CN114315848B

CN114315848B - 胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂及其用途

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Publication number: CN114315848B
Application number: CN202111128797.XA
Authority: CN
Inventors: 王英杰; 康博
Original assignee: Hangzhou Nain Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Nain Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN112125916A; CN114276362B; CN114276362A; CN114315848A

Abstract

本发明公开了一种胰岛素样生长因子‑1受体的小分子抑制剂及其用途，属于医药技术领域。本发明提供的胰岛素样生长因子‑1受体的小分子抑制剂为式Ⅰ所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，能够用于制备治疗和/或预防癌症的药物，具体癌症的类型包括恶性黑色素瘤、原发性神经外胚层瘤、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病、消化道肿瘤、妇科癌症等。而且本发明提供的小分子抑制剂具有良好的血脑屏障通透性、在机体内具有较长的半衰期。

Description

胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂及其用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂及其用途。

背景技术

原发性神经系统恶性肿瘤的发生呈逐年递增趋势。胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的脑肿瘤，其包括星形细胞肿瘤、少突胶质细胞肿瘤和室管膜肿瘤(Muir CS,Storm etal.,Cancer Surv,19-20:369-392,1994；Louis DN et al.,Acta Neuropathol,131:803-820,2016)，是最常见的原发性肿瘤类型。以替莫唑胺为代表的化学药物疗法是当前治疗高级别胶质瘤的金标准，但仅能很有限地延长患者生存期。胶质瘤的化疗药物治疗仍存在很多的弊端，全身用药很难在中枢系统达到高浓度并到达肿瘤所在部位，并且可能引起全身性的药物副作用。

随着基因组时代的到来，人们对肿瘤生物学和肿瘤发生过程中的基因突变的认识不断加深，针对肿瘤分子靶向治疗的研究越来越多。靶向治疗是作用于与肿瘤相关的特异性分子靶标，通过特异性地干预这些靶点而阻止肿瘤生长和扩散，能够选择性地杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞。相比于传统的化疗药物，靶向治疗中采用的靶向药物可实现更好的疗效。但是，迄今尚未有疗效更好的靶向药物在胶质瘤的治疗应用中获得成功，其原因在于绝大部分靶向药物无法透过血脑屏障。研制将药物直接投放到中枢神经系统的方法具有挑战性，需要突破血脑屏障在靶区域达到药物高浓度而在全身低浓度，减轻药物的全身性副反应。

1956年有人在血清中发现一种能促进成骨的物质，被称为胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGFs)，能促进细胞增殖、分化、抑制调亡。胰岛素样生长因子受体包括胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1receptor，IGF-1R)等。Hua H et al.(2020)Insulin-like growth factor receptor signaling intumorigenesis and drug resistance:a challenge for cancer therapy.J HematolOncol，13(1):64.和Cao J,Yee D.(2021)Disrupting insulin and IGF receptorfunction in cancer.Int J Mol Sci.PMID:33429867以及Haisa M.(2013)The type1insulin-like growth factor receptor signalling system and targeted tyrosinekinase inhibition in cancer.J Int Med Res.PMID:23569026等文献中均报道了IGF-1R在各种不同类型肿瘤发生发展中发挥着重要作用。因此，IGF-1R具有成为多种类型肿瘤的靶向治疗药物靶标的前景。

苦鬼臼毒素(Picropodophyllin,PPP)是一种环木酯素类化合物，其结构如下：

苦鬼臼毒素被认为是一种特异性IGF-1R酪氨酸激酶抑制剂，可以被用来治疗多种IGF-1R导致的疾病，具体包括多种类型的癌症、动脉硬化、牛皮癣、冠状血管成形术后再狭窄(专利文献：WO02/102804)、2型糖尿病、肾病、视网膜病、青光眼、甲状腺眼病(专利文献：WO 2007/097707)、风湿性关节炎、溃疡、多发性硬化、阿尔茨海默症、哮喘、湿疹、移植后排斥(专利文献：WO 2009/157858)。

其中，在治疗癌症方面，多种类型的肿瘤细胞中IGF-1R表达量显著升高，苦鬼臼毒素通过阻断IGF-1R介导的细胞内信号传导通路达到抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的目的(Girnita A,et al.,Cancer Res，64:236-242,2004)，可以实现靶向抑制肿瘤细胞增殖，而对正常细胞毒副作用较小。Yin S et al.,Neuro-Oncology,12:19-27,2010.报道了苦鬼臼毒素可通过抑制IGF-1R来抑制接种至大鼠脑部的人源胶质瘤细胞的增殖，提示它可能具有透过血脑屏障的特性。尽管苦鬼臼毒素具有特异性高、毒副作用小的优点，但仍存在脂溶性差，不易透过血脑屏障等问题，其在人体临床试验中效果并不佳。

我们的研究表明苦鬼臼毒素在小鼠体内代谢很快，并且不易透过血脑屏障，这也许是苦鬼臼毒素在人体临床试验中效果不佳的重要原因。因此，需要寻找一种在体内代谢更慢、体内药效更高、并更易于透过血脑屏障的化合物，用于治疗IGF-1R依赖性疾病尤其是胶质瘤和易发生脑转移的癌症。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的全部或部分不足，本发明提供一种胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂及其用途，能够延长IGF-1R抑制剂在体内的半衰期，使其在体内代谢更慢、体内药效更高，并提高其透过血脑屏障的能力。

为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂，所述小分子抑制剂为式Ⅰ所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：

其中，R选自氢、卤素、羟基、C₁-C₃烷基、C₁-C₃卤代烷基、C₁-C₃烷氧基、C₁-C₃卤代烷氧基、R_aCO-酰基、R_aCOO-酯基中的任一种；其中，R_a选自氢、C₁-C₃烷基或C₁-C₃卤代烷基。R_aCO-酰基可以是CH₃CO-(甲酰基)等，R_aCOO-酯基可以是CH₃COO-、CH₃CH₂COO-、CH₃CH₂CH₂COO-等。

在一个技术方案中，R为羟基，所述小分子抑制剂为式Ⅱ所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：

在一个技术方案中，式Ⅰ所示化合物中至少一个氢原子被氘原子取代。

进一步地，所述小分子抑制剂为式Ш所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：

本发明涉及的术语说明如下：

本发明所用术语“烷氧基”是指-O-烷基基团，其中烷基如上所定义。本发明所用“烷氧基”的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。烷氧基可以是无取代或取代的。烷氧基可任选被卤素取代一次或多次，如三氟甲氧基。

本发明所用术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。

所述药学上可接受的盐为碱金属盐、碱土金属盐、酸加成盐、碱加成盐或烷基化盐。

本发明还提供一种胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂的用途，具体的，包括以上所有方案中的所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，所述癌症为IGF-1R依赖性疾病，所述IGF-1R是指胰岛素样生长因子-1受体。所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂通过抑制IGF-1R来实现对癌症肿瘤细胞增殖的抑制作用，从而达到抗癌疗效。

所述癌症包括恶性黑色素瘤、原发性神经外胚层瘤、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病、消化道肿瘤、妇科癌症中的一种或几种。所述神经胶质瘤为恶性胶质瘤或星形胶质细胞瘤；所述消化道肿瘤为胃癌、结直肠癌、肝癌或胰腺癌。所述骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病为白血病或淋巴瘤；所述妇科癌症为卵巢癌或宫颈癌。

所述癌症为原发肿瘤向脑部转移后形成的肿瘤。脑转移瘤是常见的一类颅内肿瘤，以肺癌和乳腺癌转移最多见，其次为恶性黑色素瘤、消化道肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤等，另有相当部分为原发灶不明的肿瘤。由于脑转移瘤在发生时其原发肿瘤亦处于活跃状态，且有多发性特征，长期以来治疗也仅能够以姑息性放疗为主。由于血脑屏障的作用，一般药物难以在颅内形成有效需要浓度，因而化疗效果较差。本发明所述的胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂具有良好的血脑屏障通透性，尤其适合治疗由上述原发肿瘤向脑部转移后形成的肿瘤，例如脑部胶质瘤。

所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂或由其制备得到的药物与其他抗癌药物联用，所述其他抗癌药物包括化疗药物、靶向药物、免疫治疗药物中的一种或几种。也可以与手术切除或放疗等治疗方法联用。

从作用机制的角度来看，抗癌药物可分为化疗药物(非选择性杀伤细胞)，靶向药物(选择性杀伤高表达“靶”蛋白的肿瘤细胞)、免疫治疗药物(药物本身不直接杀伤肿瘤细胞，而是通过调动机体免疫细胞来杀伤甚至清除肿瘤细胞)。

从药物材料的角度来看，抗癌药物可分为小分子药物和大分子药物。其中，小分子药物包括化疗药物、部分靶向药物以及蛋白降解靶向嵌合体。大分子药物包括抗体药物、多肽药物、纳米药物、核酸药物等，其中，抗体药物包括部分靶向药物，纳米药物是指用纳米材料包裹小分子或大分子。

所述化疗药物为替莫唑胺，所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂或由其制备得到的药物与替莫唑胺联用，用于治疗和/或预防神经胶质瘤。

所述免疫治疗药物为PD-1抗体，所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂或由其制备得到的药物与PD-1抗体联用，用于治疗和/或预防肺癌。

所述药物的剂型为液体制剂，所述液体制剂的溶剂为DMSO+玉米油，将所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂溶于所述溶剂中。进一步地，所述溶剂中玉米油的体积比可以在80％以上，例如玉米油的比例在80％-90％之间，DMSO的比例在10％-20％之间。具体地，所述液体制剂的溶剂可以为20％(v/v)DMSO+80％(v/v)玉米油，或者10％(v/v)DMSO+90％(v/v)玉米油等，DMSO比例太高会产生生物毒性，DMSO比例过低会导致无法与玉米油和药物形成混悬液。且以DMSO和玉米油作为辅料，还可以将药物制备成固体制剂或半固体制剂。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：本发明提供了一种新颖的取代苦鬼臼毒素衍生物结构，是一种新型的胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂。本发明以氟原子替代苦鬼臼毒素上的2处氢原子，可以提高分子透过血脑屏障的能力。进一步地，以氘原子替代苦鬼臼毒素上的多处氢原子，可以延长分子在机体内的半衰期。本发明提供的胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂可以用于制备治疗和/或预防癌症的药物，具体癌症的类型包括恶性黑色素瘤、原发性神经外胚层瘤、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病、消化道肿瘤、妇科癌症等。本发明提供的小分子抑制剂在体内药效高，还具有非常好的血脑屏障通透性，而且其在体内代谢慢、在机体内具有较长的半衰期，能够有效治疗IGF-1R依赖性疾病尤其是胶质瘤和易发生脑转移的癌症。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的化合物1的合成流程图。

图2为对PB-001进行手性拆分得到PB-004、PB-005。

图3为对PB-009进行手性拆分得到PB-015、PB-016。

图4为对PB-019进行手性拆分得到PB-020、PB-021。

图5为PB-001、PB-004、PB-005对U87细胞处理后的细胞形态。

图6为PB-001、PB-004、PB-005的体外药效检测结果图。

图7为PB-009、PB-015、PB-016对U87细胞处理后的细胞形态。

图8为PB-009、PB-015、PB-016的体外药效检测结果图。

图9为PB-019、PB-020、PB-021对U87细胞处理后的细胞形态。

图10为PB-019、PB-020、PB-021的体外药效检测结果图。

图11为PB-018和PB-019对雄性裸鼠进行灌胃后在脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。其中，图11中的A为PB-018对雄性裸鼠进行灌胃后小鼠脑组织内的化合物浓度变化图；图11中的B为PB-018对雄性裸鼠进行灌胃后小鼠血浆内的化合物浓度变化图；图11中的C为PB-019对雄性裸鼠进行灌胃后小鼠脑组织内的化合物浓度变化图；图11中的D为PB-019对雄性裸鼠进行灌胃后小鼠血浆内的化合物浓度变化图。

图12为PB-016和PB-020对U87肿瘤微球处理24小时后的Western blot检测结果图，用于检测PB-016和PB-020对靶标蛋白IGF-1R与下游信号蛋白AKT的作用。

图13为苦鬼臼毒素(PPP)、PB-016和PB-020给药3小时后小鼠脑组织样的Westernblot检测结果图。给药方式为以100mg/kg剂量灌胃，用于检测苦鬼臼毒素(PPP)、PB-016和PB-020对小鼠血脑屏障的透过性。

图14为PB-016溶于不同溶剂时在小鼠脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。其中，图14中的A为PB-016溶于不同溶剂时在脑组织内的化合物浓度变化图；图14中的B为PB-016溶于不同溶剂时在血浆内的化合物浓度变化图。

图15为PB-004溶于不同溶剂时在小鼠脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。其中，图15中的A为PB-004的DMSO组对雌性裸鼠进行灌胃后小鼠脑组织内的化合物浓度变化图；图15中的B为PB-004的DMSO组对雌性裸鼠进行灌胃后小鼠血浆内的化合物浓度变化图；图15中的C为PB-004的玉米油组对雄性裸鼠进行灌胃后小鼠脑组织内的化合物浓度变化图；图15中的D为PB-004的玉米油组对雄性裸鼠进行灌胃后小鼠血浆内的化合物浓度变化图。

图16为苦鬼臼毒素(PPP)、PB-016和PB-020给药后不同时间段内药物在小鼠血浆和脑组织中的浓度动态变化实验结果图。给药方式为以50mg/kg剂量灌胃，用于检测药物在小鼠血浆和脑组织中的稳定性。

图17为PB-020按不同剂量给药后小鼠的体重变化图，用于PB-020对小鼠的短期毒性试验。

图18为PB-020对接种于裸鼠的MDA-MB-231-Luc乳腺癌细胞脑转移的抑制作用的影响结果图。

图19为PB-020与替莫唑胺联用对原位接种于裸鼠脑部的U87-Luc胶质瘤细胞增殖的抑制作用和对小鼠生存期的影响。其中，图19中的A为对U87-Luc胶质瘤细胞增殖的抑制作用；图19中的B为对小鼠生存期的影响。

图20为PB-020与PD-1抗体联用对免疫正常小鼠中LLC肺癌细胞增殖的抑制作用和对小鼠生存期的影响结果图。其中，图20中的A为对LLC肺癌细胞增殖的抑制作用；图20中的B为对小鼠生存期的影响结果图。

图21为式Ⅰ所示化合物的结构式。

具体实施方式

下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下介绍本发明所提供的部分胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂及其制备、合成过程。

实施例1、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮(化合物1，PB-001)

如图1所示，化合物1的合成过程包括：

步骤1)、4-乙烯基二氢呋喃-2(3H)-酮(中间体1.1)的合成：

在2-丁烯-1，4-二醇(206.4g，2.34mol，1.0eq)和原乙酸三乙酯(546.7g，3.4mol，1.4eq)的混合物中加入催化对苯二酚(54.00g，0.49mol，0.2eq)，混合物加热至120℃。乙醇被持续蒸馏出来，直到无更多乙醇产生时，将反应温度升高至150℃，搅拌反应混合物48小时。通过真空蒸馏(70-75℃，2-3mmHg)收集得到中间体1.1，为无色油状物(170.0g，收率65％)。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)2.36(dd,J＝17.4Hz,8.7Hz,1H),2.69(dd,J＝17.7Hz,8.4Hz,1H),3.19-3.29(m,1H),4.01-4.14(m,1H),4.43-4.47(m,1H),5.17-5.23(m,2H),5.75-5.84(m,1H)。

步骤2)、相对-(3S,4R)-3-(羟基(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-4-乙烯基二氢呋喃-2(3H)-酮(中间体1.2)的合成：

将中间体1.1(170.0g，1.52mol，1.0eq)和四氢呋喃(1500ml)混合，氮气保护，在-78℃下搅拌，滴加二异丙基氨基锂(2.0M，834ml，1.67mol，1.1eq)，并搅拌反应混合物30分钟。在相同条件下，滴加3，4，5-三甲氧基苯甲醛(327.6g，1.67mol，1.1eq)与四氢呋喃(1500ml)的混合溶液，再搅拌3小时，然后逐渐加热到环境温度过夜。反应混合物冷却至-78℃，用饱和NH₄Cl淬灭。由此产生的混合物用乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(200-300硅胶，石油醚:乙酸乙酯＝5/1-1/1)纯化得到中间体1.2(190.1g，收率41％)，为浅黄色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)2.75-2.80(m,1H),2.91-2.96(m,0.5H),3.26-3.31(m,0.5H),3.84(s,3H),3.89(s,6H),3.92(t,1H),4.30-4.40(m,1H),4.86-4.93(m,2H),6.59(s,1H),6.61(s,1H)。

步骤3)、相对-(3R,4R)-3-((R)-(2,2-二氟-6-羟基苯并[d][1,3]二氧杂-5-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-4-乙烯基二氢呋喃-2(3H)-酮(中间体1.3)的合成：

将中间体1.2(106.7g,0.41mol,1.0eq)，5-酚羟基-2,2-二氟-1,3-苯并二噁唑(107.6g,0.61mol,1.5eq)和二氯甲烷(2000ml)混合搅拌，加入FeCl₃(34.06g,0.20mol,0.5eq),反应混合物加热至40℃2-3小时，用饱和NaHCO₃淬灭，水相进一步以二氯甲烷萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(200-300硅胶，石油醚:乙酸乙酯＝5/1-1/1)纯化得到中间体1.3(153.4g，收率45％)，为米色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)3.02-3.06(m,1H),3.19-3.21(m,1H),3.83(s,6H),3.88(s,3H),4.04-4.07(m,1H),4.25-4.29(m,1H),4.73-4.75(d,J＝4.8Hz,1H),5.14-5.22(m,2H),5.55(brs,1H),5.80-5.84(m,1H),6.51-6.59(m,2H),6.82-6.96(m,1H),7.29(s,1H)。

步骤4)、相对-6-((R)-((3R,4R)-2-氧代-4-乙烯基四氢呋喃-3-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲基)-2,2-二氟苯并[d][1,3]二氧杂-5-基三氟甲磺酸酯(中间体1.4)的合成：

在持续搅拌的中间体1.3(120.0g,0.26mol,1.0eq)和二氯甲烷(1500ml)中加入三乙胺(52.62g,0.52mol,2.0eq)，然后在10℃温度下滴加三氟甲磺酸酐(110.0g,0.39mol,1.5eq)，混合物在相同温度下继续搅拌混匀30分钟。反应用饱和NaHCO₃淬灭，水相进一步以二氯甲烷萃取。合并后的有机相依次用2NHCl和饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(200-300硅胶，石油醚:乙酸乙酯＝6/1-3/1)纯化得到中间体1.4(120.0g，收率61％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)2.97-3.06(m,1H),3.13-3.17(m,1H),3.84(s,6H),3.85(s,3H),4.03-4.08(m,1H),4.37-4.41(m,1H),4.64-4.66(d,J＝8.3Hz,1H),5.08-5.20(dt,2H),5.71-5.80(m,1H),6.58(s,2H),7.04(s,1H),7.23(s,1H)。

步骤5)、相对-(5R,5aR,8aS)-2,2-二氟-9-亚甲基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧杂-6(5aH)-酮(中间体1.5)的合成：

在持续搅拌的中间体1.4(120.0g,0.20mol,1.0eq)和乙腈(1500ml)混合物中加入三苯基膦(15.83g,60.0mmol,0.3eq)，K₂CO₃(82.93g,0.60mol,3.0eq)和Pd(OAc)₂(4.49g,20.0mmol,10mol％)，加热至80℃20小时。过滤反应物，沉淀用二氯甲烷洗脱。合并后的有机相浓缩干燥，硅胶柱层析(200-300硅胶，石油醚:乙酸乙酯＝5/1-1/1)纯化得到中间体1.5(76.13g，收率61％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)3.31-3.34(dd,1H),3.65-3.68(t,1H),3.76(s,6H),3.84(s,3H),4.21-4.24(dd,1H),4.57-4.59(m,2H),5.21-5.22(d,1),5.57(s,1H),6.31(s,2H),6.95(s,1H),7.27(s,1H)。

步骤6)、相对-(5aR,8aR,9R)-2,2-二氟-9-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5a,6,8a,9-四氢呋喃[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]二氧代-5,8-二酮(中间体1.6)的合成：

在持续搅拌的中间体1.5(79.04g,0.18mol,1.0eq)，4-甲基吗啉-N-氧化物(168.7g,0.72mol,3.0eq)和二氯甲烷(1200ml)中加入OsO₄(4.00g,15.7mmol,8mol％)，混合物继续在环境温度下搅拌12小时。在反应物中分批加入固态NaIO₄(77.00g,0.36mol,2.0eq)，继续搅拌1小时。反应在冰浴中用饱和Na₂S₂O₃(300ml)淬灭，水相进一步以二氯甲烷萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(200-300硅胶，石油醚:乙酸乙酯＝5/1-1/1)纯化得到中间体1.6(48.80g，收率60％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)3.37-3.42(m,2H),3.78(s,6H),3.82(s,3H),4.38-4.42(m,1H),4.79-4.80(d,J＝2.8Hz,2H),6.22(s,2H),7.02(s,1H),7.80(s,1H)。

步骤7)、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮(化合物1)的合成：

将中间体1.6(43.30g,98.9mmol,1.0eq)和乙醚(1500ml)混合，氮气保护，在-78℃下搅拌，滴加LiAl(OtBu)₃(200ml,197mmol,2.0eq)，然后逐渐加热到环境温度过夜。反应在冰浴中用2N HCl淬灭，水相进一步以二氯甲烷萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。残余物用乙酸乙酯重结晶，得到化合物1(33.10g，收率74％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.38(s,1H),6.53(s,1H),6.47(s,2H),4.67(d,J＝0.9Hz,1H),4.55-4.43(m,2H),4.03(d,J＝6.4Hz,1H),3.89(s,3H),3.85(s,6H),3.26(q,1H),2.96(d,J＝6.9Hz,1H),2.66(m,1H)。

实施例2、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-8-氧杂-9-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,5a,6,8,8a,9-六氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-5-基乙酸酯(化合物2，PB-002)

将化合物1(1.15g,2.55mmol,1.0eq)和二氯甲烷(30ml)持续搅拌混合，加入Et₃N(770mg,7.6mmol,3.0eq)和DMAP(310mg,2.55mmol,1.0eq)，然后在冰浴下加入AcCl(400mg,5.1mmol,2.0eq)，混合物在环境温度下搅拌12小时。滴加LiAl(OtBu)₃(200ml,197mmol,2.0eq)，然后逐渐加热到环境温度过夜。反应用饱和NH₄Cl淬灭，水相进一步以二氯甲烷萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。残余物用石油醚/乙酸乙酯重结晶，得到化合物2(810mg，收率65％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.02(s,1H),6.76(s,1H),6.41(s,2H),5.81(d,J＝6.3Hz,1H),4.48-4.34(m,3H),3.87(s,3H),3.84(s,6H),3.32(d,1H),3.01(m,1H),2.12(s,3H)。

实施例3、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2,9-三氟-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮(化合物3，PB-006)

将化合物1(700mg,1.60mmol,1.0eq)和二氯甲烷(20ml)持续搅拌混合，滴加入二乙胺基三氟化硫(520mg,3.20mmol,2.0eq)，混合物在环境温度下搅拌12小时。反应用饱和NaHCO₃淬灭，继续搅拌30分钟。分离出有机相后，水相进一步以二氯甲烷萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。残余物用硅胶柱层析(200-300硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100/1-50/1)纯化，得到化合物3(130mg，收率18％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.27(s,1H),6.66(s,1H),6.44(s,2H),5.49-5.34(d,J＝50.8Hz,1H),4.60-4.47(m,2H),4.20(d,J＝5.0Hz,1H),3.88(s,3H),3.84(s,6H),3.28(m,1H),3.01(m,1H)。

实施例4、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-甲氧基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮(化合物4，PB-007)

将化合物1(600mg,1.33mmol,1.0eq)和二氯甲烷(15ml)持续搅拌混合，加入三甲基氧鎓四氟硼酸盐(246mg,1.66mmol,1.2eq)，混合物在环境温度下搅拌20小时。反应用饱和NaHCO₃淬灭，继续搅拌30分钟。分离出有机相后，水相进一步以二氯甲烷萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。残余物用硅胶柱层析(200-300硅胶，二氯甲烷:甲醇＝100/1-50/1)纯化，得到化合物4(65mg，收率11％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.16(s,1H),6.74(s,1H),6.41(s,2H),4.45-4.36(m,3H),4.34(d,J＝4.3Hz,1H),3.88(s,3H),3.83(s,6H),3.42(d,1H),3.31(s,3H),3.14(m,1H)。

实施例5、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮-9-氘代(化合物5，PB-009)

将中间体1.6(400mg,0.89mmol,1.0eq)和甲醇(10ml)持续搅拌混合，分批加入NaBD₄(37.5mg,0.89mmol,1.0eq)，混合物搅拌4小时。反应用水淬灭，浓缩干燥。残余物用水稀释，用乙酸乙酯萃取。合并后的有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。残余物用石油醚/乙酸乙酯重结晶，得到化合物5(140mg，收率35％)，为白色固体。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.38(s,1H),6.57(s,1H),6.47(s,2H),4.66(d,J＝9.8Hz,1H),4.47(m,1H),4.06(d,J＝6.2Hz,1H),3.89(s,3H),3.87(s,6H),3.27(d,1H),2.68(m,1H),2.44(s,1H)。

实施例6、(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮(化合物6，PB-004)

化合物6是运用手性柱层析法从化合物1中手性分离得到的。手性柱层析的主要参数如下：仪器:waters SFC200；层析柱:Daicel Chiralcel AD,250×50mm I.D.,10μm；流动相:A为CO₂，B为异丙醇；梯度:B 20％；流速:150mL/min；反压:100bar；柱温:38℃；波长:220nm；循环时间:6.5min；样品分离:化合物溶解于～600ml甲醇中；进样体积:每次3ml。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.38(s,1H),6.53(s,1H),6.47(s,2H),4.67(d,J＝0.9Hz,1H),4.55-4.43(m,2H),4.03(d,J＝6.4Hz,1H),3.89(s,3H),3.85(s,6H),3.26(q,1H),2.96(d,J＝6.9Hz,1H),2.66(m,1H)；e.e.＝98.56％；[α]＝11.94°(MeOH,c＝0.88g/100ml)。

实施例7、(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三甲氧基苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮-9-氘代(化合物7，PB-016)

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化合物7是运用手性柱层析法从化合物5中手性分离得到的。手性柱层析的主要参数如下：仪器:waters SFC200；层析柱:Daicel Chiralcel AD,250×50mm I.D.,10μm；流动相:A为CO₂，B为异丙醇；梯度:B 20％；流速:150mL/min；反压:100bar；柱温:38℃；波长:220nm；循环时间:6.5min；样品分离:化合物溶解于～600ml甲醇中；进样体积:每次3ml。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.38(s,1H),6.57(s,1H),6.47(s,2H),4.66(d,J＝9.8Hz,1H),4.47(m,1H),4.06(d,J＝6.2Hz,1H),3.89(s,3H),3.87(s,6H),3.27(d,1H),2.68(m,1H),2.44(s,1H)。

实施例8、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-甲基-9-羟基-5-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-5,8,8a，9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮(化合物8)

化合物8以5-酚羟基-2,2-甲基-1,3-苯并二噁唑作为起始材料，以实施例1中化合物1合成相类似的途径合成得到。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)6.95(s,1H),6.48(s,2H),6.30(s,1H),4.43-4.53(m,3H),4.12(d,J＝5.2Hz,1H),3.87(s,3H),3.84(s,6H),3.25(dd,J＝5.2Hz,9.3Hz,1H),2.74-2.80(m,1H),2.18(brs,1H),1.68(s,3H),1.65(s,3H)。

实施例9、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三甲氧基-苯基)-5,8,8a，9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮-5,9-二氘代(化合物9)

化合物9以3,4,5-三甲氧基苯甲醛-d-甲酰作为起始材料，以实施例5中化合物5合成相类似的途径合成得到。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.38(s,1H),6.56(s,1H),6.47(s,2H),4.65(d,J＝9.8Hz,1H),4.47(dd,J＝6.1Hz,9.7Hz,1H),3.90(s,3H),3.86(s,6H),3.26(d,J＝9.4Hz,1H),2.66-2.70(m,1H),2.52(brs,1H)。

实施例10、相对-(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三(氘代甲氧基-d3)苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮-9-氘代(化合物10，PB-019)

化合物10以3,4,5-三甲氧基苯甲醛-d9作为起始材料，以实施例5中化合物5合成相类似的途径合成得到。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.38(s,1H),6.55(s,1H),6.46(s,2H),4.64(dd,J＝1.2Hz,9.8Hz,1H),4.45(dd,J＝6.0Hz,9.8Hz,1H),4.04(d,J＝6.3Hz,1H),3.26(dd,J＝6.4Hz,9.3Hz,1H),2.78(s,1H),2.66(dd,J＝6.0Hz,8.5Hz,1H)。

实施例11、(5R,5aS,8aR,9R)-2,2-二氟-9-羟基-5-(3,4,5-三(氘代甲氧基-d3)苯基)-5,8,8a,9-四氢呋喃并[3',4':6,7]萘并[2,3-d][1,3]-二氧杂-6(5aH)-酮-9-氘代(化合物11，PB-020)

化合物11是运用手性柱层析法从化合物10中手性分离得到的。手性柱层析的主要参数如下：仪器:waters SFC200；层析柱:Daicel Chiralcel AD,250×50mm I.D.,10μm；流动相:A为CO₂，B为异丙醇；梯度:B 20％；流速:150mL/min；反压:100bar；柱温:38℃；波长:220nm；循环时间:6.5min；样品分离:化合物溶解于～600ml甲醇中；进样体积:每次3ml。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.38(s,1H),6.55(s,1H),6.46(s,2H),4.64(dd,J＝1.2Hz,9.8Hz,1H),4.45(dd,J＝6.0Hz,9.8Hz,1H),4.04(d,J＝6.3Hz,1H),3.26(dd,J＝6.4Hz,9.3Hz,1H),2.78(s,1H),2.66(dd,J＝6.0Hz,8.5Hz,1H)。

胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂的生物活性检测

一、化合物筛选试验

(1)细胞实验

共三组受试化合物：

第一组：PB-001(化合物1)、PB-004(化合物6)、PB-005。

第二组：PB-009(化合物5)、PB-015、PB-016(化合物7)。

第三组：PB-019(化合物10)、PB-020(化合物11)、PB-021。

如图2所示，PB-001手性拆分为PB-004、PB-005。

如图3所示，PB-009手性拆分为PB-015、PB-016。

如图4所示，PB-019手性拆分为PB-020、PB-021。

1.试验步骤

1)细胞来源：人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG(简称U87)购自中国科学院细胞库(上海)，货号TCHu138。

2)细胞培养和传代：上述细胞均贴壁培养于含完全培养基[含DMEM高糖基础培养液(#SH30243.01B，HyClone)加入终浓度为10％ FBS(#1101-500，上海普飞)和Penicillin-Streptomycin双抗(#SV30010，HyClone)]的6cm培养皿(#430166，Corning)或T75培养瓶(#3276，Corning)中，培养皿(瓶)置于37℃，5％ CO₂，饱和湿度的细胞培养箱(#3111，ThermoFisher Scientific)中培养。传代时，先吸走培养基，用PBS磷酸缓冲盐溶液(#GNM-10944，杭州吉诺)洗涤2次，然后加入适量0.25％胰酶-0.02％ EDTA(#25200-072，Gibco)，摇晃培养皿(瓶)使之均匀覆盖细胞，置于相差显微镜下观察。待大多数细胞回缩变圆，轻摇即脱落时，迅速加入两倍胰酶体积的完全培养基终止，并轻轻将细胞吹打成单细胞。将细胞悬液移到合适大小的离心管内，800rpm离心5min。弃上清，用新鲜的完全培养重悬细胞团块，重新吹打成单细胞，以1:3-1:6的比率传代接种至新的培养皿(瓶)并补足完全培养基。置于37℃，5％ CO₂的细胞培养箱中培养。

3)细胞加药处理：将上述每种细胞消化、计数，均按5000细胞/200μl培养液的密度接种至96孔细胞培养板(#3988，Corning)的每个孔中，置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养24h使细胞充分贴壁。然后分别将含梯度稀释后的各种待测化合物(每种化合物每个浓度设置3个重复孔)以及DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)溶剂对照的完全培养液替换掉原来的培养液，继续培养72h。

4)药效学测定和统计：先用倒置相差显微镜(X71，Olympus)对上述化合物处理后的细胞进行形态观察和拍照记录。然后分别将含CCK-8检测试剂(#E606335，上海生工)的无酚红培养液替换掉原来的培养液，培养箱中继续培养2h。然后在多功能酶标仪(168-1130，Bio-Rad)上测量OD450nm吸光值(OD值)。受试化合物处理细胞后，细胞存活率(cellsurvival rate)或细胞增殖率(cell growth rate)的计算公式为：存活率＝加药组OD值/对照组OD值×100％；化合物对细胞增殖的抑制率(growth inhibition rate)计算公式为：抑制率＝(对照组OD值-加药组OD值)/对照组OD值×100％。进一步根据抑制率数值在SPSS中计算出各化合物的IC50。每个数据点为三个重复样品的平均值。

2.试验结果

图5为PB-001及其手性分离化合物(PB-004、PB-005)按不同浓度处理细胞后的细胞形态。图6为PB-001及其手性分离化合物(PB-004、PB-005)的体外药效学检测结果。PB-001的IC50＝2.6μM，PB-004的IC50＝0.98μM，PB-005的IC50大于200μM，由以上三种化合物处理后的细胞形态、细胞存活率和IC50结果可以确定，PB-004为PB-001中发挥抗胶质瘤药效的对映体。

图7为PB-009及其手性分离化合物(PB-015、PB-016)按不同浓度处理细胞后的细胞形态。图8为PB-009及其手性分离化合物(PB-015、PB-016)的体外药效学检测结果。PB-009的IC50＝2.728μM，PB-016的IC50＝1.342μM，PB-015的IC50大于200μM，由以上三种化合物处理后的细胞形态、细胞存活率和IC50结果可以确定，PB-016为PB-009中发挥抗胶质瘤药效的对映体。

图9是PB-019及其手性分离化合物(PB-020和PB-021)按不同浓度处理细胞后的细胞形态。图10是PB-019及其手性分离化合物(PB-020、PB-021)的体外药效学检测结果。PB-019的IC50＝2.54μM，PB-020的IC50＝1.32μM，PB-021的IC50大于200μM，由以上三种化合物处理后的细胞形态、细胞存活率和IC50结果可以确定，PB-020为PB-019中发挥抗胶质瘤药效的对映体。

综上所述，PB-004(化合物6)、PB-016(化合物7)、PB-020(化合物11)为发挥抗胶质瘤药效的对映体，具有活性。PB-004在体外抑制U87细胞的IC95为2μM，PB-016在体外抑制U87细胞的IC95为3μM，PB-019在体外抑制U87细胞的IC95为4μM。

(2)动物实验

受试化合物：PB-018(化合物9)、PB-019(化合物10)

1.试验步骤

1)实验动物来源：SPF级雄性BALB/c品系裸鼠订购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，小鼠周龄为7周。

2)实验动物给药处理：将受试化合物溶解在DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)中，配制成50mg/ml母液。用PBS稀释受试化合物母液，受试化合物最终溶于10％(v/v)DMSO+90％(v/v)PBS，以50mg/kg剂量对小鼠进行灌胃。每种受试化合物设置3只小鼠(不含胶质瘤细胞)的重复实验。给药前禁食过夜。

3)检测样品制备：小鼠分别给药1,3,6,12或24小时后，按250μl/20g体重的剂量腹腔注射4％水合氯醛水溶液，麻醉小鼠，颈动脉取血300μl至肝素管，混匀后，4000rpm 5分钟离心，取上清200μl，加入600μl乙腈，混匀超声20分钟，12000rpm离心10分钟，上清4℃静置过夜，然后12000rpm离心10分钟，取上清作为“血浆检测样品”；取0.3-0.5g左右全脑，用预冷的PBS迅速漂洗3次，加1ml乙腈匀浆(PRIMA手持式匀浆机PB100，35000rpm，1分钟)，超声20分钟，12000rpm离心10分钟，上清4℃静置过夜，12000rpm离心10分钟，取上清作为“脑组织检测样品”。

4)HPLC检测：取上述“血浆检测样品”和“脑组织检测样品”，设置各受试化合物的标准品对照、HPLC流动相空白对照等，用高效液相色谱仪(Hitachi Chromaster-5430检测器，Hitachi Chromaster-5310柱温箱，Hitachi Chromaster-5210自动进样器，HitachiChromaster-5110泵)分析样品中受试化合物的含量。

2.试验结果

图11是PB-018和PB-019对雄性裸鼠进行灌胃后在脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。如图11所示，PB-019在脑组织内和血浆内的药物峰值浓度高于PB-018，提示PB-019在小鼠体内的药效也高于PB-018。PB-019在脑组织内的半衰期大于6小时，给药12小时后，在脑组织内的浓度仍大于1μM。与PB-018相比，PB-019在小鼠体内代谢更慢。

以下进一步的生物活性检测将主要对比PB-020和苦鬼臼毒素(PPP)对体外培养的肿瘤细胞的药效，及其在小鼠体内的血脑屏障通透性、代谢动力学、抗肿瘤药效和安全性等指标。

PB-004(化合物6)和PB-016(化合物7)为PB-020(化合物11)重要的结构类似物，部分试验中同时以化合物6和化合物7作为对照。其中，化合物6仅完成氟原子的取代，化合物7仅完成氟原子的取代和一处氘原子的取代，而化合物11完成了氟原子的取代和多处氘原子的取代。化合物11、化合物6和化合物7均为手性分子，其相应的手性对映体无生物学活性。

二、化合物体外药效学试验

受试化合物：苦鬼臼毒素(PPP)、PB-020、PB-004和PB-016。

1.试验步骤

1)细胞来源：人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG(简称U87)购自中国科学院细胞库(上海)，货号TCHu138；人胶质瘤细胞DBTRG-05MG(简称DBTRG)来自美国组织培养库ATCC，货号CRL-2020；人胶质瘤细胞KNS-81来自AcceGen Biotech，货号ABC-TC0535。

2)细胞培养和传代：与上述“化合物筛选试验”的细胞实验中细胞培养和传代方法相同。

3)细胞加药处理：与上述“化合物筛选试验”的细胞实验中细胞加药处理方法相同。

4)药效学测定和统计：与上述“化合物筛选试验”的细胞实验中药效学测定和统计方法相同。化合物对每种肿瘤细胞的IC50值数据为一次实验中三个复孔的平均值±标准差。

2.试验结果

表1不同受试化合物对多种胶质瘤细胞系的增殖抑制作用比较

根据表1的结果可知，苦鬼臼毒素(PPP)、PB-020、PB-004和PB-016即所有受试化合物对于体外贴壁培养的人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG、人胶质瘤细胞DBTRG-05MG、人胶质瘤细胞KNS-81均具有显著的抑制作用。

对以上化合物对三种人源胶质瘤细胞的IC50均值再取平均值进行比较，PPP为0.56μM、PB-004为1.60μM、PB-016为1.25μM、PB-020为1.13μM。与PB-004和PB-016相比，PB-020对三种人源胶质瘤细胞在整体上具有更好的抑制作用。PB-020与苦鬼臼毒素(PPP)对体外贴壁培养的人源胶质瘤细胞的抑制作用最为相近，其次是PB-016，最后是PB-004。

三、化合物作用机制验证

受试化合物：PB-020、PB-016

1.试验步骤：

2)肿瘤微球培养：U87细胞贴壁培养于含完全培养基[含DMEM高糖基础培养液(#SH30243.01B，HyClone)加入终浓度为10％ FBS(#1101-500，上海普飞)和Penicillin-Streptomycin双抗(#SV30010，HyClone)]的6cm培养皿(#430166，Corning)或T75培养瓶(#3276，Corning)中，培养皿(瓶)置于37℃，5％ CO₂，饱和湿度的细胞培养箱(#3111，ThermoFisher Scientific)中培养。将呈对数生长状态的U-87MG细胞用胰蛋白酶消化、收集，用无血清DMEM重悬。用细胞计数仪台盼蓝染色法计数(活细胞比例在90％以上)，将10⁵个细胞接种于6cm培养皿中，5ml无血清干细胞培养液(EGF 20ng/ml；bFGF 20ng/ml；LIF 10ng/ml；B27 1:50；PS 1:100)置于37℃，5％ CO₂，饱和湿度的细胞培养箱培养。每3天补加1ml新鲜的无血清干细胞培养液，一般培养3-5天可观察到典型的肿瘤微球的形成。

3)细胞加药处理：待上述U-87MG肿瘤微球形成后，分别将含梯度稀释后浓度分别为1μM、2μM的化合物11(PB-020)和化合物7(PB-016)以及DMSO溶剂对照的新鲜培养液替换掉原来的培养液，继续培养1-3天。

4)检测样品制备：收集上述化合物处理1-3天后的U-87MG肿瘤微球悬浮液，离心后吸去上清培养液，用冰浴预冷的PBS洗2次，吸干液体。加入200μl细胞裂解液(#P0013，碧云天)，剧烈震荡30s，冰上静置5min，重复3次。细胞裂解样品13000rpm，4℃离心6min，取上清与4×Laemmli上样缓冲液(#161-0747，Bio-Rad)3:1体积混合成为细胞裂解液蛋白样品，100℃金属浴变性6min，样品用于下列Western blot检测。

5)IGF-1R信号通路生物标志物检测：将4-15％预制梯度胶(456-8084，Bio-Rad)安装到电泳槽中，加入足量1×SDS-PAGE电泳缓冲液。使用20μl的移液枪加入20μl上述细胞裂解液蛋白样品。将电泳槽盖子盖上，并接通电源，先以80V电压电泳约30min，待样品中溴酚蓝在浓缩胶与分离胶分界线压成一条细线时将电压调至120V，根据目标蛋白以及内参蛋白条带的大小调整电泳持续时间。将预冷1×转膜缓冲液倒入合适大小的容器中，按照说明书组装好泡沫垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-泡沫垫的“三明治”结构，装入电泳槽中。加入冰块且整个电泳槽冰浴，连通电源进行转膜，250mA，2h。将PVDF膜(IPVH00010，Millipore)放入由1×TBST配制的5％脱脂奶粉中室温封闭1h。然后依次进行不同一抗(anti-pIGF1R-Y1135/Y1136，#3024S，CST；anti-pAKT-T308，#13038，CST；anti-pAKT-S473，#4060，CST；anti-pIRS1-S302，#2384，CST；anti-GAPDH[HRP]，#A00191-40，GenScript)和二抗(anti-MouseIgG HRP-linked antibody，#7076，CST；anti-Rabbit IgG HRP-linked antibody，#7074，CST)的孵育(分别室温孵育1h)与洗膜(1×TBST洗膜3次，每次5min)。最后，将PVDF膜放至塑料膜中间，加入ECL膜上反应3min，盖上另一层塑料膜，在全自动化学发光/荧光图像分析系统(5200-Multi，天能)中曝光。

2.试验结果

图12是PB-020和PB-016对U87细胞IGF-1R信号通路生物标志物的作用。用于验证受试化合物对U87肿瘤细胞具有抑制作用的作用机制。如图12所示，PB-020和PB-016对U87肿瘤微球中一系列IGF-1R信号通路生物标志物均有剂量依赖型的抑制作用。提示其药靶为IGF-1R，并且均通过抑制IGF-1R下游效应分子而高效抑制U87细胞增殖。同时，值得注意的是，PB-020还能显著降低其靶蛋白IGF-1R的蛋白量(total IGF-1R)，而PB-016的这一效果不明显，可能是由其促进IGF-1R内吞与降解而导致。

四、化合物透过血脑屏障试验(生物标志物检测)

受试化合物：苦鬼臼毒素(PPP)、PB-020和PB-016

1.试验步骤

1)实验动物来源：SPF级雄性BALB/c品系裸鼠订购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，小鼠周龄为6至8周。

2)实验动物给药处理：将受试化合物溶解在DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)中，配制成50mg/ml母液。用PBS稀释受试化合物母液，以100mg/kg剂量对小鼠进行灌胃，每种受试化合物设置3只小鼠(不含胶质瘤细胞)的实验重复。给药前禁食过夜。

3)检测样品制备：给药3小时后，颈椎脱臼法处死小鼠，取其右脑，加入800μl预冷的细胞裂解液(#P0013，碧云天，新鲜添加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂#78444，Thermo FisherScientific)，冰浴上充分匀浆，12000rpm离心10分钟后，取上清。用BCA法测定样品的蛋白浓度，加入相应量的4×Laemmli上样缓冲液(#161-0747，Bio-Rad)，以3:1体积混合成为脑组织裂解液蛋白样品，100℃金属浴变性8min，12000rpm离心2分钟，取上清进行下列Western blot检测。

4)IGF-1R信号通路生物标志物检测：与上述“化合物作用机制验证”中的IGF-1R信号通路生物标志物检测方法相同。

2.试验结果

图13是苦鬼臼毒素(PPP)、PB-016和PB-020对小鼠血脑屏障通透性的检测结果。如图13所示，小鼠口服(灌胃)PB-020和PB-016后，3小时内就下调了脑组织中的磷酸化IGF-1R/AKT等IGF-1R信号通路中关键的生物标志物，提示两者均能透过小鼠血脑屏障。而PPP未能有效下调IGF-1R信号通路中关键的生物标志物，提示其不能有效透过小鼠血脑屏障。

五、化合物药代动力学

(1)剂型选择

受试化合物：PB-004、PB-016

1.试验步骤

1)实验动物来源：SPF级雄性或雌性BALB/c品系裸鼠订购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，小鼠周龄为7周。

2)实验动物给药处理：将受试化合物溶解在DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)中，配制成50mg/ml母液。

DMSO组：用PBS稀释受试化合物母液，受试化合物最终溶于10％(v/v)DMSO+90％(v/v)PBS，以50mg/kg剂量对雌性小鼠进行灌胃。制剂配方：受试化合物溶于40μl DMSO+360μl PBS→400μl混合物。

玉米油组：用玉米油(corn oil)稀释受试化合物母液，受试化合物最终溶于20％(v/v)DMSO+80％(v/v)玉米油，以50mg/kg剂量对雄性小鼠进行灌胃。制剂配方：受试化合物溶于80μl DMSO+320μl玉米油→400μl混合物。

3)检测样品制备：与上述“化合物筛选试验”中的检测样品制备方法相同。

4)HPLC检测：与上述“化合物筛选试验”中的HPLC检测方法相同。

2.试验结果

图14是PB-016对裸鼠进行灌胃后在脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。如图14所示，玉米油组的PB-016在脑组织内和血浆内的半衰期远大于PB-016的DMSO组，特别值得注意的是，玉米油组的PB-016给药三小时后在脑组织内和血浆内均持续维持在较高浓度，提示玉米油作为药物制剂中的辅料可以有效延长PB-016在小鼠脑组织内和血浆内的半衰期。其中，特别是玉米油组的PB-016给药24小时后在脑组织内的浓度还大于3μM，而其在小鼠血浆中的浓度可保持在20μM以上。DMSO组的PB-016在脑组织内的半衰期在3小时左右，而玉米油组的PB-016在脑组织内的半衰期超过12小时。

图15是PB-004对裸鼠进行灌胃后在脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。图15中的A和图15中的B分别是PB-004的DMSO组在小鼠脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。图15中的C和图15中的D分别是PB-004的玉米油组在小鼠脑组织内和血浆内的化合物浓度的测试结果图。可见，玉米油组的PB-004在脑组织内和血浆内的半衰期远大于DMSO组的PB-004，特别值得注意的是，玉米油组的PB-004给药三小时后在脑组织内和血浆内均持续维持在较高浓度，提示玉米油作为药物制剂中的辅料可以有效延长PB-004在小鼠脑组织内和血浆内的半衰期。其中，特别是玉米油组的PB-004在脑组织内的浓度在给药12-24小时之间还出现了上升，给药24小时后在脑组织内的浓度还大于2μM，而其在小鼠血浆中的化合物浓度可保持在20μM以上。DMSO组的PB-004在脑组织内的半衰期不到3小时，而玉米油组的PB-004在脑组织内的半衰期超过12小时。

这一结果是出乎意料的，虽然实现显著延长小鼠脑组织内和血浆内的机制没有完全清楚而有待进一步研究(可能类似于缓释系统)，但可以提示采用玉米油作为药物制剂的辅料或辅料之一时，具有一定的独特性和优势，大大延长了化合物的半衰期，能显著延缓药物在小鼠体内的代谢，解决了化合物在体内快速代谢的问题。特别是可以有效延长由PB-016和PB-004这一类胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂制备得到的药物在脑组织内的半衰期，预期对原发肿瘤向脑部转移后形成的肿瘤能够产生非常有益的治疗和/或预防效果。

(2)药代动力学测定

受试化合物：苦鬼臼毒素(PPP)、PB-016和PB-020

1.试验步骤

2)实验动物给药处理：将受试化合物溶解在DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)中，配制成50mg/ml母液。用玉米油(corn oil)稀释受试化合物母液，受试化合物最终溶于10％(v/v)DMSO+90％(v/v)玉米油，以50mg/kg剂量对雄性小鼠进行灌胃。制剂配方：受试化合物溶于40μl DMSO+360μl玉米油→400μl混合物。

2.试验结果

图16为苦鬼臼毒素(PPP)、PB-016和PB-020对裸鼠进行灌胃后在血浆和脑组织内的化合物浓度的测试结果图。其中，图16中的A、图16中的B、图16中的C分别为三种化合物在小鼠血浆内化合物浓度随时间变化的折线图；图16中的D、图16中的E、图16中的F分别为三种化合物在小鼠脑组织内化合物浓度随时间变化的折线图。

如图16所示，PPP在血浆中的峰值浓度很低，原因可能是PPP在血浆中代谢很快；且PPP在脑组织中几乎不存在，出现这种情况一方面可能是PPP在小鼠体内代谢较快，能够透过血脑屏障前几乎已被代谢掉，另一方面也可能是PPP透过血脑屏障的能力较弱所导致的。与苦鬼臼毒素(PPP)相比，PB-020和PB-016在血浆和脑组织内的峰值浓度都高得多，在脑组织内，PPP的浓度几乎为零，PB-020和PB-016的浓度均远高于PPP。

PB-020在血浆和脑组织内的峰值浓度又都显著高于PB-016，在血浆和脑组织内，PB-016在给药后1小时达到峰值浓度，而PB-020在给药后3小时达到峰值浓度。药代动力学测定结果提示PB-020在血浆和脑组织内的代谢均比PB-016更慢，因而也更稳定。

综上，PB-020和PB-016的作用靶标(IGF-1R)相同，且对于体外贴壁培养的胶质瘤细胞，PB-020和PB-016具有相近的药效。而对于体外培养的胶质瘤细胞肿瘤微球(肿瘤微球富含肿瘤干细胞，比贴壁培养的细胞更能模拟三维结构的肿瘤组织)，PB-020除了和PB-016一样能抑制IGF-1R下游信号通路外，还能降低肿瘤微球细胞中的IGF-1R蛋白量，因此，尽管具体分子机制尚不明确，PB-020还兼具类似PROTAC(proteolysis-targeting chimeras)的作用。药代动力学结果提示PB-020在血浆和脑组织中的代谢都比PB-016更慢，因而也更稳定。PB-020在脑组织中能较长时间维持一定浓度对于治疗胶质瘤具有重要意义，在治疗胶质瘤时，PB-020比PB-016更有优势。

六、化合物短期安全性评价

受试化合物：PB-020

1.试验步骤

2)实验动物给药处理：将受试化合物溶解在DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)中，配制成50mg/ml母液。用PBS稀释受试化合物母液，受试化合物最终溶于10％(v/v)DMSO+90％(v/v)PBS，以50，100，200，400mg/kg四个剂量对小鼠进行灌胃。每天给药1次，分别于第2，4，6，8天称量体重，并观察形态和行为。DMSO作为对照组。

2.试验结果

图17为PB-020按不同剂量给药后小鼠的体重变化图，是采用PB-020对小鼠进行短期毒性试验的结果。如图17所示，灌胃给药后8天内，所有剂量组小鼠均未见体重减轻和明显的形态与行为异常，提示PB-020具有较好的安全性。下述小鼠体内药效学试验均采用50mg/kg较低剂量的PB-020进行。

七、化合物体内药效学试验

(1)对接种于裸鼠的人源乳腺癌细胞向脑部转移的抑制作用

受试化合物：PB-020

1.试验步骤

1)细胞来源：MDA-MB-231-Luc细胞，购自上海雅吉生物科技有限公司，货号为YS3852C。

2)实验动物来源：SPF级雌性BALB/c品系裸鼠订购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，小鼠周龄为5周。

3)建模及分组：MDA-MB-231-Luc细胞复苏，扩大培养。待细胞数量满足实验要求后，消化收集细胞，将细胞混入PBS中，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×10⁶/ml，用于实验。5周龄雌性BALB/c裸鼠24只，适应性饲养5-7天，开始实验。阿佛丁麻醉小鼠，左心室注射细胞。细胞接种量为100μl/只。接种后腹腔注射D-Luciferin，IVIS检测接种效果，选择20只用于实验。待小鼠苏醒后，返回IVC系统继续饲养。接种后第14天进行活体成像，根据成像效果，将小鼠随机分为2组，每组8只小鼠用于给药实验。

4)实验动物给药处理：

Vehicle组：以100μl 10％ DMSO+90％玉米油对第一组的小鼠进行灌胃，每天1次，连续给药30天。

PB-020组：PB-020溶解于10％ DMSO+90％玉米油，以50mg/kg剂量、总体积100μl对第二组的小鼠进行灌胃，每天1次，连续给药30天。

5)药效评价：小鼠开始给药后，第0,5,16,24,30天进行活体成像，测定小鼠脑部所接种MDA-MB-231-Luc细胞的荧光强度，以此来判断MDA-MB-231-Luc细胞向小鼠脑部的转移/增殖情况和PB-020对其转移/增殖的抑制程度；每天称量记录小鼠体重，一天内小鼠体重下降超过10％时暂停给药；每天观察记录小鼠的形态与行为特征。

2.试验结果

图18为PB-020对接种于裸鼠的MDA-MB-231-Luc乳腺癌细胞脑转移的抑制作用的测定结果。如图18所示，PB-020给药后，转移至小鼠脑部的MDA-MB-231-Luc细胞增殖相对缓慢，给药后24天才进入快速增殖期。在给药后24天到30天的快速增殖期内，PB-020较为显著地抑制了MDA-MB-231-Luc细胞增殖。由于采用的转移模型致死率很低，无法制作生存曲线。

(2)PB-020与替莫唑胺联用对原位接种于裸鼠脑部的人源胶质瘤细胞增殖的抑制作用

受试化合物以及药物：PB-020、替莫唑胺(TMZ)

1.试验步骤

1)细胞来源：U87-Luc细胞(Cat.#BW124577，Perkin Elmer)。

2)实验动物来源：SPF级雌性BALB/c品系裸鼠订购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，小鼠周龄为10周。

3)建模及分组：选取10周龄雌性BALB/c品系裸鼠40只，每只小鼠颅腔内注射5μl含3x 10⁵U87-Luc细胞的悬液，待小鼠恢复几天后，通过活体成像术检测所接种U87-Luc细胞的荧光强度来判断其增殖情况。根据U87-Luc细胞的荧光强度，将接种成功的小鼠随机分成4组，每组8只小鼠用于给药实验。

4)实验动物给药处理：

Vehicle组：以200μl 10％ DMSO+90％玉米油(#C8267-500ML，Sigma-Aldrich)对第一组小鼠进行灌胃，每天1次，连续给药14-19天，直至小鼠死亡。

PB-020组：PB-020溶解于10％ DMSO+90％玉米油，以50mg/kg剂量、总体积200μl对第二组小鼠进行灌胃，每天1次，连续给药17-21天，直至小鼠死亡。

TMZ组：TMZ(替莫唑胺)溶解于PBS，以20mg/kg剂量、总体积200μl对第三组小鼠进行腹腔注射，每天1次，连续给药5天。

PB-020+TMZ组：按上述单药的给药方式和剂量分别对第四组小鼠进行给药，在给药的最初5天，于PB-020灌胃结束后立即进行TMZ腹腔注射。

5)药效评价：小鼠开始给药后，每3天用活体成像术测定所接种U87-Luc细胞的荧光强度，以此来判断U87-Luc细胞在小鼠脑部的增殖情况和待测药物对其增殖的抑制程度；每天称量记录小鼠体重，一天内小鼠体重下降超过10％时暂停给药；每天观察记录小鼠的形态与行为特征；记录小鼠死亡时间，作出生存曲线。

2.试验结果

图19为PB-020单药、替莫唑胺(TMZ)单药以及两者联用对原位接种于裸鼠脑部的U87-Luc胶质瘤细胞增殖的抑制作用和对小鼠生存期影响的测定结果图。如图19所示，给药1周内，PB-020和TMZ均有效抑制了U87细胞在小鼠脑部的快速增殖。超过1周后，PB-020的药效显著下降，而TMZ持续有效，并能小幅缩减移植瘤的体积。给药10天内，PB-020和TMZ联用比单药的效果更明显。

给药15天之后，对照组的小鼠生存率开始下降，PB-020和TMZ均能够有效延长移植瘤小鼠的生存期，而在给药20天后，PB-020与TMZ的联用还能够保持100％的生存率。在该实验模型中，由于TMZ单药已有出色药效，PB-020与之联用的药效很难有效展现。

(3)PB-020与PD-1抗体联用对免疫正常小鼠中肺癌细胞增殖的抑制作用受试化合物以及药物：PB-020、PD-1抗体

1.试验步骤

1)细胞来源：LLC肺癌细胞，购自中国科学院细胞库(上海)，货号TCM 7。

2)实验动物来源：5周龄C57BL/6雌性免疫正常小鼠，购自国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心。

3)建模及分组：32只5周龄C57BL/6雌性免疫正常小鼠，适应性饲养1周，用于实验。小鼠LLC肺癌细胞常规培养，满足实验要求后，制成密度为1x10⁷/ml的单细胞悬液，待用。将LLC细胞接种于C57BL/6小鼠右侧腋下，返回继续饲养。待肿瘤长至50-150mm³时，将小鼠随机分为4组，每组8只小鼠用于给药实验。

4)实验动物给药处理：

Vehicle组：以200μl 10％ DMSO+90％玉米油(#C8267-500ML，Sigma-Aldrich)对第一组小鼠进行灌胃，每天1次，连续给药直至小鼠死亡。

PB-020组：PB-020溶解于10％ DMSO+90％玉米油，以50mg/kg剂量、总体积200μl对第二组小鼠进行灌胃，每天1次，连续给药直至小鼠死亡。

PD1组：将200μg anti-mouse PD-1(RMP1-14，Bio X Cell)溶解于100μl PBS，对第三组小鼠进行腹腔注射，每3天给药1次。

PB-020+PD1组：按上述单药的给药方式和剂量分别对第四组小鼠进行给药。

5)药效评价：小鼠开始给药后，跟踪测量肿瘤体积大小，每周2次；每天称量记录小鼠体重，一天内小鼠体重下降超过10％时暂停给药；每天观察记录小鼠的形态与行为特征；记录小鼠死亡时间，肿瘤体积超过2000mm³时，根据动物伦理要求，认定小鼠死亡，至Vehicle组小鼠全部死亡，绘制小鼠生存曲线。

2.试验结果

图20为PB-020单药及其与PD-1抗体联用对免疫正常小鼠中LLC肺癌细胞增殖的抑制作用和对小鼠生存期影响的测定结果图。如图20所示，PB-020单药能有效抑制鼠源LLC肺癌细胞在免疫正常小鼠体内的增殖，其效果优于PD-1抗体单药；PB-020与PD-1抗体联用具有一定的协同作用，能高效抑制LLC细胞增殖。

给药19天之后，对照组的小鼠生存率开始下降，PB-020和PD-1抗体均能够有效延长移植瘤小鼠的生存期，而在给药25天后，PB-020与PD-1抗体的联用才开始出现生存率的少量下降，PB-020与PD-1抗体的联用能够显著延长小鼠的生存期。

目前虽有PPP用于肺癌、乳腺癌等治疗的二期、三期临床试验，但结果都不理想，很可能与PPP代谢稳定性差有关。我们通过解决PPP的代谢稳定性和血脑屏障通透性两大问题，能够拓展其临床应用。本发明提供的胰岛素样生长因子-1受体的新型小分子抑制剂不仅可用于治疗脑胶质瘤，也可治疗肺癌、乳腺癌等的脑转移(这些癌的脑转移比例很高，因此市场很大)及其原位癌。

综上所述，本发明设计合成了靶向胰岛素样生长因子-1受体的新型小分子抑制剂PB-020及其系列类似物。相对于目前处于临床试验阶段的苦鬼臼毒素，PB-020在维持其作用机理和生化特性的同时，具有更高的血脑屏障通透性和更长的体内半衰期。PB-020在单独使用时，能有效抑制多种裸鼠移植瘤(尤其是胶质瘤)的增殖和脑转移；PB-020与替莫唑胺联用能高效抑制原位移植胶质瘤细胞的增殖，显著延长小鼠的生存期；PB-020和PD-1抗体联用具有一定的协同作用，能高效抑制LLC细胞在免疫正常小鼠体内的增殖，显著延长小鼠的生存期。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护的范围内。

Claims

1.一种胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂，其特征在于，所述小分子抑制剂为如下所示化合物或其药学上可接受的盐：。

2.权利要求1所述的胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，所述癌症为IGF-1R依赖性疾病。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述癌症包括恶性黑色素瘤、原发性神经外胚层瘤、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病、消化道肿瘤、妇科癌症中的一种或几种。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述癌症为原发肿瘤向脑部转移后形成的肿瘤。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂或由其制备得到的药物与其他抗癌药物联用。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述其他抗癌药物选自化疗药物、靶向药物、免疫治疗药物中的一种或几种。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述化疗药物为替莫唑胺；所述免疫治疗药物为PD-1抗体。

8.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型为液体制剂，所述液体制剂的溶剂为DMSO+玉米油，将所述胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂溶于所述溶剂中。