JP2016511251A - ビンブラスチン誘導体及びその製造方法、並びにその応用 - Google Patents
ビンブラスチン誘導体及びその製造方法、並びにその応用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
S1:ビンブラスチン類化合物又はその塩を有機溶剤に溶解してからヒドラジン水和物を添加して、暗所、窒素下で10〜60時間撹拌しながら加熱反応させ、反応温度は40℃〜120℃の範囲内にコントロールして、反応終了後に分離と精製とを行って、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物(R−NHNH2)を得た。
S2:ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物(R−NHNH2)、ベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリン(Z−GP−OH)及びカップリング剤を、−10℃〜50℃下、暗所で攪拌しながら反応させ、反応終了後に水を加えてクエンチしてから分離と精製とを行って、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体(Z−GP−NHNH−R)を得た。
(1)本発明のビンブラスチン類ジペプチド誘導体によれば、正常細胞毒性及び体内毒性をかなり減らすことができ、また体内外において、FAPα酵素による特有な加水分解でジペプチド部分(Z−GP)を切除し、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物をリリースすることができる。
(2)前記ビンブラスチン誘導体は、種々の腫瘍細胞株の体外増殖、及び担癌マウスの体内腫瘍の成長をかなり抑制することができる。
(3)本発明の前記ビンブラスチン誘導体は、新しい血管新生の抑制作用及び既に形成した新生血管のダメージ作用を有する。
(4)本発明の前記ビンブラスチン誘導体は、HUVECs細胞の侵害能力、転移能力、及びHUVECsルーメンの形成に対して良好な抑制作用を有し、角膜マイクロポケット血管新生、滑膜血管新生、及び以及マトリゲル塞栓モデル血管新生などについても良好な抑制作用を有する。また、既に形成されたHUVECsルーメン、角膜マイクロポケット血管、滑膜血管、及びマトリゲル栓塞血管に対して、ダメージ作用を有する。
(5)体内外で薬効試験結果に示されたように、本発明の前記ビンブラスチン誘導体は、悪性腫瘍、糖尿病性網膜症、及び関節リウマチなど疾患の治療また予防に応用することができる。特に、本発明は、前記ビンブラスチン誘導体が悪性腫瘍、糖尿病性網膜症及び関節リウマチ等疾患の治療また予防に応用される場合、ビンブラスチン類化合物と比較すれば、より良好な薬理効果を有し、両者の差が有意差であることを見出した。
(6)本発明の合成方法は、穏やかな反応条件、簡単な実験プロセス、高収率、高製品純度、経済実用など特徴を有する。特に、本発明の前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の合成中間体とすることができるだけではなく、その自身も良好な生理学的活性を有し、活性成分としてかかる薬物の調製に応用することができる。
1.1.1 ビンブラスチンのヒドラジン分解:ビンブラスチン硫酸塩182mg(0.2mmol)を秤量し、35mLの厚肉耐圧配管に入れて、8mLのメタノールと0.9mLの80%ヒドラジン水和物(23mmol)を加えた。先に、5min間超音波をかけて、溶液中に含まれる空気を除去するために窒素を充填してからプラグを差し込んた。そして、アルミホイルで包んで光を遮断して、60℃のオイルバスにいれて24h攪拌しながら反応させた。反応終了後に水を添加し希釈して,ジクロロメタン(DCM)にて数回抽出して、有機相を合併して、水と飽和NaCl溶液にて順番に洗浄して、無水Na2SO4により乾燥させてから、減圧により溶剤を蒸発させた。得られた混合物をRP−HPLC(逆相分取高速液体クロマトグラフィー)によって分離と精製とをして(移動相として、MeOH:H2O:Et3N=70:30:0.005,V/V/V),薄黄色粉末状固体化合物116mgを得た。収率は76.1%であった。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 8.19(s, 1H), 8.03( s, 1H), 7.51 (d, J = 9.0Hz, 1H), 7.07〜7.22(m, 3H), 6.54(s, 1H), 6.09 (s, 1H), 5.74〜5.88(m, 2H), 4.13(m, 2H), 3.84〜4.00 (m, 3H), 3.78(s, 3H), 3.60(s, 3H), 3.45〜3.56 (m, 2H), 3.34 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.29(d, J = 6.0Hz, 1H), 3.12〜3.27(m, 3H), 2.81〜2.93(m, 3H), 2.78(s, 3H), 2.61 (s, 1H), 2.39〜2.54 (m, 3H), 2.26〜2.38 (m, 2H), 1.94〜2.08(m, 2H), 1.64〜1.80(m, 4H), 1.43〜1.58(m, 3H), 1.32〜1.45(m, 4H), 0.81〜0.96(m, 6H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 175.3, 173.4, 158.0, 152.5, 135.0, 131.4, 130.4, 129.3, 123.9, 123.7, 122.5, 122.3, 120.0, 118.9, 118.4, 116.7, 110.5, 93.4, 84.1, 80.5, 73.7, 69.3, 66.4, 64.0, 55.8, 55.7, 53.3, 52.4, 50.4, 50.2, 49.7, 47.7, 45.1, 42.2, 41.0, 40.8, 38.3, 34.5, 32.8, 29.7, 22.6, 8.6, 6.9;ESI−MS (m/z): 769.9[M+H]+。上記のデータによって、産物がヒドラジン分解ビンブラスチン(JJ−CCJ)であることを証明し、その構造は、下記のとおりである。
実験方法:対数増殖期細胞(A549(ヒト非小細胞肺癌細胞)、LOVO(ヒト結腸癌細胞)、CNE−2(ヒト鼻咽頭癌細胞)、HepG2(ヒト肝細胞癌細胞)、Hela(ヒト子宮頚癌細胞)、MCF−7(ヒト乳癌細胞)、MDA−MB−231(ヒト乳癌細胞)、NCI−N87(ヒト胃癌細胞)、PC−3(ヒト前立腺癌細胞)、DU145(ヒト前立腺癌細胞)、K562(ヒト白血病細胞)、A375(ヒトメラノーマ細胞)、SH−SY5H(ヒト神経芽腫細胞)、ヒト前骨髄性白血病細胞(HL−60)、BEL−7402/5−Fu(ヒト肝細胞癌のフルオロウラシル耐性株)、HepG2/ADM(ヒト肝癌ドキソルビシン耐性株)、MCF−7/ADR(ヒト乳癌のアドリアマイシン耐性株))を取って、それぞれ適量なRPMI 1640培養液(FBS10%、ペニシリン100U/mL)を加えて、細胞濃度が5×105個/mLとなるように調製して、96ウェル培養プレートに播種して、各ウェルに腫瘍細胞のサスペンション液100μLを播種した。そして、5%CO2のインキュベーターに置いて、37℃で24h培養した後に、調製したテスト用薬物を加えて(対照群について薬物を添加しないとした)、さらに72h培養した。その後に、各ウェルに5mg/mL MTT [3−(4,5−Dimethylthiazol−2−yl)−2,5−diphenyltetrazolium bromide] の溶液30μLを加えて、37℃で4hインキュベーションして、上澄みを取り除いて、さらに各ウェルにDMSO 100μLにて溶解し得たホルマザン(formazan)を添加して、酵素標識器具を利用して(Thermo製品)570nmでOD値を測定した。
実験方法:実施例2の方法と同様に、ビンブラスチン類化合物、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体の、人正常肝癌細胞LO2及びヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC対する体外細胞毒性について測定した。
実験方法:HPLCクロマトグラフの条件は、下記のとおりである:
高速液体クロマトグラフィーAgilent 1200;
コラムCosmosil C18逆相カラム(4.6×250mm2,5μm);
移動相[0min,55%メタノールと45%水(2mMギ酸アンモニウムを含有);10min,65%メタノールと35%水(2mMギ酸アンモニウムを含有);15 min,75%メタノール和25%水(2mMギ酸アンモニウムを含有);30min,85%メタノール和15%水(2mMギ酸アンモニウムを含有);40min,85%メタノール和15%水(2mMギ酸アンモニウムを含有)];
流速:1mL/min;
検出波長:254nm;
注入量:2μL。
実験方法:ヌードマウスに移植瘤を接種した21日後に、CO2で麻酔してから頚椎脱臼によって殺して、皮下腫瘍をストリップした。生理食塩水で洗浄し脂肪組織を取り除いて、紙で表面の水分を吸収し除去した。約2gの腫瘍組織を秤量して、はさみで小さな組織ブロックとなるように切ってからガラスホモジナイザーに移して、10mLの酵素分解緩衝液を入れて破砕した。破砕液を収集して、200メッシュに通した。10mLの破砕液を正確に量って、化合物の最終濃度は50μMとなるように、10μLの濃度50 mMのビンブラスチン類ジペプチド誘導体の保存液に添加して、37℃の水浴にて反応させた。0、2、8、12及び24h後に、それぞれ2mLの破砕液を取り15mLの遠心分離管に入れて、5mLの抽出剤(アセトニトリル/ジクロロエタン=1 : 4)を添加して、ボルテックスにより1min間ミックスして、2500rpmで5min遠心分離した。下層の有機相を取って、窒素下にブロー乾燥して、200μLのメタノールを添加し残留物を溶解させた。0.22μm濾過膜によって不純物を除去して、HPLC法によって酵素分解産物を測定して、酵素分解率を計算した。その中、A: BX−CCJ;B: BX−CCRB;C: BX−CCFN;D: BX−CCXJである。
実験方法:体重18〜22gの昆明種マウス(広東省の動物センターから購入)を用意して、ランダムにグループ化して、各グループは10匹とした。それぞれ異なる用量のVLB(ビンブラスチン)及びビンブラスチン類ジペプチド誘導体を腹腔内注射して、マウスの生存状況に基づいて、半数致死量LD50を計算した。
実験方法:対数増殖期のMDA−MB−231細胞をダイジェストして、PBS(リン酸緩衝液)を用いて2回洗浄した。細胞密度が1×107個となるように調整して、各BALB/nu/nu雌性ヌードマウスに皮下に0.1mLを接種した。腫瘍が70〜100 mm3 までに成長したら、ヌードマウスをランダムに生理食塩水群(対照群)、ビンブラスチン類化合物(VLB、CCRB、CCFN、CCXJ)並びにビンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、 BX−CCFN、JJ−CCXJ及びBX−CCXJ群に分かれて、各群毎に6匹とした。各ヌードマウスについて、それぞれ1日おきで1mg/kgの上記薬物を腹腔内に注射した。総計8回投薬して、1日あけてヌードマウスの体重及び腫瘍のサイズを測定した。実験終了した後に、ヌードマウスを殺して、ピール腫瘍塊とオルガンオルガンを剥離した。上記実験中の腫瘍体積計算式は、V=1/2 ab2)であって、その中、a、bはそれぞれ腫瘍塊の長径を表す。
実験方法:対数増殖期のHUVECs細胞をダイジェストして、遠心分離しカウントして、5×106/mLとなるようにマトリゲル(Matrigel)(BD公司)被覆Transwellシステムに接種して、各ウェルに0.1mLとし、5%CO2を含有して、37℃である細胞インキュベーターに24時間培養した。そして、ブランコ対照群と投薬群に分かれて、投薬群にそれぞれビンブラスチン類化合物及びビンブラスチン誘導体を投薬して、薬物の最終濃度は何れも100pmol/Lであった。24時間培養したら、培養液を除去しPBSで1回洗浄して、4%(W/V)パラホルムアルデヒドで15分間固着して、ギムザ染料を用いて30分間着色して、さらにPBSで1回洗浄した。顕微鏡で観測し細胞数を計数した結果を図3に示した。
実験方法:対数増殖期のHUVECs細胞を用意して、PBSで洗浄し遠心分離して、細胞を無血清培地に再度にサスペンションした。2×106個/mLの細胞をTranswellチャンバーに接種して、各ウェルに100μLとした。そして、ブランコ対照群と投薬群に分かれて、投薬群にそれぞれビンブラスチン類化合物ビンブラスチン(CCJ)、ビノレルビン(CCRB)、ビンフルニン(CCFN)、及びビンクリスチン(CCXJ)、並びにビンブラスチン誘導体ヒドラジン分解ビンブラスチン(JJ−CCJ)、ビンブラスチンジペプチド(BX−CCJ)、ヒドラジン分解ビノレルビン(JJ−CCRB)、ビノレルビンジペプチド(BX−CCRB)、ヒドラジン分解ビンフルニン(JJ−CCFN)、ビンフルニンジペプチド(BX−CCFN)、ヒドラジン分解ビンクリスチン(JJ−CCXJ)及びビンクリスチンジペプチド(BX−CCXJ)、を投薬して、薬物の最終濃度は何れも100pmol/Lであった。そして、下チャンバーに700μLの10%新生仔ウシ血清を含有する1640培養液を添加して、5%CO2を含有し37℃である細胞インキュベーターに24時間培養した。その後、培養液を取り除いて、4%パラホルムアルデヒドで4℃の条件下に30min間固着して、水で2回ゆっくり洗浄した。ギムザ染料を用いて30分間着色してから、綿棒で膜上の細胞を拭き除いて、さらに水でゆっくり洗浄した。顕微鏡で観測し細胞数を計数した結果を図4に示した。
実験方法: マトリゲル(Matrigel)を予め冷やした48ウェルプレートに設置して、各ウェルに100μLを添加して、37℃である細胞インキュベーターに20分間培養した。マトリゲルが固化したら、1×105個HUVECs細胞/ウェルで培養液を添加した。細胞の培養液は、予めビンブラスチン類化合物ビ及びンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、 BX−CCFN、JJ−CCXJ及びBX−CCXJ(最終濃度:100pmol/L)並びに血管内皮増殖因子(VEGF)(最終濃度:100ng/mL)を添加した。薬物及びVEGFを添加していなかったウェルは、ブランク対照群とした。継続的に8h間培養してから、倒立顕微鏡下にルーメンの形成状況を観測し撮影して、結果を図5に示した。
実験方法:文献(Zhi−Ting Deng, et al. Biochemical Pharmacology 2011, 82:1832−42.)に記載の方法を参考し改良して、マトリゲル(Matrigel)を予冷した48ウェルプレートに設置して、各ウェルに100μLを添加して、37℃である細胞インキュベーターに20分間培養した。マトリゲルが固化したら、1×105個HUVECs細胞/ウェルとなるように細胞培養液を添加して、さらに4h培養した。HUVECsルーメンが形成した後に、細胞培養液をビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、BX−CCFN、JJ−CCXJ及びBX−CCXJ(最終濃度:100pmol/L)並びに血管内皮増殖因子(VEGF)(最終濃度:100ng/mL)を添加した培養液に入れ替えた。薬物及びVEGFを添加していなかったウェルは、ブランク対照群とした。継続的に8h間培養してから、倒立顕微鏡下にルーメンの形成状況を観測し撮影して、結果を図6に示した。
実験方法:文献(Cho SG, et al. Cancer Res. 2009, 69(17): 7062−7070)に記載の方法を参考して、60個の5日齢種卵をランダムにPBS群、ビンブラスチン類化合物群、並びにビンブラスチン誘導体JJ−CCJ群、BX−CCJ群、JJ−CCRB群、BX−CCRB群、JJ−CCFN群、BX−CCFN群、JJ−CCXJ群、及びBX−CCXJ群に分け、各群は10個とした。種卵を消毒した後に、空気チャンバーを上向け、37℃のインキュベーターに入れた。8日間培養したら、ハサミやピンセットを利用して空気チャンバーに口を切り開いて(1.5cm×1.5cm)、卵殻膜を剥離して、鶏胚漿尿膜を露出させた。薬物含有濾紙を鶏胚漿尿膜の血管の少ないところに置いた。パラフィルムを用いて空気チャンバーの口をシールして、インキュベーターにおいてさらに1日間培養した後に、パラフィルムを取り外して、メタノールとアセトンの混合液(1:1, V/V)を注入して、室温で15min間固着した。血管が凝固したら、濾紙を中心として膜を切り取って、少量な水を盛っていた皿において展開して、ろ紙上にタイルに設置した。その後に、ろ紙と膜を一緒に水から取り出して、眼科用顕微鏡を利用して実験部周辺5mmの範囲内の血管を観測し計数して、撮影した。結果を図7に示した。
実験方法:60個の5日齢種卵をランダムにビンブラスチン類化合物組、並びにビンブラスチン誘導体JJ−CCJ群、BX−CCJ群、JJ−CCRB群、BX−CCRB群、JJ−CCFN群、BX−CCFN群、JJ−CCXJ群、及びBX−CCXJ群に分け、各群は10個とした。種卵を消毒した後に、空気チャンバーは上向け、37℃のインキュベーターに入れた。8日間培養したら、ハサミやピンセットを利用して空気チャンバーに口を切り開いて(1.5cm×1.5cm)、卵殻膜を剥離して、鶏胚漿尿膜を露出させた。VEGF(100nmol)を含有する濾紙を鶏胚漿尿膜の血管少ないところに置いた。パラフィルムを用いて空気チャンバーの口をシールして、インキュベーターにおいてさらに1日間培養した後に、パラフィルムを取り外して、濾紙にそれぞれビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、BX−CCFN、JJ−CCXJ及びBX−CCXJを各1nmol落下して、パラフィルムで再度に空気チャンバーの口をシールして、インキュベーターにおいてさらに1日間培養した。その後に、パラフィルムを取り外して、メタノールとアセトンの混合液(1:1, V/V)を注入して、室温で15min間固着した。血管が凝固したら、濾紙を中心として膜を切り取って、少量の水を盛った皿において展開して、ろ紙上にタイルに設置した。その後に、ろ紙と膜を一緒に水から取り出して、眼科用顕微鏡を利用して実験部周辺5mmの範囲内の血管を観測し計数して、撮影した。結果を図8に示した。
実験方法:文献(Srinivas Reddy Boreddy, et al. PLoS One. 2011, 6(10): e25799)に記載の方法を参考して、100μLの予冷し溶解したマトリゲル(Matrigel)を予冷した48ウェルプレートに添加して、37℃である細胞インキュベーターに30分間培養して、マトリゲルを完全に固化させた。この間に、SDラットをCO2によって安楽死させた後に、75%のアルコールで3min間浸けて、無菌台上にラットの胸腔を切り開いて、胸部大動脈を分離した。分離し得た胸部大動脈をPBSで血痕のないまでに洗浄して、DMEM/F12完全培養液に移した。その後、はさみや鉗子で大動脈周りに脂肪組織と結合組織を取り除いて、そして、眼科ハサミで胸部大動脈を約1ミリメートルの小片に切断して、マトリゲルに接種した。血管リングに再度に100μLの予冷したマトリゲルを設置して、再度に37℃である細胞インキュベーターに30分間培養した。その後、ブランク対照群と投薬群に分けて、投薬群に対してウェルに2nmol/Lビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、BX−CCFN、JJ−CCXJ及びBX−CCXJのそれぞれを含有したDMEM/F12完全培養液(100ng/mL VEGFを含有)を添加した。1日おきに液を入れ替えて、液を4回入れ替えたら、倒立顕微鏡下で撮影して、発芽管を計数した。結果は図9に示した。
実験方法:文献(Deng ZT, et al. Biochemical Pharmacology 2011, 82:1832−42)に記載の方法を参考し改良して、100 μLの予冷し溶解したマトリゲル(Matrigel)を予冷した48ウェルプレートに添加して、37℃である細胞インキュベーターに30分間培養して、マトリゲルを完全に固化させた。この間に、SDラットをCO2によって安楽死させた後に、75%のアルコールで3min間浸けて、無菌台上にラットの胸腔を切り開いて、胸部大動脈を分離した。分離し得た胸部大動脈をPBSで血痕のないまでに洗浄して、DMEM/F12完全培養液に移した。その後、はさみや鉗子で大動脈周りに脂肪組織と結合組織を取り除いて、そして、眼科ハサミで胸部大動脈を約1ミリメートルの小片に切断して、マトリゲルに接種した。血管リングに再度に100μLの予冷したマトリゲルを設置して、再度に37℃である細胞インキュベーターに30分間培養した後に、DMEM/F12完全培養液(100ng/mL VEGFを含有)を加えた。1日おきで液を入れ替えて、微小血管が形成されたら、ウェルに2 nmol/L ビンブラスチン類化合物、又はビンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、 BX−CCFN、JJ−CCXJ、BX−CCXJをそれぞれ含有したDMEM/F12完全培養液を添加して、24h後に倒立顕微鏡下で撮影して、発芽管を計数した。結果は図10に示した。
実験方法:文献(Nasim Akhtar, et al. Angiogenesis. 2002, 5: 75−80)に記載の方法を参考して、500μLの予冷したマトリゲルを用意して,500ngのVEGFと150単位のヘパリンを添加して、ビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、BX−CCFN、JJ−CCXJ及びBX−CCXJのそれぞれ1:1(V/V)比率で混合して、薬物最終濃度が100pmol/Lとなるように、6週齢のBALB/C nu/nuヌードマウスの背部皮下に接種した。PBS群をブランク対照群として用意して、各群は6匹とした。通常のように14日間育種した後に、ヌードマウスをCO2で安楽死させた。マトリゲル塞栓を慎重に剥離した直後に、4%のパラホルムアルデヒドで固着した。24 h後に、パラフィン切片とH&E染色を行って、切片について倒立顕微鏡下で血管形成状況を観測し撮影して、新生血管の数を計数した。その結果は、図11に示した。
実験方法:文献(Nasim Akhtar, et al. Angiogenesis. 2002, 5: 75−80)に記載の方法を参考して、500μLの予冷したMatrigelを用意して,500ngのVEGFと150単位のヘパリンを添加して、6週齢のBALB/C nu/nuヌードマウスの背部皮下に接種した。一週後に、1日おきでビンブラスチン類化合物並びにビンブラスチン誘導体JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、BX−CCFN、JJ−CCXJ及びBX−CCXJのそれぞれを尾静脈注射した。薬物濃度は、何れも1mg/kgであった。生理食塩水のをブランク対照群として設立して、各群は6匹とした。投薬7回後に、ヌードマウスをCO2で安楽死させた。マトリゲル塞栓を慎重に剥離した直後に、4%のパラホルムアルデヒドで固着した。24h後に、パラフィン切片とH&E染色を行って、切片について倒立顕微鏡下で血管形成状況を観測し撮影して、新生血管の数を計数した。その結果は、図12に示した。
実験方法:文献(Yi ZF, et al. Int J Cancer. 2009, 124: 843−852)に記載の方法を参考して、ラット角膜マイクロポケットモデルを構築した。スクラルファートとPoly−HEMAを用いてVEGF200ng/粒を含有する徐放性粒子を調製して,SDラットを2%のペントバルビタールナトリウムで麻酔した後に、VEGF徐放性粒子を角膜マイクロポケットに注射して、手術後にクロラムフェニコールを用いて目を塗った。手術後の翌日に、ラットをランダムにPBS群、ビンブラスチン類化合物群、JJ−CCJ群、 BX−CCJ群、JJ−CCRB群、 BX−CCRB群、JJ−CCFN群、BX−CCFN群、JJ−CCXJ群、及びBX−CCXJ群に分けて、各群は10匹として、投薬量は、いずれも1mg/kgであった。1日おきで、尾静脈投薬1回として、投薬7回後に、実体顕微鏡にて血管の成長状況を観測して、新生血管の長さ(VL)とクロックアワー数(CN)を計数して、下記の式で血管の面積を計算した:Area (mm2) = 0.2× π × VL(mm) × CN (mm)。結果は、図13に示した。
実験方法:文献(Yi ZF, et al. Int J Cancer. 2009, 124(4): 843−852)に記載の方法を参考して、ラット角膜マイクロポケットモデルを構築した。スクラルファートとPoly−HEMAを用いてVEGF200ng/粒を含有する徐放性粒子を調製して,SDラットを2%のペントバルビタールナトリウムで麻酔した後に、VEGF徐放性粒子を角膜マイクロポケットに注射して、手術後にクロラムフェニコールを用いて目を塗った。手術後の翌日に、ラットをランダムにPBS群、ビンブラスチン類化合物群、JJ−CCJ群、BX−CCJ群、JJ−CCRB群、BX−CCRB群、JJ−CCFN群、BX−CCFN群、JJ−CCXJ群、及びBX−CCXJ群に分けて、各群は、10匹とした。まずは一週間フィードして、血管が新生した後に、1日おきで尾静脈投薬1回として、投薬量は、いずれも1 mg/kgであった。投薬7回後に、実体顕微鏡にて血管の成長状況を観測して、新生血管の長さ(VL)とクロックアワー数(CN)を計数して、下記の式で血管の面積を計算した:Area (mm2) = 0.2 × π × VL (mm) × CN (mm)。結果は、図14に示した。
実験方法:文献(Campbell IK, et al. Eur J Immunol, 2000, 30: 1568−1575)に記載の方法によってC57マウスCIA (抗原誘導性関節炎)モデルを構築して、毎匹100μLの量で、尾根部から、100μgのII型コラーゲンを含有する乳液を皮内マルチポイント励起注射した。対照群について、モデル群と同様な方法で、生理食塩水を注射した。マウスがモデルを構築したらランダムにグループ化して、各群は10匹とした。モデル構築の翌日に、一日おきで、尾静脈によりそれぞれPBS、ビンブラスチン類化合物、JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、BX−CCFN、JJ−CCXJ又はBX−CCXJを注射して、投薬量は1.0mg/kgであった。継続的に7回投薬したら実験を終了して、マウスをCO2で安楽死させて、後ろ足の右膝を剥がし取って、滑膜組織を単離した。4%のパラホルムアルデヒドで固着した後に、通常免疫組織化学方法(Yajuan Song, et al. Angiogenesis. 2012, 15: 421−432)によって滑膜組織の血管新生を検出して、CD31とラベルした。微小血管の評価基準は、文献(Tatsuta M, et al. Int J Cancer, 1999, 80: 396−399)を参考した:ブラウンも染められたシングル内皮細胞又は内皮細胞クラスターは、一つの血管として計数して、ルーメンが8個赤血球より大きくて、厚い筋層を有する血管エリアにおける血管について計数しないとした。計数方法:まずは低倍率(×10)の顕微鏡によって3つの血管密度の高いエリアを選択して、そして高倍率(×40)の顕微鏡の下で各エリアにおける微小血管の密度(MVD)値を計数した。結果は、図15に示した。
実験方法:文献(Campbell IK, et al. Eur J Immunol, 2000, 30: 1568−1575)に記載の方法によってC57マウスCIA (抗原誘導性関節炎)モデルを構築して、毎匹100μLの量で、尾根部から、100μgのII型コラーゲンを含有する乳液を皮内マルチポイント励起注射した。対照群について、モデル群と同様な方法で、生理食塩水を注射した。マウスがモデルを構築したらランダムにグループ化して、各群は10匹とした。モデルを構築した後にまずは7日間フィードフィードして、そして一日おきで、尾静脈によりそれぞれPBS、ビンブラスチン類化合物、JJ−CCJ、BX−CCJ、JJ−CCRB、BX−CCRB、JJ−CCFN、BX−CCFN、JJ−CCXJ又はBX−CCXJを注射して、投薬量は1.0mg/kgであった。継続的に7回投薬したら実験を終了して、マウスをCO2で安楽死させて、後ろ足の右膝を剥がし取って、滑膜組織を単離した。4%のパラホルムアルデヒドで固着した後に、通常免疫組織化学方法(Yajuan Song, et al. Angiogenesis. 2012, 15: 421−432)によって滑膜組織の血管新生を検出して、CD31とラベルした。微小血管の評価基準は、文献(Tatsuta M, et al. Int J Cancer, 1999, 80: 396−399)を参考した:ブラウンも染められたシングル内皮細胞又は内皮細胞クラスターは、一つの血管として計数して、ルーメンが8個赤血球より大きくて、厚い筋層を有する血管エリアにおける血管については計数しないこととした。計数方法:まずは低倍率(×10)の顕微鏡によって3つの血管密度の高いエリアを選択して、そして高倍率(×40)の顕微鏡の下で各エリアにおける微小血管の密度(MVD)値を計数した。結果は、図16に示した。
Claims (10)
- ビンブラスチン類ジペプチド誘導体が、以下に示されるBX−CCXJ、BX−CCJ、BX−CCRB又は BX−CCFN
- 請求項1に記載の前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体の調製方法であって、
(1)ビンブラスチン類化合物又はその塩をヒドラジン水和物と反応させ、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物を得るステップと、
(2)ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物とベンジルオキシカルボニル−グリシル−プロリンを、カップリング剤の作用下に反応させ、前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体を得るステップと、を含み、
前記ビンブラスチン類化合物は、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンフルニン、ビノレルビン、又はそれらの塩であり、前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、下記に示されたJJ−CCXJ、JJ−CCJ、JJ−CCRB、又はJJ−CCFN
- 前記カップリング剤は、クロロギ酸エチル、1−エチル−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、1H−ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート及び1−クロロ−N,N’,2−トリメチルプロペから選択された一種又は一種以上の混合物であることを特徴とする請求項2に記載の調製方法。
- 以下に示されるJJ−CCXJ又はJJ−CCFN
- ビンブラスチン誘導体の抗腫瘍薬物の調製における応用であって、
前記ビンブラスチン誘導体は、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体、又はそれらの生理学的に許容される塩であり、
前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、請求項4に記載のヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物であり、
前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、請求項1に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体であり、
前記腫瘍は、胃癌、肺癌、上咽頭癌、乳癌、結腸癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、前立腺癌、子宮頸癌、黒色腫、卵巣癌、神経芽細胞腫、上咽頭癌、ウィルムス腫瘍、又は多剤耐性腫瘍であることが好ましい、応用。 - 請求項1に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩の、腫瘍の間質性線維芽細胞活性化プロテアーゼα(FAPα)の特有な加水分解基質の薬物の調製における応用であることを特徴とする請求項5に記載の応用。
- ビンブラスチン誘導体の、糖尿病性網膜症又は関節リウマチの治療又は予防用薬物の調製における応用であって、
前記ビンブラスチン誘導体は、ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物、ビンブラスチン類ジペプチド誘導体、又はそれらの生理学的に許容される塩であり、
前記ヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物は、JJ−CCFN、JJ−CCJ、JJ−CCRB、JJ−CCXJ、又はそれらの生理学的に許容される塩から選択され、
前記ビンブラスチン類ジペプチド誘導体は、請求項1に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体である、応用。 - ビンブラスチン誘導体の、血管新生阻害剤又は血管遮断剤として用いられる薬物の調製における応用であって、
前記ビンブラスチン誘導体は、JJ−CCFN、JJ−CCJ、JJ−CCRB、JJ−CCXJ、BX−CCJ、 BX−CCFN、BX−CCRB、BX−CCXJ、又はそれらの生理学的に許容される塩から選択される、応用。 - 前記生理学的に許容される塩は、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、酒石酸塩、又はクエン酸塩であることを特徴とする請求項1〜8の何れか1項に記載の応用。
- 請求項1に記載のビンブラスチン類ジペプチド誘導体又はその生理学的に許容される塩、あるいは請求項4に記載のヒドラジン分解ビンブラスチン類化合物又はその生理学的に許容される塩を含むことを特徴とする薬物組成物。
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