CN116143797A - 苦鬼臼毒素衍生物、其药物组合物及用途 - Google Patents

苦鬼臼毒素衍生物、其药物组合物及用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种苦鬼臼毒素衍生物，是一种新型的胰岛素样生长因子‑1受体的小分子抑制剂。本发明提供的苦鬼臼毒素衍生物为式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，可以用于制备治疗和/或预防癌症的药物。本发明提供的苦鬼臼毒素衍生物能够在保证药效的同时，具有良好的血脑屏障透过率，在治疗IGF‑1R依赖性疾病尤其是胶质瘤和易发生脑转移的癌症中效果较好。

Description

苦鬼臼毒素衍生物、其药物组合物及用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种苦鬼臼毒素衍生物、其药物组合物及用途。
背景技术
原发性神经系统恶性肿瘤的发生呈逐年递增趋势。胶质瘤是指起源于神经胶质细胞的脑肿瘤，其包括星形细胞肿瘤、少突胶质细胞肿瘤和室管膜肿瘤(Muir CS,Storm etal.,Cancer Surv,19-20:369-392,1994；Louis DN et al.,Acta Neuropathol,131:803-820,2016)，是最常见的原发性肿瘤类型。以替莫唑胺为代表的化学药物疗法是当前治疗高级别胶质瘤的金标准，但仅能很有限地延长患者生存期。胶质瘤的化疗药物治疗仍存在很多的弊端，全身用药很难在中枢系统达到高浓度并到达肿瘤所在部位，并且可能引起全身性的药物副作用。
随着基因组时代的到来，人们对肿瘤生物学和肿瘤发生过程中的基因突变的认识不断加深，针对肿瘤分子靶向治疗的研究越来越多。靶向治疗是作用于与肿瘤相关的特异性分子靶标，通过特异性地干预这些靶点而阻止肿瘤生长和扩散，能够选择性地杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞。相比于传统的化疗药物，靶向治疗中采用的靶向药物可实现更好的疗效。但是，迄今尚未有疗效更好的靶向药物在胶质瘤的治疗应用中获得成功，其原因在于绝大部分靶向药物无法透过血脑屏障。研制将药物直接投放到中枢神经系统的方法具有挑战性，需要突破血脑屏障在靶区域达到药物高浓度而在全身低浓度，减轻药物的全身性副反应。
1956年有人在血清中发现一种能促进成骨的物质，被称为胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGFs)，能促进细胞增殖、分化、抑制调亡。胰岛素样生长因子受体包括胰岛素样生长因子-1受体(insulin-like growth factor-1receptor，IGF-1R)等。Hua H et al.(2020)Insulin-like growth factor receptor signaling intumorigenesis and drug resistance:a challenge for cancer therapy.J HematolOncol，13(1):64.和Cao J,Yee D.(2021)Disrupting insulin and IGF receptorfunction in cancer.Int J Mol Sci.PMID:33429867以及Haisa M.(2013)The type1insulin-like growth factor receptor signalling system and targeted tyrosinekinase inhibition in cancer.J Int Med Res.PMID:23569026等文献中均报道了IGF-1R在各种不同类型肿瘤发生发展中发挥着重要作用。因此，IGF-1R抑制剂具有成为多种类型肿瘤的靶向治疗药物的前景。
苦鬼臼毒素(Picropodophyllin,PPP)是一种环木酯素类化合物，其结构如下：
Figure BDA0003945056470000021
苦鬼臼毒素被认为是一种特异性IGF-1R酪氨酸激酶抑制剂，可以被用来治疗多种IGF-1R导致的疾病，具体包括多种类型的癌症、动脉硬化、牛皮癣、冠状血管成形术后再狭窄(专利文献：WO02/102804)、2型糖尿病、肾病、视网膜病、青光眼、甲状腺眼病(专利文献：WO 2007/097707)、风湿性关节炎、溃疡、多发性硬化、阿尔茨海默症、哮喘、湿疹、移植后排斥(专利文献：WO 2009/157858)。
其中，在治疗癌症方面，多种类型的肿瘤细胞中IGF-1R表达量显著升高，苦鬼臼毒素通过阻断IGF-1R介导的细胞内信号传导通路达到抑制肿瘤细胞生长并促进其凋亡的目的(Girnita A,et al.,Cancer Res，64:236-242,2004)，可以实现靶向抑制肿瘤细胞增殖，而对正常细胞毒副作用较小。Yin S,et al.,Neuro-Oncology,12:19-27,2010.报道了苦鬼臼毒素可通过抑制IGF-1R来抑制接种至大鼠脑部的人源胶质瘤细胞的增殖，提示它可能具有透过血脑屏障的特性。尽管苦鬼臼毒素具有特异性高、毒副作用小的优点，但仍存在脂溶性差，不易透过血脑屏障等问题，其在人体临床试验中效果并不佳。
我们的研究表明苦鬼臼毒素在小鼠体内代谢很快，并且不易透过血脑屏障，这也许是苦鬼臼毒素在人体临床试验中效果不佳的重要原因。因此，需要寻找一种能够在保证药效的同时，在体内具有良好的半衰期和血脑屏障透过率的化合物，用于治疗IGF-1R依赖性疾病尤其是胶质瘤和易发生脑转移的癌症。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的全部或部分不足，本发明提供一种苦鬼臼毒素衍生物、其药物组合物及用途，提供的苦鬼臼毒素衍生物能够在保证药效的同时，在体内具有良好的半衰期和血脑屏障透过率，在治疗IGF-1R依赖性疾病尤其是胶质瘤和易发生脑转移的癌症中效果较好。
为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种苦鬼臼毒素衍生物，所述苦鬼臼毒素衍生物如式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003945056470000031
式(I)中：
X1、X2各自独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基中的任一种；
A1、A2、A3各自独立地选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5卤代烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5卤代烷氧基、磷酸酯基、RaCOO-酯基中的任一种；其中，Ra选自氢、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
R为取代吡唑环类衍生物基团，R的结构如式(II)所示：
Figure BDA0003945056470000032
式(II)中：
L选自C或N；
X选自O、S、N(Rh)，其中，Rh选自氢、C1-C5烷基、C1-C5卤代烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5卤代烷氧基中的任一种；
B为连接基团，选自碳氧双键、碳硫双键、亚磺酰基或磺酰基中的任一种；
R3选自氢、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、无取代或取代的五元芳基、无取代或取代的六元芳基中的任一种；
R4选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基中的任一种；
R5、R6各自独立地选自氢、卤素、硝基、氨基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基中的任一种；
式(II)中，与式(I)所示化合物上氧原子连接的位置选自R3、R4、R5、R6或B中任意可连接的C或S。
在一个技术方案中，式(I)所示化合物中，X1为氢，X2为氢，A1、A2、A3均为甲氧基，包括以下化合物：
Figure BDA0003945056470000041
在另一个技术方案中，式(I)所示化合物中，X1为氢，X2为氢，A1和A3均为甲氧基，A2为羟基，包括以下化合物：
Figure BDA0003945056470000051
在另一个技术方案中，式(I)所示化合物中，X1为氟原子，X2为氟原子，A1、A2、A3均为甲氧基。
在另一个技术方案中，式(I)所示化合物中，X1为氟原子，X2为氟原子，A1和A3均为甲氧基，A2为羟基。
式(I)所示化合物中至少一个氢原子被氘原子取代。进一步地，式(I)所示化合物中，A1、A2、A3中至少一个氢原子被氘原子取代。
本发明涉及的术语说明如下：
本发明所用术语“芳基”是指5到12个碳原子的全碳单环或稠合多环基团，具有完全共轭的π电子系统。芳环的非限制性实例有：苯环、萘环和蒽环。芳环可以是无取代或取代的。芳环的取代基选自卤素、硝基、氨基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6卤代烷基、C1-C6卤代烷氧基、C3-C6环烷基、C3-C6卤代环烷基。
本发明所用术语“烷氧基”是指-O-烷基基团，其中烷基如上所定义。本发明所用“烷氧基”的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基和叔丁氧基。烷氧基可以是无取代或取代的。烷氧基可任选被卤素取代一次或多次，如三氟甲氧基。
本发明所用术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。
本发明还提供一种药物组合物，包括以上所有方案中的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、辅料或其他活性药物。所述药物组合物中可以是式(I)所示化合物与药物载体的组合物，还可以是式(I)所示化合物与药物辅料的组合物，还可以是式(I)所示化合物与其他活性药物的组合物，当然也可以是以上多种材料的共混物。药物组合物中的活性组分除了是式(I)所示化合物之外，还可以是其光学异构体或药学上可接受的盐等。所述药学上可接受的盐可以是酸加成盐、碱加成盐、碱金属盐、碱土金属盐、烷基化盐等。
本发明还提供一种苦鬼臼毒素衍生物的用途，具体的包括，以上所有方案中所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，或者以上所有方案中所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。所述癌症为IGF-1R依赖性疾病，所述IGF-1R是指胰岛素样生长因子-1受体。所述化合物或药物组合物等通过抑制IGF-1R来实现对癌症肿瘤细胞增殖的抑制作用，从而达到抗癌疗效。
所述癌症包括恶性黑色素瘤、原发性神经外胚层瘤、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病、消化道肿瘤、妇科癌症。所述神经胶质瘤为恶性胶质瘤或星形胶质细胞瘤；消化道肿瘤为胃癌、结直肠癌、肝癌或胰腺癌；所述妇科癌症为卵巢癌或宫颈癌。所述骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病为白血病、淋巴瘤。
式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐还可以选择与其他抗癌药物联用，例如其他细胞增殖抑制剂(特别是在不完全依赖IGF-1R的肿瘤治疗药物中)，以达到协同增效等作用。所采用的剂型可以是“DMSO+玉米油”作为溶剂而制备得到的制剂。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：本发明提供了一种新颖的取代苦鬼臼毒素衍生物，是一种新型的胰岛素样生长因子-1受体的小分子抑制剂。本发明提供的苦鬼臼毒素衍生物可以用于制备治疗和/或预防癌症的药物，具体癌症的类型包括恶性黑色素瘤、原发性神经外胚层瘤、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病、消化道肿瘤、妇科癌症等。而且，本发明提供的苦鬼臼毒素衍生物能够在保证药效的同时，在体内具有良好的半衰期和血脑屏障透过率，能够有效治疗IGF-1R依赖性疾病尤其是胶质瘤和易发生脑转移的癌症。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的化合物1的合成流程图。
图2为本发明实施例2提供的化合物2的合成流程图。
图3为本发明实施例3提供的化合物3的合成流程图。
图4为本发明实施例7提供的化合物7的合成流程图。
图5为本发明实施例8提供的化合物8的合成流程图。
图6为本发明实施例9提供的化合物9的合成流程图。
图7为本发明实施例10提供的化合物10的合成流程图。
图8为本发明实施例11提供的化合物11的合成流程图。
图9为本发明实施例12提供的化合物12的合成流程图。
图10为本发明实施例13提供的化合物13的合成流程图。
图11为本发明实施例14提供的化合物14的合成流程图。
图12为本发明实施例15提供的化合物15的合成流程图。
图13是化合物1(PPP-A5)与对照化合物的第一组体外药效学检测结果。
图14是化合物1(PPP-A5)与对照化合物的第二组体外药效学检测结果。
图15是化合物1(PPP-A5)与对照化合物对U87细胞IGF-1R信号通路生物标志物的作用。
图16为化合物1(PPP-A5)与对照化合物对小鼠血脑屏障通透性的检测结果。
图17为化合物1(PPP-A5)与对照化合物抑制U87细胞增殖的形态学证据。
图18为式(I)所示化合物的结构式。
具体实施方式
下面将对本发明具体实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下介绍本发明所提供的部分苦鬼臼毒素衍生物及其制备、合成过程。
实施例1、4-O-[4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物1)
Figure BDA0003945056470000081
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如图1所示，化合物1的合成过程包括：
步骤1)、4,5-二溴呋喃-2-羧酸甲酯(中间体1-2)的合成：
将呋喃-2-甲酸甲酯(中间体1-1)(6.4g，50mmol)和氯仿(50ml)加入三口烧瓶，氮气保护，-10℃下搅拌，分批加入三氯化铝(14.6g，110mmol)，缓慢滴加溴素(16.0g，100mmol)，滴加完毕后室温反应2h。加入碎冰淬灭反应，加入二氯甲烷(100ml)萃取，水(50ml×3)洗涤，10％NaS2O3(50ml×2)洗涤，饱和NaHCO3(50ml×2)和食盐水(60ml×2)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂，正己烷结晶得到淡黄色固体11.1g，为4,5-二溴呋喃-2-羧酸甲酯(中间体1-2)收率78％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.19(s,1H),3.91(s,3H)。
步骤2)、4-溴呋喃-2-羧酸甲酯(中间体1-3)的合成：
将4,5-二溴呋喃-2-羧酸甲酯(中间体1-2)(14.2g，50mmol)和四氢呋喃(100ml)加入三口烧瓶，氮气保护，-40℃下搅拌，滴加2N异丙基氯化镁的四氢呋喃溶液(38ml)，室温反应1h，加入水(50ml)淬灭，过滤后加入乙酸乙酯分液，有机相用饱和食盐水洗涤两次，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝10:1～2:1)纯化得到8.1g黄色粉末(中间体1-3)，收率79％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.58(s,1H),7.19(s,1H),3.91(s,3H)。
步骤3)、4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酸甲酯(中间体1-4)的合成：
将4-溴-呋喃-2-甲酸甲酯(中间体1-3)(6.15g，30mmol)、四(三苯基磷)钯(3.45g，3mmol)、1-甲基-1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯(7.5g，36mmol)和K3PO4﹒3H2O(12.0g，45mmol)依次加入反应瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(100mL)，氮气保护，90℃下反应12h。反应完毕冷却至室温，将反应液倒入水(300mL)中，乙酸乙酯(100mL)萃取反应液3次，合并有机相饱和氯化钠水溶液(200mL)洗1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝4:1～1:1)，回收溶剂后得黄色固体(5.0g,24mmol)，收率67％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.43(d,J＝2.0Hz,1H),7.20(d,J＝3.6Hz,1H),6.60(d,J＝3.6Hz,1H),6.56(d,J＝2.0Hz,1H),4.07(s,3H),3.86(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ158.75,148.21,143.93,138.49,132.59,119.26,109.60,106.41,51.90,38.84.
步骤4)、4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酸(中间体1-5)的合成：
将4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酸甲酯(中间体1-4)(1.8g,8.8mmol)溶于30mL MeOH和H2O的混合溶液(v/v,4:1)中，缓慢加入3N NaOH水溶液(10mL，30mmol)，室温反应约5h。TLC显示原料反应彻底，减压回收溶剂，向残余物中加入H2O(30mL)溶解，并用1N盐酸水溶液调pH至2～3，EtOAc(30mL×3)萃取，合并有机层，饱和NaCl溶液(50mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂，真空干燥，得白色固体(1.5g，8.1mmol)，收率60％。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.59(s,1H),7.33(d,J＝3.6Hz,1H),7.05(d,J＝3.6Hz,1H),4.05(s,3H,CH3).13CNMR(125MHz,CDCl3)δ159.03,145.15,144.30,137.11,137.04,128.91,118.88,112.63,108.52.
步骤5)、4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酸(中间体1-6)的合成：
将4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酸(中间体1-5)(2.06g,10mmol)溶于30mL四氢呋喃中，加入N-氯代琥珀酰亚胺(1.46g,11mmol)，升温至80℃，反应2h。TLC显示原料反应彻底，将反应液倒入H2O(50mL)中，用EtOAc(30mL×3)萃取，合并有机层，饱和NaCl溶液(50mL×2)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂，残余物经柱层析纯化得白色固体，收率85％。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.59(s,1H),7.33(d,J＝3.6Hz,1H),7.05(d,J＝3.6Hz,1H),4.05(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ159.03,145.15,144.30,137.11,137.04,128.91,118.88,112.63,108.52.
步骤6)、4-O-[4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物1)的合成：
将4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酸(中间体1-6)(3.44g,15.2mmol)，苦鬼臼毒素(6.00g,14.5mmol)，4-二甲氨基吡啶(1.06g,8.7mmol)，二氯甲烷(120mL)加入到反应瓶中，在室温下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(5.56g,29.0mmol)，反应混合物室温搅拌反应过夜。反应液依次用0.5M盐酸水溶液(50mL)，水(50mL)，饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，饱和食盐水洗涤(50mL)，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂，残余物经甲苯精制得到白色固体，收率48.74％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.47(s,1H),6.97(d,J＝3.7Hz,1H),6.91(d,J＝3.3Hz,1H),6.90(s,1H),6.60(s,1H),6.39(s,2H),5.99(d,J＝1.2Hz,1H),5.98–5.96(m,2H),4.50(dd,J＝9.6,7.3Hz,1H),4.46(d,J＝3.3Hz,1H),4.31(dd,J＝9.6,3.4Hz,1H),4.10(s,3H),3.82(s,3H),3.73(s,6H),3.40(dd,J＝9.4,3.4Hz,1H),3.22–3.14(m,1H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ177.38,157.75,153.32,148.71,147.37,146.49,143.23,139.06,137.47,137.03,131.30,129.04,128.90,128.23,125.76,125.30,119.86,111.92,110.26,110.10,108.79,105.51,101.54,73.00,70.51,60.83,56.19,45.24,44.29,40.43,39.73.
实施例2、4-O-[4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物2)
Figure BDA0003945056470000101
如图2所示，化合物2的合成过程包括：
步骤1)、4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(中间体2-2)的合成：
将4-溴-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(中间体2-1)(2.2g，10mmol)、四(三苯基磷)钯(1.1g，1mmol)、1-甲基-1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯(2.5g，12mmol)和K3PO4﹒3H2O(4.0g，15mmol)依次加入反应瓶中，加入N,N-二甲基甲酰胺(30mL)，氮气保护，90℃下反应12h。反应完毕冷却至室温，反应液倒入水中(50mL)，乙酸乙酯(50mL)萃取反应液3次，合并有机相饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝4:1～1:1)，纯化后得浅黄色固体，为4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(中间体2-2)，收率75％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.44(d,J＝1.9Hz,1H,),7.04(d,J＝2.0Hz,1H),6.95(d,J＝1.9Hz,1H),6.23(d,J＝1.9Hz,1H),3.97(s,3H),3.93(s,3H),3.84(s,3H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ161.37,138.33,137.35,127.73,123.09,116.57,112.97,104.64,51.25,37.57,36.96.
步骤2)、4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-3)的合成：
将4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(中间体2-2)(8.8mmol)溶于30mL MeOH和H2O的混合溶液(v/v,4:1)中，缓慢加入3N NaOH水溶液(10mL，30mmol)，室温反应约5h。TLC显示原料反应彻底，减压回收溶剂，向残余物中加入水(30mL)溶解，并用1N盐酸水溶液调pH至2～3，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，饱和氯化钠水溶液(50mL×3)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂，真空干燥，得黄色固体，收率68％，m.p.＝207-208℃。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.44(d,J＝2.0Hz,1H),7.35(d,J＝1.9Hz,1H),7.05(d,J＝2.1Hz,1H),6.33(d,J＝1.9Hz,1H),3.89(s,6H).13C NMR(125MHz,CDCl3)δ161.82,137.62,137.09,128.11,123.38,115.84,111.97,103.99,37.68,36.55.
步骤3)、4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-4)的合成：
将4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-3)(10mmol)溶于30mL四氢呋喃中，加入N-氯代琥珀酰亚胺(1.46g,11mmol)，升温至80℃，反应2h。TLC显示原料反应彻底，将反应液倒入H2O(50mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有机层，饱和氯化钠水溶液(50mL×2)洗涤，无水Na2SO4干燥，减压回收溶剂，残余物经柱层析纯化得白色固体，收率85％。1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.55(s,1H),7.50(d,J＝2.0Hz,1H),7.11(d,J＝2.0Hz,1H),3.93(s,3H),3.85(s,3H).13C NMR(125MHz,DMSO)δ161.70,136.21,133.70,129.31,123.54,116.45,108.49,106.16,38.64,36.68.
步骤4)、4-O-[4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物2)的合成：
将4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-4)(34.0mg,0.144mmol)，苦鬼臼毒素(40mg,0.097mmol)，4-二甲氨基吡啶(6mg,0.049mmol)，二氯甲烷(120mL)加入到反应瓶中，在室温下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(37.19mg,0.194mmol)，反应混合物室温搅拌反应过夜。反应液依次用0.5M盐酸水溶液(50mL)，水(50mL)，饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，饱和食盐水洗涤(50mL)，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂，残余物经硅胶柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝4:1-1:1)得到白色固体，收率50.5％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.46(s,1H),7.14(d,J＝1.9Hz,1H),6.99(d,J＝2.0Hz,1H),6.87(s,1H),6.51(s,1H),6.45(s,2H),5.99–5.97(m,1H),5.97–5.95(m,1H),4.47(d,J＝6.3Hz,1H),4.45(d,J＝2.9Hz,1H),4.36(d,J＝4.1Hz,1H),4.01(s,3H),3.87(s,3H),3.78(s,3H),3.77(s,5H),3.32(dd,J＝9.2,4.2Hz,1H),3.16–3.09(m,1H)。
实施例3、4’-O-去甲基-4-O-乙酰基苦鬼臼毒素(化合物3)
Figure BDA0003945056470000121
如图3所示，化合物3的合成过程包括：
步骤1)、4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)的合成：
将4’-O-去甲基鬼臼毒素(中间体3-1)(200mg,0.5mmol)溶于甲醇(10mL)中，35-40℃温度下搅拌至反应液澄清，加入20％氨水(2.5mL)，保温反应，TLC检测反应至原料消失，减压回收溶剂，甲醇精制，得到白色固体，收率48％。1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.31(s,1H),6.97(s,1H),6.73(s,1H),6.41(s,2H),5.99(s,1H),5.98(s,1H),5.61(s,1H),4.50(d,J＝8.5Hz,1H),4.26(m,2H),4.11(d,J＝8.0Hz,1H),3.72(dd,J＝9.2,8.2Hz,1H),3.68(s,6H),3.23–3.16(m,1H).
步骤2)、4’-O-去甲基-4-O-乙酰基苦鬼臼毒素(化合物3)的合成：
将4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)(10mg,0.025mmol)，冰乙酸(3mg,0.037mmol)，4-二甲氨基吡啶(1.5mg,0.012mmol)，二氯甲烷(3mL)加入到反应瓶中，在室温下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(20mg,0.10mmol)，反应混合物室温搅拌反应过夜。反应液依次用0.5M盐酸水溶液(5mL)，水(5mL)，饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)，饱和食盐水(5mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂，残余物经中性氧化铝柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝3:1-1:1)得到白色固体，收率40.5％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ7.03(s,1H),6.64(s,1H),6.37(s,2H),5.99(d,J＝1.2Hz,1H),5.96(d,J＝1.3Hz,1H),5.30(s,2H),4.82(d,J＝5.3Hz,1H),4.48(d,J＝2.8Hz,1H),4.37–4.32(m,1H),4.29(dd,J＝9.8,4.0Hz,1H),3.73(s,6H),3.44(dd,J＝10.6,3.0Hz,1H),3.17(ddd,J＝14.1,9.8,4.6Hz,1H),2.32(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ177.72,167.85,151.25,146.51,146.35,139.38,130.26,128.37,126.51,108.89,105.19,103.35,100.21,67.02,66.45,55.23,44.45,43.60,38.33,19.46.
实施例4、4-O-乙酰基苦鬼臼毒素(化合物4)
Figure BDA0003945056470000131
以苦鬼臼毒素和乙酸为原料，将实施例3中4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)改为苦鬼臼毒素，摩尔量不变；其余等同于实施例3。得化合物4，收率70.1％，m.p.＝211-214℃。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ6.78(s,1H),6.58(s,1H),6.42(s,2H),6.00(d,J＝1.3Hz,1H),5.98(d,J＝1.4Hz,1H),5.75(d,J＝4.8Hz,1H),4.45(dd,J＝9.7,6.9Hz,1H),4.42(d,J＝3.5Hz,1H),4.32(dd,J＝9.7,2.9Hz,1H),3.85(s,3H),3.83(s,6H),3.30(dd,J＝9.2,3.5Hz,1H),3.04-2.96(m,1H),2.02(s,3H)。13CNMR(126MHz,CDCl3)δ176.23,169.49,152.24,147.43,146.24,137.87,135.88,130.21,125.17,108.81,107.35,104.50,100.42,71.46,69.83,59.82,55.17,44.52,43.24,38.69,19.97。HR-MS(ESI):m/zcalculated forC24H24O9[M+H]+:457.1498,found:457.1527。
实施例5、4’-O-去甲基-4-O-[4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物5)
Figure BDA0003945056470000132
以4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)和4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酸(中间体1-6)为原料，将实施例1中苦鬼臼毒素改为4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)，摩尔量不变；其余等同于实施例1。得化合物5，收率43.2％，ESI-MS[M+H]+＝609。
实施例6、4’-O-去甲基-4-O-[4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物6)
Figure BDA0003945056470000141
以4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)和4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-4)为原料，将实施例13中苦鬼臼毒素改为4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)，摩尔量不变；其余等同于实施例2。得化合物6，收率46.2％，ESI-MS[M+H]+＝622。
实施例7、4-O-[3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物7)
Figure BDA0003945056470000142
如图4所示，化合物7的合成过程包括：
步骤1)、3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-羧酸甲酯(中间体7-1)的合成：
将4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-羧酸甲酯(中间体1-4)(3.01g，14.6mmol)溶于40mlTHF和DMF混合溶液(v/v,2:3)中，加入N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)(5.3g,40mmol)，加热至80℃，反应6h。TLC监测原料转化彻底，将反应液导入H2O(100ml)中，用乙酸乙酯(50ml×3)萃取，合并有机层，饱和食盐水(70ml×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂，残余物经硅胶柱层析纯化(石油醚:乙酸乙酯＝10:1～5:1)，得到3.1g白色固体(中间体7-1)，收率68％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.28(s,1H),3.97(s,3H),3.89(s,3H)。
步骤2)、3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-羧酸(中间体7-2)的合成：
将3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-羧酸甲酯(中间体7-1)(2.1g，6.8mmol)溶于乙醇(10ml)中，室温下缓慢加入6N氢氧化钠水溶液11.3ml，室温反应约2h(TLC薄层层析监测反应是否完全)。反应完毕后，减压回收溶剂。向剩余反应混合物中加入10ml水，并用1N盐酸中和反应液中的氢氧化钠至pH约为3，乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相饱和氯化钠洗1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂直接得到浅黄色固体2.0g(中间体7-2)，收率89％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.25(s,1H),3.96(s,3H)。
步骤3)、4-O-[3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物7)的合成：
将3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-羧酸(中间体7-2)(4.49g,15.2mmol)，苦鬼臼毒素(6.00g,14.5mmol)，4-二甲氨基吡啶(1.06g,8.7mmol)，二氯甲烷(120mL)加入到反应瓶中，在室温下加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(5.56g,29.0mmol)，反应混合物室温搅拌反应过夜。反应液依次用0.5M盐酸水溶液(50mL)，水(50mL)，饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)，饱和食盐水洗涤(50mL)，无水硫酸钠干燥，减压回收溶剂，残余物经甲苯精制得到白色固体，收率49.2％，ESI-MS[M+H]+＝691。
实施例8、4’-O-去甲基-4-O-[3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物8)
Figure BDA0003945056470000151
如图5所示，化合物8的合成过程包括：
以4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)和3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)呋喃-2-羧酸(中间体7-2)为原料，将实施例7中苦鬼臼毒素改为4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)，摩尔量不变；其余等同于实施例7。得化合物8，收率50.3％，ESI-MS[M+H]+＝677。
实施例9、4-O-[3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物9)
Figure BDA0003945056470000161
如图6所示，化合物9的合成过程包括：
步骤1)、3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(中间体9-1)的合成：
将4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸甲酯(中间体2-2)(6.6g，30mmol)，N-氯代丁二酰亚胺(8.0g，60mmol)溶于四氢呋喃(30ml)和N,N-二甲基甲酰胺(5ml)的混合溶液中，升温至100℃，密封反应5h(TLC薄层层析监测反应是否完全)。反应完毕冷却至室温，减压回收溶剂，将剩余混合物用饱和碳酸氢钠水溶液洗，乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相饱和氯化钠洗1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝4:1)回收溶剂后得浅黄色固体(中间体9-1)7.4g，收率76％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.32(s,1H),3.91(s,3H),3.84(s,3H),3.54(s,3H)。
步骤2)、3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(中间体9-2)的合成：
将3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸甲酯(中间体9-1)(2.1g，6.8mmol)溶于乙醇(10ml)中，室温下缓慢加入6N氢氧化钠水溶液11.3ml，室温反应约2h(TLC薄层层析监测反应是否完全)。反应完毕后，减压回收溶剂。向剩余反应混合物中加入10ml水，并用1N盐酸中和反应液中的氢氧化钠至pH约为3，乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相饱和氯化钠洗1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂直接得到浅黄色固体1.9g(中间体9-3)，收率89％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.35(s,1H),3.92(s,3H),3.64(s,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ163.46,137.37,139.31,132.41,125.52,114.75,110.31,85.27,39.18,37.62。
步骤3)、4-O-[3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物9)的合成：
以苦鬼臼毒素和3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(中间体9-2)为原料，将实施例2中4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-4)改为3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(中间体9-2)，摩尔量不变；其余等同于实施例2。得化合物9，收率52.3％，ESI-MS[M+H]+＝704。
实施例10、4’-O-去甲基-4-O-[3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物10)
Figure BDA0003945056470000171
如图7所示，化合物10的合成过程包括：
以4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)和3,5-二氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-羧酸(中间体9-2)为原料，将实施例9中苦鬼臼毒素改为4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)，摩尔量不变；其余等同于实施例9。得化合物10，收率49.5％，ESI-MS[M+H]+＝690。
实施例11、4-O-[5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物11)
Figure BDA0003945056470000181
如图8所示，化合物11的合成过程包括：
步骤1)、4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲醛(中间体11-2)的合成：
在氮气保护下，将4-溴-2-噻吩甲醛(中间体11-1)(1.9g，10mmol)、四(三苯基磷)钯(1.1g，1mmol)、1-甲基-1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯(2.5g，12mmol)和磷酸三钾(三水合物)(4.0g，15mmol)依次加入装有50mL DMF的100ml三颈瓶中，反应体系置于90℃充分搅拌反应过夜。反应完毕冷却至室温，将反应液倒入100ml水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，用饱和氯化钠洗两次后，无水硫酸钠干燥，
减压浓缩，所得粗产品用硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝25:1～10:1)纯化得浅黄色固体1.7g(中间体11-2)，收率88％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.98(d,J＝1.1Hz,1H),7.85(d,J＝1.1Hz,1H),7.77(s,1H),7.53(d,J＝1.9Hz,1H),6.39(d,J＝1.9Hz,1H),3.97(s,3H)；ESI-MS[M+H]+＝193。
步骤2)、5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲醛(中间体11-3)的合成：
将中间体11-2(192.2mg，1mmol)，N-氯代丁二酰亚胺(400.6mg，3mmol)溶于DMF/THF(v/v＝1:1，10ml)中，升温至80℃反应约3h,反应完成后冷却至室温，将体系倒入20ml水中，然后用乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相饱和氯化钠洗1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝25:1～10:1)纯化得浅黄色固体159.3mg(中间体11-3)，收率61％。1HNMR(500MHz,CDCl3)δ10.00(d,J＝1.1Hz,1H),7.92(t,J＝1.2Hz,1H),7.91(d,J＝1.4Hz,1H),3.87(s,3H)。
步骤3)、5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲酸(中间体11-4)的合成：
将中间体11-3(522.2mg，2mmol)溶于丙酮(5ml)中，然后缓慢加入高锰酸钾(379.3mg，2.4mmol)，室温搅拌约2h,反应完成后，抽滤，滤饼用甲乙酸乙酯洗两次，合并滤液，浓缩并用乙酸乙酯重结晶，得到白色固体0.44g(中间体11-4)，收率80％。1HNMR(500MHz,d6-DMSO)δ7.99(s,1H),7.67(s,1H),3.82(s,3H)。
步骤4)、4-O-[5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物11)的合成：
以苦鬼臼毒素和5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲酸(中间体11-4)为原料，将实施例2中4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-4)改为5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲酸(中间体11-4)，摩尔量不变；其余等同于实施例2。得化合物11，收率53.4％，ESI-MS[M+H]+＝673。
实施例12、4’-O-去甲基-4-O-[5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物12)
Figure BDA0003945056470000191
如图9所示，化合物12的合成过程包括：
以4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)和5-氯-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻吩-2-甲酸(中间体11-4)为原料，将实施例11中苦鬼臼毒素改为4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)，摩尔量不变；其余等同于实施例11。得化合物12，收率47.5％，ESI-MS[M+H]+＝659。
实施例13、4-O-[5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物13)
Figure BDA0003945056470000192
如图10所示，化合物13的合成过程包括：
步骤1)、5-甲基-4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲醛(中间体13-2)的合成：
在氮气保护下，将5-甲基-2-噻唑甲醛(中间体13-1)(2.1g，10mmol)、四(三苯基磷)钯(1.1g，1mmol)、1-甲基-1H-吡唑-5-硼酸频哪醇酯(2.5g，12mmol)和磷酸钾(三水合物)(4.0g，15mmol)依次加入装有50mL DMF的100ml三颈瓶中，反应体系置于90℃充分搅拌反应过夜。反应完毕冷却至室温，将反应液倒入100ml水中，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，用饱和氯化钠洗两次后，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，所得粗产品用硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝25:1～10:1)纯化得浅黄色固体3.6g(中间体13-2)，收率83％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.66(s,1H),7.24(s,1H),6.48(s,1H),3.93(s,3H),2.39(s,3H)。
步骤2)、5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲醛(中间体13-3)的合成：
将中间体13-2(207.0mg，1mmol)，N-氯代丁二酰亚胺(400.6mg，3mmol)溶于DMF/THF(v/v＝1:1，10ml)中，升温至80℃反应约3h，反应完成后冷却至室温，将体系倒入20ml水中，然后用乙酸乙酯萃取反应液3次，合并有机相饱和氯化钠洗1次后，无水硫酸钠干燥。减压回收溶剂，硅胶柱层析(石油醚:乙酸乙酯＝25:1～10:1)纯化得浅黄色固体120.2mg(中间体13-3)，收率58％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.65(s,1H),8.23(s,1H),3.93(s,3H),2.37(s,3H)。
步骤3)、5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲酸(中间体13-4)的合成：
将中间体13-3(483.4mg，2mmol)溶于丙酮(5ml)中，然后缓慢加入高锰酸钾(279.3mg，2.4mmol)，室温搅拌约2h，反应完成后，抽滤，滤饼用甲乙酸乙酯洗两次，甲乙酸乙酯洗涤后的所得液与滤液合并，浓缩并用乙酸乙酯重结晶，得到白色固体0.44g(中间体13-4)，收率86％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.22(s,1H),3.94(s,3H),2.38(s,3H)。
步骤4)、4-O-[5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物13)的合成：
以苦鬼臼毒素和5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲酸(中间体13-4)为原料，将实施例2中4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-甲基-1H-吡咯-2-甲酸(中间体2-4)改为5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲酸(中间体13-4)，摩尔量不变；其余等同于实施例2。得化合物13，收率48.4％，ESI-MS[M+H]+＝654。
实施例14、4’-O-去甲基-4-O-[5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲酰基]苦鬼臼毒素(化合物14)
Figure BDA0003945056470000211
如图11所示，化合物14的合成过程包括：
以4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)和5-甲基-4-(4-氯-1-甲基-1H-吡唑-5-基)噻唑-2-甲酸(中间体13-4)为原料，将实施例13中苦鬼臼毒素改为4’-O-去甲基苦鬼臼毒素(中间体3-2)，摩尔量不变；其余等同于实施例13。得化合物14，收率47.5％，ESI-MS[M+H]+＝640。
实施例15、4’-O-去甲基-4-O-乙酰基苦鬼臼毒素-4’-磷酸酯(化合物15)
Figure BDA0003945056470000212
如图12所示，化合物15的合成过程包括：
步骤1)、4’-O-去甲基-4-O-乙酰基苦鬼臼毒素-4’-磷酸二苄酯(中间体15-1)的合成：
在氮气保护下，将4’-O-去甲基-4-O-乙酰基苦鬼臼毒素(化合物4)(274.0mg，0.62mmol)加入装有4mL无水乙腈的25ml三颈瓶中，将悬浮液冷却至-10℃。加入四氯化碳(0.3ml,3.12)，保持温度为-10℃。于3分钟内用注射器加入N,N-二异丙基乙胺(0.23ml,1.31mmol)，一次全部加入N,N-二甲氨基吡啶(7.63mg,0.063mmol)，再于15分钟内滴加亚磷酸二苄酯(0.2ml,0.91mmol)。在-10℃下保温反应1小时。反应结束后加入0.5N磷酸二氢钾溶液(10ml)，反应液升至室温。混合物用乙酸乙酯(20ml)萃取，再用水洗(2×10ml)。有机层经无水硫酸钠干燥，真空浓缩。加入异丙醇精制，得到类白色固体(中间体15-1)(387mg,0.55mmol)，收率89.％，ESI-MS[M+H]+＝703。
步骤2)、4’-O-去甲基-4-O-乙酰基苦鬼臼毒素-4’-磷酸酯(化合物15)的合成：
将20mg的5％钯碳加到4’-O-去甲基-4-O-乙酰基苦鬼臼毒素-4’-磷酸二苄酯(中间体15-1)(140mg,0.20mmol)的甲醇和四氢呋喃混合液中(50ml，甲醇:四氢呋喃＝1:1)。混合物于室温下、0.3MPa氢气压力下氢化3-6小时。反应完毕，滤除催化剂，用甲醇冲洗。40-50℃真空浓缩滤液，经中性氧化铝柱纯化(石油醚：乙酸乙酯：甲醇＝150:10:1-50:10:1)，得到固体化合物15(78.6mg,0.15mmol)，收率75.3％，ESI-MS[M+H]+＝523。经HPLC测定纯度为99.3％(面积)。
苦鬼臼毒素衍生物的生物活性检测
以下生物活性检测主要测定化合物1(命名为PPP-A5)及其衍生物抑制体外培养的人源胶质瘤细胞和其它组织来源肿瘤细胞增殖的药效，验证其以IGF-1R作为药靶的作用机制，验证其具有透过小鼠血脑屏障的化学特性。部分试验中以苦鬼臼毒素(PPP)和其它结构类似化合物作为阳性对照，以DMSO作为阴性对照。
一、化合物体外药效学试验
(1)部分化合物对各类肿瘤细胞的增殖抑制作用
受试化合物：
表1抑制各类肿瘤细胞增殖的受试化合物及其化学结构式
Figure BDA0003945056470000221
Figure BDA0003945056470000231
/>
1.试验步骤
1)细胞来源：下列人源肿瘤细胞系均购自中国科学院细胞库(上海)：人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG(简称U87)，货号TCHu138；人肺癌细胞A549，货号SCSP-503；人胃腺癌细胞AGS，货号TCHu232；人肝癌细胞HepG2，货号TCHu72；人结肠癌细胞HT-29，货号TCHu103；人宫颈癌细胞HeLa，货号TCHu187。
2)细胞培养和传代：上述细胞均贴壁培养于含完全培养基[含DMEM高糖基础培养液(#SH30243.01B，HyClone)加入终浓度为10％ FBS(#1101-500，上海普飞)和Penicillin-Streptomycin双抗(#SV30010，HyClone)]的6cm培养皿(#430166，Corning)或T75培养瓶(#3276，Corning)中，培养皿(瓶)置于37℃，5％ CO2，饱和湿度的细胞培养箱(#3111，ThermoFisher Scientific)中培养。传代时，先吸走培养基，用PBS磷酸缓冲盐溶液(#GNM-10944，杭州吉诺)洗涤2次，然后加入适量0.25％胰酶-0.02％ EDTA(#25200-072，Gibco)，摇晃培养皿(瓶)使之均匀覆盖细胞，置于相差显微镜下观察。待大多数细胞回缩变圆，轻摇即脱落时，迅速加入两倍胰酶体积的完全培养基终止，并轻轻将细胞吹打成单细胞。将细胞悬液移到合适大小的离心管内，800rpm离心5min。弃上清，用新鲜的完全培养基重悬细胞团块，重新吹打成单细胞，以1:3-1:6的比率传代接种至新的培养皿(瓶)并补足完全培养基。置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中培养。
3)细胞加药处理：将上述每种细胞消化、计数，均按5000细胞/200μl培养液的密度接种至96孔细胞培养板(#3988，Corning)的每个孔中，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h使细胞充分贴壁。然后分别将含梯度稀释后的各种待测化合物(每种化合物每个浓度设置3个重复孔)以及DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)溶剂对照的完全培养液替换掉原来的培养液，继续培养72h。
4)药效学测定和统计：先用倒置相差显微镜(X71，Olympus)对上述化合物处理后的细胞进行形态观察和拍照记录。然后分别将含CCK-8检测试剂(#E606335，上海生工)的无酚红培养液替换掉原来的培养液，培养箱中继续培养2h。然后在多功能酶标仪(168-1130，Bio-Rad)上测量OD450nm吸光值(OD值)。受试化合物处理细胞后，细胞存活率(cellsurvival rate)或细胞增殖率(cell growth rate)的计算公式为：存活率＝加药组OD值/对照组OD值×100％；化合物对细胞增殖的抑制率(growth inhibition rate)计算公式为：抑制率＝(对照组OD值-加药组OD值)/对照组OD值×100％。进一步根据抑制率数值在SPSS中计算出各化合物的IC50。化合物对每种肿瘤细胞的IC50值数据为一次实验中三个复孔的平均值±标准差。
2.试验结果
表2不同受试化合物对多种人源肿瘤细胞系的增殖抑制作用比较
Figure BDA0003945056470000241
根据表2的结果可知，化合物1、化合物2、化合物5-12即所有受试化合物对于体外贴壁培养的人源胶质瘤(U87)均具有显著的抑制作用。其中，针对化合物1和化合物5进行了多种人源肿瘤细胞系的增殖抑制作用试验，可以看出，化合物1和化合物5对胶质瘤U87细胞、肺癌A549细胞、胃癌AGS细胞，肝癌HepG2细胞、结直肠癌HT-29细胞、宫颈癌Hela细胞的增殖均有抑制作用。
在人源胶质瘤U87细胞的增殖抑制作用中，化合物1(记作PPP-A5)的IC50值最小，提示其药效最强。且根据PPP-A5在各人源肿瘤细胞系的抑制作用结果来看，PPP-A5在肺癌和结直肠癌方面或许具有更为突出的抑制作用，可以进行进一步研究。在上述不同受试化合物对多种人源肿瘤细胞系的增殖抑制作用基础上，化合物1(PPP-A5)在多种人源肿瘤细胞系中的增殖抑制作用具有更明显的优势。
(2)化合物1(PPP-A5)与对照化合物对U87细胞的增殖抑制作用比较
受试化合物：
表3抑制U87细胞增殖的受试化合物及其化学结构式
Figure BDA0003945056470000251
Figure BDA0003945056470000261
1.试验步骤
1)细胞来源：人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG(简称U87)购自中国科学院细胞库(上海)，货号TCHu138。
2)细胞培养和传代：与上述“部分化合物对各类肿瘤细胞的增殖抑制作用”中的细胞培养和传代方法相同。
3)细胞加药处理：与上述“部分化合物对各类肿瘤细胞的增殖抑制作用”中的细胞加药处理方法相同。共进行两组试验，第二组试验作为重复性试验。
4)药效学测定和统计：与上述“部分化合物对各类肿瘤细胞的增殖抑制作用”中的药效学测定和统计方法相同。
2.试验结果
图13是化合物1(PPP-A5)与对照化合物的第一组体外药效学检测结果。
图14是化合物1(PPP-A5)与对照化合物的第二组体外药效学检测结果。
表4不同受试化合物对U87细胞的增殖抑制作用比较
Figure BDA0003945056470000262
注：U87细胞为贴壁培养，数据为3次独立实验IC50数值的平均值。
根据表4的结果可知，PPP(苦鬼臼毒素)、PPP-A4、PPP-A5(化合物1)、PB-001、PB-002即所有受试化合物对于体外贴壁培养的人源胶质瘤(U87)均具有显著的抑制作用。
与化合物PB-001以及化合物PB-002相比，化合物PPP-A5对人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG明显具有更好的抑制作用。化合物PPP-A5与PPP的IC50最接近，提示化合物PPP-A5对人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG具有良好的抑制作用。结果表明，PPP-A5的体外药效与PPP非常接近，高于其他对照物。
二、化合物作用机制验证
受试化合物：PPP、PPP-A4、PPP-A5、PB-001、PB-002(各化合物的结构式与“化合物体外药效学试验”中受试化合物对应的结构式相同)
1.试验步骤
1)细胞来源：人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG(简称U87)购自中国科学院细胞库(上海)，货号TCHu138。
2)细胞培养和传代：与上述“部分化合物对各类肿瘤细胞的增殖抑制作用”中的细胞培养和传代方法相同。
3)细胞加药处理：将上述U87细胞消化、计数，均按5000细胞/200μl培养液的密度接种至96孔细胞培养板(#3988，Corning)的每个孔中，置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中培养24h使细胞充分贴壁。然后分别采用上述体外药效学中确定的每种化合物达到IC95后的2个最低抑制剂量以及DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)溶剂对照的完全培养液替换掉原来的培养液，继续培养24h。
4)检测样品制备：收集上述化合物处理24h后的U87细胞，离心后吸去上清培养液，用冰浴预冷的PBS洗2次，吸干液体。加入200μl细胞裂解液(#P0013，碧云天)，剧烈震荡30s，冰上静置5min，重复3次。细胞裂解样品13000rpm，4℃离心6min，取上清与4×Laemmli上样缓冲液(#161-0747，Bio-Rad)3:1体积混合成为细胞裂解液蛋白样品，100℃金属浴变性6min，样品用于下列Western blot检测。
5)IGF-1R信号通路生物标志物检测：将4-15％预制梯度胶(456-8084，Bio-Rad)安装到电泳槽中，加入足量1×SDS-PAGE电泳缓冲液。使用20μl的移液枪加入20μl上述细胞裂解液蛋白样品。将电泳槽盖子盖上，并接通电源，先以80V电压电泳约30min，待样品中溴酚蓝在浓缩胶与分离胶分界线压成一条细线时将电压调至120V，根据目标蛋白以及内参蛋白条带的大小调整电泳持续时间。将预冷1×转膜缓冲液倒入合适大小的容器中，按照说明书组装好泡沫垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-泡沫垫的“三明治”结构，装入电泳槽中。加入冰块且整个电泳槽冰浴，连通电源进行转膜，250mA，2h。将PVDF膜(IPVH00010，Millipore)放入由1×TBST配制的5％脱脂奶粉中室温封闭1h。然后依次进行不同一抗(anti-total IGF1R,#3027，CST；anti-pIGF1R-Y1135/Y1136(Y1135和Y1136位点磷酸化的IGF1R，是被激活状态的IGF1R)，#3024S，CST；anti-total AKT，#4691s，CST；anti-pAKT-T308(T308位点磷酸化的AKT，IGF-1R被激活后会导致AKT该位点的磷酸化)，#13038，CST；anti-pAKT-S473(S473位点磷酸化的AKT，IGF-1R被激活后会导致AKT该位点的磷酸化)，#4060，CST；anti-GAPDH[HRP]，#A00191-40，GenScript)和二抗(anti-Mouse IgG HRP-linked antibody，#7076，CST；anti-Rabbit IgG HRP-linked antibody，#7074，CST)的孵育(分别室温孵育1h)与洗膜(1×TBST洗膜3次，每次5min)。最后，将PVDF膜放至塑料膜中间，加入ECL膜上反应3min，盖上另一层塑料膜，在全自动化学发光/荧光图像分析系统(5200-Multi，天能)中曝光。
2.试验结果：
图15是化合物1(PPP-A5)与对照化合物对U87细胞IGF-1R信号通路生物标志物的作用。用于验证五种受试化合物对U87肿瘤细胞具有抑制作用的作用机制。如图15所示，五种受试化合物对U87细胞中一系列IGF-1R信号通路生物标志物均有剂量依赖型的抑制作用，尤其显著抑制了pIGF1R-Y1135/Y1136、pAKT-T308，提示其通过竞争性抑制IGF1等配体与IGF-1R结合，阻断了IGF-1R的磷酸化与激酶活性，并进一步通过抑制AKT等IGF-1R下游效应分子而高效抑制U87细胞增殖。
三、化合物透过血脑屏障试验(生物标志物检测)
受试化合物：PPP、PPP-A4、PPP-A5、PB-001、PB-002(各化合物的结构式与“化合物体外药效学试验”中受试化合物对应的结构式相同)
1.试验步骤
1)实验动物来源：SPF级雄性BALB/c品系裸鼠订购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，小鼠周龄为6至8周。
2)实验动物给药处理：将受试化合物溶解在DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)中，配制成50mg/ml母液。用PBS稀释受试化合物母液，以100mg/kg剂量对小鼠进行灌胃，每种受试化合物设置3只小鼠(不含胶质瘤细胞)的实验重复。给药前禁食过夜。
3)检测样品制备：给药3小时后，颈椎脱臼法处死小鼠，取其右脑，加入800μl预冷的细胞裂解液(#P0013，碧云天，新鲜添加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂#78444，Thermo FisherScientific)，冰浴上充分匀浆，12000rpm离心10分钟后，取上清。用BCA法测定样品的蛋白浓度，加入相应量的4×Laemmli上样缓冲液(#161-0747，Bio-Rad)，以3:1体积混合成为脑组织裂解液蛋白样品，100℃金属浴变性8min，12000rpm离心2分钟，取上清进行下列Western blot检测。
4)IGF-1R信号通路生物标志物检测：与上述“化合物作用机制验证”中的IGF-1R信号通路生物标志物检测方法相同，一抗(anti-pIGF1R-Y1135/Y1136，#3024S，CST；anti-pAKT-T308，#13038，CST；anti-pAKT-S473，#4060，CST；anti-pIRS1-S302，#2384，CST；anti-GAPDH[HRP]，#A00191-40，GenScript)和二抗(anti-Mouse IgG HRP-linked antibody，#7076，CST；anti-Rabbit IgG HRP-linked antibody，#7074，CST)。
2.试验结果：
图16为化合物1(PPP-A5)与对照化合物对小鼠血脑屏障通透性的检测结果。如图16所示，化合物1(PPP-A5)对小鼠血脑屏障透过率优于PPP(苦鬼臼毒素)。
四、化合物药效学和血脑屏障透过率综合评价
根据“化合物体外药效学试验”和“化合物透过血脑屏障试验”的试验结果进行分析。在化合物体外药效学试验中，共进行两组试验，对两组试验结果中不同受试化合物的IC50分别取平均值，来评估不同受试化合物对U87细胞的增殖抑制作用。在化合物透过血脑屏障试验中，对试验结果中不同受试化合物的血脑屏障透过率以“-”和“+”进行统计，来评估不同受试化合物的血脑屏障透过率。
表5不同受试化合物的药效学和血脑屏障透过率综合评价
IC50(μM) 血脑屏障透过率
PPP 0.31 -
PPP-A5 0.37 +
PPP-A4 0.44 ++
PB-001 2.45 +++
PB-002 9.76 ++
根据表5的结果可知，PB-001的药效学作用和血脑屏障透过率均优于PB-002。而PB-001的药效学作用比PPP、PPP-A4、PPP-A5更弱。其中，PPP-A5的药效学作用是最接近PPP(苦鬼臼毒素)的。
但是，PPP(苦鬼臼毒素)的血脑屏障透过率非常低，出现这种情况一方面可能是PPP在小鼠体内代谢较快，能够透过血脑屏障前几乎已被代谢掉，另一方面也可能是PPP透过血脑屏障的能力较弱所导致的。而PPP-A5的血脑屏障透过率略优于PPP(苦鬼臼毒素)。因此，综合来看，PPP-A5能够在保证药效显著的同时，获得比PPP更好的血脑屏障透过率。
如图16所示，小鼠口服化合物PB-001后，3小时内就下调了脑组织中的磷酸化IGF-1R/AKT等IGF-1R信号通路中关键的生物标志物，提示PB-001能高效透过小鼠血脑屏障。而PPP未能有效下调IGF-1R信号通路中关键的生物标志物，提示其不能有效透过小鼠血脑屏障。PPP-A5仅能小幅下调上述生物标志物，提示其透过血脑屏障的能力不强，需要通过进一步的结构优化来提升其透过血脑屏障的能力。此试验结果也提示如果按照PB-001的方式在化合物PPP-A5及其结构类似物上添加氟原子，有希望进一步提高PPP-A5的血脑屏障透过率。而在化合物将氢原子全部或部分取代为氘原子可以有效延长化合物在生物体内的半衰期。
五、化合物处理后的细胞形态学记录
受试化合物：PPP、PPP-A4、PPP-A5、PB-001、PB-002(各化合物的结构式与“化合物体外药效学试验”中受试化合物对应的结构式相同)
1.试验步骤
1)细胞来源：人脑星形胶质母细胞瘤/胶质瘤细胞U-87MG(简称U87)购自中国科学院细胞库(上海)，货号TCHu138。
2)细胞培养和传代：与上述“部分化合物对各类肿瘤细胞的增殖抑制作用”中的细胞培养和传代方法相同。
3)细胞加药处理：将上述U87细胞消化、计数，均按5000细胞/200μl培养液的密度接种至96孔细胞培养板(#3988，Corning)的每个孔中，置于37℃，5％ CO2的细胞培养箱中培养24h使细胞充分贴壁。然后分别采用上述体外药效学中确定的每种化合物达到IC95后的2个最低抑制剂量以及DMSO(#D5879，Sigma-Aldrich)溶剂对照的完全培养液替换掉原来的培养液，继续培养24h。拍照记录细胞形态。
2.试验结果
图17为化合物1(PPP-A5)与对照化合物抑制U87细胞增殖的形态学证据。如图17所示，PPP(苦鬼臼毒素)、PPP-A4、PPP-A5(化合物1)、PB-001、PB-002即所有受试化合物对于体外贴壁培养的人源胶质瘤(U87)均具有显著的抑制作用。其中PPP-A5、PPP-A4和PPP的抑制效果相当，均明显优于PB-001和PB-002。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护的范围内。

Claims (11)

1.式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003945056460000011
式(I)中：
X1、X2各自独立地选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基中的任一种；
A1、A2、A3各自独立地选自氢、羟基、C1-C5烷基、C1-C5卤代烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5卤代烷氧基、磷酸酯基、RaCOO-酯基中的任一种；其中，Ra选自氢、C1-C4烷基或C1-C4卤代烷基；
R为取代吡唑环类衍生物基团，R的结构如式(II)所示：
Figure FDA0003945056460000012
式(II)中：
L选自C或N；
X选自O、S、N(Rh)，其中，Rh选自氢、C1-C5烷基、C1-C5卤代烷基、C1-C5烷氧基、C1-C5卤代烷氧基中的任一种；
B为连接基团，选自碳氧双键、碳硫双键、亚磺酰基或磺酰基中的任一种；
R3选自氢、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、无取代或取代的五元芳基、无取代或取代的六元芳基中的任一种；
R4选自氢、卤素、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基中的任一种；
R5、R6各自独立地选自氢、卤素、硝基、氨基、氰基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基中的任一种；
式(II)中，与式(I)所示化合物上氧原子连接的位置选自R3、R4、R5、R6或B中任意可连接的C或S。
2.如权利要求1所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)所示化合物中，X1为氢，X2为氢，A1、A2、A3均为甲氧基，包括以下化合物：
Figure FDA0003945056460000021
3.如权利要求1所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)所示化合物中，X1为氢，X2为氢，A1和A3均为甲氧基，A2为羟基，包括以下化合物：
Figure FDA0003945056460000031
4.如权利要求1所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)所示化合物中，X1为氟原子，X2为氟原子，A1、A2、A3均为甲氧基。
5.如权利要求1所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)所示化合物中，X1为氟原子，X2为氟原子，A1和A3均为甲氧基，A2为羟基。
6.如权利要求1所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)所示化合物中至少一个氢原子被氘原子取代。
7.如权利要求6所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，式(I)所示化合物中，A1、A2、A3中至少一个氢原子被氘原子取代。
8.药物组合物，其特征在于，包括权利要求1-7任一项所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、辅料或其他活性药物。
9.如权利要求1-7任一项所述的式(I)所示化合物、其光学异构体或其药学上可接受的盐，或者权利要求8所述的药物组合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途，所述癌症为IGF-1R依赖性疾病。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述癌症包括恶性黑色素瘤、原发性神经外胚层瘤、神经胶质瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、骨髓增生性及淋巴组织增生性疾病、消化道肿瘤、妇科癌症。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述神经胶质瘤为恶性胶质瘤或星形胶质细胞瘤；消化道肿瘤为胃癌、结直肠癌、肝癌或胰腺癌；所述妇科癌症为卵巢癌或宫颈癌。
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