WO2016047738A1

WO2016047738A1 - 抗癌剤のスクリーニング方法

Info

Publication number: WO2016047738A1
Application number: PCT/JP2015/077057
Authority: WO
Inventors: 達朗金木; 泰斗西野
Original assignee: 日産化学工業株式会社
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2016-03-31
Also published as: TW201619375A; JPWO2016047738A1

Abstract

　本発明は、接着性がん細胞を、トランスフォーミング増殖因子等の増殖因子、及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、接着性癌細胞の培養方法を提供する。また、本発明は、癌腫細胞を、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮系様形質の維持方法を提供する。更に、本発明は、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子、及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮間葉転換の誘導方法を提供する。

Description

抗癌剤のスクリーニング方法

　本発明は、細胞又は組織を浮遊培養することが可能な培地組成物を用いた癌細胞の培養方法や抗癌剤のスクリーニング方法等に関する。

　抗癌剤の研究開発或いは癌治療における適切な抗癌剤の選択のために、候補薬剤或いは抗癌剤を含有する培養液中で癌細胞を生体外で培養することによって、癌細胞に対する薬剤の抗癌活性を評価することが行われている。しかし、既存の抗癌活性の評価方法では、生体外では抗癌活性を示す薬剤が、生体内に投与した時には低い効果しか得られないため使用されない場合があるなど、生体外での評価結果と実際の臨床効果に乖離があると言う不具合が起きていた。最近では、ＥＧＦやＴＧＦ－βなどの増殖因子に対する受容体をターゲットにした抗癌剤開発（分子標的薬）が盛んに行われている。特に増殖因子による癌細胞の増殖や血管新生および形質変換（ＥＭＴ：上皮間葉転換）を評価する際に、既存の単層培養による細胞を用いた評価方法では、増殖因子の効果を引き出せないことが報告されていた。このことは、増殖因子受容体をターゲットにした分子標的薬の研究開発においても、多数の候補薬剤の中から、従来の評価方法で薬剤の有効性を決めても、実際の臨床における抗癌効果とは一致しないことが多く、研究開発に大きな障害となっていた。また新しい抗癌剤を開発する際に、有用な増殖因子による細胞試験を実施できないことが大きな課題となっていた。

　以上の様な抗癌活性の評価方法に関する問題を改善するため、体内環境をできるだけ再現した細胞培養条件にて活性評価を行う手法が開発されてきた。例えば、軟寒天、コラーゲンゲル、ハイドロゲル等の支持体にて癌細胞を包埋することにより、培養容器への接着を阻害した環境にて癌細胞を培養し、抗癌剤の評価を行う方法が開発されている（特許文献１、非特許文献１～６）。また、培養容器表面を細胞接着の阻害材料にてコーティングすることや、表面に特殊な加工を施すことにより細胞接着を阻害して癌細胞を凝集させた状態にて培養（スフェア培養）し、抗癌活性の評価を行う方法が開発されている（特許文献２、３）。しかしながら、これらの癌細胞培養法は、培養容器の作成過程及び細胞培養の操作が煩雑である、コラーゲン等の支持体から細胞を回収して抗癌活性を評価する際の操作が煩雑である、支持体が動物由来の成分である際には高価であるためにその供給が制限される場合がある、細胞凝集塊（スフェア）同士の会合が生じてその大きさが過剰になるために細胞生存率や再現性が低くなるなどの様々な問題を有している。特に、増殖因子受容体などをターゲットにした分子標的薬のスクリーニングを実施する際には、簡便かつ均一で、大量のサンプルを処理できる、再現性の高い癌細胞の培養方法が求められている。

　本発明者らは、液体培地中の粘度を実質的に高めることなく、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能な培地組成物の開発に成功している（特許文献４）。

特表２０１４－５１９８１３号公報特表２０１３－５３６６８９号公報特表２０１２－５１９２８１号公報ＷＯ２０１４／０１７５１３　Ａ１

Ｍｉｙａｚｏｎｏ　Ｋら、Ｐｒｏｃ　Ｊｐｎ　Ａｃａｄ　Ｓｅｒ　Ｂ　Ｐｈｙｓ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ　２００９、８５：３１４－３２３Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ　Ｈら、Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉ　２００９、１２２：４２７７－４２８６Ｄｅｌ　Ｃａｓｔｉｌｌｏら、Ｅｘｐ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ　２００６、３１２：２８６０－２８７１Ｗａｋｅｌｉｎｇ　ＡＥら、Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　Ｔｒｅａｔ　１９９６、３８：６７－７３Ｈｅｉｌｍａｎｎ　ＡＭら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　２０１４、７４：３９４７－３９５８Ｓｏｎｐａｖｄｅ　Ｇら、Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇ　Ｄｒｕｇｓ　２０１４、２３：３０５－３１５

　本発明の目的は、生体内での臨床効果を的確に再現可能な癌細胞の培養技術及び抗癌剤のスクリーニング方法を提供することにある。また、本発明の目的は、増殖因子による癌細胞の増殖や上皮間葉転換をインビトロにおいて高感度で評価可能な方法を提供することにある。

　本発明者らは、液体培地中の粘度を実質的に高めることなく、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能な培地組成物中で接着性癌細胞を浮遊培養することにより、単層培養では、検出することが困難であった、癌細胞のトランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子への反応性が、該浮遊培養において高感度で検出し得ることを見出し、この浮遊培養技術が、これらの増殖因子を阻害する抗癌剤のスクリーニングに有用であることを見出した。
　更に、本発明者らは、癌腫細胞を単層培養すると、間葉系様形質へ転換してしまう傾向にあるところ、液体培地中の粘度を実質的に高めることなく、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能な培地組成物中で浮遊培養すると、上皮系様形質が良好に維持されることを見出した。さらに、この浮遊培養系へ、ＥＧＦやＴＧＦ－β等の上皮間葉転換誘導因子を添加すると、間葉系への転換が誘導されたことから、この浮遊培養系を用いることにより、癌細胞の上皮間葉転換の評価や、癌細胞の上皮間葉転換を阻害する物質のスクリーニングを行うことができることを見出した。
　このような知見に基づき、更に検討を加え、本発明を完成した。

　すなわち、本発明は下記のとおりである：

［１］トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有する接着性癌細胞を、当該増殖因子、及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有する接着性癌細胞の培養方法。
［２］増殖因子がトランスフォーミング増殖因子である、［１］記載の方法。
［３］トランスフォーミング増殖因子が、ＴＧＦ－β１である、［２］記載の方法。
［４］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［１］～［３］のいずれか記載の方法。
［５］培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、［１］～［４］のいずれか記載の方法。
［６］接着性癌細胞の、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子への反応性を試験する方法であって、
（１）接着性癌細胞を、当該増殖因子の存在下及び非存在下で、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌細胞の増殖を測定すること、及び
（３）当該増殖因子の存在下で培養した癌細胞の増殖を、当該増殖因子の非存在下での増殖と比較すること
を含む、方法。
［７］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［６］記載の方法。
［８］培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、［６］又は［７］記載の方法。
［９］トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子への反応性を有する接着性癌細胞に対する抗癌剤のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、当該癌細胞を、当該増殖因子及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌細胞の増殖を測定すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌細胞の増殖を、被検物質の非存在下での増殖と比較すること
を含む、方法。
［１０］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［９］記載の方法。
［１１］培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、［９］又は［１０］記載の方法。
［１２］癌腫細胞を、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮系様形質の維持方法。
［１３］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［１２］記載の方法。
［１４］培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、［１２］又は［１３］記載の方法。
［１５］上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子、及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮間葉転換の誘導方法。
［１６］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［１５］記載の方法。
［１７］培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、［１５］又は［１６］記載の方法。
［１８］癌腫細胞の上皮間葉転換を誘導する物質のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を評価すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を、被検物質の非存在下での上皮間葉転換と比較すること
を含む、方法。
［１９］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［１８］記載の方法。
［２０］培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、［１８］又は［１９］記載の方法。
［２１］癌腫細胞の上皮間葉転換を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を評価すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を、被検物質の非存在下での上皮間葉転換と比較すること
を含む、方法。
［２２］前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、［２１］記載の方法。
［２３］培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、［２１］又は［２２］記載の方法。

　本発明により、癌細胞のトランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子への反応性を、高感度で検出することが可能である。従って、本発明の方法は、これらの増殖因子を阻害する抗癌剤のスクリーニングに有用である。
　本発明の方法を用いると、単層培養と比較して、癌腫細胞の、上皮系様形質が良好に維持される。また、本発明の方法を用いると、癌腫細胞の上皮間葉転換をインビトロで良好に再現することが可能なので、上皮間葉転換を阻害する抗癌剤のスクリーニングに有用である。

（１）本発明に用いる培地組成物
　本発明は、浮遊状態を維持したまま、細胞や組織を培養することが可能な培地組成物を用いた、癌細胞の培養技術を提供する。当該培地組成物は、浮遊状態を維持したまま、評価対象の癌細胞やこれを含む組織を培養することを可能にする。当該培地組成物は、WO 2014/017513 A1の記載に従い、調製することが可能である。以下、当該培地組成物を培地組成物Ｉと称することがある。

　細胞とは、動物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。

　本発明において用いる癌細胞は、哺乳動物の癌細胞である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目、イヌ、ネコ等のネコ目、ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（マウス等）又は霊長類（ヒト等）である。

　癌の例としては、以下に限定されるものではないが、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、骨髄癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、骨髄芽種、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、癌患者由来の血液等の組織が挙げられる。癌細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ヒト乳癌細胞株としてＨＢＣ－４、ＢＳＹ－１、ＢＳＹ－２、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－７／ＡＤＲ　ＲＥＳ、ＨＳ５７８Ｔ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＡ－Ｎ、ＢＴ－５４９、Ｔ４７Ｄ、ヒト子宮頸癌細胞株としてＨｅＬａ、ヒト肺癌細胞株としてＡ５４９、ＥＫＶＸ、ＨＯＰ－６２、ＨＯＰ－９２、ＮＣＩ－Ｈ２３、ＮＣＩ－Ｈ２２６、ＮＣＩ－Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ－Ｈ４６０、ＮＣＩ－Ｈ５２２、ＤＭＳ２７３、ＤＭＳ１１４、ヒト大腸癌細胞株としてＣａｃｏ－２、ＣＯＬＯ－２０５、ＨＣＣ－２９９８、ＨＣＴ－１５、ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＫＭ－１２、ＳＷ－６２０、ＷｉＤｒ、ヒト前立腺癌細胞株としてＤＵ－１４５、ＰＣ－３、ＬＮＣａＰ、ヒト中枢神経系癌細胞株としてＵ２５１、ＳＦ－２９５、ＳＦ－５３９、ＳＦ－２６８、ＳＮＢ－７５、ＳＮＢ－７８、ＳＮＢ－１９、ヒト卵巣癌細胞株としてＯＶＣＡＲ－３、ＯＶＣＡＲ－４、ＯＶＣＡＲ－５、ＯＶＣＡＲ－８、ＳＫ－ＯＶ－３、ＩＧＲＯＶ－１、ヒト腎癌細胞株としてＲＸＦ－６３１Ｌ、ＡＣＨＮ、ＵＯ－３１、ＳＮ－１２Ｃ、Ａ４９８、ＣＡＫＩ－１、ＲＸＦ－３９３Ｌ、７８６－０、ＴＫ－１０、ヒト胃癌細胞株としてＭＫＮ４５、ＭＫＮ２８、Ｓｔ－４、ＭＫＮ－１、ＭＫＮ－７、ＭＫＮ－７４、皮膚癌細胞株としてＬＯＸ－ＩＭＶＩ、ＬＯＸ、ＭＡＬＭＥ－３Ｍ、ＳＫ－ＭＥＬ－２、ＳＫ－ＭＥＬ－５、ＳＫ－ＭＥＬ－２８、ＵＡＣＣ－６２、ＵＡＣＣ－２５７、Ｍ１４、白血病細胞株としてＣＣＲＦ－ＣＲＭ、Ｋ５６２、ＭＯＬＴ－４、ＨＬ－６０ＴＢ、ＲＰＭＩ８２２６、ＳＲ、ＵＴ７／ＴＰＯ、Ｊｕｒｋａｔ、ヒト上皮様癌細胞株として、Ａ４３１、ヒトメラノーマ細胞株としてＡ３７５、ヒト骨肉腫細胞株として、ＭＮＮＧ/ＨＯＳ、ヒト膵臓癌細胞株として、ＭＩＡＰａＣａ－２等が挙げられる。細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ　Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。

　本発明における細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が接着しない状態（非接着）であることをいう。さらに、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液体培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。また、「浮遊静置」において浮遊させることのできる期間としては、５分以上、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上等が含まれるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。

　本発明に用いる培地組成物は、細胞や組織の維持や培養が可能な温度範囲（例えば、０～４０℃）の少なくとも１点において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。本発明に用いる培地組成物は、好ましくは２５～３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。

　浮遊静置が可能か否かは、例えば、培養対象の細胞を、２×１０^４個／ｍｌの濃度で、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、１５ｍｌコニカルチューブ中に１０ｍｌ注入し、少なくとも５分以上（例、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７日以上）、３７℃にて静置し、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。全細胞のうちの７０％以上が浮遊状態の場合、浮遊状態が維持されたと結論できる。細胞に代えて、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ　５００－６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ．製）に代替して評価してもよい。

　本発明に用いる培地組成物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる（好ましくは浮遊静置培養できる）構造体と培地を含有する組成物である。
　本発明に用いる培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において、培地組成物からの細胞または組織の回収が可能である組成物であり、より好ましくは、培地組成物からの細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない組成物である。
　本発明における構造体とは、特定化合物から形成されたもので、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、高分子化合物がイオンを介して集合したもの、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成したもの等が含まれる。また、多糖類が金属イオンを介してマイクロゲルを形成することは公知であり（例えば、特開２００４－１２９５９６号公報）、本発明の構造体には、一態様として当該マイクロゲルも含まれる。
　また、高分子化合物がイオンを介して集合したものとしては、その一態様としてフィルム状の構造体が挙げられる。
　本発明における構造体の大きさは、フィルターで濾過した場合、孔径が０．２μｍ乃至２００μｍのフィルターを通過するものが好ましい。当該孔径の下限としては、より好ましくは、１μｍを超えるものであり、安定に細胞または組織を浮遊させることを考慮すると、さらに好ましくは５μｍを超えるものである。当該孔径の上限としては、より好ましくは、１００μｍ以下のもの、細胞または組織の大きさを考慮すると、さらに好ましくは７０μｍ以下のものである。
　本発明における特定化合物とは、特定化合物を液体培地と混合した際、不定形な構造体を形成し、当該構造体が当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有するものである。「液体の粘度を実質的に高めない」とは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明に用いる培地組成物の粘度）は、３７℃において、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。さらに、当該構造体を液体培地中に形成し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）効果を示すものであれば、特定化合物の化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
　構造体を含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、ＴＶ－２２型粘度計、機種：ＴＶＥ－２２Ｌ、コーンロータ：標準ロータ　１°３４´×Ｒ２４、回転数１００ｒｐｍ）を用いて測定することができる。

　本発明に用いる特定化合物の例としては、特に制限されるものではないが、高分子化合物が挙げられ、好ましくはアニオン性の官能基を有する高分子化合物が挙げられる。
　アニオン性の官能基としては、カルボキシ基、スルホ基、リン酸基及びそれらの塩が挙げられ、カルボキシ基またはその塩が好ましい。
　本発明に用いる高分子化合物は、前記アニオン性の官能基の群より選択される１種又は２種以上を有するものを使用できる。
　本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した多糖類が挙げられ、より好ましくは、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。ここにいう酸性多糖類とは、その構造中にアニオン性の官能基を有すれば特に制限されないが、例えば、ウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類、構造中の一部に硫酸基又はリン酸基を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類であって、天然から得られる多糖類のみならず、微生物により産生された多糖類、遺伝子工学的に産生された多糖類、或いは酵素を用いて人工的に合成された多糖類も含まれる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（以下、ＤＡＧという場合もある）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。多糖類は、好ましくは、ヒアルロン酸、ＤＡＧ、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン又はそれらの塩であり、低濃度の使用で細胞又は組織を浮遊させることができ、かつ細胞又は組織の回収のしやすさを考慮すると、最も好ましくは、ＤＡＧである。
　ここでいう塩とは、例えば、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩、カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩又はアルミニウム、亜鉛、銅、鉄、アンモニウム、有機塩基及びアミノ酸等の塩が挙げられる。
　これらの高分子化合物（多糖類等）の重量平均分子量は、好ましくは１０，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１００，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１，０００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるプルラン換算で測定できる。
　さらに、ＤＡＧはリン酸化したものを使用することもできる。当該リン酸化は公知の手法で行うことができる。

　本発明においては、上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。多糖類の組み合わせの種類は、上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともＤＡＧ又はその塩を含む。即ち、好適な多糖類の組合せには、ＤＡＧ又はその塩、及びＤＡＧ又はその塩以外の多糖類（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。具体的な多糖類の組み合わせとしては、ＤＡＧとラムザンガム、ＤＡＧとダイユータンガム、ＤＡＧとキサンタンガム、ＤＡＧとカラギーナン、ＤＡＧとザンタンガム、ＤＡＧとローカストビーンガム、ＤＡＧとκ－カラギーナン、ＤＡＧとアルギン酸ナトリウム、ＤＡＧとメチルセルロース等が挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明に用いる特定化合物の更に好ましい具体例としては、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム及びそれらの塩が挙げられ、培地組成物の粘度を低くできる点と細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、最も好ましい例としては脱アシル化ジェランガムまたはその塩が挙げられる。

　本発明における脱アシル化ジェランガムとは、１－３結合したグルコース、１－４結合したグルクロン酸、１－４結合したグルコース及び１―４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ_１、Ｒ_２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ_１がグリセリル基を、Ｒ_２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。
　本発明における構造体は特定化合物により様々な形態となるが、脱アシル化ジェランガムの場合について記載すると、脱アシル化ジェランガムは、液体培地と混合した際に、液体培地中の金属イオン（例えば、カルシウムイオン）を取り込み、当該金属イオンを介した不定形な構造体を形成し、細胞及び／又は組織を浮遊させる。脱アシル化ジェランガムから調製される本発明に用いる培地組成物の粘度は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。

　本発明における特定化合物は、化学合成法でも得ることができるが、当該化合物が天然物である場合は、当該化合物を含有している各種植物、各種動物、各種微生物から慣用技術を用いて抽出及び分離精製することにより得るのが好適である。その抽出においては、水や超臨界ガスを用いると当該化合物を効率よく抽出できる。例えば、ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムの場合は、粘膜物を回収する際にアルカリ処理を施し、１－３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。精製方法としては、例えば、液－液抽出、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ－２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、不純物を除き精製することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ　ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
　そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ－ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。また、ネイティブ型ジェランガムとして、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＨＴ」等を使用することができる。

　培地中での特定化合物の濃度は、特定化合物の種類に依存し、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができるが、通常０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるようにすれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、更に好ましくは０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０３％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。κ－カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。ネイティブ型ジェランガムの場合、０．０５％乃至１．０％(重量／容量)、好ましくは、０．０５％乃至０．１％(重量／容量)培地中に添加すれば良い。

　上記多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用する場合、当該多糖類の濃度は、当該多糖類の組み合わせが上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ＤＡＧ又はその塩と、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類との組合せを用いる場合、ＤＡＧ又はその塩の濃度としては０．００５～０．０２％（重量／容量）、好ましくは０．０１～０．０２％（重量／容量）が例示され、ＤＡＧ又はその塩以外の多糖類の濃度としては、０．００５～０．４％（重量／容量）、好ましくは０．１～０．４％（重量／容量）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
ＤＡＧ又はその塩：０．００５～０．０２％（好ましくは０．０１～０．０２％）（重量／容量）
ＤＡＧ以外の多糖類
キサンタンガム：０．１～０．４％（重量／容量）
アルギン酸ナトリウム：０．１～０．４％（重量／容量）
ローカストビーンガム：０．１～０．４％（重量／容量）
メチルセルロース：０．１～０．４％（重量／容量）（好ましくは０．２～０．４％（重量／容量））
カラギーナン：０．０５～０．１％（重量／容量）
ダイユータンガム：０．０５～０．１％（重量／容量）

　なお該濃度は、以下の式で算出できる。
　濃度（％）＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００

　前記化合物は、化学合成法によってさらに別の誘導体に変えることもでき、そのようにして得た当該誘導体も、本発明において有効に使用できる。具体的には、脱アシル化ジェランガムの場合、その一般式（Ｉ）で表される化合物のＲ_１及び／又はＲ_２に当たる水酸基を、Ｃ１－３アルコキシ基、Ｃ１－３アルキルスルホニル基、グルコースあるいはフルクトースなどの単糖残基、スクロース、ラクトースなどのオリゴ糖残基、グリシン、アルギニンなどのアミノ酸残基などに置換した誘導体も本発明に使用できる。また、１－ｅｔｈｙｌ－３－(３－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ)ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）等のクロスリンカーを用いて当該化合物を架橋することもできる。

　本発明に使用される特定化合物或いはその塩は製造条件により任意の結晶形として存在することができ、任意の水和物として存在することができるが、これら結晶形や水和物及びそれらの混合物も本発明の範囲に含有される。また、アセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどの有機溶媒を含む溶媒和物として存在することもあるが、これらの形態はいずれも本発明の範囲に含有される。

　本発明に使用される特定化合物は、環内或いは環外異性化により生成する互変異性体、幾何異性体、互変異性体若しくは幾何異性体の混合物、又はそれらの混合物の形で存在してもよい。本発明の化合物は、異性化により生じるか否かに拘わらず、不斉中心を有する場合は、分割された光学異性体或いはそれらを任意の比率で含む混合物の形で存在してよい。

　本発明に用いる培地組成物には、金属イオン、例えば２価の金属イオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）が存在してもよく、好ましくはカルシウムイオンを含有する。当該金属イオンは、例えばカルシウムイオンとマグネシウムイオン、カルシウムイオンと亜鉛イオン、カルシウムイオンと鉄イオン、カルシウムイオンと銅イオンのように、２種類以上を組み合わせて使用することができる。当業者は適宜その組み合わせを決定することができる。一態様において、培地組成物に金属イオン（例、カルシウムイオン）が含まれることにより、高分子化合物が当該金属イオンを介して集合し、高分子化合物が三次元ネットワークを形成することにより（例えば、多糖類が金属イオン（例、カルシウムイオン）を介してマイクロゲルを形成することにより）本発明の構造体が形成される。金属イオンの濃度は、特定化合物が上述の構造体を液体培地中に形成し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。金属イオン濃度は０．１ｍＭ及至３００ｍＭで、好ましくは、０．５ｍＭ及至１００ｍＭであるが、これらに限定されない。当該金属イオンは、培地と共に混合する、あるいは、塩溶液を別途調製しておき、培地に添加してもよい。また本発明に用いる培地組成物には、後述の細胞外マトリックス、接着分子等を含んでもよい。

　本発明で用いる特定化合物から構成された構造体は、細胞及び／又は組織を生体外で培養した時に、当該細胞及び／又は組織を、当該特定化合物の構造体を含有する液体中で浮遊させる効果（好ましくは浮遊静置させる効果）を示すものである。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞及び／又は組織を増やして培養することが可能である。また、従来の浮遊培養方法において回転や振とう操作を伴う場合、細胞及び／又は組織に対するせん断力が働くため、細胞及び／又は組織の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに細胞及び／又は組織を均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く容易かつ大量に取得することができる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞及び／又は組織を浮遊培養する際、細胞及び／又は組織の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物を用いることにより、細胞及び／又は組織を浮遊培養し、その機能を損なうこと無く観察し、回収することができる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合があるが、本発明の特定化合物の構造体を含有する培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することができる。

　本発明における特定化合物を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と特定化合物を混合して培地組成物を調製することができる。このような培地の組成による分類では天然培地、半合成培地、合成培地、また、形状による分類では半固形培地、液体培地、粉末培地（以下、粉培地という場合もある）などが挙げられる。細胞及び／又は組織が動物由来である場合、動物細胞の培養に用いられる培地であればいずれも用いることができる。このような培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ‘s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ　１５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ　ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ－７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ　ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。

　癌細胞の培養に用いられる培地には、上記培地に、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、癌細胞スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。

　上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。
　動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。

　培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β-クロロペニシラン酸、6-アセチルメチレン-ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、ｍ－カルボキシフェノール、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。

　本発明における特定化合物を上記の培地に添加する場合には、まず適切な溶媒にて当該特定化合物を用時溶解または分散させる（これを、培地添加剤とする。）。その後、培地中での特定化合物濃度として、上に詳述したように、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．４％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、当該培地添加剤を培地中に添加すれば良い。例えば、脱アシル化ジェランガムの場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。キサンタンガムの場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０５％乃至０．５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．１％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。κ－カラギーナンおよびローカストビーンガム混合系の場合、０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．００５％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとダイユータンガムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．０１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとメチルセルロースの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．００５％乃至０．２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとローカストビーンガムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとアルギン酸ナトリウムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとキサンタンガムの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。脱アシル化ジェランガムとκ－カラギーナンの混合系の場合、０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。なお該濃度は、以下の式で算出できる。
　濃度（％）＝特定化合物の重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００

　ここで、培地添加剤に用いる適切な溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどの水性溶媒が挙げられるが、これらに限られるわけではない。この際、特定化合物濃度は０．００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．０１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．１％乃至０．６％（重量／容量）とすることが望ましい。その際、当該特定化合物の効果を高めたり、使用する際の濃度を下げたりするような添加物を更に添加することもできる。この様な添加剤の例として、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、タマリンドシードガム、プルラン等の多糖類を１種以上混合することができる。また、当該特定化合物を培養の際に担体表面上に固定化或いは、担体内部に担持して使用することもできる。当該特定化合物は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該特定化合物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。また、本発明における特定化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ乃至１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ乃至１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ乃至０．５μｍである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。

　上記調製により特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加することにより、液体培地中に上記構造体が形成され、本発明に用いる培地組成物を得ることができる。培地には通常、高分子化合物がイオンを介して集合、あるいは、高分子化合物が三次元のネットワークを形成するのに十分な濃度の金属イオン（例、カルシウムイオン等の２価金属イオン）が含まれるので、本発明の特定化合物の溶液又は分散液を液体培地に添加するのみで、本発明に用いる培地組成物を得ることができる。あるいは、培地添加剤（特定化合物の溶液又は分散液）に培地を添加してもよい。さらに、本発明に用いる培地組成物は、特定化合物と培地成分とを、水性溶媒（例えばイオン交換水や超純水等を含む水）中で混合して調製することもできる。混合の態様としては、（１）液体培地と培地添加剤（溶液）とを混合する、（２）液体培地に上記高分子化合物（粉末等の固体）を混合する、（３）培地添加剤（溶液）に粉末培地を混合する、（４）粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合する、等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いる培地組成物における特定化合物の分布が不均一になるのを防ぐために、（１）若しくは（４）又は（１）若しくは（３）の態様が好ましい。
　特定化合物を溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する、または、特定化合物及び粉末培地を溶媒へ溶解する際、溶解促進のため、当該混合液を加熱するのが好ましい。加熱する温度としては、例えば８０℃～１３０℃、好ましくは加熱滅菌されるような１００℃～１２５℃（例、１２１℃）が挙げられる。加熱後、得られた特定化合物の溶液を室温まで冷却する。当該溶液に、上述の金属イオン（例、カルシウムイオン等の２価金属イオン）を添加することにより（例えば、当該溶液を液体培地へ添加することにより）、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。或いは、特定化合物を、上述の金属イオン（例、カルシウムイオン等の２価金属イオン）を含む溶媒（例、水、液体培地等の水性溶媒）へ溶解する際に、加熱（例えば８０℃～１３０℃、好ましくは１００℃～１２５℃（例、１２１℃））し、得られた溶液を室温まで冷却することによっても、当該特定化合物から構成された上記構造体が形成される。

　本発明に用いる培地組成物の調製方法を例示するが、本発明はこれによって限定されるものではない。特定化合物をイオン交換水あるいは超純水に添加する。そして、当該特定化合物を溶解できる温度（例えば、６０℃以上、８０℃以上、９０℃以上）で加熱しながら撹拌して透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、滅菌（例えば、１２１℃にて２０分でのオートクレーブ滅菌）を行う。室温に戻した後、静置培養に使用する任意の培地を撹拌（例えば、ホモミキサー等）しながら、当該培地に前記滅菌後の水溶液を添加し、当該培地と均一になるように混合する。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明に用いる培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。

　あるいは、粉末培地及び上記高分子化合物（粉末等の固体）を水性溶媒と混合し、上記温度で加熱することで本発明に用いる培地組成物を調製する。
　例えば、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．１％乃至１％（重量／容量）、好ましくは０．２％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．３％乃至０．４％（重量／容量）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。また、別の局面では、脱アシル化ジェランガムを調製する場合、０．１％乃至１％（重量／容量）、好ましくは０．２％乃至０．８％（重量／容量）、より好ましくは０．３％乃至０．６％（重量／容量）となるようにイオン交換水あるいは超純水に脱アシル化ジェランガムを添加する。
　そして、前記脱アシル化ジェランガムを溶解できる温度であれば何度でもよいが、６０℃以上、好ましくは８０℃以上、より好ましくは９０℃以上（例、８０～１３０℃）に加熱しながら撹拌することにより透明な状態になるまで溶解させる。溶解後、撹拌しながら放冷し、例えば１２１℃にて２０分間オートクレーブ滅菌を行う。室温に戻した後に、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をホモミキサー等で撹拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し（例えば終濃度が０．０１５％の場合は０．３％水溶液：培地の比率は１：１９）、均一に混合させる。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。また、混合後に本発明に用いる培地組成物をフィルターにてろ過してもよい。ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは、５μｍ乃至１００μｍ、好ましくは５μｍ乃至７０μｍ、より好ましくは１０μｍ乃至７０μｍである。

　本発明に用いる培地組成物及びその製造方法の好適な態様を以下に記載する。
　本発明に用いる培地組成物は、好適には、細胞または組織を浮遊させて培養できる培地組成物であって、前記培地組成物の粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下（３７℃条件下）であり、且つ脱アシル化ジェランガムまたはその塩を含有することを特徴とする、培地組成物である。一態様において、培地組成物中の脱アシル化ジェランガムまたはその塩の濃度が、０．０１～０．０５％（重量／容量）である。一態様において、当該培地組成物は、さらに、脱アシル化ジェランガムまたはその塩以外の多糖類を含有する。一態様において、当該培地組成物には、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度の２価金属イオン（例、カルシウムイオン）を含有する。該濃度は、例えば、０．１ｍＭ及至３００ｍＭ、好ましくは、０．５ｍＭ及至１００ｍＭである。

　当該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムまたはその塩と培地とを混合することにより製造することが出来る。一態様において、当該培地は液体培地である。一態様において、当該液体培地には、脱アシル化ジェランガムが細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を形成するのに十分な濃度の２価金属イオン（例、カルシウムイオン）を含有する。該濃度は、例えば、０．１ｍＭ及至３００ｍＭ、好ましくは、０．５ｍＭ及至１００ｍＭである。一態様において、溶媒中に溶解または分散した脱アシル化ジェランガムまたはその塩と、培地とを混合する。一態様において、溶媒中に溶解または分散した脱アシル化ジェランガムまたはその塩は、滅菌された状態である。一態様において、滅菌はオートクレーブ滅菌により行われる。別の態様において、滅菌はろ過滅菌により行われる。一態様において、ろ過滅菌は０．１～０．５μｍのフィルターを通過させることにより実施する。

（２）増殖因子存在下での癌細胞の培養（方法論Ｉ）
（２－１）癌細胞の培養方法
　本発明は、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有する接着性癌細胞を、当該増殖因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養することを含む、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有する接着性癌細胞の培養方法（本発明の方法１）を提供する。単層培養では、これらの増殖因子に対する接着性癌細胞の反応性が低く、評価が困難であったのに対して、上記培地組成物Ｉ中で浮遊培養すると、これらの増殖因子に対する反応性が向上し、増殖が大きく促進される。

　方法論Ｉに用いる癌細胞は、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有する。従って、当該癌細胞は、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に対する機能的な受容体を発現する。

　トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）としては、ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βを挙げることができる。好ましくは、ＴＧＦ-βである。ＴＧＦ-βには、β１～３のサブタイプがあるが、いずれも本発明に包含される。ＴＧＦ－αの受容体は、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲである。ＴＧＦ－βの受容体としては、１型受容体（ＴＧＦ－βＲ１）及び２型受容体（ＴＧＦ－βＲ２）が挙げられるが、いずれも本発明に包含される。

　インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）としては、ＩＧＦ-１及びＩＧＦ-２を挙げることができる。好ましくは、ＩＧＦ-１である。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２は、ＩＧＦ－１受容体に強力に結合し活性化させることに加え、インスリン受容体と弱く結合する。ＩＧＦ－２受容体はＩＧＦ－２とだけ結合し、細胞内シグナル経路を活性化させない。ＩＧＦ受容体は、好ましくは、ＩＧＦ－１受容体である。

　線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）としては、ＦＧＦ１～ＦＧＦ２３が確認されている。ヒトＦＧＦ１９はマウスＦＧＦ１５のオルソログであるので、ヒト及びマウスのＦＧＦファミリーは２２のメンバーで構成される。本明細書において、ＦＧＦの呼称はヒトＦＧＦのノメンクラチャに従うものとする。ＦＧＦは、好ましくはＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）である。ＦＧＦの受容体としては、ＦＧＦＲ１～４が挙げられ、いずれも本発明に包含される。

　方法論Ｉに用いる癌細胞は、好ましくは、ＴＧＦ-β、ＩＧＦ-１及びＦＧＦ２からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有し、より好ましくは、ＴＧＦ-βに反応性を有する。上記培地組成物Ｉ中で浮遊培養すると、とりわけＴＧＦ-βに対する反応性が向上し、増殖が大きく促進される。

　方法論Ｉに用いる癌細胞は、接着細胞である。接着細胞とは、足場に接着することで生存及び増殖を行なうことができる足場依存性の細胞を意味する。

　接着性の癌細胞としては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。接着性の癌細胞は、好ましくは、上皮細胞由来の悪性腫瘍、即ち癌腫（カルシノーマ）細胞である。

　本発明の培養方法においては、上述の増殖因子に対する反応性を有する接着性癌細胞を、当該増殖因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養する。

　本発明の培養方法に用いる増殖因子は、通常、哺乳動物の増殖因子である。哺乳動物としては、上記のものを挙げることができる。増殖因子は、多くの哺乳動物の種間で交差反応性を有するので、本発明の目的を達成し得る限り、いずれの哺乳動物の増殖因子を用いてもよいが、好適には、培養する癌細胞と同一種の哺乳動物の増殖因子が用いられる。例えば、ＴＧＦ-βに反応性を有するヒト接着性癌細胞は、好適には、ヒトＴＧＦ-βを含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養される。ヒトＴＧＦ-βとは、ＴＧＦ-βが、ヒトが生体内で天然に発現するＴＧＦ-βのアミノ酸配列を有することを意味する。本明細書中、他のタンパク質等についても、同様に解釈する。

　本発明の方法に用いる増殖因子は、好ましくは単離されている。「単離」とは、目的とする成分や細胞以外の因子を除去する操作がなされ、天然に存在する状態を脱していることを意味する。従って、「単離された増殖因子Ｘ」には、培養対象の細胞や組織から産生された内在性の増殖因子Ｘは包含されない。「単離されたタンパク質Ｘ」の純度（総タンパク質重量に占めるタンパク質Ｘの重量の百分率）は、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９９％以上、最も好ましくは１００％である。浮遊培養に用いられる培地に含まれる単離された増殖因子は、培地組成物Ｉ中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、単離された、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子を提供する工程を含む。また、一態様において、培地組成物Ｉ中へ、単離されたトランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子を外因的に添加する工程を含む。

　培地組成物Ｉ中の、上記増殖因子の濃度は、培養対象の接着性癌細胞の増殖を促進する濃度である。そのような濃度は、当業者であれば、適宜設定することが可能である。ＴＧＦ-βの濃度は、通常、３ｎｇ／ｍｌ以上である。ＩＧＦ-１の濃度は、通常１０ｎｇ／ｍｌ以上である。ＦＧＦ２の濃度は、通常１０ｎｇ／ｍｌ以上である。添加する増殖因子の上限値は、培養対象の接着性癌細胞の増殖を促進する限り、特に限定されないが、細胞増殖に対する良好な濃度依存性を確保する観点から、ＴＧＦ-βの濃度は３０ｎｇ／ｍｌ以下程度、ＩＧＦ-１の濃度は１００ｎｇ／ｍｌ以下程度、ＦＧＦ２の濃度は１００ｎｇ／ｍｌ以下程度とすることが好ましい。

　本発明の培養方法を用いて、上述の接着性癌細胞を培養する際には、細胞の培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、細胞培養フラスコ、スピナーフラスコ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。これらの培養容器のうち、多数の抗癌剤の評価、医薬品候補化合物又は医薬品の評価を実施する際には、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートが好適に用いられる。これらのプレートのウェル底形状は、特に制限されないが、平底、Ｕ字型、Ｖ字型のものを用いることが可能であり、好ましくはＵ字型のものが用いられる。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、エチルセルロースやアセチルセルロース等のセルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブタジエン、ポリ（エチレン－ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（ブタジエン－スチレン）コポリマー、ポリ（ブタジエン－アクリロニトリル）コポリマー、ポリ（エチレン－エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン－メタアクリレート）コポリマー、ポリクロロプレン、スチロール樹脂、クロロスルフォン化ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル、アクリル系ブロックコポリマー等のプラスチック等が挙げられる。これらのプラスチックは、酸素や二酸化炭素等のガス透過性に優れるだけでなく、工業的に成形加工性に優れ、各種の滅菌処理に耐えうるものであり、かつ培養器材内部の様子を観察することができる透明性の材質であることが好ましい。ここで、滅菌処理を施す方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌等が挙げられる。また、これらのプラスチックに対して種々の表面処理（例えば、プラズマ処理、コロナ処理等）を施してもよい。

　上記接着性癌細胞の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞及び／又は組織に供給する手法として、流加培養、連続培養及び灌流培養があるが、いずれの手法も本発明の培養方法に用いることができる。また、バイオリアクターや自動培養装置に用いられる培養容器には、開閉が容易で外界との接触面積が大きい開放系培養容器（例えば蓋を有する培養容器）と、開閉が容易ではなく外界との接触面積の小さい閉鎖系培養容器（例えばカートリッジ型培養容器）があるが、いずれの培養容器も本発明の培養方法に用いることができる。

　本発明の培養方法において、培養する接着性癌細胞の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、接着性癌細胞が単一細胞の状態で培地組成物Ｉ中に分散した状態、接着性癌細胞が担体表面上に接着した状態、接着性癌細胞が担体内部に包埋した状態、複数個の接着性癌細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態等が挙げられる。接着性癌細胞は、好ましくは、単一細胞の状態で培地組成物Ｉ中に分散した状態、又は複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態で、培地組成物Ｉ中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。即ち、好ましくは、癌細胞を接着や包埋するための担体を用いない。これらの状態の内、細胞塊（スフェア）を形成した状態は、生体内環境に近い細胞－細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、好ましい。

　細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、３次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ－ＨＥＭＡ（ポリ－（２－ハイドロキシ－エチルメタクリレート）２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体、ポリ（２－メトキシメチルアクリレート）、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド、メビオールジェル（登録商標）などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。

　目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るため、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。

　培養組成物Ｉを用いてスフェアを形成させることもできる。例えば、スフェアは、培養組成物Ｉ中に、単一細胞状態にまで解離した、目的とする接着性癌細胞を均一に分散させ、３日間乃至１０日間静置して浮遊培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状或いは楕円球形状であるとした際には２０μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは４０μｍ乃至５００μｍ、より好ましくは５０μｍ乃至３００μｍ、最も好ましくは８０μｍ乃至２００μｍの直径を有する。このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。

　本発明の方法で、接着性癌細胞を培養する際には、上記増殖因子を含む培養組成物Ｉに対して別途調製した接着性癌細胞を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は、得られた接着性癌細胞懸濁液を静置で培養してもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより接着性癌細胞と培地組成物を分離した後、新鮮な上記増殖因子を含む培地組成物Ｉを細胞に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより接着性癌細胞を適宜濃縮した後、新鮮な上記増殖因子を含む培地組成物Ｉをこの濃縮液に添加すればよい。

　一態様において、接着性の癌細胞の浮遊培養に際して、例えば、当該癌細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。癌細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。分散された接着性の癌細胞を、上記増殖因子を含む培地組成物Ｉ中に懸濁し、これを浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。培養物中、癌細胞は、単一細胞の状態で、又はスフェアの状態で、培地組成物Ｉ中に浮遊しながら、増殖する。

　接着性癌細胞を培養する際の温度は、通常２５乃至３９℃、好ましくは３７℃である。ＣＯ_２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、好ましくは５体積％である。酸素濃度は、培養の雰囲気中、１５～５０体積％であり、好ましくは２０体積％である通常、培養期間は通常１乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。

（２－２）癌細胞の増殖因子への反応性を試験する方法
　本発明は、接着性癌細胞の、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子への反応性を試験する方法であって、
（１）接着性癌細胞を、当該増殖因子の存在下及び非存在下で、上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌細胞の増殖を測定すること、及び
（３）当該増殖因子の存在下で培養した癌細胞の増殖を、当該増殖因子の非存在下での増殖と比較すること
を含む、方法（本発明の方法２）を提供する。
　上述のように、単層培養では、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子に対する接着性癌細胞の応答性が低いのに対して、上記本発明の方法Ｉにより、上記培地組成物Ｉ中で浮遊培養すると、これらの増殖因子に対する応答性が向上し、増殖が大きく促進されるため、この方法を応用することにより、接着性癌細胞の上記増殖因子に対する反応性を高感度で評価することが出来る。

　本発明の方法２における、用語の定義や、試験条件（好適な条件を含む）は、特に断りのない限り、本発明の方法１と同一である。

　工程（１）においては、評価対象の接着性癌細胞を、トランスフォーミング増殖因子（例、ＴＧＦ-β）、インスリン様増殖因子（例、ＩＧＦ-１）及び線維芽細胞増殖因子（例、ＦＧＦ２）からなる群から選択されるいずれかの増殖因子の存在下及び非存在下で、上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。当該増殖因子は、好ましくは、ＴＧＦ-βである。

　培養期間は、評価対象の接着性癌細胞の、当該増殖因子の刺激による増殖促進効果が検出可能な限り特に限定されないが、通常、１～７日程度である。

　培養した癌細胞の増殖の測定は、自体公知の方法により実施することが出来る。例えば、培養後の癌細胞の細胞数を計測する。増殖或いは出現した細胞の数は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いてカウントすることができる。あるいは、癌細胞の細胞数の計測は、コロニー形成法、クリスタルバイオレッド法、チミジン取り込み法、トリパンブルー染色法、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）測定法、３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚａｌｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）染色法、ＷＳＴ－１（登録商標）染色法、ＷＳＴ－８（登録商標）染色法、フローサイトメトリー法、細胞数自動測定装置を用いた方法などを用いて実施することもできる。

　そして、当該増殖因子の存在下で培養した癌細胞の増殖を、当該増殖因子の非存在下での増殖と比較する。癌細胞の増殖の比較は、好ましくは、統計学的有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検増殖因子を添加しない対照癌細胞の増殖の程度は、被検増殖因子を接触させた癌細胞の増殖の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定されたものであることが好ましい。

　比較の結果、当該増殖因子の添加によって増殖の促進が確認された場合、当該癌細胞は、当該増殖因子に対する反応性を有すると判定することが出来る。

（２－３）抗癌剤のスクリーニング方法
　本発明は、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子への反応性を有する接着性癌細胞に対する抗癌剤のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、当該癌細胞を、当該増殖因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌細胞の増殖を測定すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌細胞の増殖を、被検物質の非存在下での増殖と比較すること
を含む、方法（本発明の方法３）を提供する。
　上述のように、単層培養では、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子に対する接着性癌細胞の応答性が低いのに対して、上記本発明の方法Ｉにより、上記培地組成物Ｉ中で浮遊培養すると、これらの増殖因子に対する応答性が向上し、増殖が大きく促進されるため、この方法を応用することにより、接着性癌細胞の上記増殖因子依存的な増殖を阻害する物質を高感度でスクリーニングするが出来る。

　本発明の方法３における、用語の定義や、試験条件（好適な条件を含む）は、特に断りのない限り、本発明の方法１及び２と同一である。

　工程（１）においては、被検物質の存在下及び非存在下で、トランスフォーミング増殖因子（例、ＴＧＦ-β）、インスリン様増殖因子（例、ＩＧＦ-１）及び線維芽細胞増殖因子（例、ＦＧＦ２）からなる群から選択されるいずれかの増殖因子への反応性を有する接着性癌細胞を、当該増殖因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。当該増殖因子は、好ましくは、ＴＧＦ-βである。

　本発明の方法３に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。

　培養した癌細胞の増殖の測定は、自体公知の方法により実施することが出来る。例えば、培養後の癌細胞の細胞数を計測する。増殖或いは出現した細胞の数は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いてカウントすることができる。癌細胞の数の計測は、コロニー形成法、クリスタルバイオレッド法、チミジン取り込み法、トリパンブルー染色法、ＡＴＰ（アデノシン３リン酸）測定法、３－（４，５－Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｌ－２－ｙｌ）－２，５－Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚａｌｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）染色法、ＷＳＴ－１（登録商標）染色法、ＷＳＴ－８（登録商標）染色法、フローサイトメトリー法、細胞数自動測定装置を用いた方法などを用いて実施することができる。

　そして、当該被検物質の存在下で培養した癌細胞の増殖を、当該被検物質の非存在下での増殖と比較する。癌細胞の増殖の比較は、好ましくは、統計学的有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質を添加しない対照癌細胞の増殖の程度は、被検物質を接触させた癌細胞の増殖の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定されたものであることが好ましい。

　比較の結果、当該被検物質の添加により、当該増殖因子による当該接着性癌細胞の増殖を阻害した物質を、接着性癌細胞の当該増殖因子依存的な増殖を阻害する候補物質として、或いは接着性癌細胞に対する抗癌剤の候補物質として選択することが出来る。

　上記比較のみでは、上記培地組成物Ｉ中へ添加した増殖因子による増殖促進効果とは無関係に（例えば、単なる細胞毒性により）、評価対象の癌細胞の増殖を抑制した可能性が否定できない。そこで、培地組成物Ｉ中へ、評価対象の増殖因子を添加せずに、上記工程（１）～（３）と同一の操作を行い、当該増殖因子に非依存的な当該癌細胞の増殖に対する被検物質の効果を、更に評価してもよい。そして、比較の結果、当該被検物質が、当該増殖因子不在化における当該接着性癌細胞の増殖を阻害しない場合、当該被検物質を、当該増殖因子依存的な接着性癌細胞の増殖を選択的に阻害する物質として選択することが出来る。このように、特定の増殖因子依存的な接着性癌細胞の増殖を選択的に阻害する物質は、非特異的に正常細胞を傷害するリスクが低減されているので、接着性癌細胞に対する抗癌剤の候補物質として優れている。

　更に、得られた候補物質の効果を生体内において確認してもよい。例えば、該候補物質を担癌非ヒト哺乳動物（例えば、インビトロ方法で増殖阻害活性が確認された接着性癌細胞を移植した非ヒト哺乳動物）へ投与し、該非ヒト哺乳動物における当該癌細胞の増殖の程度をコントロール非ヒト哺乳動物（候補物質を投与しないこと以外の飼育条件が候補物質を投与した担癌非ヒト哺乳動物と同一）と比較し、比較結果に基づき該非ヒト哺乳動物における癌細胞の増殖を阻害した候補物質を、生体内における有効性が確認された抗癌剤の候補物質として選択することができる。

（３）癌腫細胞の上皮間葉転換の評価（方法論ＩＩ）
（３－１）癌腫細胞の上皮系様形質の維持方法
　本発明は、癌腫細胞を、上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮系様形質の維持方法（本発明の方法４）を提供する。癌腫細胞を単層培養に付すと、上皮間葉転換が促進され、上皮系様形質が失われて、間葉系様形質が優勢となるのに対して、癌腫細胞を上記培地組成物Ｉ中で浮遊培養に付すと、上皮間葉転換が抑制され、上皮系様形質が維持されるのみならず、間葉系様形質が優勢となった癌腫細胞の上皮系様形質への転換（即ち、間葉上皮転換）が誘導され、その結果、上皮系様形質が優勢となる。

　上皮間葉転換（ＥＭＴ）とは、上皮細胞がその細胞極性や周囲細胞との細胞接着機能を失い、遊走、浸潤能を得ることで間葉系様の細胞へと変化するプロセスを意味する。一般に癌腫細胞は、上皮間葉転換を引き起こすことにより、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に高く細胞同士が面で接着している上皮系様形質から、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に高く、細胞同士が点で接着し、細胞同士の接着性が低下した間葉系様形質へと移行し、これが、周辺組織への浸潤や、転移を引き起こす原因の１つと考えられている。

　癌腫（カルシノーマ）細胞としては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、腎細胞癌、尿管癌、肝癌、胆管癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、頭蓋咽頭癌、喉頭癌、舌癌、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、神経膠腫、星状細胞腫、髄膜腫、網膜芽細胞腫等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

　方法論ＩＩにおいて用いられる癌腫細胞は、上皮間葉転換能を有する。上皮間葉転換能とは、上皮間葉転換誘導因子の刺激により、上皮間葉転換を引き起こす能力を意味する。上皮間葉転換誘導因子としては、ＴＧＦ－β、ＦＧＦ（ＦＧＦ１～ＦＧＦ２３、好ましくはＦＧＦ２）、ＥＧＦ受容体アゴニスト（ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、β-cellulin、amphiregulin、epiregulin等）、ＨＧＦ、Ｗｎｔ／β－カテニン、Ｎｏｔｃｈ、Ｉ型コラーゲン等が挙げられる。一般に、癌腫細胞の上皮間葉転換は可逆的であり、間葉系様形質へと移行した後で、上皮系様形質へと戻ることが可能である。

　本発明の方法４においては、癌腫細胞が、上記培地組成物Ｉ中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。浮遊培養により、癌腫細胞の上皮間葉転換が抑制され、上皮系様形質が維持される。癌腫細胞を単層培養すると間葉系様形質が優勢となるが、このように間葉系様形質が優勢となった癌腫細胞を、上記培地組成物Ｉ中で浮遊培養に付すと、間葉上皮転換が誘導されて、間葉系様形質が失われ、上皮系様形質が優勢となる。本発明の方法４における「癌腫細胞における上皮系様形質の維持」には、癌腫細胞における上皮系様形質が優勢である状態を維持すること、及び、間葉系様形質が優勢である癌腫細胞を、上皮系様形質が優勢である状態へと移行させることを包含する。

　本発明の方法４において、癌腫細胞を培養する際に用いる培養容器や培養装置としては、上記本発明の方法１において記載した培養容器や培養装置を挙げることができる。

　本発明の方法４において、培養する癌腫細胞の形態や状態は、特に制限されるものではないが、好ましくは、癌腫細胞は、単一細胞の状態で培地組成物Ｉ中に分散した状態、又は複数個の癌腫細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態で、培地組成物Ｉ中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。好ましくは、癌腫細胞を接着又は包埋するための担体を用いずに、浮遊培養を行う。癌腫細胞の担体への接着により、上皮間葉転換が誘導される可能性があるためである。

　細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法としては、上記本発明の方法１に記載した方法を挙げることができる。

　本発明の方法４で、癌腫細胞を培養する際には、培養組成物Ｉに対して別途調製した癌腫細胞を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は、得られた癌腫細胞懸濁液を静置で培養してもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより癌腫細胞と培地組成物を分離した後、新鮮な培地組成物Ｉを細胞に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより癌腫細胞を適宜濃縮した後、新鮮な培地組成物Ｉをこの濃縮液に添加すればよい。

　一態様において、癌腫細胞の浮遊培養に際して、例えば、当該癌腫細胞を継代培養から回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散する。癌腫細胞の分散は、適切な細胞解離液を用いて行われる。細胞解離液としては、例えば、EDTA；トリプシン、コラゲナーゼIV、メタロプロテアーゼ等のタンパク分解酵素等を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。分散された癌腫細胞を、上記培地組成物Ｉ中に懸濁し、これを浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。培養物中、癌腫細胞は、単一細胞の状態で、又はスフェアの状態で、培地組成物Ｉ中に浮遊しながら、増殖する。

　好ましい態様において、本発明の方法４においては、癌腫細胞の上皮系様形質を維持するため、及び間葉上皮転換を阻害しないため、培地組成物Ｉは、上皮間葉転換誘導濃度の上皮間葉転換誘導因子を含有しない。上皮間葉転換誘導因子としては、ＴＧＦ－β、ＦＧＦ（ＦＧＦ１～ＦＧＦ２３、好ましくはＦＧＦ２）、ＥＧＦ受容体アゴニスト（ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、β-cellulin、amphiregulin、epiregulin等）、ＨＧＦ、Ｗｎｔ／β－カテニン、Ｎｏｔｃｈ、Ｉ型コラーゲン等が挙げられる。

　癌腫細胞を培養する際の温度は、通常２５乃至３９℃、好ましくは３７℃である。ＣＯ_２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、好ましくは５体積％である。

　低酸素環境は、上皮間葉転換を誘導するので、本発明の方法４において、癌腫細胞を培養する際の酸素濃度は、空気中の酸素分圧（２０体積％）以上とすることが好ましい。

　培養期間は、癌腫細胞の上皮系様形質の維持が達成される限り特に限定されず、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。間葉系様形質が優勢である癌腫細胞を、上皮系様形質が優勢である状態へと移行させる場合（例えば、単層培養に付していた癌腫細胞を回収し、培地組成物Ｉ中での浮遊培養に付す場合）には、間葉上皮転換が十分に進行するよう、例えば６日以上、好ましくは、１１日以上、培地組成物Ｉ中で浮遊培養を継続することが好ましい。

　このようにして、癌腫細胞を、培地組成物Ｉ中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）することにより、上皮系様形質が維持された癌腫細胞を得ることが出来る。本発明の方法４は、上皮系様形質を有する癌腫細胞の調製方法でもある。

　培養後の癌腫細胞において、上皮系様形質が維持されたこと（上皮系様形質が優勢であること）を確認してもよい。本発明の方法４は、このような確認工程を含み得る。上皮系様形質が維持された状態にあることの確認は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現を調べることにより実施することが出来る。上皮系様形質が優勢な状態では、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に高く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に低いが、間葉系様形質が優勢な状態では、これが逆転し、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に低く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に高い。従って、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に高く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に低ければ、培養後の癌腫細胞が、上皮系様形質が維持された（上皮系様形質が優勢な）状態にあると判断することが出来る。また、間葉系様形質が優勢である癌腫細胞を、上皮系様形質が優勢である状態へと移行させる場合には、培養後の癌腫細胞における、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現を、培養開始時の癌腫細胞と比較し、Ｅ-カドヘリン発現の上昇及びＮ-カドヘリン発現の低下が確認されれば、癌腫細胞が上皮系様形質が優勢である状態へ移行したと判断することが出来る。Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現は、mRNA又はタンパク質の発現を評価することにより行うことが出来る。mRNA発現は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンに対する特異的プライマーやプローブを用いたRT-PCR、ノーザンブロッティング、核酸アレイ等により評価することが出来る。タンパク質の発現は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンに対する特異的抗体を用いた免疫組織学的解析（免疫組織染色、フローサイトメトリー等）により評価することが出来る。

（３－２）上皮間葉転換の誘導方法
　本発明は、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮間葉転換の誘導方法（本発明の方法５）を提供する。上記本発明の方法４において、培地組成物Ｉ中に、上皮間葉転換誘導に十分な量の上皮間葉転換誘導因子を添加することにより、癌腫細胞の上皮間葉転換が誘導される。

　本発明の方法５における、用語の定義や、試験条件（好適な条件を含む）は、特に断りのない限り、本発明の方法４と同一である。

　本発明の方法５においては、まず、上皮系様形質を有する癌腫細胞が提供される。上皮系様形質を有する癌腫細胞は、例えば、上記本発明の方法４により調製することが出来る。従って、本発明の方法５を実施するに先立ち、本発明の方法４を実施し、上皮系様形質を有する癌腫細胞を調製してもよい。

　次に、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。上皮間葉転換誘導因子としては、ＴＧＦ－β、ＦＧＦ（ＦＧＦ１～ＦＧＦ２３、好ましくはＦＧＦ２）、ＥＧＦ受容体アゴニスト（ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、β-cellulin、amphiregulin、epiregulin等）、ＨＧＦ、Ｗｎｔ／β－カテニン、Ｎｏｔｃｈ、Ｉ型コラーゲン等が挙げられる。当該上皮間葉転換誘導因子は、好ましくは単離されている。浮遊培養に用いられる培地に含まれる単離された上皮間葉転換誘導因子は、培地組成物Ｉ中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、単離された、上皮間葉転換誘導因子を提供する工程を含む。また、一態様において、培地組成物Ｉ中へ、単離された上皮間葉転換誘導因子を外因的に添加する工程を含む。上記培地組成物Ｉには、上皮間葉転換誘導濃度の上皮間葉転換誘導因子が含まれる。各因子の上皮間葉転換誘導濃度は、当業者であれば容易に設定することが可能であるが、例えば、ＴＧＦ－β濃度は０．１ｎｇ／ｍｌ以上、ＨＢ－ＥＧＦ濃度は３０ｎｇ／ｍｌ以上である。

　本発明の方法５において、培養する癌腫細胞の形態や状態は、特に制限されるものではないが、好ましくは、癌腫細胞は、単一細胞の状態で培地組成物Ｉ中に分散した状態、又は複数個の癌腫細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態で、培地組成物Ｉ中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。好ましくは、癌腫細胞を接着又は包埋するための担体を用いずに、浮遊培養を行う。

　一態様において、上記本発明の方法４を実施することにより、上皮系様形質を有する癌腫細胞を得る。そして、培地組成物Ｉ中に、上皮間葉転換誘導濃度の単離された上皮間葉転換誘導因子を添加し、浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）を継続する。

　低酸素環境は、上皮間葉転換を誘導するので、本発明の方法５において、低酸素（２～１０体積％、好ましくは３体積％）環境下で、癌腫細胞を浮遊培養してもよい。一方、低酸素環境による影響を排除し、添加した上皮間葉転換誘導因子による効果のみを評価する観点から、本発明の方法５における培養時の酸素濃度を空気中の酸素分圧（２０体積％）以上とすることも、また好ましい。

　培養期間は、癌腫細胞の上皮間葉転換が誘導される限り特に限定されないが、上皮間葉転換が十分に進行するよう、例えば６日以上、好ましくは、１１日以上、上皮間葉転換誘導因子を含有する培地組成物Ｉ中での浮遊培養を継続することが好ましい。

　このようにして、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子を含有する培地組成物Ｉ中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）することにより、上皮間葉転換が誘導され、間葉系様形質を有する癌腫細胞を得ることが出来る。本発明の方法５は、間葉系様形質を有する癌腫細胞の調製方法でもある。

　培養後に、上皮間葉転換が誘導されたこと、即ち、癌腫細胞が間葉系様形質を有すること（間葉系様形質が優勢であること）を確認してもよい。本発明の方法５は、このような確認工程を含み得る。上皮間葉転換が誘導されたことの確認は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現を調べることにより実施することが出来る。上皮系様形質が優勢な状態では、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に高く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に低いが、間葉系様形質が優勢な状態では、これが逆転し、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に低く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に高い。従って、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に低く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に高ければ、培養後の癌腫細胞が、間葉系様形質を有する（間葉系様形質が優勢である）と判断することが出来る。また、培養後の癌腫細胞における、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現を、培養開始時の癌腫細胞と比較し、Ｅ-カドヘリン発現の低下及びＮ-カドヘリン発現の上昇が確認されれば、上皮間葉転換が誘導されたと判断することが出来る。Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現は、mRNA又はタンパク質の発現を評価することにより行うことが出来る。mRNA発現は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンに対する特異的プライマーやプローブを用いたRT-PCR、ノーザンブロッティング、核酸アレイ等により評価することが出来る。タンパク質の発現は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンに対する特異的抗体を用いた免疫組織学的解析（免疫組織染色、フローサイトメトリー等）により評価することが出来る。

（３－３）上皮間葉転換を誘導する物質のスクリーニング方法
　本発明は、上皮間葉転換を誘導する物質のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を評価すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を、被検物質の非存在下での上皮間葉転換と比較すること
を含む、方法（本発明の方法６）を提供する。
　上述の様に、本発明の方法５を用いると、インビトロにおいて、上皮間葉転換誘導因子の刺激により、癌腫細胞の上皮間葉転換を誘導することが可能なので、上皮間葉転換誘導因子に代えて、被検物質を用いることにより、上皮間葉転換を誘導する物質をスクリーニングすることが出来る。

　本発明の方法６における、用語の定義や、試験条件（好適な条件を含む）は、特に断りのない限り、本発明の方法４及び５と同一である。

　本発明の方法６においては、まず、上皮系様形質を有する癌腫細胞が提供される。上皮系様形質を有する癌腫細胞は、例えば、上記本発明の方法４により調製することが出来る。従って、本発明の方法６を実施するに先立ち、本発明の方法４を実施し、上皮系様形質を有する癌腫細胞を調製してもよい。

　工程（１）においては、被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。

　本発明の方法６に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。

　好ましい態様において、工程（１）においては、添加した被検物質の効果を明確化するため、培地組成物Ｉは、上皮間葉転換誘導濃度の上皮間葉転換誘導因子を含まない。上皮間葉転換誘導因子としては、ＴＧＦ－β、ＦＧＦ（ＦＧＦ１～ＦＧＦ２３、好ましくはＦＧＦ２）、ＥＧＦ受容体アゴニスト（ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、β-cellulin、amphiregulin、epiregulin等）、ＨＧＦ、Ｗｎｔ／β－カテニン、Ｎｏｔｃｈ、Ｉ型コラーゲン等が挙げられる。

　培養期間は、添加した被検物質の上皮間葉転換誘導効果を評価し得る限り特に限定されないが、上皮間葉転換が十分に進行するよう、例えば６日以上、好ましくは、１１日以上、培地組成物Ｉ中で浮遊培養を継続することが好ましい。

　培養した癌腫細胞の上皮間葉転換の評価は、自体公知の方法により実施することが出来る。例えば、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現を調べることにより当該評価を実施することが出来る。上皮系様形質が優勢な状態では、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に高く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に低いが、間葉系様形質が優勢な状態では、これが逆転し、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に低く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に高い。従って、Ｅ-カドヘリン発現が相対的に低く、Ｎ-カドヘリン発現が相対的に高ければ、培養後の癌腫細胞が、間葉系様形質を有する（間葉系様形質が優勢な）状態にあると判断することが出来る。また、培養後の癌腫細胞における、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現を、培養開始時の癌腫細胞と比較し、Ｅ-カドヘリン発現の低下及びＮ-カドヘリン発現の上昇を確認することにより、上皮間葉転換が誘導されたと判断することが出来る。Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンの発現は、mRNA又はタンパク質の発現を評価することにより行うことが出来る。mRNA発現は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンに対する特異的プライマーやプローブを用いたRT-PCR、ノーザンブロッティング、核酸アレイ等により評価することが出来る。タンパク質の発現は、Ｅ-カドヘリン及びＮ-カドヘリンに対する特異的抗体を用いた免疫組織学的解析（免疫組織染色、フローサイトメトリー等）により評価することが出来る。

　そして、当該被検物質の存在下で培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を、当該被検物質の非存在下での上皮間葉転換と比較する。上皮間葉転換の比較は、好ましくは、統計学的有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質を添加しない対照癌腫細胞の上皮間葉転換の程度は、被検物質を接触させた癌腫細胞の上皮間葉転換の測定に対し、事前に測定したものであっても、同時に測定したものであってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定されたものであることが好ましい。

　比較の結果、当該被検物質の添加により、上皮間葉転換が誘導された場合、当該物質を、癌腫の上皮間葉転換を誘導する候補物質として選択することが出来る。

（３－４）上皮間葉転換を阻害する物質のスクリーニング方法
　本発明は、癌腫細胞の上皮間葉転換を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を評価すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を、被検物質の非存在下での上皮間葉転換と比較すること
を含む、方法（本発明の方法７）を提供する。
　上述の様に、本発明の方法５を用いると、インビトロにおいて、上皮間葉転換誘導因子の刺激により、癌腫細胞の上皮間葉転換を誘導することが可能なので、当該培養系に被検物質を更に添加することにより、上皮間葉転換を阻害する物質をスクリーニングすることが出来る。

　本発明の方法７における、用語の定義や、試験条件（好適な条件を含む）は、特に断りのない限り、本発明の方法４及び５と同一である。

　本発明の方法７においては、まず、上皮系様形質を有する癌腫細胞が提供される。上皮系様形質を有する癌腫細胞は、例えば、上記本発明の方法４により調製することが出来る。従って、本発明の方法７を実施するに先立ち、本発明の方法４を実施し、上皮系様形質を有する癌腫細胞を調製してもよい。

　工程（１）においては、被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子を含有する上記培地組成物Ｉ中で、浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）する。

　本発明の方法７に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。

　上皮間葉転換誘導因子としては、ＴＧＦ－β、ＦＧＦ（ＦＧＦ１～ＦＧＦ２３、好ましくはＦＧＦ２）、ＥＧＦ受容体アゴニスト（ＥＧＦ、ＨＢ－ＥＧＦ、ＴＧＦ－α、β-cellulin、amphiregulin、epiregulin等）、ＨＧＦ、Ｗｎｔ／β－カテニン、Ｎｏｔｃｈ、Ｉ型コラーゲン等が挙げられる。当該上皮間葉転換誘導因子は、好ましくは単離されている。浮遊培養に用いられる培地に含まれる単離された上皮間葉転換誘導因子は、培地組成物Ｉ中へ外因的に添加されたものである。従って、一態様において、本発明は、単離された、上皮間葉転換誘導因子を提供する工程を含む。また、一態様において、培地組成物Ｉ中へ、単離された上皮間葉転換誘導因子を外因的に添加する工程を含む。上記培地組成物Ｉには、上皮間葉転換誘導濃度の上皮間葉転換誘導因子が含まれる。各因子の上皮間葉転換誘導濃度は、当業者であれば容易に設定することが可能であるが、例えば、ＴＧＦ－β濃度は０．１ｎｇ／ｍｌ以上、ＨＢ－ＥＧＦ濃度は３０ｎｇ／ｍｌ以上である。

　本発明の方法７において、培養する癌腫細胞の形態や状態は、特に制限されるものではないが、好ましくは、癌腫細胞は、単一細胞の状態で培地組成物Ｉ中に分散した状態、又は複数個の癌腫細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態で、培地組成物Ｉ中で浮遊培養（好ましくは、浮遊静置培養）される。好ましくは、癌腫細胞を接着又は包埋するための担体を用いずに、浮遊培養を行う。

　低酸素環境は、上皮間葉転換を誘導するので、本発明の方法７において、低酸素（２～１０％、好ましくは３％）環境下で、癌腫細胞を浮遊培養してもよい。一方、低酸素環境による影響を排除し、添加した上皮間葉転換誘導因子のみに対する被検物質の効果を評価する観点から、本発明の方法７における培養時の酸素濃度を空気中の酸素分圧（２０％）以上とすることも、また好ましい。

　培養期間は、上皮間葉転換誘導因子による癌腫細胞の上皮間葉転換が評価可能な限り特に限定されないが、上皮間葉転換が十分に進行するよう、例えば６日以上、好ましくは、１１日以上、浮遊培養を継続することが好ましい。

　比較の結果、当該被検物質の添加により、上皮間葉転換誘導因子による癌腫細胞の上皮間葉転換が阻害された場合、当該物質を、癌腫細胞の上皮間葉転換（好ましくは、上皮間葉転換誘導因子による癌腫細胞の上皮間葉転換）を阻害する候補物質として選択することが出来る。上皮間葉転換は、癌腫の浸潤や転移に寄与するので、当該物質は、癌腫の浸潤や転移を阻害するための医薬の候補物質として有用である。

　ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

　以下に本発明に用いる培地組成物の分析例、試験例を実施例として具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

　（試験例１：各増殖因子で刺激したＳＫＯＶ３細胞の増殖作用における単層培養法との比較）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、「脱アシル化ジェランガム・低接着培養法」は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。「低接着培養法」は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。「単層培養法」は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を、２２００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。各プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、３、１０ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、３、１０ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）および１０、１００ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＩＧＦ－１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）をそれぞれ１５μＬずつ添加した。単層培養群では、１０倍濃度の各増殖因子のみの培地組成物をそれぞれ１５μＬずつ添加した。培養は７日間継続した。８日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いたＳＫＯＶ３細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトＨＢ－ＥＧＦとヒトＴＧＦ－β１の薬効が強く示されることが分かった。また、培養８日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）％のＣｏｎｔｒｏｌ値を表１に示す。

　（試験例２：ＴＧＦ－βで刺激したＳＫＯＶ３細胞の増殖作用におけるＴＧＦ－β阻害剤の効果）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、「脱アシル化ジェランガム・低接着培養法」は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。「単層培養法」は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を、２２００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。各プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度３０ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）とＴＧＦ－β受容体阻害剤であるＬＹ３６４９４７（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）をそれぞれ１５μＬずつ添加した。単層培養群では、１０倍濃度のヒトＴＧＦ－β１とＬＹ３６４９４７のみの培地組成物をそれぞれ１５μＬずつ添加した。培養は４日間継続した。５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いたＳＫＯＶ３細胞増殖試験法により、ヒトＴＧＦ－β１刺激による細胞増殖に対する阻害剤の効果が明確に判断できることが分かった。一方、単層培養では阻害剤の効果を判断できなかった。単層培養４日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表２に示し、本発明培地組成物を用いた培養４日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表３に示す。

　（試験例３：各増殖因子で刺激したＡ４３１細胞の増殖作用についての単層培養法との比較）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注した。単層培養法は、ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１を、２２００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。各プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１０、３０ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトｂＦＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１０、３０ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）、１、１０ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＰＤＧＦ－ＢＢ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）および１０、１００ｎｇ／ｍｌになるように１０倍濃度のヒトＩＧＦ－１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）をそれぞれ１５μＬずつ添加した。単層培養群では、１０倍濃度の各増殖因子のみの培地組成物をそれぞれ１５μＬずつ添加した。培養は７日間継続した。８日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いたＡ４３１細胞増殖試験法により、単層培養法に比べてヒトＨＢ－ＥＧＦ、ヒトＥＧＦ、ヒトｂＦＧＦ，ヒトＴＧＦ－β１、ヒトＩＧＦ１の薬効が強く示されることが分かった。また、静置培養８日目のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）の％Ｃｏｎｔｒｏｌ値を表４に示す。

　（試験例４：ヒトＨＢ－ＥＧＦで刺激したＳＫＯＶ３細胞のＥＭＴマーカー発現における単層培養法との比較）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、脱アシル化ジェランガム・低接着培養法は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。単層培養法は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３を、７４００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物に播種した後、９６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製、＃３５８５）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。各プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度３０、１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）および１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦのみの培地組成物（単層培養群）をそれぞれ１５μＬずつ添加し、引き続き培養を１１日間継続した。１２日目に癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応に用いた各ｃＤＮＡサンプルは、分注し滅菌水で１/１０に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたｃＤＮＡを使用し、３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で設定した。ＰＣＲ反応は、各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ^ＴＭ（タカラバイオ社製）と各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。特異性はＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを内在性コントロールとし、Ｅ－ＣａｄｈｅｒｉｎおよびＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨの値で補正した。用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
　ＧＡＰＤＨ：ＨＳ９９９９９９０５
　Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＨＳ０１０２３８９４
　Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＨＳ００９８３０５６

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いたＳＫＯＶ３細胞において、単層培養法に比べてＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量が高く、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量が低いことが明らかとなり、単層培養に比べて上皮様の形質が高いものと思われた。また単層培養と比べて、ヒトＨＢ－ＥＧＦによるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ発現低下効果とＮ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ発現促進効果が強く示されることが分かった。静置培養１２日目のＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡ発現値を表５に、Ｎ－ＣａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ発現値を表６に示す。

　（試験例５：ヒトＴＧＦ－β１で刺激したＳＫＯＶ３細胞のＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ発現に対するＴＧＦ－β受容体阻害剤の効果）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。脱アシル化ジェランガム・低接着培養法は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度３０ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）とＴＧＦ－β受容体阻害剤であるＬＹ３６４９４７（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）を１５μＬずつ添加し、引き続き培養を１１日間継続した。１２日目に癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応に用いた各ｃＤＮＡサンプルは、分注し滅菌水で１/１０に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたｃＤＮＡを使用し、３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で設定した。ＰＣＲ反応は、各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ^ＴＭ（タカラバイオ社製）と各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。特異性はＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを内在性コントロールとし、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨの値で補正した。用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
　ＧＡＰＤＨ：ＨＳ９９９９９９０５
　Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＨＳ０１０２３８９４

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いたＳＫＯＶ３細胞において、ヒトＴＧＦ－β１の刺激でＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量が低下することが明らかとなった。さらにヒトＴＧＦ－β１による発現低下に対し、ＬＹ３６４９４７は濃度依存的な抑制作用を示した。静置培養１２日目のＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡ発現値を表７に示す。

　（試験例６：ヒトＨＢ－ＥＧＦで刺激したＰａｎｃ０２，０３細胞増殖に対する選択的阻害剤の効果）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。脱アシル化ジェランガム・低接着培養法は、ヒト膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ０２，０３（ＡＴＣＣ社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）とＥＧＦ受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂ, ＴＧＦ－β受容体阻害剤であるＬＹ３６４９４７, ｃ－ｋｉｔ／ＦＧＦ受容体－３阻害剤であるＭａｓｉｔｉｎｉｂ（すべてＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）を１５μＬずつ添加し、引き続き培養を１０日間継続した。１１日目に培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いることで、ＥＧＦ受容体の生体リガンドであるヒトＨＢ－ＥＧＦ刺激によりＰａｎｃ０２，０３細胞の増殖亢進作用が明確に認められた。またその増殖亢進作用は、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂで選択的に抑制されることが明らかとなった。静置培養１１日目の、ＨＢ－ＥＧＦ添加条件でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表８に示す。

　（試験例７：ヒトＨＢ－ＥＧＦで刺激したＳＫＯＶ３細胞増殖とＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ発現に対するＥＧＦ受容体阻害剤の選択性確認試験）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、脱アシル化ジェランガム・低接着培養法は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）とＥＧＦ受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂ, ＴＧＦ－β受容体阻害剤であるＬＹ３６４９４７, ｃ－ｋｉｔ／ＦＧＦ受容体－３阻害剤であるＭａｓｉｔｉｎｉｂ（すべてＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）を１５μＬずつ添加し、引き続き培養を１１日間継続した。５日目に培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。また１２日目に癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応に用いた各ｃＤＮＡサンプルは、分注し滅菌水で１/１０に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたｃＤＮＡを使用し、３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で設定した。ＰＣＲ反応は、各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ^ＴＭ（タカラバイオ社製）と各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。特異性はＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを内在性コントロールとし、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨの値で補正した。用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
　ＧＡＰＤＨ：ＨＳ９９９９９９０５
　Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＨＳ０１０２３８９４

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いることで、ＥＧＦ受容体の生体リガンドであるヒトＨＢ－ＥＧＦ刺激によりＳＫＯＶ３細胞の増殖亢進作用が明確に認められた。その増殖亢進作用は、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂで選択的に抑制された。さらにヒトＨＢ－ＥＧＦの刺激でＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量が低下した。ヒトＨＢ－ＥＧＦによる発現低下に対しても、ＥＧＦ受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂは抑制効果を示したが、他の受容体に対する阻害剤については抑制効果を認めなかった。静置培養５日目の、ＨＢ－ＥＧＦ添加条件でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表９に示す。また、静置培養１２日目のＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡ発現値を表１０に示す。

　（試験例８：ヒトＴＧＦ－β１で刺激したＳＫＯＶ３細胞のＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ発現に対するＴＧＦ－β１受容体阻害剤の選択性確認試験）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、脱アシル化ジェランガム・低接着培養法は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。プレートをＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態でインキュベートした。培養１日目に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＴＧＦ－β１（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）とＥＧＦ受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂ, ＴＧＦ－β受容体阻害剤であるＬＹ３６４９４７, ｃ－ｋｉｔ／ＦＧＦ受容体－３阻害剤であるＭａｓｉｔｉｎｉｂ（すべてＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）と終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）を１５μＬずつ添加し、引き続き培養を１１日間継続した。１２日目に癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い，ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応に用いた各ｃＤＮＡサンプルは、分注し滅菌水で１/１０に希釈したものを用いた。また検量線に用いるサンプルは、分注し混合させたｃＤＮＡを使用し、３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で設定した。ＰＣＲ反応は、各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ^ＴＭ（タカラバイオ社製）と各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて実施した。ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを内在性コントロールとし、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨの値で補正した。用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
　ＧＡＰＤＨ：ＨＳ９９９９９９０５
　Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＨＳ０１０２３８９４

　その結果、本発明に用いる培地組成物を用いることで、ヒトＴＧＦ－β１の刺激でＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量が低下することが明らかとなった。さらにヒトＴＧＦ－β１による発現低下を、ＴＧＦ－β１受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂは選択的に抑制したが、他の受容体に対する阻害剤は抑制効果を認めなかった。静置培養１２日目のＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡ発現値を表１１に示す。

　（試験例９：ヒトＨＢ－ＥＧＦで刺激したＳＫＯＶ３細胞増殖とＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ発現に対する分子標的薬の効果）
　脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ　ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＭａＣｏｙ’ｓ５ａ培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、脱アシル化ジェランガム・低接着培養法は、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、３７０００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１３５μＬになるように分注することにより実施した。プレートはＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内にて静置状態で培養した。培養１日目に、終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように、１０倍濃度のヒトＨＢ－ＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）；ＥＧＦ受容体阻害剤であるＧｅｆｉｔｉｎｉｂ、ＭＥＫ阻害剤であるＴｒａｍｅｔｉｎｉｂ、Ａｋｔ阻害剤であるＭＫ－２２０６又はＪＡＫ阻害剤であるＣｙｔ３８７（すべてＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）；及び終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含んだ培地組成物（脱アシル化ジェランガム添加群）を１５μＬずつ添加し、引き続き培養を１１日間継続した。７日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ^ＴＭ　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ，　Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁し、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。また１２日目の癌細胞を含む培養液を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）することで細胞を回収した。細胞からＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡとＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを分注し、滅菌水で１/１０に希釈し、ＰＣＲに用いた。合成したｃＤＮＡを分注し、混合し、検量線作成に用いた。３倍公比で１/３から１/２４３の希釈までの定量範囲で検量線を設定した。各ｃＤＮＡサンプル、検量サンプル、Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ^ＴＭ（タカラバイオ社製）及び各種Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用し、７５００　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＰＣＲを実施した。特異性のためにＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ　３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のｍＲＮＡを内在性コントロールとして用い、Ｅ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ　ｍＲＮＡの発現はＧＡＰＤＨの値で補正した。用いた各プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を以下に示す。
　ＧＡＰＤＨ：ＨＳ９９９９９９０５
　Ｅ―Ｃａｄｈｅｒｉｎ：ＨＳ０１０２３８９４

　その結果、本発明の培地組成物を用いることで、ＥＧＦ受容体の生体リガンドであるヒトＨＢ－ＥＧＦ刺激によるＳＫＯＶ３細胞の増殖亢進作用が明確に認められた。またその増殖亢進作用は、Ａｋｔ阻害剤であるＭＫ－２２０６で選択的に抑制されることが明らかとなった。一方、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂは弱い抑制作用を示し、Ｃｙｔ３８７は抑制効果を認めなかった。さらにヒトＨＢ－ＥＧＦの刺激でＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現量が低下することが明らかとなった。しかしヒトＨＢ－ＥＧＦによるＥ－Ｃａｄｈｅｒｉｎの発現低下に対しては、３つの阻害剤は抑制効果を認めなかった。静置培養７日目の、ＨＢ－ＥＧＦ添加条件でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表１２に示す。また、静置培養１２日目のＥ－ＣａｄｈｅｒｉｎｍＲＮＡ発現値を表１３に示す。

　ここで述べられた特許、特許出願明細書及び科学文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

　本出願は、日本で出願された特願２０１４－１９５８１４（出願日：２０１４年９月２５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

　トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有する接着性癌細胞を、当該増殖因子、及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子に反応性を有する接着性癌細胞の培養方法。
　増殖因子がトランスフォーミング増殖因子である、請求項１記載の方法。
　トランスフォーミング増殖因子が、ＴＧＦ－β１である、請求項２記載の方法。
　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
　培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
　接着性癌細胞の、トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子への反応性を試験する方法であって、
（１）接着性癌細胞を、当該増殖因子の存在下及び非存在下で、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌細胞の増殖を測定すること、及び
（３）当該増殖因子の存在下で培養した癌細胞の増殖を、当該増殖因子の非存在下での増殖と比較すること
を含む、方法。
　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項６記載の方法。
　培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、請求項６又は７記載の方法。
　トランスフォーミング増殖因子、インスリン様増殖因子及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択されるいずれかの増殖因子への反応性を有する接着性癌細胞に対する抗癌剤のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、当該癌細胞を、当該増殖因子及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌細胞の増殖を測定すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌細胞の増殖を、被検物質の非存在下での増殖と比較すること
を含む、方法。
　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項９記載の方法。
　培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、請求項９又は１０記載の方法。
　癌腫細胞を、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮系様形質の維持方法。
　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項１２記載の方法。
　培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１２又は１３記載の方法。
　上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子、及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養することを含む、当該癌腫細胞の上皮間葉転換の誘導方法。
　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項１５記載の方法。
　培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１５又は１６記載の方法。
　癌腫細胞の上皮間葉転換を誘導する物質のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を評価すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を、被検物質の非存在下での上皮間葉転換と比較すること
を含む、方法。
　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項１８記載の方法。
　培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、請求項１８又は１９記載の方法。
　癌腫細胞の上皮間葉転換を阻害する物質のスクリーニング方法であって、
（１）被検物質の存在下及び非存在下で、上皮系様形質を有する癌腫細胞を、上皮間葉転換誘導因子及び細胞または組織を浮遊させて培養できる構造体を含有する培地組成物中で、浮遊培養すること、
（２）培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を評価すること、及び
（３）被検物質の存在下で培養した癌腫細胞の上皮間葉転換を、被検物質の非存在下での上皮間葉転換と比較すること
を含む、方法。
　前記構造体が脱アシル化ジェランガムを含む、請求項２１記載の方法。
　培地組成物の３７℃における粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下である、請求項２１又は２２記載の方法。