形式得到目标物32mg。
〔合成例8〕(R，E)-N’-[1-(2,4-二羟基-3-甲基苯基)亚丙基]-2-(喹啉-7-基氨基)丙酰肼(化合物编号A-019)的合成方法
工序1：
用氮气对D-丙氨酸乙酯0.5g、7-溴喹啉554mg、三(二亚苄基丙酮)二钯(0)220mg、4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽139mg及碳酸铯2.35g的1,4-二氧杂环己烷溶液(10mL)进行3次减压脱气，于90℃搅拌16小时。向反应液中加入乙酸乙酯，用硅藻土进行过滤。用水将滤液清洗3次，用无水硫酸钠进行干燥，过滤，并进行浓缩。用硅胶柱色谱(石油醚/乙酸乙酯：0→50％)将残余物纯化，以黄色油状物的形式得到喹啉-7-基-D-丙氨酸乙酯235mg。
工序2：
利用遵照合成例3的工序2及合成例6的工序4的方法，使用工序1的目标物100mg，以黄色固体的形式得到目标物9.1mg。
式(I)所示的化合物可以利用遵照上述的合成例1至合成例8的方法来合成。将由上述的合成例合成的式(I)表示的化合物的例子示于第1表至第6表，但本发明化合物不仅限于这些。
表中，Me这样的记载表示甲基，Et这样的记载表示乙基，R2中的(R)是指R构型，(rac)是指外消旋体。另外，Ra中的“-”这样的记载表示未取代。
另外，表中、D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11及D-12表示下述结构，结构式中记载的编号表示Ra的取代位置。式中的“m”为0、1、2、3或4，“p”为0、1、2或3。
[化学式9]
Figure BDA0003182630120000471
[化学式10]
Figure BDA0003182630120000472
〔第1表〕
「化学式11]
Figure BDA0003182630120000481
[表1]
Figure BDA0003182630120000482
〔第2表〕
「化学式12]
Figure BDA0003182630120000483
[表2]
Figure BDA0003182630120000491
〔第3表〕
「化学式13]
Figure BDA0003182630120000492
[表3]
Figure BDA0003182630120000493
〔第4表〕
[化学式14]
Figure BDA0003182630120000501
[表4]
Figure BDA0003182630120000502
〔第5表〕
「化学式15]
Figure BDA0003182630120000503
[表5]
Figure BDA0003182630120000504
〔第6表〕
[化学式16]
Figure BDA0003182630120000511
[表6]
Figure BDA0003182630120000512
式(I)表示的化合物中，将第1表至第6表中记载的化合物的1H-NMR数据示于下文。
就质子核磁共振化学位移值而言，以氘代二甲基亚砜的值作为2.49ppm，在氘代二甲基亚砜中，以270MHz或400MHz进行测定。需要说明的是，1H-NMR数据中的符号表示以下的含义。s：单峰、brs：宽单峰、d：双峰、dd：二重双峰、t：三峰、q：四峰、m：多峰。
A-001(270MHz)；
δ13.68(s,1H),10.95(s,1H),9.68(s,1H),7.98(d,J＝2.7Hz,1H),7.41(t,J＝8.1Hz,1H),7.25(d,J＝8.1Hz,1H),6.93(t,J＝8.1Hz,1H),6.63(d,J＝8.1Hz,1H),6.53(t,J＝8.1Hz,1H),6.39(d,J＝8.1Hz,1H),4.11(d,J＝8.1Hz,2H),2.78(q,J＝8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.05(t,J＝8.1Hz,3H).
A-002(270MHz)；
δ13.66(s,1H),10.92(brs,1H),9.70(brs,1H),8.02(brs,1H),7.80(brs,1H),7.26(d,J＝8.1Hz,1H),7.09(t,J＝8.1Hz,1H),6.95(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.26(t,J＝8.1Hz,1H),4.00(d,J＝5.4Hz,2H),2.81(q,J＝8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.08(t,J＝8.1Hz,3H).
A-003(270MHz)；
δ13.63(s,1H),11.03(brs,1H),9.72(brs,1H),8.08(d,J＝5.4Hz,2H),7.36(t,J＝8.1Hz,1H),7.27(d,J＝8.1Hz,1H),6.64(d,J＝5.4Hz,2H),6.41(d,J＝8.1Hz,1H),4.10(d,J＝5.4Hz,2H),2.83(q,J＝8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.10(t,J＝8.1Hz,3H).
A-004(270MHz)；
δ13.63(s,1H),10.91(s,1H),9.71(s,1H),8.02(d,J＝2.7Hz,1H),7.79(d,J＝5.4Hz,1H),7.26(d,J＝8.1Hz,1H),7.08(t,J＝8.1Hz,1H),6.94(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.23(d,J＝8.1Hz,1H),4.33(m,J＝8.1Hz,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.42(d,J＝8.1Hz,3H),1.05(t,J＝8.1Hz,3H).
A-005(270MHz)；
δ13.67(s,1H),10.95(s,1H),9.75(brs,1H),8.05(brs,1H),7.77(brs,1H),7.27(d,J＝8.1Hz,1H),7.08(d,J＝8.1Hz,1H),7.00(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.21(d,J＝8.1Hz,1H),5.77(s,1H),4.21(m,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.78(m,2H),1.06(t,J＝8.1Hz,3H),0.99(t,J＝8.1Hz,3H).
A-006(270MHz)；
δ13.66(s,1H),10.92(brs,1H),9.74(brs,1H),7.90(brs,1H),7.27(d,J＝8.1Hz,1H),6.96(d,J＝8.1Hz,1H),6.93(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.01(d,J＝8.1Hz,1H),4.30(m,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),2.27(s,3H),1.95(s,3H),1.40(d,J＝8.1Hz,3H),1.05(t,J＝8.1Hz,3H).
A-007(270MHz)；
δ13.61(s,1H),10.97(s,1H),9.73(s,1H),7.89(brs,1H),7.71(brs,1H),7.26(d,J＝8.1Hz,1H),6.79(d,J＝13.5Hz,1H),6.69(d,J＝10.8Hz,1H),6.38(d,J＝8.1Hz,1H),4.34(m,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.93(s,3H),1.40(d,J＝8.1Hz,3H),1.05(t,J＝8.1Hz,3H).
A-007R(270MHz)；
δ13.63(s,1H),10.97(s,1H),9.73(s,1H),7.91(brs,1H),7.73(brs,1H),7.28(d,J＝8.1Hz,1H),6.81(d,J＝13.5Hz,1H),6.69(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),4.35(m,1H),2.84(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.42(d,J＝5.4Hz,3H),1.07(t,J＝8.1Hz,3H).
A-008(270MHz)；
δ13.64(s,1H),10.91(s,1H),9.72(s,1H),7.84(brs,1H),7.64(brs,1H),7.27(d,J＝8.1Hz,1H),6.79(brs,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.15(d,J＝8.1Hz,1H),4.33(m,1H),2.82(q,J＝Hz,2H),2.16(s,3H),1.95(s,3H),1.41(d,J＝8.1Hz,3H),1.06(t,J＝8.1Hz,3H).
A-009(270MHz)；
δ13.65(s,1H),10.89(s,1H),9.72(s,1H),9.45(s,1H),7.52(brs,1H),7.39(brs,1H),7.27(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.36(d,J＝2.7Hz,1H),6.14(d,J＝8.1Hz,1H),4.25(m,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.39(d,J＝5.4Hz,3H),1.06(t,J＝8.1Hz,3H).
A-010(270MHz)；
δ13.64(s,1H),10.93(s,1H),9.72(s,1H),7.53(brs,1H),7.27(d,J＝8.1Hz,1H),7.19(m,1H),6.92(m,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),6.23(d,J＝8.1Hz,1H),4.31(m,1H),2.81(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.41(d,J＝8.1Hz,3H),1.06(m,3H).
A-011(270MHz)；
δ13.62(s,1H),10.98(s,1H),9.73(s,1H),7.99(d,J＝2.7Hz,1H),7.78(d,J＝2.7Hz,1H),7.28(d,J＝8.1Hz,1H),7.03(s,1H),6.67(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝10.8Hz,1H),4.37(m,1H),2.84(q,J＝8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.42(d,J＝8.1Hz,3H),1.08(t,J＝8.1Hz,3H).
A-012(270MHz)；
δ13.63(s,1H),10.95(s,1H),9.72(s,1H),7.79(d,J＝2.7Hz,1H),7.27(d,J＝8.1Hz,1H),7.20(d,J＝8.1Hz,1H),7.06(m,1H),6.48(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),4.33(m,1H),2.82(q,J＝5.4Hz,2H),1.95(s,3H),1.41(d,J＝5.4Hz,3H),1.07(t,J＝8.1Hz,3H).
A-013(270MHz)；
δ13.60(s,1H),11.02(s,1H),9.72(s,1H),8.29(brs,1H),8.10(brs,1H),7.25(m,2H),6.84(d,J＝8.1Hz,1H),6.39(d,J＝8.1Hz,1H),4.44(m,1H),3.16(d,J＝5.4Hz,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.94(s,3H),1.43(d,J＝8.1Hz,3H),1.06(t,J＝8.1Hz,3H).
A-014(270MHz)；
δ13.62(s,1H),11.02(s,1H),9.72(s,1H),8.13(d,J＝2.7Hz,1H),7.58(d,J＝8.1Hz,1H),7.28(d,J＝8.1Hz,1H),7.05(s,1H),7.01(s,1H),6.40(d,J＝10.8Hz,1H),4.43(m,1H),2.84(q,J＝8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.45(d,J＝5.4Hz,3H),1.08(t,J＝8.1Hz,3H).
A-015(270MHz)；
δ13.61(s,1H),11.07(s,1H),9.73(s,1H),8.29(s,1H),7.30(t,J＝8.1Hz,2H),6.41(d,J＝8.1Hz,1H),4.50(m,1H),2.84(m,2H),1.97(s,3H),1.47(d,J＝8.1Hz,3H),1.10(t,J＝8.1Hz,3H).
A-016(400MHz)；
δ13.6(s,1H),12.4(s,1H),10.9(s,1H),9.71(s,1H),7.74(s,1H),7.42(d,J＝8.8Hz,1H),7.25(d,J＝8.8Hz,1H),6.64(d,J＝10Hz,1H),6.40-6.30(m,2H),6.20(d,J＝8.0Hz,1H),4.33-4.30(m,1H),2.83-2.78(m,2H),1.94(s,3H),1.44(d,J＝6.8Hz,3H),1.02(t,J＝7.6Hz,3H).
A-017(400MHz)；
δ13.6(s,1H),11.1-10.9(m,1H),9.75-9.65(m,1H),8.42(s,1H),8.17(s,2H),8.10-8.00(m,1H),7,27(d,J＝8.8Hz,1H),6.53(d,J＝8.8Hz,1H),6.40(d,J＝8.8Hz,1H),4.40-4.30(m,1H),2.75-2.65(m,1H),2.00-1.90(m,3H),1.43(d,J＝6.8Hz,3H),1.07(t,J＝7.4Hz,3H).
A-018(400MHz)；
δ13.6(s,1H),12.1-11.8(m 1H),10.8(s,1H),9.70(s,1H),8.00-7.80(m,1H),7.40-7.20(m,2H),6.80-6.60(m,2H),6.38(d,J＝8.8Hz,1H),5.90-5.60(m,1H),4.35-4.25(m,1H),2.78(d,J＝7.2Hz,2H),1.96(s,3H),1.43(d,J＝6.4Hz,3H),1.05-0.96(m,3H).
A-019(400MHz)；
δ13.6(s,1H),11.1(s,1H),9.70(s,1H),8.60(d,J＝3.2Hz,1H),8.03(d,J＝7.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.8Hz,1H),7.26(d,J＝8.8Hz,1H),7.16-7.09(m,2H),6.86(s,1H),6.66(d,J＝8.0Hz,1H),6.39(d,J＝8.8Hz,1H),4.48(t,J＝7.0Hz,1H),2.85(q,J＝7.3Hz,1H),1.94(s,3H),1.47(d,J＝7.0Hz,3H),1.08(t,J＝7.3Hz,3H).
A-020(400MHz)；
δ13.6(s,1H),11.1(s,1H),9.71(s,1H),8.62(d,J＝1.6Hz,1H),8.48(d,J＝1.6Hz,1H),7.77(d,J＝9.2Hz,1H),7.40(dd,J＝9.2 and 2.4Hz,1H),7.27(d,J＝8.8Hz,1H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),6.83(d,J＝2.0Hz,1H),6.39(d,J＝8.0Hz,1H),4.55-4.45(m,1H),2.86(q,J＝7.4Hz,1H),1.94(s,3H),1.49(d,J＝6.8Hz,3H),1.08(t,J＝7.4Hz,3H).
B-001(270MHz)；
δ13.37(s,1H),9.62(s,1H),9.54(s,1H),8.54(s,1H),8.47(d,J＝2.7Hz,1H),7.73(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),6.94(t,J＝8.1Hz,1H),6.37(d,J＝8.1Hz,1H),4.37(d,J＝8.1Hz,2H),2.66(q,J＝8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J＝8.1Hz,3H).
B-002(270MHz)；
δ13.41(s,1H),9.55(s,1H),9.53(s,1H),7.61(s,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),6.76(t,J＝8.1Hz,1H),6.41(t,J＝8.1Hz,1H),6.37(d,J＝8.1Hz,1H),6.29(d,J＝2.7Hz,1H),4.33(d,J＝5.4Hz,2H),2.64(q,J＝8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J＝8.1Hz,3H).
B-003(270MHz)；
δ13.44(s,1H),9.53(s,1H),9.52(s,1H),7.62(s,1H),7.60(d,J＝8.1Hz,1H),7.16(d,J＝8.1Hz,1H),6.63(t,J＝8.1Hz,1H),6.48(s,1H),6.37(d,J＝8.1Hz,1H),4.17(d,J＝2.7Hz,2H),2.64(q,J＝8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J＝8.1Hz,3H).
B-004(270MHz)；
δ13.39(s,1H),9.58(s,1H),9.54(s,1H),7.41(d,J＝2.7Hz,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),7.00(d,J＝5.4Hz,1H),6.97(t,J＝5.4Hz,1H),6.88(t,J＝8.1Hz,1H),6.37(d,J＝8.1Hz,1H),4.51(d,J＝8.1Hz,2H),2.65(q,J＝8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J＝8.1Hz,3H).
B-005(270MHz)；
δ13.44(s,1H),9.54(s,1H),9.53(s,1H),7.51(d,J＝5.4Hz,1H),7.34(s,1H),7.16(d,J＝8.1Hz,1H),7.09(d,J＝5.4Hz,1H),6.76(t,J＝8.1Hz,1H),6.37(d,J＝8.1Hz,1H),4.32(d,J＝5.4Hz,2H),2.64(q,J＝8.1Hz,2H),1.97(s,3H),1.07(t,J＝8.1Hz,3H).
B-006(270MHz)；
δ13.33(s,1H),9.67(s,1H),9.56(s,1H),8.45(s,1H),8.42(s,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,1H),7.16(d,J＝8.1Hz,1H),7.00(m,1H),6.36(d,J＝8.1Hz,1H),4.40(d,J＝5.4Hz,2H),2.66(q,J＝8.1Hz,2H),1.96(s,3H),1.06(t,J＝8.1Hz,3H).
B-007(270MHz)；
δ13.40(s,1H),9.56(s,1H),9.54(s,1H),8.48(s,1H),8.46(s,1H),7.71(m,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),7.00(d,J＝8.1Hz,1H),6.36(d,J＝10.8Hz,1H),4.93(m,1H),2.63(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.46(d,J＝8.1Hz,3H),1.09(t,J＝8.1Hz,3H).
C-001(270MHz)；
δ13.58(s,1H),11.11(s,1H),9.77(s,1H),8.30(s,1H),8.19(t,J＝2.7Hz,1H),7.35(d,J＝2.7Hz,1H),7.33(d,J＝2.7Hz,1H),7.29(d,J＝8.1Hz,1H),6.40(d,J＝8.1Hz,1H),5.20(q,J＝8.1Hz,1H),2.82(q,J＝8.1Hz,2H),1.95(s,3H),1.58(d,J＝8.1Hz,3H),1.06(t,J＝8.1Hz,3H).
〔试验例1〕本发明化合物对SKOV3细胞增殖的作用评价1
将人卵巢癌细胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)在含有15％胎牛血清(以下简称为FBS。Corning公司制)的McCoy’s5a培养基(Sigma-Aldrich公司制)中进行预培养(单层培养)。对处于对数生长期的上述细胞进行PBS清洗。对于粘附细胞而言,添加0.25％(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士膜和光纯药公司制),于37℃培养3分钟后剥离。添加上述培养基，离心后利用相同培养基进行再次悬浮。
按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(富士膜和光纯药公司制)，制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，三昌株式会社制)及15％(v/v)FBS、30ng/mL人EGF(PEPROTECH公司制)的McCoy’s5a培养基(SigmaAldrich公司制)的组合物。接着，将上文中制备的SKOV3细胞悬浮于上述的添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物中，然后，以每1孔成为2000个细胞/90μL/孔的方式分注至96孔平底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，#3474)的孔中。用上述培养基将溶解于二甲基亚砜中的本发明化合物稀释，以本发明化合物的最终浓度成为5μM、20μM、40μM的方式，分别每次添加10μL的该稀释液。向一部分的孔中仅添加二甲基亚砜(DMSO)作为对照组。各板在CO2培育箱(37℃，5％CO2)内以静置状态培养4天。针对第四天的培养液，添加ATP试剂100μL[CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制]，使用板式振荡器(Micro plate mixer NS-P，AS ONE Corporation.制)于室温搅拌2分钟，然后静置10分钟。向96孔平底白色板(Corning公司制，#3912)转移100μL，利用Enspire(PerkinElmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定活细胞的数量。以下记载将对照组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、各最终浓度下相对值显示125％以上的本发明化合物的化合物编号。
本发明化合物编号(5μM)：A-002、A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012。
本发明化合物编号(20μM)：A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-016、B-003、B-004、B-005及B-007。
本发明化合物编号(40μM)：A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-016、A-017、B-001、B-003、B-004、B-005、B-006及B-007。
〔试验例2〕本发明化合物对SKOV3细胞增殖的作用评价2
将与试验例1同样地进行了预培养的SKOV3细胞悬浮于15％FBS/McCoy’s5a培养基(Sigma Aldrich公司制)中，然后，以每1孔成为700个细胞/90μL/孔的方式分注于96孔U底微孔培养板(Corning公司制，#4515)的孔中。接着，用上述培养基分别稀释溶解于二甲基亚砜(DMSO)中的本发明化合物。以化合物的最终浓度成为10μM、20μM或40μM的方式，在上述的细胞悬浮液90μL中分别每次添加10μL的本稀释液。向一部分的孔中仅添加DMSO作为对照组。各板在CO2培育箱(37℃，5％CO2)内以静置状态培养4天。针对第四天的培养液，添加ATP试剂100μL(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)，用板式振荡器(AS ONE Corporation.制，Micro plate mixer NS-P)于室温搅拌2分钟，然后静置10分钟。向96孔平底白色板(Corning公司制，#3912)转移100μL，利用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定活细胞的数量。以下记载将对照组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、各最终浓度下相对值显示125％以上的本发明化合物的化合物编号。
本发明化合物编号(10μM)：A-004A、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
本发明化合物编号(20μM)：A-001、A-002、A-004、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012、A-013及B-005。
本发明化合物编号(40μM)：A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012、A-013、A-016、B-004及B-007。
〔试验例3〕本发明化合物对NIH3T3细胞增殖的作用评价1
将小鼠胚胎成纤维细胞株NIH3T3(ATCC公司制)在含有10％胎牛血清(以下简称为FCS。ATCC公司制)的DMEM培养基(ATCC公司制)中进行预培养(单层培养)。对处于对数生长期的上述细胞进行PBS清洗。对于粘附细胞而言，添加0.25％(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士膜和光纯药公司制)，于37℃培养3分钟后剥离。添加上述培养基，离心后利用相同培养基进行再次悬浮。
按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(富士膜和光纯药公司制)，制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，三昌株式会社制)及10％(v/v)FCS的DMEM培养基(ATCC公司制)的组合物。接着，将上文中制备的NIH3T3细胞悬浮于上述的添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物中，然后，以每1孔成为2000个细胞/90μL/孔的方式，分注于96孔平底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，#3474)的孔中。用上述培养基将溶解于二甲基亚砜中的本发明化合物稀释，以本发明化合物的最终浓度成为10μM的方式，分别每次添加10μL的该稀释液。向一部分的孔中仅添加二甲基亚砜(DMSO)作为对照组。各板在CO2培育箱(37℃，5％CO2)内以静置状态培养4天。针对第四天的培养液，添加ATP试剂100μL[CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent CellViability Assay，Promega公司制]，使用板式振荡器(Micro plate mixer NS-P，AS ONECorporation.制)，于室温搅拌2分钟，然后静置10分钟。向96孔平底白色板(Corning公司制，#3912)转移100μL，利用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定活细胞的数量。以下记载将对照组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、各最终浓度下相对值显示125％以上的本发明化合物的化合物编号。
本发明化合物编号(10μM)：A-004。
〔试验例4〕本发明化合物对MDCK细胞的作用的研究
将狗肾小管上皮细胞(MDCK细胞，DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)在含有10％FBS及1％NEAA的EMEM培养基中进行预培养。将冷Matrigel(注册商标)基质低生长因子(以下，有时记载为Matrix GFR。Corning公司制)在24孔板中各涂抹50μL，于37℃培养15分钟使其固化。将前述的MDCK细胞以11000个细胞/mL的浓度悬浮于培养基中，进而加入20μL/mL的冷Matrigel(注册商标)Matrix GFR，以0.9mL/孔进行接种。以最终浓度成为10μM、20μM、40μM的方式，每次添加0.1mL的溶解于培养基中的本发明化合物，在37℃、5％CO2的条件下，在培育箱中培养6天。将未加入本发明化合物而仅添加了DMSO使最终浓度成为0.1％的试验区作为对照。6天后，使用Cell3iMager(SCREEN Holdings Co.，Ltd.制)对形成的Cyst的大小及个数进行测定。以下述的计算式算出直径为80μm以上的Cyst在直径为30μm以上的Cyst中的比例(％)。
直径为80μm以上的Cyst的比例(％)
＝直径为80μm以上的Cyst数/直径为30μm以上的Cyst数×100
就作为对照的DMSO而言，直径为80μm以上的Cyst的比例为12％。此时，将各最终浓度下直径为80μm以上的Cyst的比例显示20％以上的本发明化合物的化合物编号记载于下文。
本发明化合物编号(10μM)：A-002、A-004、A-004A及B-005。
本发明化合物编号(20μM)：A-002、A-004及B-001。
本发明化合物编号(40μM)：B-004。
〔试验例5〕利用共聚焦荧光显微镜进行的Cyst的形态观察
针对包含Cyst(其是在试验例3所得到的添加了DMSO或A-004A(10μM)的培养基中培养而成的)的各Matrix GFR，用PBS清洗后(1mL/孔)添加4％多聚甲醛/PBS(富士膜和光纯药公司制)(1mL/孔)，于室温固定20分钟。然后，除去上清液，以1mL/孔添加染色缓冲液[含有0.2％TritonX-100(Sigma Aldrich公司制)、0.05％Tween20(Sigma Aldrich公司制)的PBS]，静置30分钟，除去。以1mL/孔添加渗透化缓冲液(0.5％Triton X-100(Sigma Aldrich公司制)/PBS)，于室温培养30分钟。除去上清液，用染色缓冲液清洗3次(每次间隔5分钟)，以0.5mL/孔添加封闭缓冲液[1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma Aldrich公司制)/染色缓冲液]，培养30分钟。除去上清液，在封闭缓冲液中，将抗β联蛋白抗体(BD Bioscience公司制)稀释100倍，以250μL/孔进行添加，于室温培养60分钟。用染色缓冲液清洗3次(每次间隔5分钟)，在封闭缓冲液中，将2次抗体(Alexa Fluor555，Thermo Fisher Scientific公司制)和Phalloidin(Alexa Fluor 488，Thermo Fisher Scientific公司制)各稀释250倍，以250μL/孔进行添加，在室温、遮光下培养60分钟。用染色缓冲液清洗3次(每次间隔5分钟)，然后滴加VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories公司制)，利用共聚焦荧光显微镜(FV1200 IX83，Olympus公司制)进行观察。由观察的结果确认了在化合物A-004A的存在下进行培养时，形成正常形态的Cyst(图1)。
〔试验例6〕本发明化合物对LATS1及LATS2的抑制活性评价
针对本发明化合物，进行对LATS1及LATS2(Carna Biosciences公司制)的抑制活性评价(激酶抑制率的计算)。活性测定使用以下记载的激酶活性分析法进行。以最终浓度成为100nM或1000nM的方式设定本发明化合物的试验浓度。
作为数据的分析方法，将包含本发明化合物以外的反应组分的对照孔的平均信号作为0％抑制，将未添加酶的平均信号作为100％抑制，根据各化合物的试验2孔的平均信号计算抑制率。
激酶活性分析法：
将在分析缓冲液(20mM HEPES，0.01％Triton X-100，2mM DTT、50μg/mL BSA，pH7.5)中制备的2μL的2.5倍浓度本发明化合物溶液、1μL的5倍浓度基质(SGKtide：NH2-CKKRNRRLSVA-COOH，SignalChem公司制)、ATP(Sigma Aldrich公司制)、MgCl2(富士膜和光纯药公司)溶液(最终浓度分别为10μM、400μM及5mM)及2μL的2.5倍浓度激酶溶液(LATS1或LATS2的最终浓度5μg/mL)在聚丙烯制384孔板(Greiner Bio-One公司制，#784900)的孔内混合，于室温反应5小时。向该溶液中添加5μL的检测溶液[Fluorospark(注册商标)Kinase/ADP Multi-Assay Kit；富士膜和光纯药公司制]，于室温反应30分钟。接着，添加5μL的反应停止液[Fluorospark(注册商标)Kinase/ADP Multi-Assay Kit；富士膜和光纯药公司制]使反应停止。然后，利用EnSpire(Perkin Elmer公司制)对反应溶液中的ADP浓度进行定量，检测激酶反应。算出基于本发明化合物的激酶抑制率，将抑制率显示40％以上的本发明化合物的化合物编号记载于下文。
对LATS1的抑制效果：
本发明化合物编号(100nM)：A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-006、A-007、A-007R、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-015、A-016、A-017、A-019及B-005。
本发明化合物编号(1000nM)：A-001、A-002、A-004、A-004A、A-004B、A-005、A-006、A-007、A-007R、A-008、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-015、A-016、A-017、A-018、A-019、A-020、B-001、B-002、B-003、B-004、B-005、B-006、B-007及C-001。
对LATS2的抑制效果：
本发明化合物编号(100nM)：A-001、A-002、A-004、A-004A、A-005、A-006、A-007、A-007R、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-016、A-017及B-005。
本发明化合物编号(1000nM)：A-001、A-002、A-004、A-004A、A-004B、A-005、A-006、A-007、A-007R、A-008、A-009、A-010、A-011、A-012、A-013、A-014、A-015、A-016、A-017、A-018、A-019、A-020、B-001、B-002、B-003、B-004、B-005、B-006、B-007及C-001。
〔试验例7〕本发明化合物对人间充质干细胞的作用
通过使用了间充质干细胞增殖培养基(PromoCell制)的单层培养，对来自骨髓的人间充质干细胞(BM-hMSC，PromoCell制)进行预培养。用HEPES-Buffered SalineSolution(PromoCell制)将上述细胞清洗后，添加0.04％胰蛋白酶/0.03％EDTA溶液(PromoCell制)，于室温静置3分钟后剥离，添加等量的TrypsinNeutralizing Solution溶液(PromoCell公司制)后将细胞回收。离心后除去上清液，在相同培养基中进行再次悬浮。
按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(富士膜和光纯药公司制)，制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，三昌株式会社制)的间充质干细胞增殖培养基(PromoCell公司制)的组合物。接着，将上文中制备的BM-hMSC细胞悬浮于上述的添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物中，然后，以成为6000个细胞/90μL/孔的方式接种于96孔平底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，#3474)(3D)。同样地，也使细胞悬浮于不含脱酰基结冷胶的培养基中，以各自成为2000个细胞/90μL/孔的方式，接种于96孔平底粘附表面微孔培养板(Corning公司制，#3585)及EZSPHERE(注册商标)-SP 96孔微孔培养板(AGC TECHNO GLASS公司制)(各自为2D，EZSPHERE)。接着，以最终浓度成为10或12.5μM的方式，以10μL/孔添加溶解于培养基的本发明化合物，在37℃、5％CO2的条件下，在培育箱中培养4天。将未加入本发明化合物而仅添加DMSO使最终浓度为0.1％的组作为对照。针对第四天的培养液，添加ATP试剂100μL[CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制]，用板式振荡器(Micro platemixer NS-P，As One公司制)，于室温搅拌2分钟，然后静置10分钟。向96孔平底白色板(Corning公司制，#3912)转移100μL，利用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定活细胞的数量。以下记载将对照组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、各最终浓度下相对值显示125％以上的本发明化合物的化合物编号。
2D培养条件
本发明化合物编号(10μM)：A-005及A-007。
本发明化合物编号(12.5μM)：A-002、A-001及A-004。
3D培养条件
本发明化合物编号(10μM)：A-005及A-007。
本发明化合物编号(12.5μM)：A-002、B-005、A-001及A-004。
EZSPHERE培养条件
本发明化合物编号(10μM)：A-005及A-007。
本发明化合物编号(12.5μM)：A-002、B-005、A-001及A-004。
〔试验例8〕本发明化合物对各种细胞的作用
如下所述，利用各培养基对各种细胞进行预培养。来自人肝癌的细胞株HuH-7(JCRB细胞库制，含有10％FBS的D-MEM)、来自狗肾小管上皮细胞的细胞株MDCK(DS PHARMABIOMEDICAL公司制，含有1％NEAA及10％FBS的E-MEM)、来自小鼠胎儿成纤维细胞的细胞株C3H 10T1/2(理研生物资源研究中心制，含有10％FBS的BME(ThermoFisher公司制))、来自中国仓鼠卵巢的细胞株CHO-K1(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制，含有10％FBS的Ham’sF12(富士膜和光纯药公司制))、来自非洲绿猴肾上皮细胞的细胞株Vero(JCRB细胞库制，含有5％FBS的Medium199(Sigma Aldrich公司制))、人脐带静脉内皮细胞株HUVEC(PromoCell公司制，Endothelial Cell Growth Medium(PromoCell公司制))。对处于对数生长期的上述细胞进行PBS清洗，然后，添加0.25％(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士膜和光纯药公司制)，于37℃培养2～8分钟后剥离。就HUVEC细胞而言，使用DetachKit(PromoCell公司制)，于室温培养3分钟，同样地剥离。添加各培养基后，进行离心，利用相同培养基进行再次悬浮后，以各单细胞进行回收。
按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(富士膜和光纯药公司制)，制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，三昌株式会社制)的各培养基的组合物。接着，将上文中制备的各种细胞悬浮于上述的添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物或者未添加脱酰基结冷胶的培养基中，然后，以每1孔成为700～2000个细胞/90μL/孔的方式，分注于96孔平底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，含有脱酰基结冷胶的培养基)或96孔U底超低粘附表面微孔培养板(Corning公司制，不含脱酰基结冷胶的培养基)的孔中。用上述培养基将溶解于二甲基亚砜中的本发明化合物稀释，以本发明化合物的最终浓度成为10μM的方式，分别每次添加10μL的该稀释液。向一部分的孔中仅添加二甲基亚砜(DMSO)作为对照组。各板在CO2培育箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养4天。针对第四天的培养液，添加ATP试剂100μL[CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制]，使用板式振荡器(Micro platemixer NS-P，As One公司制)于室温搅拌2分钟，然后静置10分钟。向96孔平底白色板(Corning公司制，#3912)转移100μL，利用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定活细胞的数量。以下记载将对照组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、各最终浓度下相对值显示125％以上的本发明化合物的化合物编号。
U底超低粘附表面微孔培养板：
本发明化合物编号(HuH-7细胞)：A-001、A-002、A-004、A-005及A-007。
本发明化合物编号(MDCK细胞)：A-001、A-002及A-004。
本发明化合物编号(10T1/2细胞)：A-001、A-002、A-004及B-005。
本发明化合物编号(Vero细胞)：A-001、A-004及A-007。
本发明化合物编号(HUVEC细胞)：A-001、A-002、A-004、A-005、A-007及B-005。
平底超低粘附表面微孔培养板：
本发明化合物编号(HuH-7细胞)：A-001、A-002、A-004、A-005及A-007。
本发明化合物编号(MDCK细胞)：A-001、A-002、A-004及B-005。
本发明化合物编号(10T1/2细胞)：A-004。
本发明化合物编号(CHO-K1细胞)：A-005及A-007。
本发明化合物编号(Vero细胞)：A-001、A-004及A-007。
本发明化合物编号(HUVEC细胞)：A-001、A-002、A-004、A-005、A-007及B-005。
〔试验例9〕本发明化合物在A431细胞悬滴培养法中的作用
通过使用了含有10％FBS及1％NEAA的EMEM培养基的单层培养，对来自人上皮样细胞癌的细胞株(A431，ATCC公司制)进行预培养。对处于对数生长期的上述细胞进行PBS清洗，然后，添加0.25％(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士膜和光纯药公司制)，于37℃培养3分钟后剥离。添加培养基，离心后除去上清液。接着，以成为50000个细胞/mL的方式再次悬浮于上述培养基中，进而，将溶解于DMSO中的本发明所使用的化合物以最终浓度成为10μM的方式添加于培养基中。将该细胞悬浮液以每次10μL的方式接种于35mm皿(Falcon公司制)的盖子的背面，合计15滴,制作液滴。此时，作为对照，将添加了DMSO的细胞悬浮液(DMSO浓度为0.05％)以每次10μL的方式合计接种15滴。将该盖子放回至添加了2mL的PBS的35mm皿，在37℃、5％CO2培育箱中培养2天。将经培养的液滴回收至1.5mL容量的管中，以最终量成为150μL的方式添加培养基。添加ATP试剂150μL[CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制]，用板式振荡器(Micro platemixer NS-P，As One公司制)于室温搅拌2分钟，然后静置10分钟。向96孔平底白色板(Corning公司制，#3912)转移100μL，用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定活细胞的数量。以下记载将对照组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、各最终浓度下相对值显示125％以上的本发明化合物的化合物编号。
本发明化合物编号(10μM)：A-001、A-002、A-004、A-005、A-007R及A-010。
〔试验例10〕本发明化合物对人多能性干细胞(hiPS细胞)的作用
在包被有iMatrix-511(Nippi公司制)的皿上，使用StemFit(注册商标)AK02N(味之素公司制)培养基，对hiPS细胞253G1(由理化学研究所出售)进行培养。对处于对数生长期的上述细胞进行PBS清洗后，添加0.5mmоl/L-EDTA/PBS溶液(NacalaiTesque公司)，于37℃培养8-10分钟后剥离。添加上述培养基，离心后除去上清液，利用相同培养基进行再次悬浮。将上述细胞悬浮于含有10μM的Y-27632(富士膜和光纯药公司制)的培养基中，以16000个细胞/180μL/孔接种于96孔EZSPHERE-SP板(AGC TECHNO GLASS公司制)。接种后，用上述培养基将溶解于二甲基亚砜中的本发明化合物稀释，以本发明化合物的最终浓度成为12.5μM的方式，分别每次添加20μL该稀释液。向一部分的孔中仅添加二甲基亚砜(DMSO)作为对照组。各板在CO2培育箱(37℃，5％CO2)内培养，每天将一半量(100μL)的培养基上清液更换为以上述浓度添加了化合物的新培养基，同时培养4天。使用移液器，从第四天的培养液200μL中平稳地抽吸除去100μL的上清液，添加ATP试剂100μL[CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制]，使用板式振荡器(Micro platemixer NS-P，As One公司制)于室温搅拌2分钟，然后静置10分钟。向96孔平底白色板(Corning公司制，#3912)转移100μL，用Enspire(Perkin Elmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定活细胞的数量。以下记载将对照组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、各最终浓度下相对值显示125％以上的本发明化合物的化合物编号。
本发明化合物编号(12.5μM)：A-001、A-002、A-004及A-005。
〔试验例11〕本发明化合物的抑制YAP磷酸化的作用
将人卵巢癌细胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)在含有15％FBS的McCoy’s5a培养基(Sigma Aldrich公司制)中进行预培养(单层培养)。对处于对数生长期的上述细胞进行PBS清洗。对于粘附细胞而言，添加0.25％(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士膜和光纯药公司制)，于37℃培养3分钟后剥离。添加上述培养基，离心后利用相同培养基进行再次悬浮。
按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(富士膜和光纯药公司制)，制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，三昌株式会社制)的含10％FBS的DMEM培养基(不含Phenol-red，富士膜和光纯药公司制)的组合物。接着，将上述制备的各种细胞悬浮于上述的添加了脱酰基结冷胶的培养基组合物(3D培养条件)或者未添加脱酰基结冷胶的培养基(2D培养条件)中，然后，以成为100000个细胞/孔的方式，接种于50μL/孔(Corning公司制，96孔平底板，#3585，2D培养条件)或25μL/孔(Corning公司制，96孔低粘附平底板，#3474)。在37℃、5％CO2培育箱中静置，从接种起3小时后，将利用培养基以最终浓度的2倍或6倍的浓度进行了稀释的本发明化合物、DMSO、或仅培养基以50μL/孔(2D培养条件)、5μL/孔(3D培养条件)的条件添加于板，使各化合物的最终浓度为10μM。进而，在37℃、5％CO2培育箱中培养1小时后，在2D培养条件下，对上清液进行抽吸，添加辅助裂解缓冲液(1倍浓度，Cisbio公司制，YAP-total套装或YAP phospho-S27套装)50μL，在3D培养条件下，将辅助裂解缓冲液(4倍浓度)10μL添加于培养上清液中，用板式振荡器搅拌30分钟。然后，将板离心，将上清液16μL转移至384孔白色板(Corning公司，#4512)，以合计4μL/孔添加套装附带的各抗体溶液(pYAP d2抗体或Total-YAP d2抗体、和pYAP Cryptate抗体或Total-YAP Cryptate抗体)，于室温静置一夜。作为空白对照组，向未进行化合物刺激的细胞仅添加pYAP Cryptate抗体或Total-YAP Cryptate抗体，同样地进行处理。第二天，利用EnVision(Perkin Elmer公司制)的HTRF模式，测定665nm及615nm波长。
以下述方式对得到的信号进行计算。比例＝信号(665nm)/信号(615nm)×10000、ΔR＝信号(比例)-背景荧光。表7及8(2D培养)、表9及10(3D培养)中示出了将未添加化合物的组(未处理)的ΔR作为100％时的各化合物的相对磷酸化YAP量或总YAP量。由该结果显示，本发明化合物在2D、3D这两种培养条件下均具有抑制YAP磷酸化的作用。
[表7]
2D培养条件
Figure BDA0003182630120000691
[表8]
Figure BDA0003182630120000692
[表9]
3D培养条件
Figure BDA0003182630120000701
[表10]
Figure BDA0003182630120000702
〔试验例12〕对HeLa、人原代表皮角化细胞及HUVEC细胞的粘附促进作用
使用以下所示的各培养基，对各种来自人的细胞进行培养。来自人宫颈癌的细胞株HeLa(ATCC公司制，含有10％FBS(Corning公司制)的DMEM(和光纯药工业公司制))、人脐带静脉内皮细胞株HUVEC(PromoCell公司制，Endothelial Cell Growth Medium(PromoCell公司制))、人原代表皮角化细胞(American Type Culture Collection(ATCC)、#PCS-200-010，添加了角质细胞用添加物套装(ATCC、#PCS-200-040)的表皮细胞系基础培养基(ATCC、#PCS-200-030))。用PBS对处于对数生长期的上述细胞进行清洗后，就HeLa而言，添加0.25w/v％胰蛋白酶-1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(和光纯药工业公司制)，于37℃培养3分钟后剥离，添加各培养基，离心后除去上清液；就HUVEC及人原代表皮角化细胞而言，使用DetachKit(PromoCell公司制)，于室温培养3分钟后剥离，添加各培养基，离心后除去上清液。然后，利用相同培养基进行再次悬浮后，将一部分悬浮于台盼蓝(和光纯药工业公司制)中，使用TC-20(BIO-RAD公司制)对活细胞的数量进行计数。
将溶解于DMSO的本发明化合物溶液以最终浓度成为10μM的方式添加于悬浮有HeLa及HUVEC的各培养基中，以8000个细胞/100μL/孔各接种于96孔粘附板(Corning公司制，#3585)。另外，将溶解于DMSO中的本发明化合物溶液以最终浓度成为10μM的方式添加于悬浮有人原代表皮角化细胞的各培养基中，以19000个细胞/190μL/孔各接种于48孔粘附板(Corning公司制，#3548)。作为对照，接种添加了DMSO的细胞悬浮液(DMSO最终浓度0.1％)。将该板在37℃、5％CO2培育箱中静置培养30分钟(HeLa及HUVEC)或60分钟(人原代表皮角化细胞)后，将培养液抽吸，使用PBS进行2次清洗，由此将未粘附于培养板的细胞除去，然后以100或200μL/孔添加各培养基。接着，对培养液添加等量的ATP试剂(CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)并使其悬浮，于室温静置10分钟。进而，使用EnSpire(PerkinElmer公司制)测定发光强度(RLU值)，减去培养基本身的发光值，由此测定吸附于板的细胞数。以下示出将仅添加了DMSO的组的RLU值(ATP测定，发光强度)作为100％时、显示120％以上的值的化合物。由该结果显示，本发明化合物具有细胞粘附促进效果。
对HeLa的细胞粘附促进效果(120％以上)：
本发明化合物编号：A-001、A-002、A-004、A-005、A-007及B-005。
对HeLa的细胞粘附促进效果(150％以上)：
本发明化合物编号：A-001、A-002、A-007及B-005。
对HUVEC的细胞粘附促进效果(120％以上)：
本发明化合物编号：A-001、A-002、A-004、A-007及B-005。
对人原代表皮角化细胞的细胞粘附促进效果(200％以上)：
本发明化合物编号：A-004、A-004A及A-007。
〔试验例13〕使用了人角膜上皮细胞的细胞增殖试验
就人原代角膜上皮细胞(ATCC，#PCS-700-010)而言，使用添加了角膜上皮细胞系添加物套装(ATCC，#PCS-700-040)的角膜上皮细胞系基础培养基(ATCC，#PCS-700-030)，利用单层培养法进行预培养。将角膜上皮细胞悬浮于相同培养基中，然后以最终浓度成为10μM的方式(关于A-011及A-012，最终浓度为5μM)，分别添加溶解于DMSO中的本发明化合物，在单层培养(2D培养条件)中，以成为700个细胞/64μL/孔的方式接种于96孔平底板(Corning公司，#3585)。在三维培养法(3D培养条件)中，以成为700个细胞/64μL/孔的方式接种于96孔U底细胞低粘附板(Corning公司，#4520)中。将这些板在37℃、5％CO2培育箱中培养4天。作为对照，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。培养后，使用ATP试剂(Promega公司，CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay)，计算活细胞的数量。对于平底板的培养液，以64μL/孔添加ATP试剂并使其悬浮，将悬浮液以100μL/孔转移至分析用白色板(Corning公司，#3912)。于室温静置10分钟后，使用平板计数器(PerkinElmer公司，EnSpire)测定发光量。
对于测得的发光量，算出相对于对照组(DMSO)的相对值，结果，通过添加下述编号的化合物，在2D培养条件下发光量增加1.2倍以上，在3D培养条件下增加4倍以上。即，通过添加下述的化合物，细胞数增加1.2倍以上，显示本发明化合物具有促进人角膜上皮细胞增殖的效果。
细胞数增加1.2倍以上的本发明化合物编号(2D培养条件)：
A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012及A-016。
细胞数增加2倍以上的本发明化合物编号(2D培养条件)：
A-004、A-004A及A-007。
细胞数增加4倍以上的本发明化合物编号(3D培养条件)：
A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
〔试验例14〕使用了牛角膜内皮细胞的细胞增殖试验
使用添加了10％牛血清(ATCC，#30-2030)的DMEM(ATCC，#30-2002)，对牛角膜内皮细胞株BCE C/D-1b(ATCC，#CRL-2048)进行预培养。将角膜内皮细胞悬浮于相同培养基后，在单层培养法(2D培养条件)中，以成为700个细胞/90μL/孔的方式接种于96孔平底板(Corning公司，#3585)。在三维培养法(3D培养条件)中，以成为700个细胞/90μL/孔的方式接种于96孔U底细胞低粘附板(Corning公司，#4520)。接着，以最终浓度成为10μM的方式，以10μL/孔添加溶解于DMSO中的本发明化合物，在37℃、5％CO2培育箱中培养4天。作为对照，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。培养后，使用ATP试剂(Promega公司，CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay)，计算活细胞的数量。对于培养液，以100μL/孔添加ATP试剂并使其悬浮，将悬浮液以100μL/孔转移至分析用白色板(Corning公司，#3912)。于室温静置10分钟后，使用平板计数器(PerkinElmer公司，EnSpire)测定发光量。
关于测得的发光量，算出2D及3D各培养条件下的相对于对照组(DMSO)的相对值，结果，通过添加下述的化合物，在2D条件下，发光量增加1.2倍以上，在3D条件下增加2倍以上。即，通过添加下述编号的化合物，细胞数增加2倍以上。由此显示，本发明化合物具有促进角膜内皮细胞增殖的效果。
细胞数增加1.2倍以上的本发明化合物编号(2D培养条件)：A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
细胞数增加4倍以上的本发明化合物编号(3D培养条件)：A-007、A-007R及A-012。
细胞数增加3倍以上的本发明化合物编号(3D培养条件)：A-004A、A-007、A-007R、A-010及A-012。
细胞数增加2倍以上的本发明化合物编号(3D培养条件)：A-004、A-004A、A-007、A-007R、A-010、A-011及A-012。
〔试验例15〕使用了人原代表皮角化细胞的细胞增殖试验
就人原代表皮角化细胞(ATCC，#PCS-200-010)而言，使用添加了角质细胞用添加物套装(ATCC，#PCS-200-040)的表皮细胞系基础培养基(ATCC，#PCS-200-030)，利用单层培养法进行预培养。将表皮角化细胞悬浮于相同培养基中，然后以最终浓度成为10μM的方式，分别添加溶解于DMSO中的本发明化合物，以成为700个细胞/64μL/孔的方式接种于96孔U底细胞低粘附板(Corning公司，#4520)。在37℃、5％CO2培育箱中培养4天。作为对照，以最终浓度成为0.1％的方式添加DMSO。培养后，使用ATP试剂(Promega公司，CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay)，计算活细胞的数量。对于平底板的培养液，以64μL/孔添加ATP试剂并使其悬浮，将悬浮液以100μL/孔转移至分析用白色板(Corning公司，#3912)。于室温静置10分钟后，使用平板计数器(PerkinElmer公司，EnSpire)测定发光量。
关于测得的发光量，算出相对于对照组(DMSO)的相对值，结果，通过添加下述编号的化合物，发光量增加4倍以上。即，通过添加下述编号的化合物，细胞数增加4倍以上。由此显示，本发明化合物具有促进角膜内皮细胞增殖的效果。
细胞数增加4倍以上的本发明化合物编号：A-004、A-004A及A-007。
细胞数增加6倍以上的本发明化合物编号：A-004A及A-007。
〔试验例16〕本发明化合物对SKOV3细胞、人原代角膜上皮细胞及人原代表皮角化细胞的基因表达的作用
与试验例13(使用了人原代角膜上皮细胞的增殖评价)同样地，针对人原代角膜上皮细胞(ATCC，#PCS-700-010)，使用添加了角膜上皮细胞系添加物套装(ATCC，#PCS-700-040)的角膜上皮细胞系基础培养基(ATCC，#PCS-700-030)，利用单层培养法进行预培养。另外，针对人原代表皮角化细胞，也与试验例15(使用了人原代表皮角化细胞的增殖评价)同样地，使用添加了角质细胞用添加物套装(ATCC，#PCS-200-040)的表皮细胞系基础培养基(ATCC，#PCS-200-030)，利用单层培养法，对人原代表皮角化细胞(ATCC，#PCS-200-010)进行预培养。以成为50,000个细胞/380μL/孔的方式，将角膜上皮细胞及表皮角化细胞接种于24孔平底板(Corning公司，#3526)，在37℃、5％CO2培育箱中培养24小时。接着，更换为以最终浓度成为10μM的方式添加有溶解于DMSO中的本发明化合物的培养基(关于A-011及A-012，最终浓度为5μM)，进一步培养24小时。培养后，将细胞培养液除去，以500μL/孔添加D-PBS(富士膜和光纯药株式会社，#049-29793)，并除去。接着，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司制)，从细胞中分离出所有RNA(核糖核酸)。对于该RNA，实施使用了TaqmanAssay(AppliedBioSystems公司)的基因表达分析，对由添加本发明化合物引起的YAP及TAZ蛋白质下游的人基因表达的变化进行分析。将分析得到的基因名和使用的探针的AssayID示于下文。
Figure BDA0003182630120000751
将人卵巢癌细胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)在含有15％FBS的McCoy’s5a培养基(Sigma Aldrich公司制)中进行预培养(单层培养)。对处于对数生长期的上述细胞进行PBS清洗。对于粘附细胞，添加0.25％(w/v)胰蛋白酶-1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)溶液(富士膜和光纯药公司制)，于37℃培养3分钟后剥离。添加上述培养基，离心后利用相同培养基进行再次悬浮。
按照专利文献1(WO2014/017513)的方法，使用FCeM-series Preparation Kit(富士膜和光纯药公司制)，制备含有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA，三昌株式会社制)的含15％FBS的McCoy’s5a培养基的组合物，以最终浓度成为30ng/mL的方式添加EGF(PeproTech公司制)。接着，将上文中制备的细胞悬浮于上述的添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物中，然后，以成为300000个细胞/1mL/孔的方式，接种于超低粘附表面24孔板(Corning公司制，#3473)。在37℃、5％CO2培育箱中静置一夜后，将本发明化合物、DMSO、或仅培养基添加于板上，使各化合物的最终浓度为10μM。在添加化合物后24小时将细胞和培养液从板回收至管。添加冷D-PBS(富士膜和光纯药株式会社，#049-29793)，以400g离心3分钟，将上清液除去。接着，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司制)，从细胞中分离出所有RNA(核糖核酸)。对于该RNA，实施使用了TaqmanAssay(AppliedBioSystems公司)的基因表达分析，对由添加特定化合物引起的YAP及TAZ蛋白质下游的人基因表达的变化进行分析。将分析得到的基因名和使用的探针的AssayID示于下文。
Figure BDA0003182630120000761
对于得到的表达量，算出相对于GAPDH的相对值。此处，进一步算出将添加DMSO时的相对值(表达量)设为1时的、添加本发明化合物时的相对表达量。结果，与对照组(DMSO)相比，通过添加本发明化合物，相对表达量增加。即可知，关于通过YAP蛋白质来控制表达的基因，本发明化合物具有使其表达量上升的效果。
CYR61相对表达量增加2倍以上的本发明化合物编号(人原代角膜上皮细胞)：A-004、A-004A、A-005、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012及A-016。
CYR61相对表达量增加2倍以上的本发明化合物编号(人原代表皮角化细胞)：A-004、A-004A及A-007。
CYR61相对表达量增加30倍以上的本发明化合物编号(SKOV3细胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
ANKRD相对表达量增加2倍以上的本发明化合物编号(人原代角膜上皮细胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
ANKRD相对表达量增加5倍以上的本发明化合物编号(人原代角膜上皮细胞)：A-004、A-004A、A-007及A-007R。
ANKRD相对表达量增加5倍以上的本发明化合物编号(人原代表皮角化细胞)：A-004、A-004A及A-007。
ANKRD相对表达量增加100倍以上的本发明化合物编号(SKOV3细胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
CCND1相对表达量增加1.5倍以上的本发明化合物编号(人原代角膜上皮细胞)：A-004、A-007、A-007R、A-010、A-011、A-012及A-016。
CCND1相对表达量增加1.5倍以上的本发明化合物编号(人原代表皮角化细胞)：A-004、A-004A及A-007。
CCND1相对表达量增加4倍以上的本发明化合物编号(SKOV3细胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
CTGF相对表达量增加20倍以上的本发明化合物编号(SKOV3细胞)：A-004、A-004A、A-007、A-007R及A-010。
〔试验例17〕本发明化合物对YAP蛋白质及TAZ蛋白质的核内转移的作用
针对本发明化合物，进行对YAP蛋白质及TAZ蛋白质的核内转移的评价。就核内转移而言，使用人卵巢癌细胞株SKOV3(DS PHARMA BIOMEDICAL公司)，通过下文记载的使用了OperettaCLS(PerkinElmer公司)的成像分析来进行。就本发明化合物的试验浓度而言，以最终浓度成为10μM的方式添加。
成像分析：
将按照DS PHARMA BIOMEDICAL公司推荐的规程培养的人卵巢癌细胞株SKOV3以成为15,000细胞/90μL/孔的方式接种于环烯烃底面的96孔板(PerkinElmer公司，CellCarrier-Ultra)，在CO2培育箱(37℃，5％CO2)内培养1天。培养后，分别添加溶解于DMSO中的本发明所使用的特定化合物的溶液。进而在37℃的CO2培育箱中培养4小时，将培养基更换为4％多聚甲醛，于室温静置10分钟，由此将细胞固定。针对已固定的细胞，使用AlexaFluor(R)647标记YAP抗体(CellsignalingTechnology公司)、抗小鼠TAZ(D-8)抗体(SantaCruz公司)、AlexaFluor(R)555标记抗小鼠IgG抗体(ThermoFisherScientific公司)，按照CellsignalingTechnology公司推荐的规程进行免疫染色，进而利用10μg/mL的Hoechst33342溶液将细胞核染色。
使用OperettaCLS的20倍物镜，每1个孔拍摄9个视野。根据得到的荧光图像，使用分析软件Harmony(PerkinElmer公司)，分别鉴定出细胞核区域和细胞质区域，提取各区域内的YAP蛋白质-AlexaFluor(R)647荧光强度以及TAZ蛋白质-AlexaFluor(R)555荧光强度。进而，根据提取的值，算出细胞核区域的荧光强度相对于细胞质区域的荧光强度而言的比例。此次，将荧光强度比为1.4以上的情况定义为YAP蛋白质及TAZ蛋白质转移至核内的细胞群，算出其比例。
关于算出的细胞群的比例，算出相对于对照组(DMSO)的相对值，结果，通过添加下述编号的化合物，关于YAP蛋白质，细胞群增加5倍以上，关于TAZ蛋白质，细胞群增加1.5倍以上。由此可知，本发明化合物具有促进YAP蛋白质及TAZ蛋白质的核内转移的作用。
YAP蛋白质发生核内转移的细胞群增加5倍以上的本发明化合物编号：
A-004、A-004A及A-007。
TAZ蛋白质发生核内转移的细胞群增加1.5倍以上的本发明化合物编号：
A-004、A-004A及A-007。
[试验例18]对小鼠肝部分切除模型中的肝重量增加的作用
以下述记载的方式制作小鼠肝脏被部分切除的肝部分切除模型，通过比较刚切除后的肝重量和切除3天后的肝重量，对本发明化合物的肝重量增加效果进行评价。
评价样品：
对0.5w/v％甲基纤维素水溶液(0.5％MC，富士膜和光纯药制)及A-007进行评价。就A-007而言，悬浮于0.5％MC，以最终浓度成为1mg/mL的方式制备。
步骤：
小鼠为BALB/cAnNCrlCrlj(5周，雄性)，其购自日本Charles River(株)。就0.5％MC施予-对照组而言，向腹腔内单次施予0.5％MC10mL/kg，24小时后将肝脏全部摘出并测定肝重量(n＝3)。此处，所谓对照组，是指未除去肝脏的组。另外，就0.5％MC-肝切除组而言，每24小时向腹腔内施予0.5％MC 10mL/kg，连续施予共计4次。
在第二次施予后立刻在异氟醚(株式会社Interbet)麻醉下开腹，使用缝合线将肝脏叶的根部结扎，将经结扎的叶的前端切除，由此最终将肝脏的30％左右除去。然后，合腹，在从最终施予起24小时后，将肝脏全部摘出，测定肝重量(n＝3)。就A-007施予-对照组而言，将10mg/kg的A-007向腹腔内单次施予，在24小时后将肝脏全部摘出，测定肝重量(n＝3)。另外，就A-007-肝切除组而言，每24小时向腹腔内施予10mg/kg的A-007，连续施予合计4次。在第二次施予后立刻在异氟醚麻醉下开腹，使用缝合线将肝脏叶的根部结扎，将经结扎的叶的前端切除，由此最终将肝脏的30％左右除去。然后，合腹，在从最终施予起24小时后，将肝脏全部摘出，测定肝重量(n＝3)。
作为本试验的结果，在图2中示出施予了0.5％MC、A-007的肝部分切除小鼠的肝体重比的变化。如图2所示，可知A-007具有促进肝重量增加的作用。
[实施例19]大肠炎模型小鼠的炎症抑制效果
以下述方式制作施予了葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium，DSS，富士膜和光纯药制)的大肠炎模型。另外，就大肠炎的评价而言，使用大肠的长度作为形态学参数，根据炎症的程度，大肠缩短。因此，通过比较大肠的长度来评价化合物的炎症抑制效果。
评价样品：
缓冲液使用向0.5w/v％甲基纤维素水溶液(富士膜和光纯药制)中以成为1v/v％的方式添加二甲基亚砜(富士膜和光纯药制)而成的溶液。将化合物A-004A以成为5mg/mL的方式悬浮于上述缓冲液而制备。
步骤：
小鼠为C57BL/6NCrl(6周，雄性)，其购自日本Charles River(株)。就饮用水而言，自由饮用蒸馏水或2.5w/v％DSS水溶液。将DSS饮水开始日作为第一天，饮水至第8天。从第一天起，每隔24小时将50mg/kg的化合物A-004A施予至腹腔内。作为阴性对照，同样地仅施予缓冲液。在第8天进行解剖，摘出大肠，测定大肠的长度。各组实施3-4例。
作为本试验的结果，图3中示出施予了缓冲液、化合物A-004A的小鼠的大肠的长度。如图3所示，与蒸馏水饮水组相比，DSS饮水-缓冲液施予组的大肠更短，但DSS饮水-化合物A-004A施予组抑制了大肠的缩短。由此可知，化合物A-004A具有抑制由DSS引起的大肠炎发病的效果。
[实施例20]对小鼠肠管类器官培养的作用
从日本Charles River(株)购入7周的雄性C57BL/6N小鼠。在驯养期后，在麻醉下摘出小肠及结肠。针对摘出的小肠、结肠，按照IntestiCult(商标)Organoid GrowthMedium的规程，将隐窝(crypt)回收。具体而言，用1mL的冷PBS对肠管内进行清洗，然后沿纵向切开，用1mL冷PBS清洗3次。将肠管转移至装满冷PBS的10cm陪替氏培养皿中，再次充分洗涤，一边切成2mm切片，一边转移至加入有15mL冷PBS的50mL管中。用10mL移液器将切片搅拌3次，静置30秒后(切片沉降后)，平稳地除去上清液，将其反复进行15次以上。除去上清液后，利用25mL的Gentle Cell Dissociation Reagent(STEMCELL Technologies公司)，一边于室温以20rpm搅拌15分钟(小肠)或20分钟(结肠)，一边培养。静置，切片沉降后除去上清液，用10mL的0.1％BSA/冷PBS搅拌3次，切片沉降后取上清液，从70μm的细胞过滤器通过，回收至管中。将其进一步重复三次，制作了Flaction1～4。于4℃离心290g×5分钟，将上清液除去，用10mL的0.1％BSA/冷PBS再次悬浮，转移至15mL管。于4℃离心200g×3分钟，将上清液除去，制作粒料。向前述的粒料中添加10mL的冷DMEM/F-12培养基，再次悬浮，将其中的1mL转移至6孔板，在显微镜下进行观察，分别确定了包含大量隐窝的Flaction。在显微镜下，对10μL悬浮液中包含的隐窝数进行计数并确定浓度，以成为800隐窝/管的方式分注于15mL管中，在4℃、200g的条件下离心5分钟。除去上清液，将200μL的IntestiCult(商标)Organoid Medium添加于各管中，进行搅拌。进而添加200μL Matrigel GFR(Corning公司)并混合后，向预先加热至37℃的24孔板中各分注50μL，在37℃培育箱中加热10分钟，使其固化成圆顶状。将750μL的IntestiCult(商标)Organoid Medium添加于各孔中，添加溶解于DMSO中的A-007使其最终浓度为10μM(以DMSO换算计，为0.025％以下)。此时，向一部分的孔中仅添加DMSO作为对照组。接着，在37℃、5％CO2培育箱中静置培养，每隔2-3天更换培养基。经时地利用Cell3iMager duos(SCREEN Holdings Co.，Ltd.)对类器官进行图像分析。在图像分析中，于培养的第一天，测定直径30-200μm的隐窝数作为接种隐窝数，然后，对经时地生长为70μm以上的隐窝数进行计数，将其作为类器官，算出来自隐窝的类器官形成率。此时，算出同时计量的类器官的平均直径。将类器官形成率(％)及平均直径(μm)示于下表。
[表11]
Figure BDA0003182630120000821
另外，将培养第9天的小肠类器官及培养第21天的结肠类器官的培养上清液除去，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司制)，从细胞中分离出全部RNA(核糖核酸)。针对该RNA，使用Takara-Bio公司制造的PrimeScript RT Master Mix来合成cDNA，实施使用了TaqmanAssay(AppliedBioSystems公司)的基因表达分析，对添加了DMSO或A-007的类器官中的小肠、结肠或肠管特异性基因的表达量进行分析。进而，与作为内部标准的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Gapdh)的表达量进行比较。以下示出将Gapdh的表达量设为1时相对表达量被确认为0.5以上的基因和样品。
小肠类器官
小肠特异性基因Lyz1：DMSO，A-007。
结肠类器官
结肠特异性基因Muc2：DMSO，A-007。
小肠类器官及结肠类器官
肠管特异性基因Vil1：DMSO，A-007。
根据以上的结果可知，A-007大幅改善小鼠小肠及结肠类器官的形成率，还确认了平均直径增大。另外，确认了形成的小肠及结肠类器官分别表达部位特异性标志物基因。由以上内容可知，A-007显示出促进肠管类器官形成的效果。
产业上的可利用性
根据本发明，能够实现细胞增殖的促进。由本发明制备的细胞等例如在创新药物领域中非常有用。另外，根据本发明，能够治疗与细胞增殖不完全相伴的疾病或组织损伤。
本申请以在日本提出申请的日本特愿2019-014899(申请日：2019年1月30日)及日本特愿2019-103322(申请日：2019年5月31日)为基础，它们的内容全部包括在本说明书中。

Claims (20)

1.式(I)表示的酰肼化合物或其盐，
[化学式1]
Figure FDA0003182630110000011
式(I)中，X为-N(R5)C(R2)(R3)-、-C(R2)(R3)N(R5)-或-C(R2)(R3)O-，
W表示以下的D-1、D-2、D-3、D-4、D-5、D-6、D-7、D-8、D-9、D-10、D-11、D-12中的任一者所示的环，
[化学式2]
Figure FDA0003182630110000012
[化学式3]
Figure FDA0003182630110000013
R1为C1～C6烷基或卤代(C1～C6)烷基，
R2及R3各自独立地为氢原子或C1～C6烷基，
R4及R5各自独立地为氢原子或C1～C6烷基，
Ra为羟基、硝基、卤素原子、C1～C6烷基、卤代(C1～C6)烷基、C2～C6链烯基、C2～C6炔基、C1～C6烷氧基、卤代(C1～C6)烷氧基、C1～C6烷基硫基、卤代(C1～C6)烷基硫基、C1～C6烷基亚磺酰基或C1～C6烷基磺酰基，
m为0、1、2、3或4，
p为0、1、2或3，
r为0或1。
2.如权利要求1所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-C(R2)(R3)N(R5)-，
W为D-1、D-2或D-3中任一者所示的环，
R4及R5为氢原子，
Ra为C1～C6烷基或卤素原子，
m为0或1，
r为0。
3.如权利要求1所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-N(R5)C(R2)(R3)-，
W为D-2、D-4、D-5、D-6或D-7中任一者所示的环，
R2、R3、R4及R5为氢原子，
p、m及r为0。
4.如权利要求1所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-C(R2)(R3)O-，
W为D-2所示的环，
m及r为0。
5.如权利要求1所述的酰肼化合物或其盐，其中，
X为-C(R2)(R3)N(R5)-，
W为D-8、D-9、D-10、D-11或D-12中的任一者所示的环，
R4及R5为氢原子，
p为0。
6.培养基添加用组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
7.如权利要求6所述的培养基添加用组合物，其用于促进细胞增殖。
8.如权利要求7所述的培养基添加用组合物，其中，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。
9.如权利要求6所述的培养基添加用组合物，其用于促进球状体形成、胞囊形成或类器官形成。
10.如权利要求6所述的培养基添加用组合物，其用于移植用细胞或移植用类器官的制造。
11.如权利要求6所述的培养基添加用组合物，其用于促进细胞粘附。
12.细胞培养培养基，其包含权利要求1至5中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
13.促进细胞增殖的方法，其包括将权利要求1至5中任一项所述的酰肼化合物或其盐添加至细胞培养培养基的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其中，细胞选自由正常细胞株、癌细胞株及干细胞组成的组。
15.促进细胞粘附的方法，其包括将权利要求1至5中任一项所述的酰肼化合物或其盐添加至细胞培养培养基的步骤。
16.激酶抑制剂，其包含权利要求1至5中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
17.如权利要求16所述的激酶抑制剂，其中，激酶为LATS。
18.Hippo信号传导通路抑制剂，其包含权利要求1至5中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
19.药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的酰肼化合物或其盐。
20.如权利要求19所述的药物组合物，其用于治疗眼、肝脏、皮肤或肠的疾病。
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